CN104126018B - 酶方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法使用孔和RecD解旋酶。所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。

Description

酶方法
技术领域
本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法使用孔和RecD解旋酶。所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。
背景技术
当前，需要可以广泛应用的快速且便宜的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是由于它们依赖于扩增技术产生大量的多核苷酸并需要大量的专业荧光化学品进行信号检测。
跨膜孔(纳米孔)具有极大潜力作为聚合物和许多小分子的直接的，电生物传感器。特别是最近的关注点是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。
穿过纳米孔施加电势时，当分析物诸如核苷酸短暂停留在桶内一段时间将会有电流的变化。核苷酸的纳米孔检测给出已知标记和时间的电流变化。在“链测序(StrandSequencing)”方法中，使单个多核苷酸链穿过所述孔并获得对各核苷酸的鉴定。链测序可涉及使用核苷酸调控蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。
发明内容
本发明人已经证明RecD解旋酶能够控制多核苷酸穿过孔的移动，尤其当在施加电势诸如电压时。所述解旋酶能使目标多核苷酸以可控和逐步的方式逆着或顺着由所施加的电压引起的电场进行运动。令人惊奇地，所述解旋酶能在高的盐浓度下起作用，这对于表征多核苷酸，尤其是使用链测序的方法确定多核苷酸的序列，是有利的。这将在下文进一步详细描述。
相应的，本发明提供一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)将目标多核苷酸与跨膜孔和RecD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述孔，并且使所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及
(b)随着所述多核苷酸相对所述孔移动获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
本发明还提供了：
-一种用于表征目标多核苷酸的传感器的形成方法，包括在孔和RecD解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器；
-RecD解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用；
-一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)RecD解旋酶；以及
-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析设备，包括多个孔和多个RecD解旋酶；
-一种表征目标多核苷酸的方法,包括：
(a)将目标多核苷酸与RecD解旋酶接触，使得所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动；以及
(b)随着RecD解旋酶控制所述多核苷酸的运动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸；
-RecD解旋酶在表征目标多核苷酸的过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用；
-RecD解旋酶在对目标多核苷酸的部分或全部进行测序的过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用；
-一种用于表征样本中的目标多核苷酸的分析装置，其特征在于包括RecD解旋酶；以及
-一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)用于表征目标多核苷酸的分析装置和(b)RecD解旋酶。
附图说明
图1.A)使用解旋酶控制DNA穿过纳米孔的运动的例示图。将ssDNA底物与含有胆固醇标签的退火引物添加到双分子层的顺侧。胆固醇标签结合到所述双分子层上，在双分子层表面处富集所述底物。添加到顺侧隔间(compartment)的解旋酶连接到DNA上。在二价金属离子和NTP底物的存在下，所述解旋酶沿着所述DNA运动。在施加的电压下，纳米孔捕获所述DNA底物。在施加的电势的力的作用下，所述DNA被牵拉穿过所述孔直到连接在DNA上的解旋酶与所述孔的顶部接触，防止进一步的不受控的DNA移位。之后所述解旋酶继续移动所述DNA使其以受控制的方式穿过所述纳米孔。
所述例示图显示了将DNA引入纳米孔的两种可能的方法：一种模式(上部分图)所述解旋酶顺着所施加的电场的方向，将被捕获的DNA移进所述纳米孔，以及另一种模式(下部分图)所述解旋酶逆着所施加的电场的方向，将被捕获的DNA牵拉出所述纳米孔。当顺着所施加的电场移动时，DNA将被移动到所述膜的反侧。在上部分图和下部分图中，反侧的箭头表示DNA的运动方向，顺侧的箭头表示解旋酶相对于与DNA的运动方向。当逆着所施加的电场移动时，DNA被移动回所述膜的顺侧，并且如果所述解旋酶不解离，DNA可完全移位到所述顺侧。通过底物设计，诸如使用合适的前导区，上述方法的一个或两个可以同时使用。解旋酶的RecD家族沿着DNA的5’-3’方向运动。因此，顺着所述电场移动所述DNA需要捕获DNA的5’端下游，并且逆着所述电场移动所述DNA需要捕获DNA的3’端下游。B)实施例中使用的DNA底物的设计。
图2是解旋酶能以可控方式移动DNA穿过纳米孔，随着DNA移动穿过纳米孔(MspA-(B2)8)，产生逐步变化的电流。解旋酶-DNA事件的例子(140mV,400mM NaCl,10mM Hepes,pH8.0,0.60nM 400merDNA(SEQ ID NO:172,173和174),100nM Tra1 Eco(SEQ ID NO:61),1mM DTT,1mM ATP,1mM MgCl2)。上部)，获得Tra1400mer DNA事件的电流vs.时间的分图。所述开孔(open-pore)电流为～100pA。DNA在施加的电势(+140mV)的力的作用下被所述纳米孔捕获。具有酶连接的DNA产生长的模块(block)(在该条件下，在～25pA)，随着酶移动DNA穿过所述孔，该模块显示出逐步变化的电流。中部)是解旋酶控制的DNA事件中的一个的放大图，显示DNA-酶的捕获，以及随着DNA被牵拉穿过所述孔时电流的逐步变化。下部)，随着DNA移动穿过所述纳米孔电流逐步变化的另一个放大图。
图3是TraI Eco(SEQ ID 61)解旋酶控制的400merDNA(400merDNASEQ ID NO:172,173和174)移动穿过MspA-B2(8)纳米孔事件的另一个实例。下部)，显示DNA链的不同部分移动穿过所述纳米孔引起的电流逐步变化的事件的放大分图。
图4是检测酶活性的荧光分析。A)使用常规的荧光底物检测解旋酶(a)用于置换杂交的双链DNA的能力。1)所述荧光底物链(终浓度50nM)具有5’ssDNA突出部分(overhang)，以及杂交的双链DNA的40个碱基部分。主链上部(The major upper strand)在3’末端具有羧基荧光素碱基，并且所述杂交的互补链在5’末端具有黑洞淬灭剂(black-hole quencher(BHQ-1))碱基。当杂交时，来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭，所述底物基本上是无荧光的。所述分析中还包括，与荧光底物的较短链互补的1μM的捕获链。2)，在ATP(1mM)和MgCl2(10mM)存在下，添加到所述底物中的解旋酶(100nM)连接到所述荧光底物的5’尾部，沿着所述主链移动，并如图所示置换所述互补链。3)，一旦具有BHQ-1的互补链被完全取代，则主链上的荧光素发荧光。4)，过量的捕获链优先与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火与丢失荧光。B)在含有100mM到1M不同浓度的KCl的缓冲液((RecD Nth和Dth SEQ序号28和35,100mM Hepes pH8.0,1mM ATP,10mMMgCl2,50nM荧光底物DNA,1μM捕获DNA)中RecD解旋酶活性的初始速率的图。
图5是解旋酶控制的DNA事件的实例，使用了不同的Tra1解旋酶，TrwC Cba(+140mV,10mM Hepes,pH8.0,0.6nM,400merDNASEQ ID NO:172,172和173,100nM TrwC CbaSEQ ID 65,1mM DTT,1mM ATP,1mM MgCl2)。上部)，获得TrwC Cba 400mer DNA事件的电流vs.时间的分图。所述开孔电流为～100pA。DNA在施加的电势(+140mV)的力的作用下被所述纳米孔捕获。具有酶连接的DNA产生长的模块(在该条件下，在～25pA)，随着酶移动DNA穿过所述孔，该模块显示出逐步变化的电流。下部)，底部的线条显示DNA事件的放大的分图，表明了随着DNA被牵拉穿过所述孔时序列依赖性电流的逐步变化。
图6显示了使用TrwC(Atr)(SEQ ID NO:144)解旋酶时解旋酶控制的DNA运动的电流线条的实例。
图7显示了使用TrwC(Sal)(SEQ ID NO:140)解旋酶时解旋酶控制的DNA运动的电流线条的实例。
图8显示了使用TrwC(Ccr)(SEQ ID NO:136)解旋酶时解旋酶控制的DNA运动的电流线条的实例。
图9显示了使用TrwC(Eco)(SEQ ID NO:74)解旋酶时解旋酶控制的DNA运动的电流线条的实例。
图10显示了使用TrwC(Oma)(SEQ ID NO:106)解旋酶时解旋酶控制的DNA运动的电流线条的实例。
图11显示了使用TrwC(Afe)(SEQ ID NO:86)解旋酶时解旋酶控制的DNA运动的电流线条的实例。底部的线条显示了解旋酶控制的DNA运动的放大区域。
图12显示了使用TrwC(Mph)(SEQ ID NO:94)解旋酶时解旋酶控制的DNA运动的电流线条的实例。底部的线条显示了解旋酶控制的DNA运动的放大区域。
序列表的说明
SEQ ID NO:1显示了密码子优化的、编码MS-B1突变MspA单体的多核苷酸序列。该突变缺少信号序列并含有下列突变:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。
SEQ ID NO:2显示了MspA单体的MS-B1突变的成熟形式的氨基酸序列。该突变缺少信号序列并含有下列突变:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。
SEQ ID NO:3显示了编码α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN；Stoddart等人,PNAS,2009；106(19):7702-7707)的一个亚基的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:4显示了α-HL-NN的一个亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:7显示了MspB,C和D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示了类RecD模序(RecD-like motif)I的序列。
SEQ ID NO:9，10和11显示了延长的类RecD模序I的序列。
SEQ ID NO:12显示了RecD模序I的序列。
SEQ ID NO:13，14和15显示了延长的RecD模序I的序列。
SEQ ID NO:16显示了类RecD模序V的序列。
SEQ ID NO:17显示了RecD模序V的序列。
SEQ ID NO:18-45显示了表5中RecD解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46-53显示了MobF模序III的序列。
SEQ ID NO:54-60显示了MobQ模序III的序列。
SEQ ID NO:61-171显示了图7中所示TraI解旋酶和TraI亚族(subgroup)解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:172-182显示了实例中使用的序列。
具体实施方式
可以理解公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需求进行调整。也可以理解本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方式，不意为对本发明的限制。
另外，如在说明书和随附的权利要求书中使用的，单数形式的“一个”，“该”，“所述”包括复数，除非本文另有明确说明。因此，例如，涉及“一个孔”时包括两个或多个这样的孔，涉及“一个解旋酶”时包括包括两个或多个这样的解旋酶，涉及“一个多核苷酸”时包括两个或多个多这样的核苷酸，等。
所有在本文——无论前文或后文——中引用的出版物，专利和专利申请，均以全文参考的方式纳入本文中。
本发明的方法
本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法。所述方法包括将所述目标多核苷酸与跨膜孔和RecD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述孔并且所述RecD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。然后随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，使用现有技术已知的标准方法测定目标多核苷酸的一个或多个特征。优选随着所述多核苷酸相对于所述孔移动测定目标多核苷酸的一个或多个特征。步骤(a)和(b)优选在对该孔施加电势时实施。如下面进一步详细描述的，施加的电势典型地导致在所述孔和解旋酶之间形成复合体。施加的电势可以是电压电势。替换的，施加的电势可以是化学电势。其一个例子是横跨两性分子层使用盐梯度。Holden等人,J Am Chem Soc.2007 Jul 11；129(27):8650-5中公开了盐梯度。
在一些情况下，随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，穿过所述孔的电流用于确定目标多核苷酸的序列。这就是链测序。
所述方法具有多个优势。首先，本发明人出乎意料的发现RecD解旋酶具有出乎意料的高的盐耐受性，因此本发明方法能够在高的盐浓度下实施。在链测序中，电荷载体，诸如盐，是产生导电溶液必须的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和移位目标多核苷酸并且随着所述多核苷酸相对于所述孔的移动测定产生的序列依赖性电流变化。因为测量信号依赖于盐浓度，因此有利的是使用高的盐浓度以提高获得信号的强度。高的盐浓度提供了高信噪比，并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。对于链测序，超过100mM的盐浓度是理想的，例如超过400mM,600mM或800mM的盐浓度。本发明人出乎意料的发现RecD解旋酶能在非常高的盐浓度例如1M下有效发挥作用。本发明包括能在超过1M的盐浓度下例如2M下有效发挥作用的解旋酶。
第二，当施加电压时，RecD解旋酶能出乎意料的朝两个方向，即逆着或顺着由施加的电压产生的电场，移动目标多核苷酸。因此，本发明的方法可以两种优选方式之一实施。根据目标多核苷酸相对于所述孔的运动方向，即逆着或顺着所述电场，获得不同的信号。下面将对这进行更详细描述。
第三，RecD解旋酶通常一次移动所述目标多核苷酸中的一个核苷酸穿过所述孔。RecD解旋酶由此可作为单碱基棘齿(ratchet)。当然，这对测序目标多核苷酸是有利的，因为使用所述孔可以鉴定目标多核苷酸中的基本上全部的核苷酸——如果不是全部的话。
第四，RecD解旋酶能控制单链多核苷酸和双链多核苷酸的运动。这意味着根据本发明可以表征多种不同的目标多核苷酸。
第五，RecD解旋酶表现出非常耐受由施加的电压产生的电场。本发明人发现在“解链”状态下多核苷酸几乎不发生运动。解链状态通常是在缺乏核苷酸例如缺乏ATP的时候出现。当解旋酶在解链模式下操作时，其作用类似闸(brake)，防止目标序列在施加的电压的影响下太快穿过所述孔。这是非常重要的，因为这意味着，当逆着所施加电压产生的电场移动多核苷酸时，不会发生不希望的“向后”运动问题。
第六，RecD解旋酶非常容易制备和操控。因此它们非常适合用于直接且便宜的测序方法。
本发明方法是用于表征目标多核苷酸。多核苷酸，诸如核酸，是一种含有两个或多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任何组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被破坏。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被修饰，例如使用标记或标签。所述目标核苷酸可以包括一个或多个间隔物。
核苷酸通常含有碱基，糖和至少一个磷酸基团。核苷碱基通常是杂环的。核苷碱基包括但不局限于，嘌呤和嘧啶，更具体地，腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶,尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖通常为戊糖。核苷酸糖包括但不局限于，核糖和脱氧核糖。所述核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有单磷酸，二磷酸或三磷酸。磷酸可以连接在核苷酸的5’或3’端。
核苷酸包括但不局限于，腺苷单磷酸(AMP),鸟苷单磷酸(GMP),胸苷单磷酸(TMP),尿苷单磷酸(UMP),胞苷单磷酸(CMP),环状腺苷单磷酸(cAMP),环状鸟苷单磷酸(cGMP),脱氧腺苷单磷酸(dAMP),脱氧鸟苷单磷酸(dGMP),脱氧胸苷单磷酸(dTMP),脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和脱氧胞苷单磷酸(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP,TMP,GMP,CMP,UMP,dAMP,dTMP,dGMP或dCMP。
核苷酸可以是脱碱基的(即缺少核苷碱基)。
所述多核苷酸可以是单链或双链的。至少多核苷酸的一部分优选是双链的。
所述多核苷酸可以是核酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。所述目标多核苷酸可包括与一条DNA链杂交的一条RNA链。所述多核苷酸可以是本领域已知的任何人造核酸，诸如肽核酸(PNA),甘油核酸(GNA),苏糖核酸(TNA),锁定核酸(LNA)，或其他具有核苷侧链的合成聚合物。
目标多核苷酸的整体或仅部分可以通过所述方法表征，所述目标多核苷酸可具有任何长度。例如，所述多核苷酸可以为至少10,至少50,至少100,至少150,至少200,至少250,至少300,至少400或至少500个核苷酸对的长度。所述核苷酸可以是1000或更多个核苷酸对，5000或更多个核苷酸对的长度，或者100000或更多个核苷酸对的长度。
目标多核苷酸存在于任何合适的样本中。本发明通常针对已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样本实施。替换的，可以对样本实施本发明，以确认所识别的一个或多个目标多核苷酸，所述目标多核苷酸已知或预期存在于所述样本中。
所述样本可以是生物样本。本发明可以针对由任何生物体或微生物体获得或提取的样本在体外实施。所述生物体或微生物体通常是古核的(archaean),原核的或真核的并通常属于以下五界中的一个:植物界,动物界,真菌界,无核原生物界和原生生物界。本发明可以针对由任何生病毒获得或提取的样本在体外实施。所述样本优选为液体样本。所述样本通常包括患者的体液。所述样本可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，优选血液，血浆或血清。通常，所述样本是来自人的，但替换的，其可以是来自其他哺乳动物的，诸如商购可获得的家畜诸如马，牛，羊或猪，或可替换的，为宠物，如猫或狗。可替换的，源自植物的样本通常获得自经济作物，诸如谷类，豆类，水果或蔬菜，例如小麦，大卖，燕麦，油菜，玉米，大豆，稻米，香蕉，苹果，西红柿，土豆，葡萄，烟草，黄豆，扁豆，甘蔗，可可豆，棉花。
所述样本可以是非生物样本。所述非生物样本优选为液体样本。所述非生物样本的实例包括外科手术液体，水诸如饮用水，海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。
通常在分析前对所述样本进行处理，例如，通过离心或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞，诸如红血细胞。可以在获取所述样本后立即进行检测。通常也可以在分析前储存所述样本，优选在低于-70℃储存。
跨膜孔是一种在一定程度上穿过膜的结构，其允许离子诸如水合离子在施加的电势的驱动下穿过所述膜流动或在所述膜内流动。所述跨膜孔通常穿过整个膜使得离子可以从膜的一侧流向膜的另一侧。然而，所述跨膜孔不一定必须穿过所述膜。其可以在一端封闭。例如，所述孔可以是在所述膜内的井(well)，离子可以沿着所述井流动或流进所述井。
根据本发明可使用任何膜。合适的膜是本领域已知的。所述膜优选为两性分子层。两性分子层是一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子诸如磷脂质形成的层。所述两性分子层可以是单层或双层。所述两性分子层通常是一种平面脂双层或支撑双层。
所述两性分子层通常是脂质双分子层。脂质双分子层是细胞膜的模型并被用作多种实验研究的优良平台。例如，脂质双分子层能被通过单通道记录用于对膜蛋白进行体外研究。替换的，脂质双分子层可以用作生物传感器以检测多种物质的存在。所述脂质双分子层可以是任何的脂质双分子层。合适的脂质双分子层包括但不局限于，平面脂质双分子层，支撑双分子层或脂质体。所述脂质双分子层优选为平面脂质双分子层。合适的脂质双分子层公开在国际申请No.PCT/GB08/000563(公布号WO 2008/102121),国际申请No.PCT/GB08/004127(公布号WO 2009/077734)和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公布号WO 2006/100484)中。
形成脂质双分子层的方法为本领域已知的。合适的方法公开在实施例中。脂质双分子层通常通过Montal和Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1972；69:3561-3566)的方法形成，其中脂质单分子层穿过孔的任一侧负载在水溶液/空气界面上，所述孔垂直于所述界面。
所述Montal&Mueller的方法非常受欢迎，因为其成本经济并是一种相对迅速的形成具有良好质量的适合蛋白质孔嵌入的脂质双分子层的方法。其他常规的用于形成脂质双分子层的方法包括脂质体双分子层的尖端浸渍(tip-dipping),涂覆双分子层(paintingbilayers)和膜片钳(patch-clamping)方法。
在一个优选实施方式中，所述脂质双分子层如国际申请No.PCT/GB08/004127(公布号WO 2009/077734)所述形成。
在另一个优选实施方式中，所述膜为固态层。固态层不来源于生物体。换句话，固态层不是由生物环境获得或分离出的，所述生物环境诸如生物体或细胞或是生物上可获得的结构合成制得的变体结构(synthetically manufactured version)。固态层可以由有机和无机材料形成，所述有机和无机材料包括但不局限于微电子材料，绝缘材料诸如Si3N4,A12O3,和SiO，有机和无机聚合物诸如聚酰胺，塑料诸如
Figure BDA0000553961800000101
或弹性体诸如双组分加成固化硅橡胶，和玻璃。所述固态层可以由单原子层诸如石墨烯形成，或者只有几个原子厚的层形成。适合的石墨烯层在国际申请No.PCT/US2008/010637(公布号WO 2009/035647)中公开。
所述方法通常使用以下的物质进行实施：(i)含有孔的人工两性分子层，(ii)分离出的，天然存在的含有孔的脂质双分子层，或(iii)含有孔嵌入其中的细胞。所述方法通常使用人工两性分子层诸如人工脂质双分子层实施。所述分子层除孔之外还可以含有其他跨膜和/或膜内蛋白以及其他分子。适合的设备和条件如下所述。本发明的方法通常在体外实施。
所述多核苷酸可以偶联到所述膜。这可使用任何已知方法完成。如果所述膜是两性分子层，诸如脂质双分子层(如上文详细所述的)，所述多核苷酸优选可以通过存在于所述膜中的多肽或存在于所述膜中的疏水锚(anchor)偶联到所述膜。所述疏水锚优选为脂质，脂肪酸，固醇，碳纳米管或氨基酸。
所述多核苷酸可以直接偶联到所述膜。所述多核苷酸优选通过连接体(linker)偶联到膜。优选的连接体包括但不局限于，聚合物诸如多核苷酸，聚乙二醇(PEG)和多肽。如果多核苷酸直接偶联到所述膜上，则由于所述膜与所述解旋酶之间的距离，表征不能进行到所述多核苷酸的末端，将丢失一些数据。如果使用连接体，则所述多核苷酸能够被表征完全。如果使用连接体，连接体可以在任何位置连接到所述多核苷酸。所述连接体优选在尾部聚合物连接到所述多核苷酸。
所述偶联可以是稳定的或暂时的。对于某些应用，暂时性的偶联是优选的。如果一个稳定的偶联分子直接连接在多核苷酸的5’或3’端，则由于所述双分子层与所述解旋酶的活性位点之间的距离，表征不能进行到所述多核苷酸的末端，将丢失一些数据。如果所述偶联是暂时性的，则当偶联的末端随机的变为相对于双分子层是自由的状态时，所述多核苷酸能被表征完全。与膜形成稳定或暂时性的连接的化学基团在下面更详细的描述。所述多核苷酸可以使用所述胆固醇或脂肪酰基链暂时性地与两性分子层诸如脂质双分子层偶联。可以使用任何具有6-30个碳原子长度的脂肪酰基链，诸如十六烷酸。
在优选实施方式中，将所述多核苷酸偶联到两性分子层上。多核苷酸与合成的脂质双分子层的偶联可以预先用多种不同的拴系策略(tethering strategies)实施。这些策略综合在下面的表1中。
表1
Figure BDA0000553961800000111
Figure BDA0000553961800000121
多核苷酸可以使用经修饰的亚磷酰胺在合成反应中官能化，使其能容易的与反应性基团的加成兼容，所述反应性基团诸如硫醇，胆固醇，脂质和生物素基团。这些不同的连接化学成分为多核苷酸提供了一系列连接选择。每个不同的修饰基团以稍微不同的方式连接到所述多核苷酸并且所述偶联不总是永久性的，由此使得多核苷酸到所述双分子层有不同的停留时间。暂时性偶联的优点如上所述。
多核苷酸的偶联还能通过很多其他手段实现，条件是反应性基团被添加到所述多核苷酸。之前已经有在DNA任一端添加反应性基团的报道。可以使用多核苷酸激酶和ATPγS在ssDNA的5’端添加硫醇基团(Grant,G.P.和P.Z.Qin(2007)."A facile method forattaching nitroxide spin labels at the 5'terminus of nucleic acids."Nucleic Acids Res 35(10):e77)。可以使用末端转移酶添加具有多种不同选择的化学基团，诸如生物素，硫醇和荧光素，将经修饰的寡核苷酸添加到ssDNA的3’端(Kumar,A.,P.Tchen,等人(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes withterminal deoxynucleotidyl transferase."Anal Biochem 169(2):376-82)。
替换的，反应性基团可以被认为是DNA短片段互补性添加到已经偶联到所述双分子层的DNA短片段，使得所述连接可以通过杂交实现。已经报道ssDNA的短片段的连接可以使用T4 RNA连接酶I实现(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williams,等人(1992)."Ligation-anchored PCR:a simple amplification technique with single-sided specificity."Proc Natl Acad Sci U S A89(20):9823-5)。替换的，ssDNA或双链DNA可以连接到天然双链DNA上，然后通过加热变性或化学变性分开这两条链。对于天然双链DNA，可以在该双链的一个或两个末端添加一段ssDNA或双链DNA。然后当双链被解链(melted)时，如果使用ssDNA进行连接，每条单链将具有5’端或3’端的修饰，或者，如果使用双链DNA进行连接，每条单链将具有5’端修饰，3’端修饰、或5’端修饰和3’端修饰。如果所述多核苷酸是人工合成链，则所述偶联化学成分能在多核苷酸的化学合成过程中加入。例如，所述多核苷酸能使用具有反应性基团连接其上的引物合成。
一种常规的用于扩增基因组DNA片段的技术是使用聚合酶链反应(PCR)。这里，使用两个合成的寡核苷酸引物，可形成相同DNA片段的大量拷贝，其中对于每个拷贝，双链的每条链的5’端将是一个人工合成的多核苷酸。通过使用具有反应性基团诸如胆固醇、硫醇、生物素或脂质的反义引物，每个扩增的目标DNA的拷贝将含有用于偶联的反应性基团。
所述跨膜孔优选是一个跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是一个在一定程度上穿过所述膜的蛋白结构。其允许离子在施加的电压的驱动下穿过所述膜流动或在所述膜内流动。跨膜蛋白孔通常是多肽或多肽的组合，其允许离子，诸如分析物，从膜的一侧流到膜的另一侧。然而，所述跨膜蛋白孔不一定必须穿过所述膜。其可以在一端封闭。例如，所述跨膜孔可以在所述膜内形成井，离子可以沿着所述井流动或流进所述井。所述跨膜蛋白孔优选允许分析物诸如核苷酸穿过所述膜流动或在所述膜内流动。所述跨膜蛋白孔允许多核苷酸诸如DNA或RNA穿过所述孔移动。
所述跨膜蛋白孔可以是单体或寡聚物。所述孔优选由多个重复亚基诸如6,7,8或9个亚基构成。所述孔优选为六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的孔。
所述跨膜蛋白孔通常含有离子能穿过其流动的桶状结构或通道。所述孔的亚基通常围绕一中心轴并向跨膜β桶状结构或通道或跨膜α-螺旋束或通道提供链。
所述跨膜蛋白孔的桶状结构或通道通常含有能促进与分析物相互作用的氨基酸，所述分析物诸如核苷酸，多核苷酸或核酸。这些氨基酸优选位于所述桶状结构或通道的缢痕(constriction)附近。所述跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，诸如精氨酸，赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸，诸如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常可以促进所述孔与核苷酸，多核苷酸或核酸之间的相互作用。
在本发明中使用的跨膜蛋白孔可源自β-筒状孔或α-螺旋束孔。β-筒状孔包括由β-链形成的桶状结构或通道。合适的β-筒状孔包括但不局限于，β-毒素诸如α-溶血素,炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白/孔蛋白，诸如耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)，例如MspA，外膜孔蛋白F(OmpF),外膜孔蛋白G(OmpG),外膜磷酯酶A和奈瑟氏菌(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶状结构或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不局限于，内膜蛋白和α外膜蛋白，诸如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可以源自Msp或源自α-溶血素(α-HL)。
所述跨膜蛋白孔优选源自Msp，优选源自MspA。所述孔通常是寡聚的并通常包括7,8,9或10个源自Msp的单体。所述孔可以是源自含相同单体的Msp的同源寡聚孔(homo-oligomeric pore)。替换的，所述孔可以是源自含至少一个不同于其他的单体的Msp的异源寡聚孔。优选所述孔源自MspA或其同源物或并系同源物(paralog)。
所述源自Msp的单体含有SEQ ID NO:2所示序列或其变体(variant)。SEQ ID NO:2是MspA单体的MS-(B1)8突变体(mutations)。其包括以下突变:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。SEQ ID NO:2的变体是具有由SEQ ID NO:2的氨基酸序列变化而来并保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的多肽。所述变体形成孔的能力可通过本领域任何已知方法检测。例如，所述变体可以与其他适合的亚基一起插入两性分子层中，然后其寡聚形成孔的能力可以被检测。本领域已知将亚基插入膜诸如两性分子层中的方法。例如，亚基可以纯化的形式悬浮在含有脂质双分子层的溶液中，使得亚基扩散到脂质双分子层并通过结合到所述脂质双分子层上并装配成功能状态而插入。替换的，亚基可以直接使用M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公布号WO2006/100484)中描述的“拾取与放置(pick and place)”方法插入所述膜中。
在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度上，基于氨基酸的相似性，变体优选与该序列具有至少50％的同源性。更优选的，基于氨基酸序列的相似性，相比于SEQ ID NO:2的整个长度的氨基酸序列，所述变体具有至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％并且更优选至少95％,97％或99％的同源性。在100或更长,例如125,150,175或200或更长的长度的连续氨基酸上，具有至少80％,例如至少85％,90％或95％氨基酸相似性(“严格同源性”)。
可使用本领域标准方法测定同源性。例如UWGCG软件包提供的BESTFIT程序，其能用于计算同源性，例如使用其默认设置(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或比对序列(line up sequence)(例如识别等价残基，或对应的序列(通常基于其默认设置))，例如Altschul S.F.(1993)JMol Evol 36:290-300；Altschul,S.F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10中所描述的。用于执行BLAST分析的软件是通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)即可公开获得的。
SEQ ID NO:2是MspA单体的MS-(B1)8突变体。相比于MspA，所述变体可以含有MspB,C或D单体的突变中的任何一个。成熟形式的MspB,C和D示于SEQ ID NO:5到SEQ IDNO:7。特别的，所述变体可以包含以下存在于MspB:A138P中的置换。所述变体可以包括以下一个或多个存在于MspC:A96G,N102E和A138P中的置换。所述变体可以包括以下一个或多个存在于MspD中的突变：G1,L2V,E5Q,L8V,D13G,W21A,D22E,K47T,I49H,I68V,D91G,A96Q,N102D,S103T,V104I,S136K和G141A的缺失。所述变体可以包括一个或多个来自于Msp B,C和D的突变和置换的组合。所述变体优选含有突变L88N。含有突变L88N以及MS-B1的所有突变的SEQ ID NO:2的变体称为MS-B2。在本发明中使用的孔优选为MS-(B2)8。
除了以上所论述的，氨基酸的置换可以发生在SEQ ID NO:2的氨基酸序列上，例如高达1,2,3,4,5,10,20或30个置换。保守置换使用其他相似化学结构，相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸置换氨基酸。相比于被置换的氨基酸，引入的氨基酸可具有相似的极性，亲水性，疏水性，碱性，酸性，中性和所带电荷。替换的，所述保守置换可以引入芳香族的或脂肪族的其他氨基酸置换之前存在的芳香族的或脂肪族氨基酸。保守氨基酸改变是本领域已知的，并可以根据下面表2中定义的20个主要氨基酸的性质选择。其中，各氨基酸具有相似的极性，这可以参考表3的氨基酸侧链亲水性大小确定。
表2–氨基酸的化学性质
Figure BDA0000553961800000161
表3-亲水性大小
Figure BDA0000553961800000162
Figure BDA0000553961800000171
SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以从上述多肽中缺失。多达1,2,3,4,5,10,20或30或更多个残基可以被缺失。
所述变体可以包括SEQ ID NO:2的片段。该片段保留有形成孔的活性。所述片段可以至少为50,100,150或200个氨基酸长度。该片段可用于制造孔。片段优选包括SEQ ID NO:2的形成孔的结构域。片段必须含有SEQ ID NO:2的88,90,91,105,118和134残基中一个。通常，片段含有SEQ ID NO:2的88,90,91,105,118和134残基的全部。
一个或多个氨基酸可以替换的或额外的添加到上述的多肽上。可以在SEQ ID NO:2氨基酸序列或其多肽变体或其片段的氨基末端或羧基末端提供一延伸。所述延伸可以是非常短的例如1-10个氨基酸长度。替换的，所述延伸可以更长，例如50或100个氨基酸长度。载体蛋白可以融合到本发明的氨基酸序列上。其他融合蛋白将在下面进行更详细描述。
如上所述，变体是具有由SEQ ID NO:2的氨基酸序列变化而来并保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的多肽。变体通常含有SEQ ID NO:2的与孔形成有关的区域。含有β-筒的Msp的孔形成能力是由每个亚基中的β-片层(β-sheet)提供的。SEQ ID NO:2的变体通常包括SEQ ID NO:2中形成β-片层的区域。可以对SEQ ID NO:2中形成β-片层的区域进行一个或多个修饰只要获得的变体保留有其形成孔的能力。SEQ ID NO:2的变体优选在其α-螺旋和/或环形区域中包括一个或多个修饰，诸如置换，添加或缺失。
源自Msp的单体可以被修饰以帮助对它们的鉴定或纯化，所述修饰例如通过下述进行：通过添加组氨酸残基(hist标签)，天冬氨酸残基(asp标签),链霉亲和素标签或flag标签，或通过添加信号序列促进它们从细胞的分泌——当多肽并不天然含有该序列时。引入遗传标签的替换方案是通过化学反应将标签连接到所述孔的天然或人工位点。其一个例子为将凝胶迁移试剂与人工连接在所述孔外的半胱氨酸进行反应。其被证明是一种用于分离溶血素异源寡聚体的方法(Chem Biol.1997 Jul；4(7):497-505)。
源自Msp的单体可以用显示标记物(revealing label)标记。所述显示标记物可以是任何允许所述孔被检测的适宜标记物。适合的标记物包括但不局限于荧光分子，放射性同位素，如125I,35S，酶，抗体，抗原，多核苷酸和配体诸如生物素。
源自Msp的单体也可以使用D-氨基酸制备。例如，源自Msp的单体可以含有L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域常规的制备这类蛋白质或肽的方式。
源自Msp的单体可以含有一个或多个特异性修饰以促进对核苷酸的辨别。源自Msp的单体也可以含有其他非特异性的修饰只要它们不影响孔的形成。可以对源自Msp的单体的侧链进行很多本领域已知的非特异性侧链修饰。这些修饰包括，例如，通过与醛进行反应然后用NaBH4还原而进行的氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)进行的脒基化，或用乙酸酐进行的酰化。
源自Msp的单体可以使用本领域已知的标准方法制备。所述源自Msp的单体可以人工合成或通过重组手段制备。例如，所述孔可以通过体外翻译和转录(IVTT)进行合成。适合的用于制备孔的方法在国际申请No.PCT/GB09/001690(公布号WO 2010/004273),PCT/GB09/001679(公布号WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布号WO 2010/086603)中有论述。对将孔插入膜的方法进行了论述。
所述跨膜蛋白孔还优选源自α-溶血素(α-HL)。野生型的α-HL孔由7个相同单体或亚基形成(即其是七聚体类型的)。α-溶血素-NN的一个单体或亚基的序列如SEQ ID NO:4所示。所述跨膜蛋白孔优选包含7个单体，每个单体含有SEQ ID NO:4的序列或其变体。SEQ IDNO:4的1,7到21,31到34,45到51,63到66,72,92到97,104到111,124到136,149到153,160到164,173到206,210到213,217,218,223到228,236到242,262到265,272到274,287到290和294位氨基酸形成环形区域。SEQ ID NO:4的残基113和147形成α-HL的桶状结构或通道的缢痕部分。
在该实施方式中，包括七个蛋白质或单体的孔优选使用在本发明的方法中，所述蛋白质或单体各自包括SEQ ID NO:4的序列或其变体。所述7个蛋白质可以相同的(同源七聚体)或不同的(异源七聚体)。
SEQ ID NO:4的变体是一个具有从SEQ ID NO:4的氨基酸序列变化而来并保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的蛋白质。变体形成孔的能力可以使用本领域任何已知方法检测。例如，所述变体可以与其他适合的亚基一起插入两性分子层，诸如脂质双分子层中，其寡聚形成孔的能力可以被检测。本领域已知将亚基插入两性分子层，诸如脂质双分子层的方法。合适的方法如上所述。
所述变体可以包括促进与解旋酶共价连接或相互作用的修饰。所述变体优选含有一个或多个反应性的半胱氨酸残基，所述残基能促进与解旋酶的连接。例如，所述变体在8,9,17,18,19,44,45,50,51,237,239和287位点中的一个或多个和/或SEQ ID NO:4的氨基或羧基末端含有半胱氨酸。优选的变体包括在SEQ ID NO:4的8,9,17,237,239和287位残基使用半胱氨酸(A8C,T9C,N17C,K237C,S239C或E287C)的置换。所述变体优选为国际申请No.PCT/GB09/001690(公布号WO 2010/004273),PCT/GB09/001679(公布号WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布号WO 2010/086603)中描述的变体中的任一个。
所述变体也可以包括有能促进与核苷酸的任何相互作用的修饰。
所述变体可以是天然形成的变体，该天然形成的变体由生物体例如，葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌天然表达。替换的，所述变体可以在体外表达或通过诸如大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌重组表达。变体还包括非天然形成的由重组技术获得的变体。在SEQ ID NO:4整个长度的氨基酸序列上，基于氨基酸的相似性，变体优选与该序列具有至少50％的同源性。更优选的，基于氨基酸的相似性，相比于SEQ ID NO:4的整个序列的氨基酸序列，所述变体多肽可具有至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％并且更优选至少95％,97％或99％的同源性。在200或更长,例如230,250,270或280或更长长度的连续氨基酸上，可以具有至少80％,例如至少85％,90％或95％的氨基酸相似性(“严格同源性”)。同源性如上所述进行测定。
除了如上所述的，可以对SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如进行多达1,2,3,4,5,10,20或30个置换。可以进行如上所述的保守置换。
SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以另外从上述多肽中缺失。多达1,2,3,4,5,10,20或30或更多个残基可以被缺失。
变体可以是SEQ ID NO:4的片段。该片段保留有形成孔的活性。所述片段可以至少为50,100,150或200个氨基酸长度。该片段优选包括SEQ ID NO:4的形成孔的结构域。片段通常含有SEQ ID NO:4的119,121,135，113和139残基。
一个或多个氨基酸可以替换地或额外地添加到上述多肽。可以在SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其变体或片段的氨基末端或羧基末端提供一个延伸。所述延伸可以是非常短的例如1-10个氨基酸长度。替换的，所述延伸可以是更长的，例如多达50或100个氨基酸。载体蛋白可以融合到孔或其变体上。
如上所述，SEQ ID NO:4的变体为具有从SEQ ID NO:4的氨基酸序列变化而来并且保留有其形成孔的能力的氨基酸序列的亚基。变体通常含有SEQ ID NO:4的用于形成孔的区域。含有β-筒的α-HL的孔形成能力由每个亚基中的β-链提供。SEQ ID NO:4的变体通常含有SEQ ID NO:4中形成β-链的区域。形成β-链的SEQ ID NO:4的氨基酸如上所述。在SEQ IDNO:4的形成β-链的区域可以进行一个或多个修饰只要得到的变体保留其形成孔的能力。可以对SEQ ID NO:4的β-链区域进行的特异性修饰如上所述。
SEQ ID NO:4的变体优选在其α-螺旋和/或环形区中包括一个或多个修饰，诸如置换，添加或缺失。形成α-螺旋和/或环形区的氨基酸如上所述。
所述变体可以进行修饰以帮助对其进行如上所述的鉴定或纯化。
源自α-HL的孔可以如上所述参考由Msp获得孔进行制备。
在一些实施方式中，所述跨膜蛋白孔是经化学修饰的。所述孔可以在任何位点以任何方式进行化学修饰。所述跨膜蛋白孔优选通过下述进行化学修饰：将分子连接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接)，将分子连接到一个或多个赖氨酸上，将分子连接到一个或多个非天然氨基酸上，表位的酶修饰或末端修饰。适用于进行这些修饰的方法是本领域已知的。所述跨膜蛋白孔可以通过连接任何分子进行化学修饰。例如，所述孔可通过连接染料或荧光团进行化学修饰。
孔中任何数目的单体都可以被化学修饰。优选一个或多个，诸如2,3,4,5,6,7,8,9或10个所述单体如上所述进行化学修饰。
半胱氨酸残基的反应性可以通过相邻残基的修饰提高。例如，侧翼精氨酸,组氨酸或赖氨酸残基的碱性基团将半胱氨酸硫醇基团的pKa改变成更大反应性的S-基团的pKa。半胱氨酸残基的反应性可以通过硫醇保护基团诸如dTNB来保护。这些保护基团可以在连接体连接之前与孔的一个或多个半胱氨酸残基反应。
所述分子(其对孔进行化学修饰)可以直接连接到所述孔或通过国际申请号PCT/GB09/001690(公布号WO 2010/004273),PCT/GB09/001679(公布号WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布号WO 2010/086603)中公开的连接体连接到所述孔。
根据本发明可以使用任何RecD解旋酶。所述RecD解旋酶的结构可以是本领域已知的(FEBS J.2008 Apr；275(8):1835-51.Epub 2008 Mar 9.ATPase activity of RecD isessential for growth of the Antarctic Pseudomonas syringae Lz4W at lowtemperature.Satapathy AK,Pavankumar TL,Bhattacharjya S,Sankaranarayanan R,RayMK；EMS Microbiol Rev.2009 May；33(3):657-87.The diversity of conjugativerelaxases and its application in plasmid classification.Garcillán-Barcia MP,Francia MV,de la Cruz F；J Biol Chem.2011 Apr8；286(14):12670-82.Epub 2011 Feb2.Functional characterization of the multidomain F plasmid TraI relaxase-helicase.Cheng Y,McNamara DE,Miley MJ,Nash RP,Redinbo MR)。
所述RecD解旋酶通常包括氨基酸模序X1-X2-X3-G-X4-X5-X6-X7(下文称为类RecD模序I；SEQ ID NO:8)，其中X1为G,S或A，X2为任意氨基酸残基，X3为P,A,S或G,X4为T,A,V,S或C,X5为G或A,X6为K或R且X7为T或S。X1优选为G。X2优选为G,I,Y或A。X2更优选为G。X3优选为P或A。X4优选为T,A,V或C。X4优选为T,V或C。X5优选为G。X6优选为K。X7优选为T或S。所述RecD解旋酶优选包括Q-(X8)16-18-X1-X2-X3-G-X4-X5-X6-X7(下文称为延长的类RecD模序I；SEQ ID NO：9,10和11，其中分别有16,17和18个X8)，其中X1到X7如上所定义，X8为任意氨基酸残基。优选在延长的类RecD模序I(SEQ ID NO:9)中有16个X8(即(X8)16)。适合的(X8)16的序列可以在SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42和44中鉴定。
所述RecD解旋酶优选包括氨基酸模序G-G-P-G-Xa-G-K-Xb(下文称为RecD模序I；SEQ ID NO:12)，其中Xa为T,V或C且Xb为T或S。Xa优选为T。Xb优选为T。所述RecD解旋酶优选包括序列G-G-P-G-T-G-K-T(SEQ ID NO:19；参见表5)。所述RecD解旋酶更优选包括氨基酸模序Q-(X8)16-18-G-G-P-G-Xa-G-K-Xb(下文称为延长的RecD模序I；SEQ ID NO:13,14和15，其中分别有16,17和18个X8),其中Xa和Xb如上所定义，X8为任意氨基酸。优选在延长的RecD模序I(SEQ ID NO:13)中有16个X8(即(X8)16)。适合的(X8)16的序列可以在SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42和44中鉴定。
所述RecD解旋酶通常包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(下文称为类RecD模序V；SEQ ID NO:16)，其中X为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸残基,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸残基且X7为G或S。X1优选为Y。X2优选为A,M,C或V。X2更优选为A。X3优选为I,M或L。X3更优选为I或L。X4优选为T或S。X4更优选为T。X5优选为A,V或I。X5更优选为V或I。X5最优选为V。(X6)3优选为H-K-S,H-M-A,H-G-A或H-R-S。(X6)3更优选为H-K-S。X7优选为G。所述RecD解旋酶优选包括氨基酸模序Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-H-K-S-Q-G(下文称为RecD模序V；SEQ ID NO:17),其中Xa为Y,W为F,Xb为A,M,C或V,Xc为I,M或L,Xd为T或S且Xe为V或I。Xa优选为Y。Xb优选为A。Xd优选为T。Xe优选为V。所述RecD解旋酶更优选包括(1)类RecD模序I和V(SEQ ID NO:8和12),(2)RecD模序I和类RecD模序V(SEQ IDNO:12和16),(3)RecD模序I和V(SEQ ID NO:12和17),(4)延长的类RecD模序I和类RecD模序V(SEQ ID NO:9,10或11和16),(5)延长的RecD模序I和类RecD模序V(SEQ ID NO:13,14或15和16)或(6)延长的RecD模序I和RecD模序V(SEQ ID NO:13,14或15和17)。
优选的RecD模序I如以下表5所示。优选的类RecD模序I如以下表7所示。优选的类RecD模序V如以下表5和7所示。
RecD解旋酶优选为以下表4所示的多种解旋酶中的一种或其变体。
表4
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所述RecD解旋酶更优选为以下表5所示的多种解旋酶中的一种或其变体。所述RecD解旋酶更优选包括表5中所示的多种解旋酶中的一种的序列，即SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42和44中的一种,或其变体。
表5-更优选的RecD解旋酶
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上表中所有序列包括类RecD模序V(如所示的)。仅SEQ ID NO:18,25,28,30,35,37,39和42包括RecD模序V(如所示的)。
所述RecD解旋酶优选为TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶。TraI解旋酶和TraI亚族解旋酶可以含有两个RecD解旋酶域,一个释放酶域和一个C-末端域。所述TraI亚族解旋酶优选为TrwC解旋酶。所述TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶优选为以下表6中所示的多种解旋酶中的一种或其变体。
所述TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶通常包括一个如上所定义的类RecD模序I(SEQID NO:8)和/或一个如上所定义的类RecD模序V(SEQ ID NO:16)。TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶优选包括类RecD模序I(SEQ ID NO:8)和类RecD模序V(SEQ ID NO:16)。所述TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶通常还包括以下两个模序中的一个:
-所述氨基酸模序H-(X1)2-X2-R-(X3)5-12-H-X4-H(下文称为MobF模序III；SEQ IDNO:46到53显示了所有可能的MobF模序III(包括所有可能的X3的个数)),其中X1和X3为任意氨基酸，且X2和X4独立地选自除了D,E,K和R以外的任意氨基酸。(X1)2当然为X1a-X1b。X1a和X1b可以是相同或不同的氨基酸。X1a优选为D或E。X1b优选为T或D。(X1)2优选为DT或ED。(X1)2最优选为DT。(X3)5-12中5到12个氨基酸可以相同或不同。X2和X4独立地选自G,P,A,V,L,I,M,C,F,Y,W,H,Q,N,S和T。X2和X4优选不带电。X2和X4优选不为H。X2更优选为N,S或A。X2最优选为N。X4最优选为F或T。(X3)5-12优选为6或10个残基长度(SEQ ID NO:47和51)。适合的(X3)5-12的实施方式可衍生自以下表7中所示的SEQ ID NO:61,65,69,73,74,82,86,90,94,98,102,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168(即除了SEQ ID NO:78和106之外所有的)。优选的MobF模序III的实施方式示于以下表7。
-所述氨基酸模序G-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-H-(X8)6-12-H-X9(下文称为MobQ模序III；SEQ ID NO:54到60显示了所有可能的MobQ模序III(包括了所有可能的X8的个数)),其中X1,X2,X3,X5,X6,X7和X9独立地选自除了D,E,K和R之外的任意氨基酸,X4为D或E且X8为任意氨基酸。X1,X2,X3,X5,X6,X7和X9独立地选自G,P,A,V,L,I,M,C,F,Y,W,H,Q,N,S和T。X1,X2,X3,X5,X6,X7和X9优选不带电。X1,X2,X3,X5,X6,X7和X9优选不为H。(X8)6-12中的6到12个氨基酸可以相同或不同。适合的(X8)6-12的实施方式可衍生自以下表7中所示的SEQ IDNO:78和106。优选的MobF模序III的实施方式示于以下表7。
表6‐优选的TraI解旋酶和TraI亚族解旋酶以及它们的登录号
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SEQ ID NO 78和106包括MobQ模序III，其中表7中的其他序列包括MobF模序III。
TraI解旋酶优选包括SEQ ID NO:61所示的序列或其变体。
RecD解旋酶的变体为具有以下氨基酸序列的酶：所述氨基酸序列由野生型解旋酶的序列变化而来并保留了多核苷酸结合活性。特别的，SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168任何一个的变体为具有以下氨基酸序列的酶：所述氨基酸序列由SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168的任何一个的序列变化而来并保留了多核苷酸结合活性。SEQ ID NO:18或61的变体为具有由SEQ ID NO:18或61的序列变化而来并保留了多核苷酸结合活性的氨基酸序列的酶。所述变体保留有解旋酶活性。用于测定解旋酶活性的方法为本领域已知的。所述解旋酶活性还可以使用实施例中描述的方法测定。所述变体必须在以下讨论的两种模式中的至少一种模式下工作。优选的，所述变体以这两种模式进行工作。所述变体可以包括促进对编码解旋酶的多核苷酸进行操作的修饰和/或促进其在高盐浓度下和/或室温下的活性的修饰。所述变体通常在上面描述的模序之外的区域与野生型解旋酶不同。然而，变体可以在这些模序中含有修饰。
在SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中任一个,诸如SEQ ID NO:18或61的氨基酸序列的整个长度上，基于氨基酸相似性，变体优选与所述序列具有至少10％的同源性。更优选，基于氨基酸相似性，相比于SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中任一个,诸如SEQ ID NO:18或61的氨基酸序列的整个长度上，所述变体多肽可以具有至少20％,至少25％,至少30％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％，至少80％,至少85％,至少90％并且更优选至少95％,97％或99％的同源性。在150或更长,例如200,300,400,500,600,700,800,900或1000，或更长长度的连续氨基酸上，可以具有至少70％,例如至少80％,至少85％,至少90％或至少95％氨基酸相似性(“严格同源性”)。同源性按上文所述进行确定。所述变体可用上文针对SEQ ID NO:2和4所论述的方式中的任一种与野生型序列进行区分。
特别的，变体可以包括SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168的片段。所述片段保留有多核苷酸结合活性。所述片段可以为至少200个，至少300个，至少400个，至少500个，至少600个，至少650个，至少700个，至少800个，至少900个或至少1000个氨基酸长度。所述片段的长度取决于野生型序列的长度。如下面所详细描述的，所述片段优选包括相关野生型序列的类RecD模序I和/或类RecD模序V。
如上所述，TraI解旋酶和TraI亚族解旋酶包括释放酶域。所述释放酶域包括MobF模序III或MobQ模序III，并通常位于TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶的氨基(N)末端。优选的TraI解旋酶和TraI亚族解旋酶的片段，诸如优选的SEQ ID NO:61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168的片段，缺少野生型序列的N末端域。所述N末端域通常相当于大约N末端第三个蛋白质(N terminal third of the protein)。SEQ ID NO:61(其为1756个氨基酸长度)中，N末端域通常为约500到约700个氨基酸长度，诸如约550到约600个氨基酸长度。在SEQ ID NO:65,69和73(其分别为970,943和960个氨基酸长度)中，所述N末端域通常为约300到约350个氨基酸长度，诸如约320到约340个氨基酸长度。
可以对SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168的氨基酸序列进行氨基酸的置换，例如多达1,2,3,4,5,10,20或30个氨基酸的置换。这些置换优选为如上所述的保守置换。可以在SEQ ID NO:41的K555,R554,T644,R647,P666,M667,H646,N604,N596,Y598,V470,G391,H409,T407,R410和Y414的氨基酸位置进行一个或多个置换。在SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中，可以在对应于SEQ IDNO:41的K555,R554,T644,R647,P666,M667,H646,N604,N596,Y598,V470,G391,H409,T407,R410和Y414的氨基酸位置的一个或多个氨基酸位点进行置换。在不同的蛋白质序列上确定相应的氨基酸位点是很容易的。例如，各蛋白质可以基于它们的同源性进行比对。同源性可以如上所述进行确定。
变体，诸如SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中任一个的片段，优选包括相关的野生型序列的类RecD模序I(或RecD模序I)和/或类RecD模序V(或RecD模序V)。变体，诸如SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中任一个的片段，优选包括相关的野生型序列的类RecD模序I(或RecD模序I)和类RecD模序V(或RecD模序V)。例如，SEQ ID NO:18的变体优选包括RecD模序I GGPGTGKT(SEQ IDNO:19)和RecD模序V WAVTIHKSQG(SEQ ID NO:20)。SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中每一个的类RecD模序I和V(或RecD模序I和V)示于表5和表7中。然而，SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168的任一个的变体可以包括不同野生型序列的类RecD模序I(或RecD模序I)和/或类RecD模序V(或RecD模序V)。例如，SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:35的变体可以包括SEQ ID NO:21的RecD模序I和类RecD模序V(分别为GGPGTGKS和YALTVHRAQG；SEQ ID NO:22和23)。SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168的任一个的变体可以包括表5和表7所示的优选模序中任一个。SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42,44,61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中任一个的变体也可在相关的野生型序列的类RecD模序I和V中包括修饰。适合的修饰在上文定义两种模序时已经讨论。在该段落中的讨论同样适用于SEQ ID NO:61,65,69,73,74,82,86,90,94,98,102,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168的MobF模序III以及SEQ ID NO:78和106的MobQ模序III。特别的，变体，诸如SEQ ID NO:61,65,69,73,74,82,86,90,94,98,102,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168任一个的片段，优选包括相关的野生型序列的MobF模序III。变体，诸如SEQ ID NO:78或106的片段，优选包括相关的野生型序列的MobQ模序III。变体，诸如SEQ ID NO:61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168任一个的片段，优选包括相关的野生型序列的类RecD模序I(或RecD模序I),类RecD模序V(或RecD模序V)和MobF或MobQ模序III。
所述解旋酶可以共价连接到所述孔上。所述解旋酶优选不共价连接到所述孔上。施加电压到所述孔和所述解旋酶上通常形成能对目标多核苷酸进行测序的传感器。这将在下面进行详细论述。
本文所论述的任何蛋白，即跨膜蛋白孔或RecD解旋酶，可以经修饰以帮助进行对它们的鉴定或纯化，所述修饰例如通过下述进行：通过添加组氨酸残基(his标签)，天冬氨酸残基(asp标签),链霉亲和素标签，flag标签，SUMO标签,GST标签或MBP标签，或通过添加信号序列促进它们从细胞的分泌——当多肽并不天然含有该序列时。引入遗传标签的一替换方案是通过化学反应将标签连接到所述孔或解旋酶上的天然或人工位点。其一个例子为将凝胶迁移试剂与人工连接在所述孔外的半胱氨酸进行反应。其被证明是一种用于分离溶血素异源寡聚体的方法(Chem Biol.1997 Jul；4(7):497-505)。
所述孔和/或解旋酶可以使用显示标记物标记。所述显示标记物可以是任何允许所述孔被检测的适宜标记物。适合的标记物包括但不局限于荧光分子，放射性同位素，如125I,35S，酶，抗体，抗原，多核苷酸和配体诸如生物素。
蛋白质可以人工合成或通过重组手段制备。例如，所述孔和/或解旋酶可以通过体外翻译和转录(IVTT)进行合成。所述孔和/或解旋酶的氨基酸序列可以被修饰为包括非天然形成的氨基酸或被修饰为用以提高蛋白质的稳定性。当通过合成手段制备蛋白质时，可以在制备过程引入所述氨基酸。所述孔和/或解旋酶也可以在合成或重组制备后被改变。
所述孔和/或解旋酶也可以使用D-氨基酸制备。例如，所述孔或解旋酶可以含有L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域常规的制备这类蛋白质或肽的方式。
所述孔和/或解旋酶也可以含有其他非特异性的修饰只要所述修饰不影响孔的形成或解旋酶功能。可以对蛋白质侧链进行很多本领域已知的非特异性侧链修饰。这些修饰包括，例如，通过与醛进行反应然后用NaBH4进行还原的氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯进行的脒基化，或用乙酸酐进行的酰化。
所述孔和解旋酶可以使用本领域已知的标准方法制备。编码孔或解旋酶的多核苷酸序列可以使用本领域标准方法获得并复制。编码孔或解旋酶的多核苷酸序列可以在细菌宿主细胞中使用本领域标准技术进行表达。所述孔和/或解旋酶可以在细胞中通过重组表达载体的多肽的原位表达进行制备。所述表达载体可选的携带有诱导型启动子以控制所述多肽的表达。这些方法在Sambrook,J.和Russell,D.(2001).Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY中描述。
所述孔和/或解旋酶可以从制备蛋白质的生物体或在重组表达后，通过任何蛋白质液相色谱系统进行纯化，而大规模制备。通常的蛋白质液相色谱系统包括FPLC,AKTA系统，Bio-Cad系统,Bio-Rad生物系统和Gilson HPLC系统。
本发明的方法涉及测定目标多核苷酸的一个或多个特征。所述方法可包括测定目标多核苷酸的两个，三个，四个或五个或更多个特征。所述一个或多个特征优选选自(i)目标多核苷酸的长度，(ii)目标多核苷酸的相似性，(iii)目标多核苷酸的序列，(iv)目标多核苷酸的二级结构和(v)目标多核苷酸是否是经修饰的。(i)到(v)的任何组合均可以根据本发明进行测定。
对于(i)，目标多核苷酸的长度可以利用目标多核苷酸与所述孔之间的多次相互作用进行测定。
对于(ii),目标多核苷酸的相似性可以通过多种方式进行测定。目标多核苷酸的相似性可以联合目标多核苷酸的序列测定或不联合目标多核苷酸的序列测定而进行测定。前者是直接的；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行鉴定。后者可以多种方式完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在(不需要测定多核苷酸的其余序列)。替换的，在所述方法中特定电和/或光信号的测定可以鉴定特定来源的目标多核苷酸。
对于(iii),目标多核苷酸的序列可以如上所述进行测定。适合的测序方法，尤其是这些使用电测量的方法，在Stoddart D等人,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR等人,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO 2000/28312中有描述。
对于(iv)，二级结构可以多种方式测定。例如，如果所述方法涉及电测量，则二级结构可以使用穿过孔的停留时间变化或电流变化进行测定。这使得单链和双链多核苷酸区域能够得到识别。
对于(v)，可以测定任何修饰的存在或不存在。所述方法优选包括确定所述目标多核苷酸是否通过甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物，标签或间隔物进行了修饰。特定的修饰将导致特定的与孔的相互作用，其可使用下面所述的方法测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中穿过孔的电流，识别胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。
可以进行多种不同类型的测量。所述测量包括但不局限于，电测量和光学测量。可行的电测量包括：电流测量，阻抗测量，隧道测量(tunnelling measurement)(Ivanov AP等人,Nano Lett.2011 Jan 12；11(1):279-85),和FET测量(国际申请WO 2005/124888)。光学测量可与电测量组合使用(Soni GV等人,Rev Sci Instrum.2010 Jan；81(1):014301)。所述测量可以是跨膜电流测量诸如对流过孔的离子电流的测量。
电测量可以使用标准单通道记录设备进行，如Stoddart D等人,Proc Natl AcadSci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR等人,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO-2000/28312中描述的。替换的，电测量可以通过使用多通道系统进行，例如国际申请WO-2009/077734和国际申请WO-2011/067559中所描述的。
在一个优选的实施方式中，所述方法包括:
(a)将目标多核苷酸与跨膜孔和RecD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及
(b)随着所述多核苷酸相对所述孔移动，测量穿过所述孔的电流，其中所述电流代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
所述方法可以使用任何适于研究膜/孔系统(其中孔嵌入膜中)的设备进行实施，所述方法可以使用任何适于感测跨膜孔的设备进行实施。例如，所述设备包括一个室，所述室包括水溶液和将该室分割为两部分的屏障(barrier)。所述屏障具有孔穴，其中所述的含有孔的膜形成其中。
所述方法可以使用国际申请No.PCT/GB08/000562(WO 2008/102120)中描述的设备进行实施。
所述方法可以包括随着所述多核苷酸相对于所述孔移动而测量穿过所述孔的电流。因此所述设备还可以包括一个能对膜和孔施加电势和测量电信号的电路。所述方法可以使用膜片钳或电压钳进行实施。所述方法优选使用电压钳。
本发明的所述方法可包括随着所述多核苷酸相对于所述孔移动而测量穿过所述孔的电流。合适的用于测量穿过跨膜蛋白孔的离子电流的条件是本领域已知的并在实施例中公开。所述方法通常通过对膜和孔施加电压进行实施。使用的电压通常为+2V到-2V,通常为-400mV到+400mV。使用的电压优选在具有以下下限和上限的范围内，所述下限选自-400mV,-300mV,-200mV,-150mV,-100mV,-50mV,-20mV和0mV并且所述上限独立地选自+10mV,+20mV,+50mV,+100mV,+150mV,+200mV,+300mV和+400mV。使用的电压更优选在100mV到240mV的范围并最优选在120mV到220mV的范围。可通过对孔施加提高的电势来提高对不同核苷酸的分辨力。
所述方法通常在任何载荷子诸如金属盐(如碱金属盐)，卤盐(如氯化物盐(如碱金属氯化物盐))的存在下实施。载荷子可包括离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵，三甲基苯基氯化铵,苯基三甲基氯化铵，或1-乙基-3-甲基咪唑鎓氯。在上面论述的示例性设备中，所述盐存在于所述室的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl),氯化钠(NaCl)或氯化铯(CsCl)。优选使用KCl。所述盐浓度可以是饱和的。所述盐浓度可以是3M或更低并且通常为0.1-2.5M,0.3-1.9M,0.5-1.8M,0.7-1.7M,0.9-1.6M或1M-1.4M。所述盐浓度优选为150mM-1M。如上所述，RecD解旋酶出乎意料的能在高的盐浓度下工作。所述方法优选使用至少0.3M,诸如至少0.4M,至少0.5M,至少0.6M,至少0.8M,至少1.0M,至少1.5M,至少2.0M,至少2.5M或至少3.0M的盐浓度进行实施。高的盐浓度能提供高的信噪比并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。
所述方法通常在缓冲剂的存在下实施。在上文所述的示例性设备中，所述缓冲剂存在于所述室的水溶液中。任何缓冲剂均可以在本发明方法中使用。通常，所述缓冲剂为HEPES。另一个适合的缓冲剂为Tris-HCl缓冲剂。所述方法通常在4.0-12.0,4.5-10.0,5.0-9.0,5.5-8.8,6.0-8.7或7.0-8.8或7.5-8.5的pH下进行实施。所述pH优选约为7.5。
所述方法可在0℃-100℃,15℃-95℃,16℃-90℃,17℃-85℃,18℃-80℃,19℃-70℃,或20℃-60℃下实施。所述方法通常在室温下实施。所述方法可选地在能支持酶功能的温度下诸如约37℃进行。
所述方法通常在游离的核苷酸或游离的核苷酸类似物以及促进解旋酶功能发挥的酶的辅因子存在下实施。所述游离的核苷酸可以是上述所有单个多核苷酸中的一个或多个。所述游离的核苷酸包括但不局限于,腺苷单磷酸(AMP),腺苷二磷酸(ADP),腺苷三磷酸(ATP),鸟苷单磷酸(GMP),鸟苷二磷酸(GDP),鸟苷三磷酸(GTP),胸苷单磷酸(TMP),胸苷二磷酸(TDP),胸苷三磷酸(TTP),尿苷单磷酸(UMP),尿苷二磷酸(UDP),尿苷三磷酸(UTP),胞苷单磷酸(CMP),胞苷二磷酸(CDP),胞苷三磷酸(CTP),环状腺苷单磷酸(cAMP),环状鸟苷单磷酸(cGMP),脱氧腺苷单磷酸(dAMP),脱氧腺苷二磷酸(dADP),脱氧腺苷三磷酸(dATP),脱氧鸟苷单磷酸(dGMP),脱氧鸟苷二磷酸(dGDP),脱氧鸟苷三磷酸(dGTP),脱氧胸苷单磷酸(dTMP),脱氧胸苷二磷酸(dTDP),脱氧胸苷三磷酸(dTTP),脱氧尿苷单磷酸(dUMP),脱氧尿苷二磷酸(dUDP),脱氧尿苷三磷酸(dUTP),脱氧胞苷单磷酸(dCMP),脱氧胞苷二磷酸(dCDP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。所述游离核苷酸优选选自AMP,TMP,GMP,CMP,UMP,dAMP,dTMP,dGMP或dCMP。所述游离核苷酸优选为腺苷三磷酸(ATP)。所述酶的辅因子为使解旋酶发挥功能的因子。所述酶的辅因子优选为二价金属阳离子。所述二价金属阳离子优选为Mg2+,Mn2+,Ca2+或Co2+。所述酶的辅因子最优选为Mg2+。
所述目标多核苷酸可以与RecD解旋酶和孔以任何顺序接触。优选的，当所述目标多核苷酸与RecD解旋酶和孔接触时，所述目标多核苷酸先与所述解旋酶形成复合体。然后，当对所述孔施加电压时，所述目标多核苷酸/解旋酶复合体与所述孔形成复合体并控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。
如上所述，RecD解旋酶可以相对于孔以两种模式工作。首先，所述方法优选使用RecD解旋酶进行实施，使所述RecD解旋酶在由施加的电压产生的电场下移动目标序列穿过所述孔。在这种模式中，DNA的5’端首先被所述孔捕获，然后所述酶移动所述DNA进入所述孔，使得目标序列在电场的作用下穿过所述孔直到其最终移动到所述双分子层的反侧。替换的，所述方法优选以如下方式进行实施：使得所述酶逆着由施加的电压产生的电场的方向移动所述目标序列穿过所述孔。在这种模式下，DNA的3’端首先被所述孔捕获，然后所述酶移动所述DNA穿过所述孔，使得目标序列朝相反于施加的电场的方向从所述孔中被拉出直到其完全退回到所述双分子层的顺侧。
本发明的方法最优选涉及源自MspA的孔和解旋酶，所述解旋酶包括SEQ ID NO:61所示的序列或其变体。上述关于MspA和SEQ ID NO:61的任何实施方式可以组合使用。
其他方法
本发明还提供形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法。所述方法包括在孔和RecD解旋酶之间形成复合体。所述复合体可以通过将孔和解旋酶在目标多核苷酸的存在下相接触，然后对所述孔施加电势而形成。所施加的电势可以如上所述是化学电势或电压电势。替换的，所述复合体可以通过孔共价连接到所述解旋酶而形成。共价连接的方法是本领域已知的并例如，在国际申请号PCT/GB09/001679(公布号WO 2010/004265)和PCT/GB10/000133(公布号WO 2010/086603)中有公开。所述复合体是用于表征目标多核苷酸的传感器。所述方法优选包括在源自Msp的孔与RecD解旋酶之间形成复合体。上面论述的关于本发明方法的任一实施方式同样适用于该方法。
试剂盒
本发明还提供了用于表征目标多核苷酸的试剂盒。所述试剂盒包括(a)孔和(b)RecD解旋酶。上面针对本发明方法论述的任一实施方式同样适用于该试剂盒。
所述试剂盒可进一步包括膜的组分，例如形成两性分子层诸如脂质双分子层所需要的磷脂质。
本发明的试剂盒可以进一步包括一种或多种其他试剂或能使上面描述的任何一种实施方案实施的仪器。所述试剂或仪器包括以下的一种或多种：合适的缓冲剂(水溶液),用于从受体获得样本的工具(诸如导管或含有针的仪器),用于扩增和/或表达多核苷酸的工具,如上所定义的膜或者电压钳或膜片钳设备。存在于所述试剂盒中的试剂可以是干态的，使得液体样本使该试剂重悬。所述试剂盒还，可选的，包括使该试剂盒能在本发明方法中使用的仪器或关于该方法可以用于哪种病人的说明书。所述试剂盒，可选的，包括核苷酸。
设备
本发明还提供了用于表征目标多核苷酸的设备。所述设备包括多个孔和多个RecD解旋酶。所述设备优选进一步包括用于实施本发明方法的说明书。所述设备可以是任何用于多核苷酸分析的常规设备，诸如阵列(array)或芯片。上面论述的关于本发明方法的任一实施方式可以同样适用于本发明的所述设备。
所述设备优选用于实施本发明的方法。
所述设备优选包括:
传感器设备，能支撑所述膜和多个孔，并能可操作的使用所述孔和解旋酶进行多核苷酸的表征；
至少一个存储器，存储用于进行表征的材料；
流体系统，配置为从至少一个存储器可控地向所述传感器设备提供材料；以及
多个容器，用于接收各样本，所述流体系统被配置为选择性地从所述容器向所述传感器设备提供样本。所述设备可以是那些在国际申请No.PCT/GB08/004127(公布号WO2009/077734),PCT/GB10/000789(公布号WO 2010/122293),国际申请No.PCT/GB10/002206(尚未公布)或国际申请No.PCT/US99/25679(公布号WO 00/28312)中描述的任一设备。
没有孔的表征
在一些实施方式中，所述目标多核苷酸使用RecD解旋酶进行表征诸如部分或全部测序，但不使用孔。特别的，本发明还提供了一种表征目标核苷酸的方法，包括将所述目标多核苷酸与RecD解旋酶接触使得所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动。在该方法中，所述目标多核苷酸优选不与孔接触，诸如跨膜孔。所述方法涉及随着RecD解旋酶控制所述多核苷酸移动获取一个或多个测量值并由此表征所述目标多核苷酸。所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征。任何所述测量值可以根据本发明获取。它们包括但不局限于：电学测量值和光学测量值。这些已经在上面详细描述。上述任何关于本发明的基于孔的方法的实施方式均可以在缺少孔的方法中使用。例如，上述的任何RecD解旋酶都可以使用。
本发明还提供了一种包括RecD解旋酶的分析设备。本发明还提供了一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)用于表征目标多核苷酸的分析设备和(b)RecD解旋酶。这些设备和试剂盒优选不包括孔，诸如跨膜孔。适合的设备如上所述。
以下的实例描述本发明。
实施例1
本实施例举例说明使用TraI解旋酶(TraI Eco；SEQ ID NO:61)控制整个DNA链穿过纳米孔的运动。总的方法和在该实施例中使用的物质如图1所示并在图片注解中有描述。
材料和方法
设计能扩增PhiX174的～400bp片段的引物。这些引物的每个5’端包括一50个核苷酸的非互补区域(non-complimentary region),可以是10个核苷酸同源聚合物部分的延伸或重复单元。其用作链穿过纳米孔的受控移位的标识物(identifier)，以及确定移位的方向。另外，正向引物的5’端为“加帽的”以包括四个2'-O-甲基-尿嘧啶(mU)核苷酸，并且所述反向引物的5’端为化学磷酸化的。这些引物的修饰使得可以使用λ核酸外切酶主要仅对反义链进行受控酶解。在反义链5’的PO4促进该酶解时，所述mU加帽可以保护正义链不被核酸酶酶解。因此，在与λ核酸外切酶共孵育后，仅双链的正义链保持完整，现成为单链DNA(ssDNA)。产生的ssDNA然后进行如上所述的PAGE纯化。
使用在本文中的所有实验中的DNA底物的设计如图1B所示。所述DNA底物由来自PhiX的ssDNA的一400个碱基部分组成，具有50T的5’-前导区以帮助通过纳米孔进行的捕获(SEQ ID NO:172)。在50T的前导区之后，含有3’的胆固醇标签的引物(SEQ ID NO:173)退火到该链以使DNA富集在所述双分子层的表面，并由此提高捕获效率。朝着所述链的3’端使用另一个引物(SEQ ID NO:174)以帮助所述链通过3’端的捕获。
缓冲液:400mM NaCl,10mM Hepes,pH8.0,1mM ATP,1mM MgCl2,1mM DTT
纳米孔:大肠杆菌(E.coli)MS(B2)8 MspA ONLP3476MS-(L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K)8
酶:TraI Eco(SEQ ID NO:61；ONLP3572,～4.3μM)23.3μl->最终的100nM。
由嵌入1,2-二植烷酰-甘油-3-胆碱磷酸脂质(Avanti Polar Lipids)双分子层的MspA纳米孔获得电测量值。通过Montal-Mueller技术，跨20μm厚的PTFE膜(在传统的Delrin室中)上的～100μm直径孔穴形成双分子层，分成两个1mL的缓冲溶液。所有实验在所述缓冲液中进行。使用装配有1440A的数字转换器的Axopatch 200B放大器(分子装置)测定单通道电流。将Ag/AgCl电极连接到所述缓冲液中使得顺侧隔间(其中添加有纳米孔和酶/DNA)连接到Axopatch探头的接地端(the ground of the Axopatch headstage)，并且反式隔间连接到所述探头的活性电极。在所述双分子层中实现单孔之后，将DNA多核苷酸和解旋酶添加到50μL缓冲液中预孵育5分钟(DNA＝12.0nM,酶＝2μM)。将所述预孵育混合物添加到电生理学室的顺侧隔间的950μL缓冲液中以引发解旋酶-DNA复合体在所述MspA纳米孔中被捕获(最终浓度：DNA＝0.6nM,酶＝0.1μM)。根据需要通过向所述顺侧隔间添加二价金属(1mMMgCl2)和NTP(1mM ATP)激活解旋酶ATP酶活性。实验在+140mV的恒定电势下实施。
结果和论述
如图1所示添加解旋酶-DNA底物到MspA纳米孔，产生了如图2和3所示的特征电流模块。没有解旋酶连接的DNA短暂地与所述纳米孔相互作用产生短期的电流模块(<<1秒)。有解旋酶连接并活动(即在ATP酶作用下沿着DNA链移动)的DNA产生电流逐步变化的长特征模块水平，如图2和3所示。纳米孔中的不同DNA模序产生独特的电流模块水平。
对于给定的底物，我们观察了反映DNA序列的电流转变的特征图(图3中的实例)。
在图1显示的实施例中，随着DNA被解旋酶沿着DNA链在随机位点捕获，DNA链的测序从随机的起始点开始。
盐的耐受性
这种类型的纳米孔链测序实验通常需要离子盐。所述离子盐对于产生导电溶液是必须的，所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和移动DNA，并且是测定DNA穿过所述纳米孔时产生的序列依赖性电流变化所必须的。因为测量信号依赖于离子的浓度，因此使用高浓度的离子盐以提高获得的信号的强度是有利的。对于纳米孔测序，超过100mM KCl的盐浓度是理想的，并且400mM KCl或更大的盐浓度是优选的。
然而，很多酶(包括一些解旋酶和DNA马达蛋白)不能耐受高的盐条件。在高的盐条件下，所述酶打开(unfold)或失去结构完整性，或不能正常工作。已知的研究解旋酶的现有文献显示几乎所有的解旋酶不能在高于大约100mM的KCl/NaCl的盐浓度下工作，并且没有报道表明，解旋酶能在400mM KCl以上条件下显示合适的活性。即使来自耐盐物种的相似酶的潜在耐盐变体存在，它们仍很难在标准的表达系统(即大肠杆菌(E.coli))中表达和纯化。
我们出乎意料的发现，在实施例中TraI显示的对盐的耐受性达到非常高的盐水平。我们发现所述酶在400mM KCl到1M KCl的盐浓度下能保持功能，无论是在荧光实验中，还是在纳米孔实验中。
正向和反向操作模式
大多数解旋酶以单向的方式沿着单链多核苷酸底物移动，为每次NTP酶的转运移动特定数目的碱基。可以不同的方式利用解旋酶运动，以受控方式供应DNA穿过所述纳米孔。图1显示了两种基本的“正向”和“反向”操作模式。在正向模式中，以相同于在施加电场的力的作用下DNA移动的方向，通过解旋酶向所述孔中供应DNA。所述方向用反向箭头显示。对于TraI，其是一种5’-3’解旋酶，这需要将DNA的5’端捕获进纳米孔直到解旋酶与所述纳米孔的顶部接触，然后在施加的电势产生的电场下，在解旋酶控制下向所述纳米孔供应所述DNA，即从顺侧向反侧移动。所述反向模式需要捕获DNA的3’端，然后所述解旋酶逆着施加电势产生的电场方向将所述螺旋状DNA从所述纳米孔牵拉出，即从反侧向顺侧移动。图1显示了使用TraI Eco的两种操纵模式。
实施例2
该实施例使用荧光分析检测酶活性来阐述RecD解旋酶的盐耐受性。
使用常规的荧光底物检测解旋酶的置换杂交的双链DNA的能力(图4A)，如图4A中的1)所示，所述荧光底物链(终浓度50nM)具有5’端ssDNA突出部分，以及一40个碱基的杂交的双链DNA部分。主链上部在3’端具有羧基荧光素碱基，并且所述杂交的互补链在5’端具有黑洞淬灭剂(BHQ-1)碱基。当杂交的来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭时，所述底物基本上是无荧光的。所述分析中还包括，与荧光底物的较短链互补的1μM的捕获链。如2)所示，在ATP(1mM)和MgCl2(10mM)存在下，添加到所述底物中的解旋酶(100nM)连接到所述荧光底物的5’端尾部，沿着所述主链移动，并置换所述互补链，如所示的。如3)所示，一旦具有BHQ-1的互补链被完全取代，则主链上的荧光素发荧光。如4)所示，过量的捕获链优先与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火和防止丢失荧光。
底物DNA:靠近3’端具有羧基荧光素的SEQ ID NO:175以及在5’端具有黑洞淬灭剂-1的SEQ ID NO:176
捕获DNA:SEQ ID NO:177。
图4B的照片显示了含有100mM到1M不同浓度的KCl的缓冲液(100mM Hepes pH8.0,1mM ATP,10mM MgCl2,50nM荧光底物DNA,1μM捕获DNA)中两个RecD解旋酶(RecD Nth和Dth,SEQ ID 28和35)的初始活性速率。所述解旋酶在1M下工作。
实施例3
在该实施例中，使用不同的TraI解旋酶，即TrwC Cba(SEQ ID NO:65)。所有实验在如之前实施例1所述相同实验条件下(孔＝MspA B2,DNA＝400mer SEQ ID NO:172,173和174,缓冲剂＝400mM KCl,10mM Hepes pH8.0,1mM dtt,1mM ATP,1mM MgCl2)进行实施。图5显示了两个典型的使用所述酶的解旋酶控制的DNA事件的实例。
实施例4
在该实施例中，研究了大量不同的TrwC解旋酶(TrwC(Atr)(SEQ ID NO:144),TrwC(Sal)(SEQ ID NO:140),TrwC(Ccr)(SEQ ID NO:136)和TrwC(Eco)(SEQ ID NO:74))控制DNA(SEQ ID NO:178,179(在3’端具有/iSp18//iSp18//iSp18//iSp18//iSp18//iSp18/TT/3CholTEG/)和180)穿过MspA纳米孔
(MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8，即8x具有G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQ ID NO:2)运动的能力。
材料和方法
缓冲液:625mM KCl,75mM K亚铁氰化物,25mM K铁氰化物,100mM Hepes at pH8.0for TrwC(Atr),TrwC(Eco)和TrwC(CcR),以及对于TrwC(Sal)的pH9.0。
酶:TrwC(Atr)(100nM)或TrwC(Sal)(100nM)或TrwC(Ccr)(100nM)或TrwC(Eco)(100nM)，所有终浓度为100nM。
如实施例1所述由嵌入1,2-二植烷酰-甘油-3-胆碱磷酸脂质(Avanti PolarLipids)双分子层的单个MspA纳米孔获得电测量值，除了使用铂电极代替Ag/AgCl电极。在所述双分子层中获得单个孔之后，向顺势隔间加入MgCl2(10mM)和dTTP(5mM,对于TrwC(Atr),TrwC(Ccr)和TrwC(Eco))或ATP(1mM，对于TrwC(Sal))，并在施加+120mV电势下进行受控实验5分钟。将DNA多核苷酸(SEQ ID NO:178与SEQ ID NO:179和SEQ IDNO:180杂交,0.1nM)添加到所述顺侧隔间，在施加+120mV电势下进行另一个受控实验5分钟。最终，适当的解旋酶(TrwC(Atr),TrwC(Sal),TrwC(Ccr)或TrwC(Eco)，添加的终浓度全部为100nM)添加到电生理学室的顺侧隔间，以开始解旋酶-DNA复合体在所述MspA纳米孔中的捕获。实验在+120mV的恒定电势下实施。
结果和论述
对每个所研究的解旋酶，观察解旋酶控制DNA的运动。实施例线条分别示于图6-9。
实施例5
在该实施例中，研究了大量不同的TrwC解旋酶(TrwC(Oma)(SEQ ID NO:106),TrwC(Afe)(SEQ ID NO:86),和TrwC(Mph)(SEQ ID NO:94))控制DNA(SEQ ID NO:172到174，对于TrwC(Oma),以及SEQ ID NO:181与SEQ ID NO:182杂交(3’端具有胆固醇标签)，对于TrwC(Afe)和TrwC(Mph))穿过MspA纳米孔
(MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8，即8x具有G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQ ID NO:2)运动的能力。
缓冲液:625mM KCl,75mM K亚铁氰化物,25mM K铁氰化物,100mM Hepes.pH8.0
酶:TrwC(Oma),TrwC(Afe),和TrwC(Mph)所有终浓度为100nM
如实施例1所述由嵌入1,2-二植烷酰-甘油-3-胆碱磷酸脂质(Avanti PolarLipids)双分子层的单个MspA纳米孔获得电测量值，除了使用铂电极代替Ag/AgCl电极。在所述双分子层获得单个孔之后，向顺势隔间加入MgCl2(10mM)，并在施加120mV电势下进行受控实验5分钟。向所述顺侧隔间添加0.15nM终浓度的DNA多核苷酸(SEQ ID NO:172到174(如实施例1所示)，对于TrwC(Oma),或SEQ ID NO:181与SEQ ID NO:182杂交，对于TrwC(Afe)和TrwC(Mph))以及100nM终浓度的适当的解旋酶(TrwC(Oma),TrwC(Afe),和TrwC(Mph)，并且在施加+120mV电势下进行另一个受控实验5分钟。最终，通过向电生理学室的顺侧隔间添加ATP(1mM)，以激活解旋酶的ATP酶活性。实验在+120mV的恒定电势下实施。
结果和讨论
对每个所研究的解旋酶，观察解旋酶控制DNA的运动。实例线条分别示于图10-12。
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Claims (36)

1.一种表征目标多核苷酸的方法，包括:
(a)将目标多核苷酸与跨膜孔和RecD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及
(b)随着所述多核苷酸相对所述孔移动获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸，
其中所述方法使用0.3M-0.4M的盐浓度进行实施；
其中所述跨膜孔选自溶血素,杀白细胞素,耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA),外膜孔蛋白F(OmpF),外膜孔蛋白G(OmpG),外膜磷酯酶A,奈瑟氏菌自转运脂蛋白(NalP)和WZA；并且
其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述一个或多个特征选自(i)所述目标多核苷酸的长度，(ii)所述目标多核苷酸的相似性，(iii)所述目标多核苷酸的序列,(iv)所述目标多核苷酸的二级结构以及(v)所述目标多核苷酸是否被修饰。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述目标多核苷酸经甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质，或用一个或多个标记物，标签或间隔物进行修饰。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行测量。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述电测量为电流测量，阻抗测量，隧道测量或场效应晶体管(FET)测量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：
(a)将目标多核苷酸与跨膜孔和RecD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；和
(b)随着所述多核苷酸相对所述孔移动测量穿过所述孔的电流，其中所述电流代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括随着所述多核苷酸移动穿过所述孔，获取一个或多个测量值。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括跨所述孔施加电压到以在所述孔和解旋酶之间形成复合体的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中至少所述多核苷酸的一部分为双链。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述跨膜蛋白由SEQ ID NO:2所示的8个相同亚基形成。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述跨膜蛋白为由SEQ ID NO:4所示的7个相同亚基形成的α-溶血素。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述RecD解旋酶包括：
-氨基酸模序X1-X2-X3-G-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:8)，其中X1为G,S或A，X2为任意氨基酸，X3为P,A,S或G,X4为T,A,V,S或C,X5为G或A,X6为K或R且X7为T或S。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述RecD解旋酶包括以下模序：
(a)GGPGTGKT(SEQ ID NO:19)和/或WAVTIHKSQG(SEQ ID NO:20)；
(b)GGPGTGKS(SEQ ID NO:22)和/或YALTVHRAQG(SEQ ID NO:23)；
(c)GGPGVGKT(SEQ ID NO:26)和/或YAISVHKSQG(SEQ ID NO:27)；
(d)GGPGTGKT(SEQ ID NO:19)和/或YCISVHKSQG SEQ ID NO:(29)；
(e)GGPGVGKT(SEQ ID NO:26)和/或YAATIHKSQG(SEQ ID NO:31)；
(f)GGPGCGKS(SEQ ID NO:33)和/或YAMTIHRSQG(SEQ ID NO:34)；
(g)GGPGTGKS(SEQ ID NO:22)和/或YAVSIHKSQG(SEQ ID NO:36)；
(h)GGPGVGKT(SEQ ID NO:26)和/或YATSVHKSQG(SEQ ID NO:38)；
(i)GGPGTGKT(SEQ ID NO:19)和/或YAVSVHKSQG(SEQ ID NO:40)；
(j)GGPGVGKT(SEQ ID NO:26)和/或YATSIHKSQG(SEQ ID NO:43)；或
(k)GGPGTGKS(SEQ ID NO:22)和/或YALTVHRGQG(SEQ ID NO:45)。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述RecD解旋酶为表4或5所示的解旋酶之一。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述RecD解旋酶包括SEQ ID NO:18,21,24,25,28,30,32,35,37,39,41,42和44中任一个所示的序列。
16.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述RecD解旋酶为TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶进一步包括：
-氨基酸模序H-(X1)2-X2-R-(X3)5-12-H-X4-H(SEQ ID NO:46到53),其中X1和X3为任意氨基酸并且X2和X4相互独立的选自除了D,E,K和R以外的任意氨基酸；或者
-氨基酸模序G-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-H-(X8)6-12-H-X9(SEQ ID NO:54到60),其中X1,X2,X3,X5,X6,X7和X9相互独立的选自除了D,E,K和R以外的任意氨基酸,X4为D或E且X8为任意氨基酸。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶包括以下的模序：
(a)GYAGVGKT(SEQ ID NO:62),YAITAHGAQG(SEQ ID NO:63)和HDTSRDQEPQLHTH(SEQ IDNO:64)；
(b)GIAGAGKS(SEQ ID NO:66),YALNVHMAQG(SEQ ID NO:67)和HDTNRNQEPNLHFH(SEQ IDNO:68)；
(c)GAAGAGKT(SEQ ID NO:70),YCITIHRSQG(SEQ ID NO:71)和HEDARTVDDIADPQLHTH(SEQ ID NO:72)；
(d)GFAGTGKS(SEQ ID NO:75),YATTVHSSQG(SEQ ID NO:76)和HETSRERDPQLHTH(SEQ IDNO:77)；
(e)GRAGAGKT(SEQ ID NO:79),YATTIHKSQG(SEQ ID NO:80)和GMVADWVYHDNPGNPHIH(SEQ ID NO:81)；
(f)GAAGTGKT(SEQ ID NO:83),YASTAHKSQG(SEQ ID NO:84)和HSTSRAQDPHLHSH(SEQ IDNO:85)；
(g)GHAGAGKT(SEQ ID NO:87),YAGTTHRNQG(SEQ ID NO:88)和HASSREQDPQIHSH(SEQ IDNO:89)；
(h)GLAGTGKT(SEQ ID NO:91),YAVTSHSSQG(SEQ ID NO:92)和HDTARPVNGYAAPQLHTH(SEQ ID NO:93)；
(i)GPAGAGKT(SEQ ID NO:95),YAITAHRAQG(SEQ ID NO:96)和HYDSRAGDPQLHTH(SEQ IDNO:97)；
(j)GWAGVGKT(SEQ ID NO:99),YAVTADHMQG(SEQ ID NO:100)和HLCGRLDPQIHNH(SEQ IDNO:101)；
(k)GVAGAGKT(SEQ ID NO:103),YALTIDSAQG(SEQ ID NO:104)和HMTSGDGSPHLHVH(SEQID NO:105)；
(l)GYAGTGKS(SEQ ID NO:107),YAATIHKAQG(SEQ ID NO:108)和GMIADLVNVHWDIGEDGKAKPHAH(SEQ ID NO:109)；
(m)GIAGAGKS(SEQ ID NO:66),YALNAHMAQG(SEQ ID NO:67)和HDTNRNQEPNLHFH(SEQ IDNO:111)；
(n)GVAGAGKS(SEQ ID NO:115),YALNAHMAQG(SEQ ID NO:67)和HDTNRNQEPNAHFH(SEQID NO:116)；
(o)GGAGVGKS(SEQ ID NO:118),YAINVHIAQG(SEQ ID NO:119)和HDVSRNNDPQLHVH(SEQID NO:120)；
(p)GIAGAGKS(SEQ ID NO:66),YALNMHMAQG(SEQ ID NO:122)和HDTSRALDPQGHIH(SEQID NO:123)；
(q)GVAGAGKS(SEQ ID NO:115),YALNAHMAQG(SEQ ID NO:67)和HDTSRALDPQGHIH(SEQID NO:123)；
(r)GRAGTGKT(SEQ ID NO:126),FASTAHGAQG(SEQ ID NO:127)和HEASRNLDPQLHSH(SEQID NO:128)；
(s)GYAGTGKT(SEQ ID NO:130),YAMTSHAAQG(SEQ ID NO:131)和HDISRDKDPQLHTH(SEQID NO:132)；
(t)GLAGTGKT(SEQ ID NO:91),YAQTVHASQG(SEQ ID NO:134)和HNTSRDLDPQTHTH(SEQID NO:135)；
(u)GFAGTAKT(SEQ ID NO:137),YVQTAFAAQG(SEQ ID NO:138)和HETSRAQDPQLHTH(SEQID NO:139)；
(v)GYAGTAKT(SEQ ID NO:141),YVDTAFAAQG(SEQ ID NO:142)和HGTSRAQDPQLHTH(SEQID NO:143)；
(w)GYAGTAKT(SEQ ID NO:141),YASTAFAAQG(SEQ ID NO:145)和HGTSRALDPQLHSH(SEQID NO:146)；
(x)GSAGSGKT(SEQ ID NO:148),YAVTSYSAQG(SEQ ID NO:149)和HDTARPVGGYAAPQLHTH(SEQ ID NO:150)；
(y)GEAGTGKT(SEQ ID NO:153),YAHTSYKEQG(SEQ ID NO:154)和HETNRENEPQLHNH(SEQID NO:155)；
(z)GYAGVAKT(SEQ ID NO:157),YVLTNYKVQG(SEQ ID NO:158)和QPSSR和PALHTH(SEQID NO:159)；
(aa)GSAGTGKT(SEQ ID NO:161),YSLTANRAQG(SEQ ID NO:162)和HSMSRAGDPEMHNH(SEQID NO:163)；
(bb)AGAGTGKT(SEQ ID NO:165),YAGTVYAAQG(SEQ ID NO:166)和HYTTREGDPNIHTH(SEQID NO:167)；或
(cc)APAGAGKT(SEQ ID NO:169),YAVTVHAAQG(SEQ ID NO:170)和HETSRAGDPHLHTH(SEQID NO:171)。
19.根据权利要求16-18任一项所述的方法，其中所述TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶为表6或7所示的解旋酶之一。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述TraI解旋酶或TraI亚族解旋酶包括SEQ IDNO:61,65,69,73,74,78,82,86,90,94,98,102,106,110,112,113,114,117,121,124,125,129,133,136,140,144,147,151,152,156,160,164和168中任一个所示的序列。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐为KCl。
22.一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在孔和RecD解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器，其中所述方法使用0.3M-0.4M的盐浓度进行实施，并且其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过(a)使所述孔和所述解旋酶在所述目标多核苷酸的存在下接触以及(a)跨所述孔施加电势而形成。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述电势是电压电势或化学电势。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述复合体通过将所述孔共价连接到所述解旋酶而形成。
26.RecD解旋酶在0.3M-0.4M的盐浓度下在控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用，其中所述孔选自溶血素，杀白细胞素，耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，外膜孔蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷酯酶A，奈瑟氏菌自转运脂蛋白(NalP)和WZA，并且其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
27.一种用于在0.3M-0.4M的盐浓度下表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)RecD解旋酶，其中所述孔选自溶血素，杀白细胞素，耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，外膜孔蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷酯酶A，奈瑟氏菌自转运脂蛋白(NalP)和WZA，所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括含有两亲分子层的芯片。
29.一种用于在0.3M-0.4M的盐浓度下表征样本中的目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个RecD解旋酶，所述多个孔选自溶血素,杀白细胞素,耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA),外膜孔蛋白F(OmpF),外膜孔蛋白G(OmpG),外膜磷酯酶A,奈瑟氏菌自转运脂蛋白(NalP)和WZA中的任意一个或多个，并且所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
30.根据权利要求29所述的分析装置，其中所述分析装置包括：
传感器设备，能支撑多个孔，并能可操作的使用所述孔和解旋酶进行多核苷酸的表征；
至少一个存储器，存储用于进行表征的材料；
流体系统，配置为从至少一个存储器可控地向所述传感器设备提供材料；以及
多个容器，用于接收各样本，所述流体系统被配置为选择性地从所述容器向所述传感器设备提供样本。
31.一种用于表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)将目标多核苷酸与RecD解旋酶接触使得所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动，以及
(b)随着所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸，
其中所述方法使用0.3M-0.4M的盐浓度进行实施，并且其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
32.根据权利要求31所述的方法，其中：
(a)所述一个或多个特征如权利要求2所定义；
(b)所述目标多核苷酸如权利要求3或9所定义；
(c)所述一个或多个特征如权利要求4或5所定义的进行测量；
(d)所述RecD为权利要求12-20任一项所定义；或者
(e)所述方法如权利要求21所定义的进行实施。
33.RecD解旋酶在0.3M-0.4M的盐浓度下在表征目标多核苷酸的过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用，其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
34.RecD解旋酶在0.3M-0.4M的盐浓度下在对目标多核苷酸的部分或全部进行测序的过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用，其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
35.一种用于在0.3M-0.4M的盐浓度下表征样本中的目标多核苷酸的分析装置，其特征在于所述分析装置包括RecD解旋酶，其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
36.一种用于在0.3M-0.4M的盐浓度下表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)用于表征目标多核苷酸的分析装置和(b)RecD解旋酶，其中所述RecD解旋酶包括氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQ ID NO:16)，其中X1为Y,W或F,X2为A,T,S,M,C或V,X3为任意氨基酸,X4为T,N或S,X5为A,T,G,S,V或I,X6为任意氨基酸且X7为G或S。
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