JP6614972B2 - 修飾ヘリカーゼ - Google Patents

修飾ヘリカーゼ

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Description

本発明は、ポリヌクレオチドからの解離が低減している修飾ヘリカーゼに関する。ヘリカーゼはポリヌクレオチドの移動を制御するために使用でき、ポリヌクレオチドを配列決定するために特に有用である。
迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌクレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍光化学物質を必要とするために、遅く高価である。
膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが近年注目されている。
電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサインおよび持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヘリカーゼなどのヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用を含み得る。
ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに結合し、移動を制御できる酵素である。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを含むいくつかのヘリカーゼは、少なくとも１つのコンホメーション状態で、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼに結合または解離できる開口部を有するポリヌクレオチド結合ドメインを有する。それにより、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの末端に位置していない場合でも、ヘリカーゼがポリヌクレオチドから離れることが可能になる。
本発明者らは、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力が、それを通ってポリヌクレオチドが解離する開口部のサイズを低減させることによって改善できることを驚くべきことに実証した。具体的にはポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、開口部を閉じることによって改善できる。本発明によれば、ヘリカーゼの少なくとも２つの部分を繋ぐことにより、開口部のサイズは低減され、または開口部は閉鎖される。
開口部のサイズの低減または開口部の閉鎖がヘリカーゼのポリヌクレオチドへの結合を妨げないことから、この結果は驚くべきものである。本発明により修飾されたヘリカーゼがポリヌクレオチドに結合すると、解離することも離されることもなく全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を制御できる。具体的には本発明者らは、本発明により修飾されたヘリカーゼが４００ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドなどの長いポリヌクレオチドに強く結合し、全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を制御することを驚くべきことに実証した。これは、ポリヌクレオチドの移動の有効な制御を、特に鎖配列決定法の際に可能にする。
本発明者らは、ポリヌクレオチドの移動を制御するＨｅｌ３０８ヘリカーゼの能力が特異的位置に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を導入することによって改善できることを驚くべきことに実証した。導入される残基が繋がれているかどうかに関わらず、修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、解離するまたは離されることなく全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を制御できる。
したがって本発明は、１つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているヘリカーゼを提供する。
本発明は、
− １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入されているＨｅｌ３０８ヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているＨｅｌ３０８ヘリカーゼ；
− 本発明のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物；
− ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法；
− 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む方法；
− 標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、（ａ）ポアと、（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間で複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む方法；
− （ａ）ポアと、（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー；
− ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物の使用；
− （ａ）ポア、および（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット；
− （ａ）複数のポア、および（ｂ）複数の本発明のヘリカーゼまたは複数の本発明の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置；
− 本発明のヘリカーゼを産生する方法であって、（ａ）１つまたは複数の単量体から形成され、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼを提供するステップ、および（ｂ）ヘリカーゼの同じ単量体上の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するようにヘリカーゼを修飾し、それにより本発明のヘリカーゼを産生するステップを含む方法；
− 本発明の修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを産生する方法であって、（ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを提供するステップ、ならびに（ｂ）１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入し、それにより本発明の修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを産生するステップを含む方法；ならびに
− 本発明の構築物を産生する方法であって、本発明のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着させ、それにより本発明の構築物を産生するステップを含む方法
も提供する。
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３反応混合物（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）のクーマシー染色７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液で添加された）を示す図である。レーンＸは適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示す。レーンａ〜ｃは、２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）単量体（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。レーンｄ〜ｆは２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、すなわち開口部が閉じられているヘリカーゼ）を含有し、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーを付着させる反応がほとんど１００％収率に進んだことはゲルから明らかであった。矢印１は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）単量体（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応し、矢印２はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、すなわち開口部が閉じられているヘリカーゼ）に対応する。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）反応混合物のクーマシー染色７．５％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルを示す図である。レーンＸは適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示す。レーンＡは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を基準として含有する。上のバンド（２と標識）はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３に対応し、下のバンド（１と標識）はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応する。レーンＢは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有し、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）（上のバンド）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）（下のバンド）に対するバンドが観察されることから、ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌリンカーに付着する反応が完了まで進まなかったことはゲルから明らかであった。レーンＣはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。 開口部が閉鎖されている２つのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０））の酵素前進性（processivity）をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）のものと比較するために使用した蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質がハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッセイするために用いられた。蛍光基質（最終５０ｎＭ）は３’ｓｓＤＮＡオーバーハングならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡ（セクションＡ、配列番号１１０、１と標識）の８０および３３塩基対セクションを有する。主要な下部「テンプレート」鎖は、５’および３’末端でそれぞれカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ、４と標識）およびブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、５と標識）塩基（配列番号１１２）で標識されている３’オーバーハングおよび３３ｎｔ蛍光プローブ（３と標識）に隣接して、８０ｎｔ「ブロッカー」鎖（配列番号１１１、２と標識）にハイブリダイズされる。ハイブリダイズされると、ＦＡＭはＢＨＱ−１から離れ、基質は基本的に蛍光を発する。セクションＢに示すとおり、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下でヘリカーゼ（６と標識、１０ｎＭ）は、基質の３’オーバーハング（配列番号１１０）に結合し、下鎖に沿って移動し８０ｎｔブロッカー鎖（配列番号１１１）を置換し始める。前進性の場合、ヘリカーゼは、蛍光プローブも置換する（セクションＣ、配列番号１１２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で３’末端で標識されている）。蛍光プローブは、その５’および３’末端が自己相補的であり、それにより一度置換されると動力学的に安定なヘアピンを形成しプローブのテンプレート鎖（セクションＤ）への再アニールを防ぐように設計される。ヘアピン産物の形成により、ＦＡＭはＢＨＱ−１の近傍に運ばれ、その蛍光は消光される。８０塩基長「ブロッカー」（配列番号１１１）および蛍光（配列番号１１２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）鎖を置換できる前進性酵素は、したがって、蛍光の経時的な減少をもたらす。しかし酵素が８０ｎｔ未満の前進性を有する場合は、蛍光鎖（配列番号１１２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）を置換することができず、したがって「ブロッカー」鎖（配列番号１１１）は主要な下部鎖に再アニールする（セクションＥ）。 制御目的にも用いられた追加的な通例の蛍光基質を示す図である。陰性対照として使用された基質は、図３に記載のものと同一であったが、３’オーバーハングを欠失している（セクションＡ（配列番号１１１（図中２と標識）、１１２（図中３と標識の鎖、その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ、図中４と標識）で、その３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、図中５と標識）で標識されている）ならびに図中７と標識の１１３））。図３に記載のものに類似しているが８０塩基対セクション（配列番号１１２（図中３と標識の鎖、その５’末端をカルボキシフルオレセイン（図中４と標識のＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、図中５と標識）で標識されている）ならびに図中８と標識の１１４）を欠失している基質が活性だが前進性である必要はないヘリカーゼの陽性対照として用いられた（セクションＢ）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を、緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１１０、１１１および１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）中の図３に示す前進性基質に対して検査した際の時間依存性蛍光変化のグラフ（ｙ軸標識＝正規化された蛍光（無作為値）、ｘ軸標識＝時間（分））である。黒菱形で印を付けたデータ点は緩衝液ブランクに対応し、白四角データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応し、黒十字データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応し、および白丸データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応する。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）によって示された蛍光の減少は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）と比較したこれらの複合体の前進性の増大を記す。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を、緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）および１１４））中の陽性対照前進性基質（図４セクションＢに示す、配列番号１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）および６０）に対して検査した際の時間依存性蛍光変化のグラフ（ｙ軸標識＝正規化された蛍光（無作為値）、ｘ軸標識＝時間（分））である。黒菱形で印を付けたデータ点は緩衝液ブランクに対応し、白四角データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応し、黒十字データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応し、および白丸データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応する。この陽性対照は、全ての試料に対する蛍光減少によって示されたとおり、全ての複合体が実際に活性であることを実証した。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの酵素制御移行の模式図であって、酵素は印加された場の力とは反対にポリヌクレオチドの移動を制御する。模式図は、３’から５’酵素（Ａと標識）の例を示し、ポア中の５’末端でのポリヌクレオチドの捕捉は、印加された場の力とは反対のポリヌクレオチドの酵素制御移動（実施例４において使用されるポリヌクレオチド配列は配列番号１１５（図７においてＢと標識）、配列番号１１６（図７においてＣと標識）および配列番号１１７（図７においてＤと標識）である）を導く。ＤＮＡ捕捉の際にハイブリダイズされた鎖は開かれる。矢印１はナノポアを通るＤＮＡ移動の方向を記し、白矢印２はＤＮＡに沿った酵素移動の方向を記し、矢印３は印加された場の方向を記す。酵素がＤＮＡから解離しない限り膜のｃｉｓ側に最終的に放されるまで酵素は、ポアの外側にＤＮＡを引く。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの酵素制御移行の模式図であって、酵素は印加された場の力と同じ方向にポリヌクレオチドの移動を制御する。模式図は、３’から５’酵素（Ａと標識）の例を示し、ポア中の３’末端でのポリヌクレオチドの捕捉は、印加された場の力でのポリヌクレオチドの酵素制御移動を導く。矢印１はナノポアを通るＤＮＡ移動の方向を記し、白矢印２はＤＮＡに沿った酵素移動の方向を記し、矢印３は印加された場の方向を記す。酵素がＤＮＡから解離しない限り、膜のｔｒａｎｓ側に最終的に放されるまで酵素はポアを通してＤＮＡを供給する。 実施例４において使用されるＤＮＡ基質設計を示す図である。９００塩基長センス鎖（配列番号１１５）はＡと標識され、４塩基対少ないリーダー（配列番号１１６）であるアンチセンス鎖はＢと標識され、プライマー（配列番号１１７）はＣと標識される。プライマーはＤと標識される３’コレステロールタグを有する。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（２００ｎＭ、配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例を示す図である（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．１ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）。最も上の電気トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））は、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（２０〜５０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、１つ（Ｈ）だけが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポア（＊と標識）を通して移動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わっている。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）での完全な実行において、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約３０％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝１９ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例を示す図である（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．０５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）。最も上の電気トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））は、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１１５ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜４０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、どれもが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポア（＊と標識）を通して移動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、場と反対（５’が下）のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約８５％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝２７ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例を示す図である（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．０５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）。最も上の電気トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））は、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜４０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｄと印を付けた一連の４個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場に沿って（ＤＮＡは３’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図８を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。３’が下のＤＮＡは、配列関係に対して異なる電流および異なる変動を伴って５’が下のＤＮＡとは特徴的に異なるサインを示す。このセクションにおける４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、どれもが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポア（＊と標識）を通して移動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、場に沿った（３’が下）のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約８７％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝１５ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例（上および下のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である（＋１２０ｍＶ、（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０、０．５ｎＭ ＤＮＡ（配列番号１２７、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに、その最後が配列番号１２８の５’末端に付着している）１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）。最も上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約４００ｐＡ）がＤＮＡレベル（２５０〜２２０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースの領域を拡大したものである。 ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌ（ビスマレイミドポリエチレングリコールリンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）反応混合物のクーマシー染色７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルを示す図である。ゲルの右のレーン（Ｍと標識）は適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの右に示されている）を示す。レーン１は５μＬの約１０μＭ ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｄ６５７Ｃ／Ｒ３３９Ｃ単独（変異Ｄ６５７Ｃ／Ｒ３３９Ｃを有する配列番号１２６）を基準として含有する。レーン２は５μＬの約１０μＭＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）を含有する。レーン２に示されるとおり、上のバンドは二量体酵素分子種に対応し（Ａと標識）、中央のバンドは閉じた複合体（Ｂと標識）ＴｒａＩ−Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）に対応する。未修飾出発材料（Ｃと標識）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ（変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）に対するバンドが観察されることから、ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌリンカーに付着する反応が進まなかったことはゲルから明らかであった。 ｄｓＤＮＡ分子の代謝回転率（分−１酵素−１）を検査するための蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質がヘリカーゼ（ａ）のハイブリダイズｄｓＤＮＡを置換する能力をアッセイするために使用された。１）蛍光基質鎖（５０ｎＭ最終、配列番号１５１および１５２）は、３’および５’の両方のｓｓＤＮＡオーバーハングを有する。上部鎖（ｂ）はカルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を５’末端近く（カルボキシフルオレセインは配列番号１５１中の位置６の修飾チミンに付着している）に有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）はブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を３’末端近く（ブラックホールクエンチャーは配列番号１５２中の位置８１の修飾チミンに付着される）に有する。ハイブリダイズされた場合、フルオレセインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は実質的に非蛍光性である。蛍光基質鎖の下部に部分的に相補的である捕捉鎖（ｆ、配列番号１５３）１μＭがアッセイに含まれる。２）ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたヘリカーゼ（１０ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖に沿って移動し、示されるとおり相補鎖（ｄ）を置換する。３）ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４）置換された下部鎖（ｄ）は過剰量の捕捉鎖（ｆ）に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。 多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（１と標識、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（２と標識、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（３と標識、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（４と標識、変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（５と標識、変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０））に関して、緩衝液（４００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１５１および１５２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号１５３））中でのｄｓＤＮＡ代謝回転（酵素−１分−１）を示すグラフである。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較した場合にｄｓＤＮＡ分子の代謝回転速度（分−１酵素−１）の増加を示した。 多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（１と標識、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（２と標識、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（６と標識、変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０））に関して、緩衝液（４００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ 蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１５１および１５２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号１５３））中でのｄｓＤＮＡ代謝回転（酵素−１分−１）を示す図である。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０）はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較した場合にｄｓＤＮＡ分子の代謝回転速度（分−１酵素−１）の増加を示した。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの酵素制御移行の模式図であって、酵素は印加された場の力とは反対にポリヌクレオチドの移動を制御する。模式図は、３’から５’酵素（Ａと標識）の例を示し、５’末端でのポア中のポリヌクレオチド（実施例９において使用するポリヌクレオチド配列は配列番号１５４（図１８においてＢと標識）、配列番号１５５（図１８においてＣと標識）および配列番１５６（図１８においてＤと標識）および、配列番号１１７（図１８においてＥと標識））の捕捉は、印加された場の力とは反対のポリヌクレオチドの酵素制御移動（印加された場の方向は矢印１により示される）を導く。ＤＮＡ捕捉の際にハイブリダイズされた鎖は、開かれる。矢印２はナノポアを通るＤＮＡ移動の方向を記し、矢印３はＤＮＡに沿った酵素移動の方向を記す。酵素がＤＮＡから解離しない限り、膜のｃｉｓ側に最終的に放されるまで酵素はポアの外側にＤＮＡを引く。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウム ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約２５０ｐＡ）がＤＮＡレベル（約５０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合のＤＮＡレベル（約３５ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースに示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものを示す。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合のＤＮＡレベル（約４０ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースに示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものを示す。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にＤＮＡレベル（約５０ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースに示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものを示す。 熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中４℃から５０℃、１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックにおいて４℃に冷却された）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合に多数のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（各移動は１〜３と番号付けられている）に関してＤＮＡレベル（約５０ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースで１と標識するヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものである。
配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。
配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、拡張Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０から５８は、表１におけるＨｅｌ３０８ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５９はＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。
配列番号６０から６２は伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。
配列番号６３はＲｅｃＤモチーフＩを示す。
配列番号６４は好ましいＲｅｃＤモチーフＩ、すなわちＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−Ｔを示す。
配列番号６５から６７は伸長されたＲｅｃＤモチーフＩを示す。
配列番号６８はＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。
配列番号６９はＲｅｃＤモチーフＶを示す。
配列番号７０から７７はＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。
配列番号７８から８４はＭｏｂＱモチーフＩＩＩを示す。
配列番号８５はＴｒａＩ Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
配列番号８６はＴｒａＩ ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。
配列番号８７はＴｒａＩ ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。
配列番号８８はＴｒａＩ ＥｃｏのＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。
配列番号８９はＸＰＤモチーフＶを示す。
配列番号９０はＸＰＤモチーフＶＩを示す。
配列番号９１はＸＰＤ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
配列番号９２はＸＰＤ ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶを示す。
配列番号９３はＸＰＤ ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶＩを示す。
配列番号９４は好ましいＨｈＨドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号９５はｇｐ３２遺伝子によってコードされる、バクテリオファージＲＢ６９由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号９６はｇｐ２．５遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ７由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号９７はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列を示す。
配列番号９８はＰＣＮＡのサブユニット１のアミノ酸配列を示す。
配列番号９９はＰＣＮＡのサブユニット２のアミノ酸配列を示す。
配列番号１００はＰＣＮＡのサブユニット３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０１はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０２はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列（１から３１９）を示す。
配列番号１０３はバクテリオファージＲＢ６９由来ｓｓｂのアミノ酸配列、すなわちＣ末端が欠失している（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）配列番号９５を示す。
配列番号１０４はバクテリオファージＴ７（ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）由来のｓｓｂのアミノ酸配列（１から２１０）を示す。全長タンパク質は配列番号９６において示されている。
配列番号１０５はＨｅｌ３０８Ｈｌａの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０６はＨｅｌ３０８Ｈｖｏの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０７は（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０８は（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０９は開口部が閉じられているヘリカーゼを形成するために使用されるペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１０から１１７は実施例において用いられるポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１８はヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１９はＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ由来ｐ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２０は大腸菌（E. coli）由来野生型ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２１は、ｇｐ３２遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ４由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２２はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＡｌａのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２３はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＮＧＧＮのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２４はＥｃｏＳＳＢ−Ｑ１５２ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２５はＥｃｏＳＳＢ−Ｇ１１７ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２６はＴｒｗＣ Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２７は実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列の一部を示す。この配列の３’末端に付着しているのは４つのｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後は配列番号１２８の５’末端に付着している。
配列番号１２８は実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列の一部を示す。この配列の５’末端に付着しているのは４つのｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後は配列番号１２７の３’末端に付着している。
配列番号１２９はトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３０はトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のドメインＨ−Ｌのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３１から１３９は表３に示すＴｒａＩ配列のいくつかを示す。
配列番号１４０は変異体Ｓ（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４１はＳｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus））のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４２はＳｓｏ１０ｂ１（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４３はＳｓｏ１０ｂ２（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４４はトリプトファンリプレッサー（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４５はラムダリプレッサー（腸内細菌（Enterobacteria）ファージラムダ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４６はＣｒｅｎ７（ヒストン・クレンアーキア（Histone crenarchaea）Ｃｒｅｎ７ Ｓｓｏ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４７はヒトヒストン（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４８はｄｓｂＡ（腸内細菌ファージＴ４）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４９はＲａｄ５１（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５０はＰＣＮＡスライディングクランプ（sliding clamp）（シトロミクロビウム・バチオマリヌム（Citromicrobium bathyomarinum)ＪＬ３５４）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５１は実施例７において使用される配列の１つを示す。この配列は、位置６に位置付けられた修飾チミンに付着しているカルボキシフルオレセインを有する。
配列番号１５２は実施例７において使用される配列の１つを示す。この配列は、位置８１に位置付けられた修飾チミンに付着しているブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）を有する。
配列番号１５３は実施例７において使用される配列の１つを示す。
配列番号１５４は実施例９において使用される配列の１つを示す。この配列は、その５’末端で４個のニトロインドールによって配列番号１５５の３’末端に付着されている。
配列番号１５５は実施例９において使用される配列の１つを示す。この配列は、４個のニトロインドールによってその３’末端で配列番号１５４の５’末端に付着されている。
配列番号１５６は実施例９において使用される配列の１つを示す。
発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。
付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって例えば、「ヘリカーゼ（a helicase）」を参照することは「ヘリカーゼ（helicases）」を含み、「開口部（an opening）」を参照することは２つ以上のそのような開口部を含み、「膜貫通タンパク質ポア（a transmembrane protein pore）」を参照することは２つ以上のそのようなポアを含む、など。
本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２つ以上の部分が繋がれた修飾ヘリカーゼ
本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために有用である修飾ヘリカーゼを提供する。修飾ヘリカーゼは、１つまたは複数の単量体を有する未修飾ヘリカーゼに基づく。換言するとヘリカーゼは単量体またはオリゴマー／多量体であってよい。これは下でより詳細に考察される。修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を少なくとも１つのコンホメーション状態で含むポリヌクレオチド結合ドメインを含む未修飾ヘリカーゼに基づく。本発明によりヘリカーゼは、ヘリカーゼの同じ単量体上の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾される。開口部のサイズの低減は、ポリヌクレオチドへの結合についてヘリカーゼを妨げない。例えばヘリカーゼは、その１つの末端でポリヌクレオチドに結合できる。開口部のサイズの低減は、ポリヌクレオチドがへリカーゼから、特にポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドから解離するまたは離される能力を減少させる。これは下でより詳細に考察され、修飾ヘリカーゼを長時間ポリヌクレオチドに結合したままにする。修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。修飾ヘリカーゼは、人工または非天然である。
ポリヌクレオチドに結合および解離するヘリカーゼの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。好適な結合／解離アッセイは、これだけに限らないが、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、蛍光偏光測定、熱量測定および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）など）を含む。ポリヌクレオチドから解離するヘリカーゼの能力は、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できる時間を測定することによって当然決定できる。これも当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、下に記載のものなどのナノポア系において典型的にはアッセイされる。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、実施例において記載のとおり決定できる。
本発明の修飾ヘリカーゼは、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用な手段である。ポリヌクレオチド、特に、５００ヌクレオチド以上のものを配列決定することにおいて生じる問題は、ポリヌクレオチドの移行を制御する分子モーターがポリヌクレオチドから離される場合があることである。これは、ポリヌクレオチドが印加された場の方向に急速かつ制御されない様式でポアを通って引かれるようにする。本発明の修飾ヘリカーゼは、配列決定されているポリヌクレオチドから解離または離されにくい。修飾ヘリカーゼは、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動をそれらが制御することからポリヌクレオチドの読み取り長さの増大を提供できる。本発明の修飾ヘリカーゼの制御下でポリヌクレオチド全体をナノポアを通して移動させる能力は、その配列などのポリヌクレオチドの特性を改善された確度でおよび公知の方法を超える速度で推定できるようにする。鎖長が長くなるにつれてこれはより重要になり、分子モーターは前進性の改善を必要とする。発明の修飾ヘリカーゼは、５００ヌクレオチド以上、例えば１０００ヌクレオチド、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００またはそれ以上の標的ポリヌクレオチドの移動を制御することにおいて特に有効である。
本発明の修飾ヘリカーゼは、等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための有用な手段でもある。そのような方法においては、２本鎖ＤＮＡの鎖は典型的には最初に本発明のヘリカーゼによって分離され、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−結合タンパク質によってコートされる。第二ステップでは、２個の配列特異的プライマーが、典型的にはＤＮＡ鋳型の各辺縁にハイブリダイズする。次いでＤＮＡポリメラーゼは鋳型にアニールしたプライマーを、２本鎖ＤＮＡを産生するように伸長するために使用でき、２個の新たに合成されたＤＮＡ産生物は、次いで本発明のヘリカーゼによって基質として使用され、次の回の反応に入ることができる。したがって鎖反応が同時に進行し、選択された標的配列の指数関数的増幅が生じる。
修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイできる。例えばヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに接触されてよく、ポリヌクレオチドの位置は、標準的方法を使用して決定され得る。ポリヌクレオチドの移動を制御する修飾ヘリカーゼの能力は、下に記載のものなどのナノポア系において、具体的には実施例において記載のとおり典型的にはアッセイされる。
本発明の修飾ヘリカーゼは、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。ヘリカーゼは、それが脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。ヘリカーゼは、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えばヘリカーゼは、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。
本発明における使用のためのヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合ドメインを含む。ポリヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドに結合できるヘリカーゼの部分である。ポリヌクレオチドは下に定義される。ポリヌクレオチドに結合するドメインの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。公知のヘリカーゼのポリヌクレオチド結合ドメインは、当技術分野において典型的には同定されている。ドメイン（結合ポリヌクレオチドを有するまたは有さない）は、タンパク質モデリング、結晶状態におけるタンパク質のＸ線回折測定（Rupp B (2009). Biomolecular Crystallography: Principles、Practice and Application to Structural Biology. New York: Garland Science.）、溶液におけるタンパク質の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（Mark Rance; Cavanagh、John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt III; Skelton、NNicholas J. (2007). Protein NMR spectroscopy: principles and practice (2nd ed.). Boston: Academic Press.）または凍結水和状態におけるタンパク質のクリオ電子顕微鏡（van Heel M、Gowen B、Matadeen R、Orlova EV、Finn R、Pape T、Cohen D、Stark H、Schmidt R、Schatz M、Patwardhan A (2000). ”Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.”. Q Rev Biophys. 33: 307-69を使用して同定できる。上に述べた方法によって決定されたタンパク質の構造情報は、タンパク質バンク（ＰＤＢ）データベースから公開で入手可能である。
タンパク質モデリングは、相同体においてタンパク質構造がタンパク質配列よりも保存されているという事実を活用する。それにより、タンパク質の原子分解モデルを作成することは、クエリー配列の構造に類似していると考えられる１つまたは複数のタンパク質構造の同定に依存する。タンパク質モデルを構築するための「鋳型」として使用するための好適なタンパク質構造が存在するかどうかを評価するために、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）データベースの検索を実施する。タンパク質構造は、クエリー配列と合理的なレベルの配列同一性を共有している場合に好適な鋳型であると考えられる。そのような鋳型が存在する場合、次いで鋳型配列はクエリー配列と「配列比較」される、すなわちクエリー配列中の残基が鋳型残基に位置付けられる。配列の配列比較および鋳型構造は、次いでクエリー配列の構造モデルを作成するために使用される。そのためタンパク質モデルの品質は、配列の配列比較および鋳型構造の品質に依存する。
ヘリカーゼなどのタンパク質は、常に運動している動的な構造である。タンパク質が動ける（explore）コンホメーション空間は、さまざまなコンホメーションがそれらのエネルギーに基づいて存在しており、相互変換の速度が状態間のエネルギー障壁に依存するエネルギー地形によって記載されている（Vinson、Science、2009: 324(5924): 197）。ヘリカーゼは、したがって、単独であるまたはポリヌクレオチドの移動を制御しているかに関わらずいくつかのコンホメーション状態で存在できる。少なくとも１つのコンホメーション状態において、本発明における使用のための未修飾ヘリカーゼのポリヌクレオチド結合ドメインは、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含む。開口部は、ヘリカーゼの全てのコンホメーション状態において存在できるが、しかし必ずではない。例えば全てのコンホメーション状態において、ポリヌクレオチド結合ドメインはそれを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含み得る。代替的に、ヘリカーゼの１つまたは複数のコンホメーション状態ではポリヌクレオチド結合ドメインは、開口部が小さすぎるためにそれを通ってポリヌクレオチド結合ドメインがヘリカーゼから解離できない開口部を含む場合がある。ヘリカーゼの１つまたは複数のコンホメーション状態ではポリヌクレオチド結合ドメインは、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含まない場合がある。
ポリヌクレオチド結合ドメインは、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドの１つまたは複数の内部ヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を好ましくは含む。内部ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中の末端ヌクレオチドではないヌクレオチドである。例えばそれは３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドではない。環状ポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドは内部ヌクレオチドである。本発明による１つまたは複数の内部ヌクレオチドからの解離を低減または妨げることは、ポリヌクレオチドの一方の末端に結合でき、全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を制御でき、次いで他方の末端からから解離できる修飾ヘリカーゼを生じ得ることから有利である。そのようなヘリカーゼは、鎖配列決定法のために特に有益である。
ヘリカーゼから解離する１つまたは複数の内部ヌクレオチドの能力は、競合アッセイを実行することによって決定できる。例えば対照ポリヌクレオチドＡから解離するヘリカーゼの能力は、末端ヌクレオチドに付着しているブロッキング基を含む同じポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）から解離する能力と比較される。ブロッキング基は、鎖Ｂの末端ヌクレオチドでのいかなる解離も妨げ、それによりヘリカーゼの内部解離だけを可能にする。代替的に、環状ポリヌクレオチドから解離するヘリカーゼの能力はアッセイできる。解離は上に記載のとおりアッセイできる。
開口部は、ポリヌクレオチド結合ドメインにおける溝、ポケットまたは陥凹であってよい。
それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部の存在は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。開口部の存在は、上により詳細に考察のとおり、ポリヌクレオチドから、具体的にはポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドから解離するヘリカーゼの能力を測定することによって決定できる。ポリヌクレオチドドメインにおける開口部は、上に考察したとおり、タンパク質モデリング、Ｘ線回折、ＮＭＲ分光法またはクリオ電子顕微鏡を使用して同定できる。
本発明によりヘリカーゼは、ヘリカーゼの同じ単量体上の２つ以上の部分を繋ぐことによって修飾される。ヘリカーゼがオリゴマーまたは多量体である場合、２つ以上の部分は異なる単量体上であることはできない。３つ、４つ、５つまたはそれ以上の部分などの任意の数の部分を繋ぐことができる。２つ以上の部分を繋ぐ好ましい方法は下により詳細に考察される。
２つ以上の部分は、本発明により繋がれた場合にそれらが開口部のサイズを低減させる限り単量体上のどこに位置付けられてもよい。２つ以上の部分は、ポリヌクレオチドドメインまたは開口部にあってよいが、必ずではない。例えば、２つ以上の部分の１つ、両方または全ては、ヘリカーゼの異なるドメインなどのポリヌクレオチド結合ドメインの外にあってもよい。２つ以上の部分の間の最大距離は、ヘリカーゼの外周である。
２つ以上の部分は、好ましくは空間的に近接している。２つ以上の部分は、４０オングストローム（Å）未満離れている、３０Å未満離れている、２５Å未満離れている、２０Å未満離れている、１０Å未満離れているまたは１０Å未満離れているなど好ましくは５０Å未満離れている。
２つ以上の部分の少なくとも１つは、好ましくは開口部の部分を形成する、開口部に隣接しているまたは開口部に近い。上に記載のとおり、開口部内のアミノ酸などの開口部の部分を同定することは容易である。部分は、それらが開口部の隣にあるが部分を形成しない場合に開口部に隣接している。例えば、開口部の部分を形成するアミノ酸の隣に位置するがそれ自体は開口部の部分を形成しないアミノ酸は、開口部に隣接している。本発明の内容では「隣にある」は、ヘリカーゼのアミノ酸配列において隣にあるまたはヘリカーゼの三次元構造において続く２つであることを意味する。部分は開口部の部分を形成するアミノ酸から１５Å未満、１０Å未満、５Å未満または２Å未満離れているなどの、開口部の部分を形成するアミノ酸から２０Å未満である場合に典型的には開口部に近い。部分は、ヘリカーゼのアミノ酸配列において開口部の部分を形成するアミノ酸の１、２、３、４または５アミノ酸以内である場合に典型的には開口部に近い。そのようなアミノ酸は、上に考察したとおり同定できる。
２つ以上の部分は、開口部の反対側にあってもよい。２つ以上の部分は、開口部の同じ側にあってもよい。本実施形態ではヘリカーゼの２つ以上の部分は繋がれて、開口部のサイズを低減するループ、蓋、狭窄またはフラップを形成してもよい。
２つ以上の部分は、単量体の表面上、すなわちヘリカーゼの表面上に好ましくはある。下により詳細に記載のとおり表面上の２つ以上の部分を繋ぐことは容易である。表面部分は、上に考察したとおりタンパク質モデリング、Ｘ線回折、ＮＭＲ分光法またはクリオ電子顕微鏡を使用して決定できる。
修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。ヘリカーゼのこの能力は、そのβ鎖およびαヘリックスによって典型的には提供されるその三次元構造により典型的には提供される。αヘリックスおよびβ鎖は、ループ領域により典型的には繋がれている。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力に影響を与えることを回避するために、２つ以上の部分は好ましくは単量体のループ領域である。具体定なヘリカーゼのループ領域は、上に考察したとおりタンパク質モデリング、Ｘ線回折、ＮＭＲ分光法またはクリオ電子顕微鏡などの当技術分野において公知の方法を使用して同定できる。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ（配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８）に関して、β鎖は２個のＲｅｃＡ様エンジン（RecA-like engine）ドメイン（ドメイン１および２）においてだけ見出すことができる。これらのドメインは、燃料ヌクレオチド（通常はＡＴＰ）の加水分解と移動との連関に関与する。ポリヌクレオチドに沿って徐々に動かすための重要なドメインは、ドメイン３および４であるが、中でもドメイン４である。興味深いことにドメイン３および４の両方はαヘリックスだけを含む。ドメイン４中にラチェットヘリックスと称される重要なαヘリックスがある。結果として本発明のＨｅｌ３０８実施形態では、２つ以上の部分は好ましくはいずれのαヘリックスの中にもない。
開口部のサイズは、ヘリカーゼからのポリヌクレオチドの解離を低減する限り、任意の程度に低減されてよい。これは上に考察したとおり決定できる。開口部のサイズを低減する方法は、下により詳細に考察される.
２つ以上の部分は、開口部を閉じるように好ましくは繋がれる。開口部が閉じられる場合は、ポリヌクレオチドは開口部を通ってヘリカーゼから解離できない。ヘリカーゼは、いかなるコンホメーション状態でも開口部を含まないようにより好ましくは修飾される。ヘリカーゼのいかなるコンホメーション状態においても開口部が存在しない場合、ポリヌクレオチドは開口部を通ってヘリカーゼから解離できない。ヘリカーゼは、ポリヌクレオチド周囲に共有結合的に閉じた構造を形成できるように最も好ましくは修飾される。共有結合的に閉じた構造が、例えばポリヌクレオチドの一方の末端でポリヌクレオチドに結合すると、それが他方の末端に達するまで解離することなくポリヌクレオチドの移動を制御できる。
接続
２つ以上の部分は、任意の方法で繋がれてよい。接続は一過的、例えば非供給的であってよい。一過的接続でさえ開口部のサイズを低減し、開口部を通るヘリカーゼからのポリヌクレオチドの解離を低減する。
２つ以上の部分は、親和性分子によって好ましくは繋がれる。好適な親和性分子は、当技術分野において公知である。親和性分子は、好ましくは、（ａ）相補的ポリヌクレオチド（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）、（ｂ）抗体またはその断片および相補的エピトープ（Biochemistry 6thEd、W.H. Freeman and co (2007) pp953-954）、（ｃ）ペプチドジッパー（O'Sheaら、Science 254 (5031): 539-544）、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる（Remaut and Waksman Trends Biochem. Sci. (2006) 31 436-444）、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン（Xiang Ma and He Tian Chem. Soc. Rev.、2010,39、70-80）、（ｇ）アプタマーおよび相補的タンパク質（James、W. in Encyclopedia of Analytical Chemistry、R.A. Meyers (Ed.) pp. 4848-4871 John Wiley & Sons Ltd、Chichester、2000）または（ｈ）ハーフキレーター（half-chelator）（Hammersteinら J Biol Chem. 2011 April 22; 286(16): 14324-14334）である。（ｅ）に関して水素結合は電気陰性原子に結合したプロトンと別の電気陰性原子との間に生じる。ｐｉ−スタッキングは、環の平面が平行である場合に互いにスタックできる２つの芳香族環を必要とする。塩橋は、それらの電子をいくつかの原子に非局在化できる基の間、例えばアスパラギン酸とアルギニンとの間にある。
２つ以上の部分は、ヘキサｈｉｓタグまたはＮｉ−ＮＴＡによって一過的に繋がれる場合がある。２つ以上の部分は、それらが一過的に相互に繋がれるように修飾されてもよい。
２つ以上の部分は、好ましくは永久的に繋がれている。本発明の内容では、ヘリカーゼが使用されている間に破壊されないまたは−Ｓ−Ｓ−結合を開くための還元を使用するなどの、使用者の部分への介入なしには破壊されない場合に接続は永久的である。
２つ以上の部分は好ましくは共有結合的に付着している。２つ以上の部分は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して共有結合的に付着されてよい。
２つ以上の部分は、システイン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンなどのそれらの天然に存在するアミノ酸を介して共有結合的に付着してよい。天然に存在するアミノ酸は、付着を促進するために修飾されてよい。例えば天然に存在するアミノ酸は、アシル化、リン酸化、グリコシル化またはファルネシル化によって修飾されてよい。他の好適な修飾は、当技術分野において公知である。天然に存在するアミノ酸への修飾は、翻訳後修飾であってよい。２つ以上の部分は、それらの配列に導入されるアミノ酸を介して付着してよい。そのようなアミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。導入されるアミノ酸は、システインまたは付着を促進する非天然アミノ酸であってよい。好適な非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、Liu C. C. and Schultz P. G.、Annu. Rev. Biochem.、2010、79、413-444の図１に含まれている１〜７１と番号付けられたアミノ酸のいずれか１つまたは下に列挙するアミノ酸のいずれか１つを含む。導入されるアミノ酸は、上に考察したとおり修飾されてよい。
好ましい実施形態では２つ以上の部分は、リンカーを使用して繋がれる。リンカー分子は、下により詳細に考察される。接続の１つの好適な方法は、システイン連結である。これは下でより詳細に考察される。２つ以上の部分は、好ましくは２つまたは３つなどの１つまたは複数のリンカーを使用して繋がれる。１つまたは複数のリンカーは、上に考察したとおり開口部のサイズを低減するまたは閉じるように設計されてよい。１つまたは複数のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使用される場合、１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、ヘリカーゼに結合した際にポリヌクレオチドと平行ではないように好ましくは方向付けられる。より好ましくは全てのリンカーは、この様式で方向付けられる。１つまたは複数のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使用される場合、１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、好ましくはヘリカーゼに結合した際にポリヌクレオチドと平行ではない方向で開口部に交差している。より好ましくは全てのリンカーがこの様式で開口部に交差している。これらの実施形態では１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、ポリヌクレオチドに垂直であってよい。そのような方向は、ポリヌクレオチドが開口部を通ってヘリカーゼから解離できないように開口部を効果的に閉じる。
各リンカーは、２個、３個または４個の機能末端などの２個以上の機能末端を有する場合がある。リンカーにおける末端の好適な立体配置は当技術分野において十分公知である。
１つまたは複数のリンカーの１つまたは複数の末端は、好ましくはヘリカーゼに共有結合的に付着している。１つの末端が共有結合的に付着している場合、１つまたは複数のリンカーは上に考察したとおり２つ以上の部分を一過的に繋ぎ得る。両方または全ての末端が共有結合的に付着している場合、１つまたは複数のリンカーは２つ以上の部分を永久的に繋ぐ。
２つ以上の部分の少なくとも１つは、１つまたは複数のリンカーの付着を促進するために好ましくは修飾される。任意の修飾が作製されてよい。リンカーは、２つ以上の部分における１つまたは複数の反応性システイン残基、反応性リシン残基または非天然アミノ酸に付着してよい。非天然アミノ酸は、上に考察した任意のものであってよい。非天然アミノ酸は、好ましくは４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である。２つ以上の部分における少なくとも１つのアミノ酸は、好ましくはシステインまたはＦａｚなどの非天然アミノ酸で置換される。
１つまたは複数のリンカーは、好ましくはアミノ酸配列および／または化学的架橋剤である。
ペプチドリンカーなどの好適なアミノ酸リンカーは、当技術分野において公知である。アミノ酸またはペプチドリンカーの長さ、可動性および親水性は、開口部のサイズを低減するが、ヘリカーゼの機能を妨害しないように典型的には設計される。好ましい可動性ペプチドリンカーは４、６、８、１０または１６などの２から２０のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、（ＳＧ）８、（ＳＧ）１０、（ＳＧ）１５または（ＳＧ）２０を含み、式中Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい硬いリンカーは、４、６、８、１６または２４などの２から３０のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい硬いリンカーは（Ｐ）１２を含み、式中Ｐはプロリンである。リンカーのアミノ酸配列は、好ましくはポリヌクレオチド結合成分を含む。そのような成分およびそれらの使用に関連する有利点は、下に考察される。
好適な化学的架橋剤は、当技術分野において十分公知である。好適な化学的架橋剤は、これだけに限らないが、次の官能基: マレイミド、活性エステル、サクシニミド、アジド、アルキン（ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルカンおよび直鎖アルカンなど）、ホスフィン（無痕跡および無痕跡でないシュタウディンガーライゲーションにおいて使用されるものなど）、ハロアセチル（ヨードアセトアミドなど）、ホスゲン型試薬、スルホニルクロリド試薬、イソチオシアン酸、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬（アリールアジド、ジアジリジンなど）を含むものを含む。
システイン／マレイミドなど、アミノ酸と官能基との間の反応は自発的であってよく、またはアジドと直鎖状アルキンを連結するためのＣｕ（Ｉ）など、他の試薬を必要としてよい。
リンカーは、必要な距離にわたって伸びる任意の分子を含んでよい。リンカーは、炭素１個（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームに長さが変化できる。直鎖状分子の例に含まれるのは、これだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミドである。これらのリンカーは不活性または反応性であってよく、具体的にはそれらは、規定の位置で化学的に切断可能であってよい、またはフルオロフォアもしくはリガンドでそれ自体が修飾されてよい。リンカーは、好ましくはジチオスレイトール（dithiothreitol）（ＤＴＴ）に抵抗性である。
好ましい架橋剤は、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエートおよび２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノエート、ジ−マレイミドＰＥＧ １ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ ３．４ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ ５ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビスマレイミドエタン、ビスマレイミドＰＥＧ３、ビスマレイミドＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ２．８ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−２６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ１１−ビオチン、（サクシニジミル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（アルファ、オメガ−ビス−マレイミドポリ（エチレングリコール））を含む。最も好ましい架橋剤は、実施例において使用されるマレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミドである。
１つまたは複数のリンカーは、切断可能であってよい。これは下でより詳細に考察される。
２つ以上の部分は、相互に特異的である２つの異なるリンカーを使用して繋がれる場合がある。リンカーの一方は、一方の部分に付着しており、他方は別の部分に付着している。リンカーは、本発明の修飾ヘリカーゼを形成するように反応しなければならない。２つ以上の部分は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載のハイブリダイゼーションリンカーを使用して繋がれてよい。具体的には２つ以上の部分は、ハイブリダイズ可能な領域および共有結合を形成できる基をそれぞれ含む２つ以上のリンカーを使用して繋がれてよい。リンカーにおけるハイブリダイズ可能な領域は、２つ以上の部分にハイブリダイズし、連結する。連結された部分は、次いで基の間の共有結合の形成を介してカップリングされる。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に開示の任意の特異的リンカーは、本発明により使用できる。
２つ以上の部分は、修飾される場合があり、次いで２つの修飾に特異的である化学的架橋剤を使用して付着されてよい。上に考察した任意の架橋剤は、使用できる。
リンカーは、標識されてよい。好適な標識は、これだけに限らないが、蛍光分子（Ｃｙ３またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５など）、放射性同位元素、例えば １２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよび、ビオチンなどのリガンドを含む。そのような標識は、リンカーの量を定量できるようにする。標識は、ビオチンなどの切断可能な精製タグ、またはタンパク質自体には存在しないがトリプシン消化によって遊離されるペプチドなどの同定方法において明らかになる特異的配列であってもよい。
２つ以上の部分を繋ぐ好ましい方法は、システイン連結を介する。これは、二機能性化学的架橋剤により、または末端に存在するシステイン残基を有するアミノ酸リンカーにより調節できる。連結は、ヘリカーゼ中の天然システインを介して生じてよい。代替的にシステインは、ヘリカーゼの２つ以上の部分に導入される場合がある。２つ以上の部分がシステイン連結を介して繋がれる場合、１つまたは複数のシステインは、置換によって２つ以上の部分に好ましくは導入される。
任意の二機能性リンカーの長さ、反応性、特異性、硬さおよび溶解度は、開口部のサイズが十分に低減され、ヘリカーゼの機能が保持されることを確実にするように設計される場合がある。好適なリンカーは、１，４−ビス（マレイミド）ブタン（ＢＭＢ）またはビス（マレイミド）ヘキサンなどのビスマレイミド架橋剤を含む。特異的部位での付着が好ましい場合に、表面の利用可能なシステイン残基への二機能性リンカーの結合は制御することが困難である場合があり、基質結合または活性に影響を与える場合があることから、二機能性リンカーを引き戻すものは、さらなる表面の利用可能なシステイン残基を含まないヘリカーゼの必要性である。ヘリカーゼがいくつかの利用可能なシステイン残基を含有する場合は、修飾がヘリカーゼのフォールディングまたは活性に影響を与えないことを確実にしながら、それらを除去するためにヘリカーゼの修飾が必要である場合がある。これは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において考察されている。システイン残基の反応性は隣接残基の、例えばペプチドリンカー上の修飾によって増強できる。例えば近接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをさらに反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ｄＴＮＢ）などのチオール保護基によって保護できる。これらは、リンカーが付着する前にヘリカーゼの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。表面の利用可能なシステインの選択的脱保護は、ビーズに固定した還元試薬（例えば固定化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ＴＣＥＰ）を使用して可能である。２つ以上の部分のシステイン連結は、下により詳細に考察される。
２つ以上の部分を付着させる別の好ましい方法は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）連結を介する。これは、二機能性化学的リンカーによってまたは末端に存在するＦａｚ残基を有するポリペプチドリンカーによって調節できる。１つまたは複数のＦａｚ残基は、置換によってヘリカーゼに好ましくは導入される。２つ以上のヘリカーゼのＦａｚ連結は、下により詳細に考察される。
ヘリカーゼ
１つまたは複数の単量体で形成されており、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含む任意のヘリカーゼは、本発明により修飾されてよい。ヘリカーゼは、しばしばトランスロカーゼとして公知であり、２つの用語は互換的に使用できる。
好適なヘリカーゼは、当技術分野において十分公知である（M. E. Fairman-Williamsら、Curr. Opin. Struct Biol.、2010、20 (3)、313-324、T. M. Lohmanら、Nature Reviews Molecular Cell Biology、2008、9、391-401）。
ヘリカーゼは、好ましくはスーパーファミリー１またはスーパーファミリー２のメンバーである。ヘリカーゼは、より好ましくは次のファミリー：Ｐｉｆ１様、Ｕｐｆ１様、ＵｖｒＤ／Ｒｅｐ、Ｓｋｉ様、Ｒａｄ３／ＸＰＤ、ＮＳ３／ＮＰＨ−ＩＩ、ＤＥＡＤ、ＤＥＡＨ／ＲＨＡ、ＲｅｃＧ様、ＲＥｃＱ様、Ｔ１Ｒ様、Ｓｗｉ／Ｓｎｆ様およびＲｉｇ−Ｉ様の１つのメンバーである。これらのファミリーの最初の３個は、スーパーファミリー１であり、次の１０個のファミリーはスーパーファミリー２である。ヘリカーゼは、より好ましくは次のサブファミリー：ＲｅｃＤ、Ｕｐｆ１（ＲＮＡ）、ＰｃｒＡ、Ｒｅｐ、ＵｖｒＤ、Ｈｅｌ３０８、Ｍｔｒ４（ＲＮＡ）、ＸＰＤ、ＮＳ３（ＲＮＡ）、Ｍｓｓ１１６（ＲＮＡ）、Ｐｒｐ４３（ＲＮＡ）、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＱ、Ｔ１Ｒ、ＲａｐＡおよびＨｅｆ（ＲＮＡ）の１つのメンバーである。これらのサブファミリーの最初の５個は、スーパーファミリー１であり、次の１１個のサブファミリーはスーパーファミリー２である。Ｕｐｆ１、Ｍｔｒ４、ＮＳ３、Ｍｓｓ１１６、Ｐｒｐ４３およびＨｅｆサブファミリーのメンバーは、ＲＮＡヘリカーゼである。残りのサブファミリーのメンバーはＤＮＡヘリカーゼである。
ヘリカーゼは、多量体またはオリゴマーヘリカーゼであってよい。換言するとヘリカーゼは、機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを形成する必要がある場合がある。そのような実施形態においては２つ以上の部分は、異なる単量体上であることはできない。ヘリカーゼは、好ましくは単量体である。換言するとヘリカーゼは、好ましくは機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを形成する必要はない。Ｈｅｌ３０８、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩおよびＸＰＤヘリカーゼは、全て単量体ヘリカーゼである。これらは下により詳細に考察される。ヘリカーゼがオリゴマー／多量体性または単量体であるかどうかを決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、ヘリカーゼを使用する放射線標識または蛍光標識ポリヌクレオチドの巻き戻しの動態は、調査できる。代替的にヘリカーゼは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して分析できる。
単量体ヘリカーゼは、一緒に付着しているいくつかのドメインを含んでよい。例えばＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、レラクサーゼ（relaxase）ドメインおよびＣ末端ドメインを含有する場合がある。ドメインは、オリゴマーを形成することなく機能できる単量体ヘリカーゼを典型的には形成する。２つ以上の部分は、単量体ヘリカーゼの同じまたは異なるドメイン上に存在できる。本発明による修飾のために好適な未修飾ヘリカーゼは、好ましくは内部ヌクレオチドで標的ポリヌクレオチドに結合できる。内部ヌクレオチドは上に定義されている。
一般に内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、末端ヌクレオチドでも結合できるが、いくつかのヘリカーゼについて内部ヌクレオチドで結合する傾向は、他よりも大きい。本発明による修飾に好適な未修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドへのその結合の典型的には少なくとも１０％が内部ヌクレオチドにである。典型的には、その結合の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％が内部ヌクレオチドにである。末端ヌクレオチドでの結合は、末端ヌクレオチドおよび隣接ヌクレオチドの両方へ結合を同時に含み得る。本発明の目的のためにこれは、内部ヌクレオチドでの標的ポリヌクレオチドへの結合ではない。換言すると本発明を使用する修飾のためのヘリカーゼは、１つまたは複数の隣接内部ヌクレオチドとの組合せで末端ヌクレオチドに結合できるだけではない。ヘリカーゼは、末端ヌクレオチドに同時に結合することなく内部ヌクレオチドに結合できる。
内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、１個より多い内部ヌクレオチドに結合できる。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の内部ヌクレオチド、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の内部ヌクレオチドに結合する。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の隣接する内部ヌクレオチド、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の隣接する内部ヌクレオチドに結合する。少なくとも２個の内部ヌクレオチドは、隣接または非隣接であってよい。
本発明による修飾が、内部ヌクレオチドからの解離が妨げられるように開口部を閉じる場合、未修飾ヘリカーゼが末端ヌクレオチドに少なくともいくらか結合できることは好ましい。これは、修飾ヘリカーゼがポリヌクレオチドの一方の末端に結合し、その全長に沿ったポリヌクレオチドの移動を解離することなく制御することを可能にする。最終的にヘリカーゼは、それが結合したのとは反対の末端でポリヌクレオチドから解離する。
内部ヌクレオチドでポリヌクレオチドに結合するヘリカーゼの能力は、競合アッセイを実行することによって決定できる。対照ポリヌクレオチドＡに結合するヘリカーゼの能力は、同じだが末端ヌクレオチドに付着しているブロッキング基を含むポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）に結合する能力と比較される。ブロッキング基は、鎖Ｂの末端ヌクレオチドでのいかなる結合も妨げ、それによりヘリカーゼの内部結合だけを可能にする。代替的に、内部ヌクレオチドに結合するヘリカーゼの能力は、環状ポリヌクレオチドを使用してもアッセイできる。
内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼの例は、これだけに限らないが、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８ＭｈｕおよびＨｅｌ３０８Ｃｓｙを含む。したがってヘリカーゼは、好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（すなわち配列番号３３）の配列もしくはその変種または（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ（すなわち配列番号２２）の配列もしくはその変種または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（すなわち配列番号５２）の配列もしくはその変種を含む。これらの配列の変種は、下により詳細に考察される。変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
ヘリカーゼは、好ましくはＨｅｌ３０８ヘリカーゼである。本発明に従って、任意のＨｅｌ３０８ヘリカーゼを使用し得る。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼはｓｋｉ２様ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用語は互換的に用いられ得る。好適なＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、米国特許出願第６１，５４９，９９８号の表４および第６１／５９９，２４４ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５７４９５として公開）に開示されている。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（本明細書以下でＨｅｌ３０８モチーフと称する；配列番号８）を典型的には含む。Ｈｅｌ３０８モチーフは、典型的にはヘリカーゼモチーフＶＩの部分である（Tuteja and Tuteja、Eur.J.Biochem.271 1849-1863(2004)）。Ｘ１は、Ｃ、ＭまたはＬであってよい。Ｘ１は、好ましくはＣである。Ｘ２は、任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘ２は、典型的には疎水性または中性残基である。Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＰまたはＲであってよい。Ｘ２は、好ましくはＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰである。Ｘ２は、より好ましくはＡ、ＭまたはＬである。Ｘ２は、最も好ましくはＡまたはＭである。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、好ましくはモチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ−Ｐ（本明細書以下で伸張されたＨｅｌ３０８モチーフと称される；配列番号９）を含み、式中Ｘ１およびＸ２は上に記載のとおり。
最も好ましいＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、Ｈｅｌ３０８モチーフおよび伸張されたＨｅｌ３０８モチーフは、下の表１に示される。
最も好ましいＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１７に示されている。最も好ましい伸長されたＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１８に示されている。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５もしくは５８の配列またはその変種を好ましくは含む。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼではポリヌクレオチドドメインおよび開口部は、ドメイン２（ＡＴＰａｓｅドメインの１つ）とドメイン４（ラッチェットドメイン）の間およびドメイン２とドメイン５（分子ブレーキ）の間に見出すことができる。本発明により繋がれている２つ以上の部分は、好ましくは（ａ）ドメイン２中の任意のアミノ酸とドメイン４中の任意のアミノ酸または（ｂ）ドメイン２中の任意のアミノ酸とドメイン５中の任意のアミノ酸とである。種々のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおいてドメイン２、４および５を定義するアミノ酸残基は、下の表２に記載されている。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列またはその変種を好ましくは含む。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕではポリヌクレオチドドメインおよび開口部は、ドメイン２（ＡＴＰａｓｅドメインの１つ）とドメイン４（ラッチェットドメイン）の間およびドメイン２とドメイン５（分子ブレーキ）の間に見出すことができる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕの繋がれている２つ以上の部分は、好ましくは（ａ）ドメイン２中の任意のアミノ酸とドメイン４中の任意のアミノ酸または（ｂ）ドメイン２中の任意のアミノ酸とドメイン５中の任意のアミノ酸とである。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕにおいてドメイン２、４および５を定義するアミノ酸残基は、上の表２に記載されている。繋がれているＨｅｌ３０８Ｍｂｕの２つ以上の部分は配列番号１０中の好ましくはアミノ酸２８４と６１５とである。これらのアミノ酸は、それらがシステイン連結によって繋がれ得るように好ましくはシステインで置換されている（すなわちＥ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃ）。
本発明は、Ｅ２８４およびＳ６１５が修飾されている配列番号１０の変種を含む変異体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕタンパク質も提供する。Ｅ２８４およびＳ６１５は好ましくは置換されている。Ｅ２８４およびＳ６１５は、より好ましくはシステインで置換されている（すなわちＥ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃ）。変種は、Ｅ２８４およびＳ６１５が修飾されている限りＥ２８４およびＳ６１５以外の位置で配列番号１０から異なっていてもよい。変種は、下により詳細に考察されるとおりアミノ酸同一性に基づいて配列番号１０に好ましくは少なくとも３０％相同性である。Ｅ２８４およびＳ６１５は繋がれていない。本発明の変異体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕタンパク質は、Ｅ２８４およびＳ６１５が繋がれている本発明の修飾ヘリカーゼを形成するために使用できる。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａの配列（すなわち、配列番号３３）もしくはその変種、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙの配列（すなわち、配列番号２２）もしくはその変種、または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕの配列（すなわち配列番号５２）もしくはその変種を含む。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼの配列から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。特に、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の変種は、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の配列から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。好適な方法は、これだけに限らないが、蛍光偏光測定、トリプトファン蛍光および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含む。例えば１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定できる。
変種はヘリカーゼ活性を保持している。これは、種々の方法において測定できる、例えばポリヌクレオチドに沿って移行させる変種の能力は電気生理化学、蛍光アッセイまたはＡＴＰ加水分解を使用して測定され得る。
変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数可）内に修飾を含む場合がある。
配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８のアミノ酸配列全長にわたって、変種は好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列に対して少なくとも３０％相同である。より好ましくは、変種ポリペプチドは、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８のアミノ酸配列に対して、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の変種は、上で表１に示されたとおり、野生型配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフを好ましくは含む。しかし変種は、異なる野生型配列由来のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３０８モチーフを含む場合がある。例えば配列番号１０の変種は、Ｈｅｌ３０８モチーフまたは配列番号１３から伸張されたＨｅｌ３０８モチーフ（すなわち配列番号１４または１５）を含んでもよい。配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の変種は、関連する野生型配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３０８モチーフ内に修飾を含む場合もある。Ｘ１およびＸ２での好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されている。配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
配列番号１０の変種は、配列番号１０の最初の１９アミノ酸を欠失しているおよび／または配列番号１０の最後の３３アミノ酸を欠失している場合がある。配列番号１０の変種は、配列番号１０のアミノ酸２０から２１１または２０から７２７にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である配列を好ましくは含む。
配列番号１０（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ）は５個の天然システイン残基を含有する。しかし、これらの残基の全ては酵素のＤＮＡ結合グローブ（grove）内または周辺に位置付けられている。ＤＮＡ鎖が酵素内に結合されると、これらの天然システイン残基は、外からの修飾に関して利用しにくくなる。これは、上に考察したとおり配列番号１０の特異的システイン変異体の設計を可能にし、システイン連結を使用して成分に付着できるようにする。配列番号１０の好ましい変種は、次の置換：Ａ２９Ｃ、Ｑ２２１Ｃ、Ｑ４４２Ｃ、Ｔ５６９Ｃ、Ａ５７７Ｃ、Ａ７００ＣおよびＳ７０８Ｃの１つまたは複数を有する。これらの位置の１つまたは複数でのシステイン残基の導入は、上に考察したとおりシステイン連結を促進する。配列番号１０の他の好ましい変種は次の置換：Ｍ２Ｆａｚ、Ｒ１０Ｆａｚ、Ｆ１５Ｆａｚ、Ａ２９Ｆａｚ、Ｒ１８５Ｆａｚ、Ａ２６８Ｆａｚ、Ｅ２８４Ｆａｚ、Ｙ３８７Ｆａｚ、Ｆ４００Ｆａｚ、Ｙ４５５Ｆａｚ、Ｅ４６４Ｆａｚ、Ｅ５７３Ｆａｚ、Ａ５７７Ｆａｚ、Ｅ６４９Ｆａｚ、Ａ７００Ｆａｚ、Ｙ７２０Ｆａｚ、Ｑ４４２ＦａｚおよびＳ７０８Ｆａｚの１つまたは複数を有する。これらの位置の１つまたは複数でのＦａｚ残基の導入は、上に考察したとおりＦａｚ連結を促進する。
ヘリカーゼは、好ましくはＲｅｃＤヘリカーゼである。任意のＲｅｃＤヘリカーゼが本発明により使用できる。ＲｅｃＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知である（FEBS J. 2008 Apr;275(8):1835-51. Epub 2008 Mar 9. ATPase activity of RecD is essential for growth of the Antarctic Pseudomonas syringae Lz4W at low temperature. Satapathy AK、Pavankumar TL、Bhattacharjya S、Sankaranarayanan R、Ray MK; EMS Microbiol Rev. 2009 May;33(3):657-87. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. Garcillan-Barcia MP、Francia MV、de la Cruz F; J Biol Chem. 2011 Apr 8;286(14):12670-82. Epub 2011 Feb 2. Functional characterization of the multidomain F plasmid TraI relaxase-helicase. Cheng Y、McNamara DE、Miley MJ、Nash RP、Redinbo MR）。
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；配列番号５９）を典型的には含み、式中Ｘ１はＧ、ＳまたはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、ＳまたはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳまたはＣであり、Ｘ５はＧまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲおよびＸ７はＴまたはＳである。Ｘ１は好ましくはＧである。Ｘ２は好ましくはＧ、Ｉ、ＹまたはＡである。Ｘ２はより好ましくはＧである。Ｘ３は好ましくはＰまたはＡである。Ｘ４は好ましくはＴ、Ａ、ＶまたはＣである。Ｘ４は好ましくはＴ、ＶまたはＣである。Ｘ５は好ましくはＧである。Ｘ６は好ましくはＫである。Ｘ７は好ましくはＴまたはＳである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、Ｑ−（Ｘ８）１６〜１８−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；配列番号６０、６１および６２）を好ましくは含み、式中Ｘ１からＸ７は上に定義のとおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。好ましくは伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩ中に１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）１６）（配列番号６０）。（Ｘ８）１６についての好適な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の配列番号１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７および５０ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２および４４で同定できる。
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書以下でＲｅｃＤモチーフＩと称する；配列番号６３）を好ましくは含み、式中ＸａはＴ、ＶまたはＣであり、ＸｂはＴまたはＳである。Ｘａは好ましくはＴである。Ｘｂは好ましくはＴである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、配列Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−Ｔ（配列番号６４）を好ましくは含む。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−（Ｘ８）１６〜１８−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤモチーフＩと称する；配列番号６５、６６および６７）をより好ましくは含み、式中ＸａおよびＸｂは上に定義のとおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。伸長されたＲｅｃＤモチーフＩ中に好ましくは１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）１６）（配列番号６５）。（Ｘ８）１６についての好適な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の配列番号１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７および５０ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２および４４で同定できる。
ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）３−Ｑ−Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＶと称する；配列番号６８）を典型的には含み、式中Ｘ１はＹ、ＷまたはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣまたはＶであり、Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴ、ＮまたはＳであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、ＶまたはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧまたはＳである。Ｘ１は好ましくはＹである。Ｘ２は好ましくはＡ、Ｍ、ＣまたはＶである。Ｘ２はより好ましくはＡである。Ｘ３は好ましくはＩ、ＭまたはＬである。Ｘ３はより好ましくはＩまたはＬである。Ｘ４は好ましくはＴまたはＳである。Ｘ４はより好ましくはＴである。Ｘ５は好ましくはＡ、ＶまたはＩである。Ｘ５はより好ましくはＶまたはＩである。Ｘ５は最も好ましくはＶである。（Ｘ６）３は好ましくはＨ−Ｋ−Ｓ、Ｈ−Ｍ−Ａ、Ｈ−Ｇ−ＡまたはＨ−Ｒ−Ｓである。（Ｘ６）３はより好ましくはＨ−Ｋ−Ｓである。Ｘ７は好ましくはＧである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｘｅ−Ｈ−Ｋ−Ｓ−Ｑ−Ｇ（本明細書以下でＲｅｃＤモチーフＶと称する；配列番号６９）を好ましくは含み、式中ＸａはＹ、ＷまたはＦであり、ＸｂはＡ、Ｍ、ＣまたはＶであり、ＸｃはＩ、ＭまたはＬであり、ＸｄはＴまたはＳであり、ＸｅはＶまたはＩである。Ｘａは好ましくはＹである。Ｘｂは好ましくはＡである。Ｘｄは好ましくはＴである。Ｘｄは好ましくはＶである。好ましいＲｅｃＤモチーフＩは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５に示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＩは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＶは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。
ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表４もしくは５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。変種は米国特許出願第６１／５８１，３３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に記載されている。
ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくはＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼである。ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、レラクサーゼドメインおよびＣ末端ドメインを含有する場合がある。ＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、好ましくはＴｒｗＣヘリカーゼである。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表６および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である。変種は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に記載されている。
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、上に定義のＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号５９）および／または上に定義のＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号６８）を典型的には含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、ＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号５９）およびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号６８）の両方を好ましくは含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、次の２つのモチーフの１つを典型的にはさらに含む：
− アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（本明細書以下でＭｏｂＦモチーフＩＩＩと称する；配列番号７０から７７）、式中Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される。（Ｘ１）２は当然ながらＸ１ａ−Ｘ１ｂである。Ｘ１ａおよびＸ１ｂは、同じまたは異なるアミノ酸であってよい。Ｘ１ａは、好ましくはＤまたはＥである。Ｘ１ｂは、好ましくはＴまたはＤである。（Ｘ１）２は、好ましくはＤＴまたはＥＤである。（Ｘ１）２は、最も好ましくはＤＴである。（Ｘ３）５〜１２中の５から１２個のアミノ酸は同じまたは異なっていてよい。Ｘ２およびＸ４はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ２およびＸ４は、好ましくは荷電していない。Ｘ２およびＸ４は、好ましくはＨではない。Ｘ２は、より好ましくはＮ、ＳまたはＡである。Ｘ２は、最も好ましくはＮである。Ｘ４は、最も好ましくはＦまたはＴである。（Ｘ３）５〜１２は、好ましくは長さ６または１０残基である。（Ｘ３）５〜１２の好適な実施形態は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表７に示す配列番号５８、６２、６６および７０、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号６１、６５、６９、７３、７４、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４および１６８由来であってよい。
− アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）６〜１２−Ｈ−Ｘ９（本明細書以下でＭｏｂＱモチーフＩＩＩと称する；配列番号７８から８４）、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤまたはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくは荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくはＨではない。（Ｘ８）６〜１２中の６から１２個のアミノ酸は、同じまたは異なっていてよい。好ましいＭｏｂＦモチーフＩＩＩは、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、より好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表６または７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である。ＴｒａＩヘリカーゼは、配列番号８５に示す配列またはその変種を最も好ましくは含む。配列番号８５はＴｒａＩ Ｅｃｏ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６１４８３．１；Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＱ９８６１９．１；配列番号８５）である。ＴｒａＩ Ｅｃｏは、次のモチーフ：ＲｅｃＤ様モチーフＩ（ＧＹＡＧＶＧＫＴ；配列番号８６）、ＲｅｃＤ様モチーフＶ（ＹＡＩＴＡＨＧＡＱＧ；配列番号８７）およびＭｏｂ ＦモチーフＩＩＩ（ＨＤＴＳＲＤＱＥＰＱＬＨＴＨ；配列番号８８）を含む。
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、下の表３に示すヘリカーゼの１つの配列、すなわち配列番号８５、１２６、１３４および１３８の１つまたはその変種をより好ましくは含む。
繋がれているＴｒｗＣ Ｃｂａの２つ以上の部分は、好ましくは（ａ）配列番号１２６中のアミノ酸６９１および３４６；（ｂ）配列番号１２６中のアミノ酸６５７および３３９；（ｃ）配列番号１２６中のアミノ酸６９１および３５０；または（ｄ）配列番号１２６中のアミノ酸６９０および３５０である。これらのアミノ酸は、それらがシステイン連結で繋がれ得るように、システインで好ましくは置換されている。
本発明はアミノ酸６９１および３４６；６５７および３３９；６９１および３５０；または６９０および３５０が修飾されている配列番号１２６の変種を含む変異体ＴｒｗＣ Ｃｂａタンパク質も提供する。アミノ酸は好ましくは置換されている。アミノ酸は、より好ましくはシステインで置換されている。変種は、関連するアミノ酸が修飾されている限り、６９１および３４６；６５７および３３９；６９１および３５０；または６９０および３５０以外の位置で配列番号１２６とは異なっていてよい。変種は、下により詳細に考察されるとおりアミノ酸同一性に基づいて配列番号１２６に好ましくは少なくとも１０％相同性である。アミノ酸６９１および３４６；６５７および３３９；６９１および３５０；または６９０および３５０は、繋がれていない。本発明の変異体ＴｒｗＣ Ｃｂａタンパク質は、修飾されるアミノ酸が繋がれている本発明の修飾ヘリカーゼを形成するために使用できる。
ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。具体的には配列番号８５、１２６、１３４または１３８の変種は、配列番号８５、１２６、１３４または１３８のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ヘリカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで作動する。変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したモチーフの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数可）内に修飾を含む場合がある。
配列番号８５、１２６、１３４および１３８の任意の１つのアミノ酸配列の全長にわたって、変種はアミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号８５、１２６、１３４および１３８の任意の１つのアミノ酸配列に少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
配列番号８５、１２６、１３４および１３８の任意の１つの変種は、野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩおよび／またはＲｅｃＤ様モチーフＶを好ましくは含む。しかし配列番号８５、１２６、１３４または１３８の変種は、野生型配列とは異なるＲｅｃＤ様モチーフＩおよび／または伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＶを含んでよい。例えば変種は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示す好ましいモチーフの任意の１つを含んでよい。配列番号８５、１２６、１３４および１３８の変種は、野生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩおよびＶ内に修飾を含んでよい。配列番号８５、１２６、１３４または１３８の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
ヘリカーゼは好ましくはＸＰＤヘリカーゼである。任意のＸＰＤヘリカーゼが本発明により使用できる。ＸＰＤヘリカーゼはＲａｄ３ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用語は互換的に使用できる。
ＸＰＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知である（Cell. 2008 May 30;133(5):801-12. Structure of the DNA repair helicase XPD. Liu H、Rudolf J、Johnson KA、McMahon SA、Oke M、Carter L、McRobbie AM、Brown SE、Naismith JH、White MF）。ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−Ｇ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶと称する；配列番号８９）を典型的には含む。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましくは荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましくはＨではない。Ｘ１は、より好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、ＳまたはＹである。Ｘ５は、より好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、ＮまたはＦである。Ｘ６は、より好ましくはＳまたはＡである。Ｘ３およびＸ４は、任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘ４は、好ましくはＫ、ＲまたはＴである。
ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（Ｘｅ）３−Ｘｆ−（Ｘｇ）７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶＩと称する；配列番号９０）を典型的には含む。Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、典型的にはＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好ましくは荷電していない。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好ましくはＨではない。Ｘｂは、より好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＭである。Ｘｃは、より好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＣである。Ｘｄは、より好ましくはＩ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＶである。Ｘｆは、ＤまたはＥであってよい。（Ｘｇ）７はＸｇ１、Ｘｇ２、Ｘｇ３、Ｘｇ４、Ｘｇ５、Ｘｇ６およびＸｇ７である。Ｘｇ２は、好ましくはＧ、Ａ、ＳまたはＣである。Ｘｇ５は、好ましくはＦ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａ、ＷまたはＹである。Ｘｇ６は、好ましくはＬ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、ＩまたはＶである。Ｘｇ７は、好ましくはＡ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳである。
ＸＰＤヘリカーゼは、ＸＰＤモチーフＶおよびＶＩを好ましくは含む。最も好ましいＸＰＤモチーフＶおよびＶＩは、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されている。
ＸＰＤヘリカーゼは、硫化鉄（ＦｅＳ）コアを２つのウォーカーＡおよびＢモチーフ（モチーフＩおよびＩＩ）の間に好ましくはさらに含む。ＦｅＳコアは、システイン残基のスルフィド基の間に配位した鉄原子を典型的には含む。ＦｅＳコアは、典型的には四面体である。
ＸＰＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表４または５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。ＸＰＤヘリカーゼは、配列番号９１に示されている配列またはその変種を最も好ましくは含む。配列番号９１は、ＸＰＤ Ｍｂｕ（メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）；ＹＰ＿５６６２２１．１；ＧＩ：９１７７３５２９）である。ＸＰＤ Ｍｂｕは、ＹＬＷＧＴＬＳＥＧ（モチーフＶ；配列番号９２）およびＱＡＭＧＲＶＶＲＳＰＴＤＹＧＡＲＩＬＬＤＧＲ（モチーフＶＩ；配列番号９３）を含む。
ＸＰＤヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。具体的には配列番号９１の変種は、配列番号９１のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ヘリカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで作動する。変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したＸＰＤモチーフＶおよびＶＩの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフの１つまたは両方の内に修飾を含む場合がある。
配列番号９１のアミノ酸配列の全長にわたって、配列番号１０などの変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％、好ましくは３０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列番号９１のアミノ酸配列に配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
配列番号９１の変種は、野生型配列のＸＰＤモチーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフＶＩを好ましくは含む。配列番号９１の変種は、配列番号９１のＸＰＤモチーフＶおよびＶＩの両方をより好ましくは含む。しかし、配列番号９１の変種は、野生型配列とは異なるＸＰＤモチーフＶおよび／またはＶＩを含む場合がある。例えば、配列番号９１の変種は、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されている好ましいモチーフの任意の１つを含む場合がある。配列番号９１の変種は、野生型配列のＸＰＤモチーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフＶＩ内に修飾も含む場合がある。これらのモチーフへの好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されている。配列番号９１の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ
本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために有用である修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼも提供する。本発明によりヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する１つまたは複数の位置への１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸の導入によって修飾され、ここでヘリカーゼはポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。
これらの修飾は、ポリヌクレオチドへの結合についてヘリカーゼを妨げない。例えばヘリカーゼは、内部ヌクレオチドを介してまたはその末端の１つでポリヌクレオチドに結合できる。これらの修飾は、ヘリカーゼから、特にポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドから解離するまたは離されるポリヌクレオチドの能力を減少させる。換言すると１つまたは複数の修飾は、ポリヌクレオチド鎖からの離脱を妨げることによってＨｅｌ３０８ヘリカーゼの前進性を増大させる。酵素の熱安定性も１つまたは複数の修飾によって増大され、鎖配列決定法において有益である改善された構造的安定性をもたらす。本発明の修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、上に考察した全ての有利点および使用を有する。
修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。これは、上に考察したとおり測定できる。修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは人工または非天然である。
本発明の修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、上に考察したとおり、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、上の表１に示すヘリカーゼの１つの変種を好ましくは含む。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種を好ましくは含む。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６、Ｋ３１９、Ｓ６１５、Ｋ７１７またはＹ７２０に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種を好ましくは含む。
下の表４ａおよび４ｂは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する、他のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおける位置を示す。例えば、Ｈｅｌ３０８ Ｈｖｏ（配列番号１６）では、Ｅ２８３はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＤ２７４に対応し、Ｅ２９３はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＥ２８４に対応し、Ｉ２９４はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＥ２８５に対応し、Ｖ２９７はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＳ２８８に対応し、Ｄ６７１はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＳ６１５に対応し、Ｋ７７５はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＫ７１７に対応し、およびＥ７７８はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＹ７２０に対応する。別のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおける対応する位置の欠如は「−」と印を付ける。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種をより好ましくは含む。関連する位置は、上の表４ａのカラムＡからＧに示されている。
ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個にシステイン残基を含んでよい。これらの位置の任意の組合せは、システインで置換されてよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリカーゼは、列においてＡからＧと標識の位置の次の組合せのいずれにもシステインを含んでよい：｛Ａ｝、｛Ｂ｝、｛Ｃ｝、｛Ｄ｝、｛Ｇ｝、｛Ｅ｝、｛Ｆ｝、｛ＡおよびＢ｝、｛ＡおよびＣ｝、｛ＡおよびＤ｝、｛ＡおよびＧ｝、｛ＡおよびＥ｝、｛ＡおよびＦ｝、｛ＢおよびＣ｝、｛ＢおよびＤ｝、｛ＢおよびＧ｝、｛ＢおよびＥ｝、｛ＢおよびＦ｝、｛ＣおよびＤ｝、｛ＣおよびＧ｝、｛ＣおよびＥ｝、｛ＣおよびＦ｝、｛ＤおよびＧ｝、｛ＤおよびＥ｝、｛ＤおよびＦ｝、｛ＧおよびＥ｝、｛ＧおよびＦ｝、｛ＥおよびＦ｝、｛Ａ、ＢおよびＣ｝、｛Ａ、ＢおよびＤ｝、｛Ａ、ＢおよびＧ｝、｛Ａ、ＢおよびＥ｝、｛Ａ、ＢおよびＦ｝、｛Ａ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、ＣおよびＦ｝、｛Ａ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ｂ、ＣおよびＧ｝、｛Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ｂ、ＤおよびＧ｝、｛Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、または｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝。
ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個にＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。これらの位置の任意の組合せは、Ｆａｚなどの非天然アミノ酸で置換されてよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリカーゼは、上にＡからＧと標識の位置の任意の組合せにＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。
ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の２つ以上に１つまたは複数のシステインおよび１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸の組合せを含んでよい。１つまたは複数のシステイン残基および１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸の任意の組合せが関連する位置に存在してよい。例えば上の表４ａおよび４ｂの各列について本発明のヘリカーゼは、上にＡからＧと標識の位置の任意の組合せに１つまたは複数のシステインおよび１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種をより好ましくは含む。関連する位置は、上の表４ａのカラムＡからＥに示されている。
ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、４個または５個、６個または７個にシステイン残基を含んでよい。これらの位置の任意の組合せは、システインで置換されてよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリカーゼは、その列にＡからＥと標識の位置の次の組合せ：｛Ａ｝、｛Ｂ｝、｛Ｃ｝、｛Ｄ｝、｛Ｅ｝、｛ＡおよびＢ｝、｛ＡおよびＣ｝、｛ＡおよびＤ｝、｛ＡおよびＥ｝、｛ＢおよびＣ｝、｛ＢおよびＤ｝、｛ＢおよびＥ｝、｛ＣおよびＤ｝、｛ＣおよびＥ｝、｛ＤおよびＥ｝、｛Ａ、ＢおよびＣ｝、｛Ａ、ＢおよびＤ｝、｛Ａ、ＢおよびＥ｝、｛Ａ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝または｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝のいずれにもシステインを含んでよい。
ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、４個または５個にＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。これらの位置の任意の組合せは、Ｆａｚなどの非天然アミノ酸で置換されてよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリカーゼは、上にＡからＥと標識の位置の任意の組合せにＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。
ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の２つ以上に１つまたは複数のシステインおよび１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸の組合せを含んでよい。１つまたは複数のシステイン残基および１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸の任意の組合せは、関連する位置に存在してよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリカーゼは、上にＡからＥと標識の位置の任意の組合せに１つまたは複数のシステインおよび１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼはＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含むＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列の変種を好ましくは含む。変種は好ましくはＤ２７２Ｃ、Ｎ２７３Ｃ、Ｄ２７４Ｃ、Ｇ２８１Ｃ、Ｅ２８４Ｃ、Ｅ２８５Ｃ、Ｅ２８７Ｃ、Ｓ２８８Ｃ、Ｔ２８９Ｃ、Ｇ２９０Ｃ、Ｅ２９１Ｃ、Ｄ２９３Ｃ、Ｔ２９４Ｃ、Ｎ３００Ｃ、Ｒ３０３Ｃ、Ｋ３０４Ｃ、Ｎ３１４Ｃ、Ｓ３１５Ｃ、Ｎ３１６Ｃ、Ｈ３１７Ｃ、Ｒ３１８Ｃ、Ｋ３１９Ｃ、Ｌ３２０Ｃ、Ｅ３２２Ｃ、Ｒ３２６Ｃ、Ｎ３２８Ｃ、Ｓ６１５Ｃ、Ｋ７１７Ｃ、Ｙ７２０Ｃ、Ｎ７２１ＣまたはＳ７２４Ｃを含む。変種は好ましくはＤ２７２Ｆａｚ、Ｎ２７３Ｆａｚ、Ｄ２７４Ｆａｚ、Ｇ２８１Ｆａｚ、Ｅ２８４Ｆａｚ、Ｅ２８５Ｆａｚ、Ｅ２８７Ｆａｚ、Ｓ２８８Ｆａｚ、Ｔ２８９Ｆａｚ、Ｇ２９０Ｆａｚ、Ｅ２９１Ｆａｚ、Ｄ２９３Ｆａｚ、Ｔ２９４Ｆａｚ、Ｎ３００Ｆａｚ、Ｒ３０３Ｆａｚ、Ｋ３０４Ｆａｚ、Ｎ３１４Ｆａｚ、Ｓ３１５Ｆａｚ、Ｎ３１６Ｆａｚ、Ｈ３１７Ｆａｚ、Ｒ３１８Ｆａｚ、Ｋ３１９Ｆａｚ、Ｌ３２０Ｆａｚ、Ｅ３２２Ｆａｚ、Ｒ３２６Ｆａｚ、Ｎ３２８Ｆａｚ、Ｓ６１５Ｆａｚ、Ｋ７１７Ｆａｚ、Ｙ７２０Ｆａｚ、Ｎ７２１ＦａｚまたはＳ７２４Ｆａｚを含む。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含むＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、上にＡからＧと標識の位置の任意の組合せに１つまたは複数のシステイン、１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸またはこれらの組合せを含んでよい。
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含むＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列の変種を好ましくは含む。例えばＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）に関して、本発明のヘリカーゼは、位置の次の組合せ：｛Ｄ２７４｝、｛Ｅ２８４｝、｛Ｅ２８５｝、｛Ｓ２８８｝、｛Ｓ６１５｝、｛Ｄ２７４およびＥ２８４｝、｛Ｄ２７４およびＥ２８５｝、｛Ｄ２７４およびＳ２８８｝、｛Ｄ２７４およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４およびＥ２８５｝、｛Ｅ２８４およびＳ２８８｝、｛Ｅ２８４およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８５およびＳ２８８｝、｛Ｅ２８５およびＳ６１５｝、｛Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４およびＥ２８５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４およびＳ２８８｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８５およびＳ２８８｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８５およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ２８８｝、｛Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ２８８｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５｝または｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５｝のいずれにもシステインまたはＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。
ヘリカーゼは、（ａ）Ｅ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃ、（ｂ）Ｅ２８４ＦａｚおよびＳ６１５Ｆａｚ、（ｃ）Ｅ２８４ＣおよびＳ６１５Ｆａｚまたは（ｄ）Ｅ２８４ＦａｚおよびＳ６１５Ｃを含む配列番号１０の変種を好ましくは含む。
ヘリカーゼは、Ｅ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃを含む配列番号１０に示される配列をより好ましくは含む。
本発明における使用のための好ましい非天然アミノ酸は、これだけに限らないが４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ６−｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ６−［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６−［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸およびＮ６−［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンを含む。
最も好ましい非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である。
上に考察したとおり、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。本発明のＨｅｌ３０８ヘリカーゼでは、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種は、それがＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む限り追加的修飾を含んでよい。好適な修飾および変種は、２つ以上の部分の接続を伴う実施形態を参照して上に考察されている。
変種は、Ｗｏｏｄｍａｎら（J. Mol. Biol. (2007)374、1139-1144）に開示のドメイン５中に変異を含んでよい。これらの変異は、配列番号１０中のＲ６８５Ａ、Ｒ６８７ＡおよびＲ６８９Ａに対応する。
本発明のＨｅｌ３０８ヘリカーゼの２つ以上の部分の接続
本発明において修飾されたＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合ドメインを含む。ポリヌクレオチド結合ドメインは、上に定義されている。本発明における使用のための未修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼのポリヌクレオチド結合ドメインは、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含む。
好ましい実施形態ではＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するようにさらに修飾されている。２つ以上の部分は、上に考察した方法のいずれで繋がれてもよい。
非接続
別の実施形態ではＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するように修飾されていない。好ましくは、１つまたは複数のシステインまたは１つまたは複数の非天然アミノ酸はいずれもヘリカーゼ中の別のアミノ酸に繋がれない。好ましくは、ヘリカーゼ中の２つのアミノ酸は、それらの天然または非天然Ｒ基を介して併せて繋がれない。
構築物
本発明は、本発明のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物も提供する。ヘリカーゼは、追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着している。構築物は人工または非天然である。
本発明の構築物は、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用な手段である。本発明の構築物は、本発明の修飾ヘリカーゼよりも配列決定されているポリヌクレオチドから離されにくい。構築物は、それがナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御することから、ポリヌクレオチドのさらに長い読み取り長を提供できる。
特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計できる。下により詳細に考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化できる。
構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。これは、上に考察したとおり決定できる。
本発明の構築物は、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。構築物は、それが脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量体などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。構築物は、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えば構築物は、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量体などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。
ヘリカーゼは、好ましくは共有結合的に追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着している。ヘリカーゼは、２個または３個などの１個以上の点で成分に付着していてよい。
ヘリカーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して成分に共有結合的に付着できる。好適な方法は、２つ以上の部分を繋ぐことを参照して上に考察されている。
ヘリカーゼおよび成分は、別々に産生され、次いで一緒に付着されてよい。２つの構成成分は、任意の立体配置で付着されてよい。例えばそれらは、それらの末端（すなわちアミノまたはカルボキシ末端）アミノ酸を介して付着してよい。好適な立体配置は、これだけに限らないが、成分のアミノ末端がヘリカーゼのカルボキシ末端に付着しているおよびその逆を含む。代替的に２つの構成成分は、それらの配列内のアミノ酸を介して付着され得る。例えば成分は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する場合がある。好ましい実施形態では成分の末端アミノ酸は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する。
好ましい実施形態ではヘリカーゼは、例えば上に考察した１つまたは複数のリンカー分子を介して、成分に化学的に付着する。別の好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に遺伝子的に融合される。構築物全体が１本のポリヌクレオチド配列から発現される場合にヘリカーゼは、遺伝子的に成分に融合されている。ヘリカーゼおよび成分のコード配列は、構築物をコードしている１本のポリヌクレオチド配列を形成するために任意の方法で組み合わされてよい。核酸結合タンパク質へのポアの遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）において考察されている。
ヘリカーゼおよび成分は、任意の立体配置で遺伝的に融合され得る。ヘリカーゼおよび成分は、それらの末端アミノ酸を介して融合され得る。例えば成分のアミノ末端はヘリカーゼのカルボキシ末端に融合でき、逆も同様である。成分のアミノ酸配列は、ヘリカーゼのアミノ酸配列にインフレームで好ましくは付加される。換言すると成分は、ヘリカーゼの配列内に好ましくは挿入される。そのような実施形態ではヘリカーゼおよび成分は、２つの点で、すなわち成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸を介して典型的には付着される。成分がヘリカーゼの配列内に挿入される場合、成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸が近接近にあり、ヘリカーゼまたはその変種の配列内の隣接アミノ酸にそれぞれ付着していることは好ましい。好ましい実施形態では成分は、ヘリカーゼのループ領域に挿入される。
構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を保持している。ヘリカーゼのこの能力は、そのβ鎖およびαヘリックスによって典型的には提供されるその三次元構造により典型的には提供される。αヘリックスおよびβ鎖は、ループ領域により典型的には繋がれている。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力に影響を与えることを回避するために、成分は好ましくはヘリカーゼのいずれかの末端に遺伝子的に融合される、またはヘリカーゼの表面露出ループに挿入される。特異的ヘリカーゼのループ領域は、当技術分野において公知の方法を使用して同定できる。本発明のＨｅｌ３０８実施形態では成分は、αヘリックスのいずれにも好ましくは遺伝子的に融合されない。
ヘリカーゼは、成分に直接付着され得る。ヘリカーゼは、上に考察したとおり２つまたは３つなどの１つまたは複数のリンカーを使用して成分に好ましくは付着される。１つまたは複数のリンカーは、成分の移動性を限定するように設計され得る。ヘリカーゼおよび／または成分は、上に考察したとおり１つまたは複数のリンカーの付着を促進するように修飾され得る。
切断可能なリンカーは、非付着構成成分からの構築物の分離への補助として使用でき、合成反応をさらに制御するために使用できる。例えばヘテロ二機能性リンカーは、ヘリカーゼと反応できるが、成分とはできない。ヘリカーゼタンパク質を表面に結合するためにリンカーの遊離末端が使用できる場合、最初の反応由来の未反応ヘリカーゼは混合物から除去され得る。続いてリンカーは、成分と反応する基を露出させるために切断され得る。付加的に、一連の連結反応に続いて、条件は最初にヘリカーゼへの反応のために、次いでリンカーの切断後の成分への反応のために最適化され得る。第二の反応は、リンカーが既に付着している領域に限定されることから、成分との正確な反応部位に向けてさらに方向付けられる。
ヘリカーゼは、ヘリカーゼ／架橋剤複合体が成分に共有結合的に付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着されてよい。代替的に成分は、二機能性架橋剤／成分複合体がヘリカーゼに付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着してよい。ヘリカーゼおよび成分は、化学的架橋剤に同時に共有結合的に付着してよい。
ヘリカーゼの成分への付着の好ましい方法は、上に記載のとおりシステイン連結およびＦａｚ連結である。好ましい実施形態では反応性システインは、成分に遺伝子的に付着しているペプチドリンカー上に存在する。これは、成分から他の利用可能なシステイン残基を除去するために追加的修飾が必ずしも必要ではないことを意味する。
ヘリカーゼまたは成分のそれ自体への交差結合は、リンカーの濃度をヘリカーゼおよび／または成分の大過剰に維持することによって妨げることができる。代替的に「鍵と鍵穴」配置は、２つのリンカーが使用される場合に使用できる。各リンカーの一方の末端だけが長いリンカーを形成するために併せて反応でき、リンカーの他方の末端は構築物の異なる部分（すなわちヘリカーゼまたは成分）とそれぞれ反応する。これは下でより詳細に考察される。
付着の部位は、構築物がポリヌクレオチドと接触する場合に、ヘリカーゼおよび成分の両方がポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できるように選択される。
付着は、ヘリカーゼおよび成分のポリヌクレオチド結合活性を使用して促進され得る。例えば相補的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼおよび成分を、それらがハイブリダイズすることから、併せて運ぶために使用できる。ヘリカーゼは一方のポリヌクレオチドに結合でき、成分は相補的ポリヌクレオチドに結合できる。次いで２つのポリヌクレオチドは、相互にハイブリダイズできるようになる。これは、ヘリカーゼを成分と密接に接触するようにして、連結反応をさらに効率的にする。これは、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための正確な方向で２つ以上のヘリカーゼを付着させるために特に有益である。使用できる相補的ポリヌクレオチドの一例は、下に示されている。
ヘリカーゼ−Ｐｈｉ２９構築物に関して、下のＤＮＡは使用され得る。
構築物の精製を容易にするためにタグが構築物に付加され得る。これらのタグは、次いでそれらの除去が必要である場合に、化学的にまたは酵素的に切断除去され得る。フルオロフォアまたはクロモフォアも含まれる場合があり、これらも切断可能であってよい。
構築物を精製するための簡単な方法は、各タンパク質（すなわちヘリカーゼおよび成分）上に、ヘキサ−Ｈｉｓ−タグおよびＳｔｒｅｐ−タグ（登録商標）などの異なる精製タグを含むことである。２つのタンパク質が互いに異なる場合、この方法は特に有用である。２つのタグの使用は、両方のタグを含む分子種だけが容易に精製されるようにする。
２つのタンパク質が２つの異なるタグを有さない場合、他の方法が使用できる。例えば遊離表面システインを有するタンパク質または構築物を形成するために反応していない付着リンカーを有するタンパク質は、例えばマレイミドリンカーに対するヨードアセトアミドレジンを使用して除去され得る。
本発明の構築物は、未反応タンパク質から異なるＤＮＡ前進性特徴に基づいても精製され得る。具体的には本発明の構築物は、未反応タンパク質からポリヌクレオチドに対する親和性の増大、既に結合したポリヌクレオチドから離れる可能性の低減および／またはナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御するときのポリヌクレオチドの読み取り長さの増大に基づいて精製され得る。
特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計され得る。下により詳細に考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化する。
ポリヌクレオチド結合成分
本発明の構築物は、ポリヌクレオチド結合成分を含む。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドである。成分は、規定のポリヌクレオチド配列に好ましくは特異的結合できる。換言すると成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に好ましくは結合するが、少なくとも１０分の１の結合を異なる配列に、またはより好ましくは少なくとも１００分の１の結合を異なる配列に、または最も好ましくは少なくとも１０００分の１の結合を異なる配列に示す。異なる配列は無作為配列であってよい。いくつかの実施形態では成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合するが、異なる配列への結合は測定できない。特異的配列に結合する成分は、そのような配列に標的化される構築物を設計するために使用され得る。
成分は、典型的にはポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用および改変する。成分は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。成分は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させること、すなわちその移動を制御することによってそれを修飾できる。
核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えばポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、紫外光による障害に典型的には関連し、皮膚メラノーマの主原因である。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾され得る。好適な標識は、上に記載されている。標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。
ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。
ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、５−メチルシチジンモノホスフェート、５−メチルシチジンジホスフェート、５−メチルシチジントリホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンモノホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンジホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジントリホスフェート、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖も欠失している場合がある（すなわちＣ３スペーサーである）。
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で相互に付着されてよい。ヌクレオチドは、核酸においてと同様にそれらの糖およびリン酸基により典型的には付着されている。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体においてと同様にそれらの核酸塩基を介して繋がれてよい。
ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、好ましくは２本鎖である。
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。
成分の三次構造が公知であることは好ましい。成分の三次元構造の知識は、本発明の構築物におけるその機能を促進するために成分に修飾を作製できるようにする。
成分は、任意のサイズであってよく、任意の構造を有してよい。例えば成分は、二量体または三量体などのオリゴマーである場合がある。成分は、好ましくは１つの単量体から形成された小さな球状ポリペプチドである。そのような成分は操作が容易であり、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を、特にヘリカーゼの配列に融合または挿入された場合に、干渉しにくい。
成分のアミノおよびカルボキシ末端は、好ましくは近接近にある。成分のアミノおよびカルボキシ末端は、成分の同じ面により好ましくは存在する。そのような実施形態は、ヘリカーゼの配列中への成分の挿入を促進する。例えば成分のアミノおよびカルボキシ末端が近接近にある場合、それぞれはヘリカーゼの配列中の隣接アミノ酸への遺伝子的融合によって付着され得る。
成分の活性部位の位置および機能が公知であることも好ましい。これは、成分の活性を消滅させる活性部位に修飾が作製されることを防ぐ。これは成分がヘリカーゼに付着できるようにし、成分はポリヌクレオチドに結合し、その移動を制御する。成分がポリヌクレオチドに結合および方向付けられる方法の知識は、有効な構築物を設計できるようにする。
本発明の構築物は鎖配列決定法において有用である。成分は、鎖配列決定法およびヌクレオチドの識別に適合性である緩衝液バックグラウンドにおいてポリヌクレオチドに好ましくは結合する。成分は、１００ｍＭから２Ｍなどの通常の生理学的レベルを大幅に上回る塩濃度において少なくとも残存活性を好ましくは有する。成分は、高塩濃度でのその活性を増大させるためにより好ましくは修飾される。成分は、その前進性、安定性および有効期間を改善するために修飾されてもよい。
好適な修飾は、好塩性、中度好塩性細菌、好熱性および中等度好熱性生物などの好極限性細菌（extremphile）、ならびに中温性または好熱性エキソヌクレアーゼの耐塩性、安定性および温度依存性を変更するための定向進化手法由来のポリヌクレオチド結合成分の特性決定から決定され得る。
ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（helix-hairpin-helix）（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding protein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディングクランプ、前進性因子（processivity factor）、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen）（ＰＣＮＡ）から独立に選択される１つまたは複数のドメインを好ましくは含む。
ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインは、ＤＮＡに配列非特異的様式で結合するポリペプチドモチーフである。それらは、ポリメラーゼに融合された場合に塩安定性および前進性を付与し、それらの熱安定性を増大させることが示されている。好適なドメインは、メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶ（配列番号１２９）由来のドメインＨ（残基６９６〜７５１）およびドメインＨＩ（残基６９６〜８０２）を含む。下の考察のとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、配列番号１３０に示す配列番号１２９のドメインＨ〜Ｌであってよい。メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶは、下に考察の２本鎖結合タンパク質の一例である。
ＨｈＨドメインは、配列番号９４もしくは１０７もしくは１０８に示す配列またはその変種を好ましくは含む。このドメインは、本発明の構築物において使用された場合にヘリカーゼの前進性および耐塩性を増大させる。配列番号９４もしくは１０７もしくは１０８の変種は、配列番号９４または１０７または１０８のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号９４または１０７または１０８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号９４または１０７または１０８と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
ＳＳＢは、高親和性で配列非特異的様式で１本鎖ＤＮＡに結合する。それらは、全ての生き物に種々の形態で存在し、単量体または多量体としてＤＮＡに結合する。アミノ酸配列の配列比較およびアルゴリズム（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖモデルなど）を使用して、ＳＳＢはそれらの配列相同に従って分類され得る。Ｐｆａｍファミリー、ＰＦ００４３６は、全てが公知のＳＳＢに配列類似性を示すタンパク質を含む。ＳＳＢのこの群は、次いでタンパク質の構造分類（Structural Classification of Proteins）（ＳＣＯＰ）に従ってさらに分類され得る。ＳＳＢは、次の系列に分けられる：クラス；全てのベータタンパク質、フォールド；ＯＢ−フォールド、スーパーファミリー：核酸結合タンパク質、ファミリー；１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ。このファミリー内でＳＳＢは、各サブファミリー内でしばしば特性決定されるいくつかの型の分子種を含むサブファミリーに分類され得る。
ＳＳＢは、ヒト、マウス、ラット、真菌、原虫または植物など由来の真核生物由来、細菌および古細菌などの原核生物由来またはウイルス由来であってよい。
真核性ＳＳＢは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）として公知である。多くの場合それらは、さまざまなサイズの単位から形成されたヘテ三量体である。大きな単位（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＰＡ７０）のいくつかは安定であり、単量体形態でｓｓＤＮＡに結合する。
細菌性ＳＳＢは安定なホモ四量体（例えば大腸菌（E.coli）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））またはホモ二量体（例えばディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima））としてＤＮＡに結合する。古細菌ゲノム由来のＳＳＢは、真核ＲＰＡと関連すると考えられている。クレン古細菌門スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）によってコードされるＳＳＢなどのそのいくつかは、ホモ四量体である。他の大部分の種由来のＳＳＢは、真核生物由来の複製タンパク質に密接に関連しており、ＲＰＡと称される。これらの種のいくつかにおいて、それらは単量体であることが示されている（メタノコッカス・ジャンナスキイ（Methanococcus jannaschii）およびメタノサーモバクター・サーモオートトロフィクカム（Methanothermobacter thermoautotrophicum）。さらに、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）およびメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）を含む古細菌の他の種は、ＲＰＡに配列類似性を有する２つのオープンリーディングフレームをそれぞれ含有すると考えられている。タンパク質レベルでの証拠はなく、それらのＤＮＡ結合能力またはオリゴマー状態に関する公表されたデータもない。しかし、これらの各遺伝子中の２つのオリゴヌクレオチド／オリゴ糖（oligonucleotide/oligosaccharide）（ＯＢ）フォールドの存在（Ｍ．ブルトニイ（M.burtonii）ＯＲＦの１つの場合にはＯＢフォールド３個）はそれらも１本鎖ＤＮＡに結合することを示唆している。
ウイルス性ＳＳＢは、単量体としてＤＮＡに結合する。このことおよびそれらの比較的小さなサイズは、それらを、例えば可動性ペプチドリンカーを介して他のタンパク質に遺伝子的に融合しやすくする。代替的にＳＳＢは、別々に発現され、化学的方法（例えばシステイン、非天然アミノ酸）によって他のタンパク質に付着される場合がある。これは下でより詳細に考察される。
ＳＳＢは、好ましくは（ｉ）正味の負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を含むＳＳＢ（ｉｉ）Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域に含む修飾ＳＳＢのいずれかである。そのようなＳＳＢは、膜貫通ポアを遮断せず、したがって標的ポリヌクレオチドの特性決定を可能にする。
正味の負電荷を有さないＣ末端領域を含むＳＳＢの例は、これだけに限らないが、ヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ；配列番号１１８、ヒト複製タンパク質Ａ ７０ｋＤａサブユニット、ヒト複製タンパク質Ａ １４ｋＤａサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質アルファサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質ベータサブユニットのコアドメイン、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のテロメアタンパク質１（Ｐｏｔ１）の保護、ヒトＰｏｔ１、マウスまたはラット由来ＢＲＣＡ２のＯＢ−フォールドドメイン、ｐｈｉ２９由来のｐ５タンパク質（配列番号１１９）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。変種は、野生型タンパク質から変化したアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる（上に記載のとおり）。例えば、１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定され得る。
配列番号１１８または１１９の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号１１８または１１９に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号１１８または１１９と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。
正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそれらのＣ末端領域に必要とするＳＳＢの例は、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）のＳＳＢ（ＥｃｏＳＳＢ；配列番号１２０、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のＳＳＢ、ディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）のＳＳＢ、サーマス・サーモフィラルス（Thermus thermophiles）のＳＳＢ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来ＳＳＢ、ヒト複製タンパク質Ａ ３２ｋＤａサブユニット（ＲＰＡ３２）断片、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＣＤＣ１３ ＳＳＢ、大腸菌（E. coli）由来プライモソーム複製タンパク質Ｎ（Primosomal replication protein N）（ＰｒｉＢ）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来ＰｒｉＢ、仮説タンパク質Ａｔ４ｇ２８４４０、Ｔ４由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号１２１）、ＲＢ６９由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号９５）、Ｔ７由来ＳＳＢ（ｇｐ２．５；配列番号９６）またはこれらの任意のタンパク質の変種を含む。したがって本発明の方法において使用されるＳＳＢは、これらのタンパク質のいずれかに由来してよい。
Ｃ末端領域中の１つまたは複数の修飾に加えて、方法において使用されるＳＳＢはＣ末端領域の外側にあるまたはＣ末端領域の正味の負電荷を減少させない追加的修飾を含んでよい。換言すると本発明の方法において使用されるＳＳＢは、野生型タンパク質の変種に由来する。変種は、野生型タンパク質のものから変化しているアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、上に考察したとおり決定され得る。
本発明において使用されるＳＳＢは、配列番号９５、９６、１２０または１２１の変種に由来してよい。換言すると配列番号９５、９６、１２０または１２１の変種は、本発明において使用されるＳＳＢのための出発点として使用できるが、実際に使用されるＳＳＢは、Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域にさらに含む。配列番号９５、９６、１２０または１２１の変種は、配列番号９５、９６、１２０または１２１にアミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号９５、９６、１２０または１２１と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有してよい。
通常のタンパク質ＮからＣへの命名法に従ってＳＳＢのＣ末端領域を同定することは容易である。ＳＳＢのＣ末端領域は、ＳＳＢのＣ末端の最後の３分の１などの好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約３分の１である。ＳＳＢのＣ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の４分の１、５分の１または８分の１などのＳＳＢのＣ末端の最後の約４分の１、５分の１または８分の１である。ＳＳＢの最後の３分の１、４分の１、５分の１または８分の１は、アミノ酸の数を単位としてまたはＳＳＢタンパク質の一次構造の実際の長さを単位として測定されてよい。ＮからＣ方向での種々のアミノ酸の長さは、当技術分野において公知である。
Ｃ末端領域は、好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１０から最後の約６０アミノ酸である。Ｃ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１５、最後の約２０、最後の約２５、最後の約３０、最後の約３５、最後の約４０、最後の約４５、最後の約５０または最後の約５５アミノ酸である。
Ｃ末端領域は、グリシンおよび／またはプロリンのリッチ領域を典型的には含む。このプロリン／グリシンリッチ領域は、Ｃ末端領域に可動性を与え、Ｃ末端領域を同定するために使用され得る。
正味の負電荷を減少させるための好適な修飾は、米国仮特許出願第６１／６７３，４５７号（２０１２年７月１９日出願）、米国仮特許出願第６１／７７４，６８８号（２０１３年３月８日出願）および本出願と同時に出願された国際出願に開示されている（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｒｅｆ：ＯＮＴ ＩＰ ０３５）。ＳＳＢは、米国仮特許出願および国際出願に開示されているいずれのＳＳＢであってもよい。
修飾ＳＳＢは、配列番号１０３、１０４、１２２から１２５に示されるものから選択される配列を最も好ましくは含む。
２本鎖結合タンパク質は高親和性で２本鎖ＤＮＡに結合する。好適な２本鎖結合タンパク質は、これだけに限らないがミューテーターＳ（ＭｕｔＳ；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿４１７２１３．１；配列番号１４０）、Ｓｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus）Ｐ２；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４３８８９．１；配列番号１４１；Nucleic Acids Research、2004、Vol 32、No. 3、1197-1207）、Ｓｓｏ１０ｂ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４６．１；配列番号１４２）、Ｓｓｏ１０ｂ２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４８．１；配列番号１４３）トリプトファンリプレッサー（Ｔｒｐリプレッサー；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２９１００６．１；配列番号１４４）、ラムダリプレッサー（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４０６２８．１；配列番号１４５）、Ｃｒｅｎ７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４５９．１；配列番号１４６）、主なヒストンクラスＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６６４０３．２；配列番号１４７）、ｄｓｂＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４９８５８．１；配列番号１４８）、Ｒａｄ５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８６６．２；配列番号１４９）、スライディングクランプおよびトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（配列番号１２９）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。配列番号１２９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号１２９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種は、ヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号１２９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。大部分のポリメラーゼは、スライディングクランプと相互作用することにより前進性を達成している。一般にこれらは、ｄｓＤＮＡの周囲を囲む多量体タンパク質（ホモ二量体またはホモ三量体）である。これらのスライディングクランプは、ＡＴＰ依存性プロセスでそれらをＤＮＡヘリックスの周囲に会合させるためにアクセサリータンパク質（クランプローダー）を必要とする。それらもＤＮＡと直接接触せず、形態的テザーとして作用する。スライディングクランプがポリメラーゼドメインを介する特異的様式で同族ポリメラーゼと相互作用することから、この断片はヘリカーゼのスライディングクランプへの動員刺激のためにヘリカーゼに融合され得る。この相互作用は共有結合の作製によってさらに安定化され得る（システインまたは非天然アミノ酸の導入）。
ＤＮＡスライディングクランプに関して前進性因子は、それらの同族ポリメラーゼをＤＮＡに固着させるウイルス性タンパク質であり、作製される断片の長さの劇的な増大を導く。それらは、単量体（単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）１由来ＵＬ４２についての場合）または多量体（サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）由来ＵＬ４４は二量体である）であってよく、それらはＤＮＡ鎖周囲に閉じた環を形成せず、それらはＤＮＡに直接接触する。ＵＬ４２は、その対応するポリメラーゼの速度を低減することなく前進性を増大させることが示されており、それがＳＳＢとは異なるモードでＤＮＡと相互作用することを示唆している。ＵＬ４２は、配列番号９７もしくは配列番号１０２に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号９７または１０２の変種は、配列番号９７または１０２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号９７または１０２に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号９７または配列番号１０２と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
ＵＬ４２をヘリカーゼに付着させることは、遺伝子的融合または化学的付着（システイン、非天然アミノ酸）を介して行われ得る。ＵＬ４２に結合しているポリメラーゼポリペプチドが結晶構造において観察できることから、これらの３５アミノ酸（残基１２００〜１２３５）はヘリカーゼのＣ末端に融合でき、このポリペプチドと前進性因子との間の天然の親和性は複合体を形成するために使用される。相互作用は、共有結合相互作用（システインまたは非天然アミノ酸）を導入することによって安定化され得る。選択肢の１つは、ポリペプチド相互作用部位近くに位置付けられている天然ＵＬ４２システイン（Ｃ３００）を利用し、ポリメラーゼポリペプチドに点変異（例えばＬ１２３４Ｃ）を導入することである。
ポリメラーゼ前進性を増大する報告された方法は、大腸菌（E.coli）チオレドキシン（Ｔｒｘ）とバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシン結合ドメイン（ＴＢＤ）（残基２５８〜３３３）との間の相互作用を活用することである。ＴｒｘからＴＢＤへの結合は、ＤＮＡに結合するものへのコンホメーション変化をポリペプチドに生じさせる。ＴＢＤは、ＤＮＡ鎖上に固定され、ポリメラーゼオフ速度を限定し、それにより前進性を増大させると考えられている。キメラポリメラーゼは、ＴＢＤを非前進性ポリメラーゼに転移することによって作製され、重合された断片長の１０００倍増加を生じる。ＴＢＤを任意の他のクラスのタンパク質に付着させる試みはなかったが、ＴＢＤとＴｒｘとの間の共有結合は操作され、相互作用を安定化するために使用できる。
いくつかのヘリカーゼは、前進性を達成するためにアクセサリータンパク質をｉｎ−ｖｉｖｏで使用する（例えば大腸菌（E.coli）Ｒｅｐヘリカーゼに関して、ファージΦｘ１７４由来ｃｉｓＡおよびファージＭ１３由来ｇｅｎｅ ＩＩタンパク質）。これらのタンパク質のいくつかは、１つより多いヘリカーゼと相互作用することが示されている（例えばＭｕｔＬは同程度ではないがＵｖｒＤおよびＲｅｐの両方に作用する）。これらのタンパク質は内在性ＤＮＡ結合能力を有し、それらのいくつかは特異的ＤＮＡ配列を認識する。いくつかのこれらのアクセサリータンパク質のそれら自体を特異的ＤＮＡ配列に共有結合的に付着させる能力は、ヘリカーゼ活性についての一連の開始点を作出するためにも使用できる。
染色体の末端を保護するタンパク質は、テロメアｓｓＤＮＡ配列に高特異性の様式で結合する。この能力は、そのまままたは配列特異性を消滅させる点変異を使用することによってのいずれかで活用され得る。
小さなＤＮＡ結合モチーフ（ヘリックス−ターン−ヘリックスなど）は、特異的ＤＮＡ配列を認識する。バクテリオファージ４３４リプレッサーの場合、６２残基断片が操作され、ＤＮＡ結合能力および特異性を保持していることが示されている。
真核生物タンパク質における豊富なモチーフ、亜鉛フィンガーは特異的様式でＤＮＡに結合するおよそ３０アミノ酸からなる。典型的には各亜鉛フィンガーは３個のＤＮＡ塩基だけを認識するが、マルチプルフィンガーはより長い配列を認識するために連結されてよい。
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを引き上げるおよび下げる非常に堅固なクランプ（ドーナツ）を形成する。クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡは、ヘテロ三量体になることが特有であり、それにより１つのサブユニットを機能化し、活性を保持することが可能である。そのサブユニットは、配列番号９８、９９および１００に示されている。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号９８、９９および１００に示す配列またはその変種を含む三量体である。ＰＣＮＡスライディングクランプ（ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ＿０６８６３０５０．１；配列番号１５０）は二量体を形成する。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号１５０またはその変種を含む二量体である。変種は、配列番号９８、９９、１００または１５０から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてそれぞれその配列全体にわたって配列番号９８、９９および１００に少なくとも５０％相同性を有する配列を含む典型的には三量体または、配列番号１５０に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を有する配列を含む二量体であり、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号９８、９９、１００または１５０と異なっている配列を含んでよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。好ましい実施形態では、クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡのサブユニット１および２（すなわち配列番号９８および９９またはその変種）は、遺伝子的に融合されるなど付着し、得られたタンパク質は本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着される。構築物の使用の際にサブユニット３（すなわち配列番号１００またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。好ましい実施形態では、ＰＣＮＡスライディングクランプ（すなわち配列番号１５０またはその変種）の１つの単量体は、遺伝子的に融合されているなど、本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着されている。構築物の使用の際に第二の単量体（すなわち配列番号１５０またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。
ポリヌクレオチド結合モチーフは、下の表５に示すもののいずれかから選択されてよい。
ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチド結合酵素に好ましくは由来する。ポリヌクレオチド結合酵素は、ポリヌクレオチドに結合でき、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用し、修飾するポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させることによってそれを修飾できる。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できる限り酵素活性を示す必要はない。例えば成分は、その酵素活性を除去するように修飾されている酵素由来であってよく、またはそれが酵素として作用することを妨げる条件下で使用されてよい。
ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくは核酸分解酵素由来である。酵素は、より好ましくは酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバー由来である。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のもののいずれかであってよい。
好ましい酵素は、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよび、ジャイレースなどのトポイソメラーゼである。好適なエキソヌクレアーゼは、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素、高度好熱菌（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪならびにバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼおよびその変種を含む。
ポリメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群２．７．７．６、２．７．７．７、２．７．７．１９、２．７．７．４８および２．７．７．４９のいずれかのメンバーである。ポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０１）由来である。成分は、配列番号１０１に示す配列またはその変種を含む場合がある。配列番号１０１の変種は、配列番号１０１のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
配列番号１０１のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列の全長にわたって配列番号１０１のアミノ酸配列に少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
ヘリカーゼは、上に考察したもののいずれであってもよい。ヘリカーゼ二量体および多量体は下に詳細に考察される。ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼ由来のポリヌクレオチド結合ドメインであってよい。例えばポリヌクレオチド結合成分は、配列番号１０５または１０６に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号１０５または１０６の変種は、配列番号１０５または１０６のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
配列番号１０５または１０６のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１０５または１０６のアミノ酸配列の配列の全長にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が４０以上のストレッチ、例えば５０、６０、７０または８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
トポイソメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
ポリヌクレオチド結合成分は、上に考察したいずれの酵素であってもよい。
成分は、明示用標識（revealing label）で標識されてよい。標識は、上に記載のもののいずれであってもよい。
成分は、大腸菌（E. coli）、Ｔ．サーモフィルス（T. thermophilus）またはバクテリオファージ、などの任意の成分産生生物から単離され得る、または合成的もしくは組換え的手段によって作製できる。例えば成分は、下に記載のとおりｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻訳および転写によって合成出来る。成分は、下に記載のとおり大規模に産生されてよく、精製が続く。
ヘリカーゼオリゴマー
上の考察から明らかであるとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼに好ましくは由来する。例えばそれは、ヘリカーゼ由来ポリヌクレオチドドメインであってよい。成分は、１つまたは複数のヘリカーゼをより好ましくは含む。ヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼを含む上に考察したもののいずれであってもよい。そのような実施形態では本発明の構築物は、ヘリカーゼの少なくとも１つが本発明により修飾されており、互いに付着している２個以上のヘリカーゼを当然ながら含む。構築物は、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のヘリカーゼを含んで良い。換言すると本発明の構築物は、ヘリカーゼ二量体、ヘリカーゼ三量体、ヘリカーゼ四量体、ヘリカーゼ五量体などを含んでよい。
２つ以上のヘリカーゼは、任意の方向で互いに付着していてよい。同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同一のアミノ酸位置または空間的に近接しているアミノ酸位置を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーヘッド」編成と呼ばれる。代替的に同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼの反対または異なる側の位置を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーテール」編成と呼ばれる。３つの同一のまたは類似のヘリカーゼを含むヘリカーゼ三量体は、ヘッドトゥーヘッドおよびヘッドトゥーテール編成の両方を含む場合がある。
２つ以上のヘリカーゼは、互いに異なっていてよい（すなわち構築物はヘテロ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。例えば本発明の構築物は：（ａ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼ；（ｂ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ；（ｃ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩヘリカーゼ；（ｄ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ；（ｅ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩヘリカーゼ；または（ｆ）１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩヘリカーゼを含む場合がある。構築物は、同じヘリカーゼの２つの異なる変種を含む場合がある。例えば構築物は、各変種において異なる位置に導入された１つまたは複数のシステイン残基またはＦａｚ残基を有する、上に考察したヘリカーゼの内の１つの２つの変種を含む場合がある。この場合ヘリカーゼは、ヘッドトゥーテール編成であってよい。好ましい実施形態では、Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０の変種はシステイン連結を介してＱ５５７Ｃを含む配列番号１０の変種に付着されてよい。Ｈｅｌ３０８ＭｂｕのＣｙｓ変異体は、必要に応じてヘテロ二量体に作製されてもよい。この手法ではＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ４４２ＣおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ５７７Ｃなどの２つの異なるＣｙｓ変異体対は、ヘッドトゥーテール様式で連結されてよい。ヘテロ二量体は、２つの可能な方法で形成されてもよい。第一は、上に考察したホモ二機能性リンカーの使用を含む。ヘリカーゼ変種の１つは、１つのリンカーがタンパク質の１分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および他のヘリカーゼ変種と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
第二は、ヘテロ二機能性リンカーの使用を含む。例えばヘリカーゼ変種の１つは、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にシクロオクチン官能基（ＤＩＢＯ）を含有する第一のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。この一例は下に示される：
第二のヘリカーゼ変種は、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にアジド官能基を含有する第二のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。一例を下に示す：
２つの異なるリンカーを有する２つのヘリカーゼ変種は、次いで精製され、二量体を作製するために合わせてクリック（銅フリークリックケミストリーを使用する）されてよい。銅フリークリックケミストリーは、その望ましい特徴によりこれらの応用において使用されている。例えばそれは、迅速、清潔およびタンパク質に無毒である。しかし他の好適な生体直交型化学は、これだけに限らないが、シュタウディンガー化学、ヒドラジンまたはヒドラジド／アルデヒドまたはケトン試薬（ＨｙＮｉｃ＋４ＦＢ化学、全てのＳｏｌｕｌｉｎｋ（商標）試薬を含む）、ディール・アルダー試薬対およびボロン酸／サリチルヒドロキサム酸試薬を含む。
同じヘリカーゼの２つの異なる変種を連結するこれらの２つの方法は、２つの異なるヘリカーゼの二量体およびヘリカーゼポリメラーゼ二量体などのヘリカーゼと成分とが互いに異なっている上に考察した構築物のいずれについても有効である。
類似の方法がさまざまなＦａｚ変種を連結するために使用され得る。１つのＦａｚ変種（Ｑ４４２Ｆａｚを含む配列番号１０など）は、１つのリンカーがタンパク質の１つの分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾Ｆａｚ変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および第二のＦａｚ変種（Ｑ５７７Ｆａｚを含む配列番号１０など）と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
ヘテロ二量体は、同じヘリカーゼまたは異なるヘリカーゼのシステイン変種とＦａｚ変種とを連結することによっても作製できる。例えば任意の上のシステイン変種（Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０など）は、任意の上のＦａｚ変種（Ｑ５７７Ｆａｚを含む配列番号１０など）と二量体を作製するために使用できる。一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能性および他方の末端にＤＢＣＯ官能性を有するヘテロ二機能性ＰＥＧリンカーは、この変異体の組合せにおいて使用できる。そのようなリンカーの一例は、下に示されている（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）：
リンカーの長さは、２つの官能基間のＰＥＧ単位の数を変えることによって変更できる。
ヘリカーゼヘテロ三量体は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼおよびこれらの変種から選択される３種の異なる型のヘリカーゼを含んでよい。３個より多いヘリカーゼを含むオリゴマーについても同様である。構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、配列番号１０、２２、３３または５２の異なる変種などの同じヘリカーゼの異なる変種であってよい。異なる変種は、異なる位置を介する付着を促進するために異なる位置で修飾されてよい。ヘテロ三量体は、したがってヘッドトゥーテールおよびヘッドトゥーヘッド編成である場合がある。
本発明の構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに同じであってよい（すなわち構築物はホモ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。ホモオリゴマーは、２つ以上のＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、２つ以上のＸＰＤヘリカーゼ、２つ以上のＲｅｃＤヘリカーゼ、２つ以上のＴｒａＩヘリカーゼまたは２つ以上の上に考察した任意の変種を含んでよい。そのような実施形態ではヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同じ位置を使用して好ましくは付着している。ヘリカーゼは、したがってヘッドトゥーヘッドで付着している。ヘリカーゼは、同じ位置でヘリカーゼに置換されているシステイン残基またはＦａｚ残基を使用して連結されてよい。同一のヘリカーゼ変種中のシステイン残基は、マレイミドまたはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基を含有するホモ二機能性リンカーを使用して連結されてよい。これらの官能基は、次の例のとおりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の末端にあってよい：
リンカーの長さは、必要とされる応用に合わせて変更できる。例えばｎは、２、３、４、８、１１、１２、１６またはそれ以上であってよい。ＰＥＧリンカーは、水溶性などの好都合な特徴を有することから好適である。他の非ＰＥＧリンカーもシステイン連結において使用できる。
同様の手法を使用することによって同一のＦａｚ変種は、ホモ二量体に作製され得る。ＤＩＢＯ官能基を有するホモ二機能性リンカーは、Ｃｕ２＋フリークリック化学を使用してホモ二量体を作製するために、同じＦａｚ変種の２分子を連結するために使用できる。リンカーの一例は下に示されている：
ＰＥＧリンカーの長さは、２、４、８、１２、１６またはそれ以上のＰＥＧ単位を含んで変化してよい。そのようなリンカーは、定量を容易にするために蛍光タグを組み込んで作製されてもよい。そのような蛍光タグは、マレイミドリンカーにも組み込まれ得る。
本発明は、本発明のヘリカーゼおよび、配列番号１３０（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来トポイソメラーゼＶ由来Ｈ−Ｌドメイン；配列番号１２９）を含むアミノ酸配列または配列番号１３０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号１３０に少なくとも８０％相同を有するその変種を含む構築物であって、ヘリカーゼがアミノ酸配列に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物も提供する。ヘリカーゼは上に考察した任意の方法でアミノ酸配列に付着してよい。
本発明の好ましい構築物は、下の表６に示されている。各列は、左側のカラムのヘリカーゼが右側のカラムの追加的ポリヌクレオチド結合成分に本発明により付着している好ましい構築物を示す。右側のカラムのポリヌクレオチド結合成分がヘリカーゼである場合、それも本発明のヘリカーゼであり得る。
ポリヌクレオチド配列
本明細書に記載の任意のタンパク質は、当技術分野において公知の方法を使用して発現され得る。ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して単離および複製され得る。染色体ＤＮＡは、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）などのヘリカーゼ産生生物からおよび／または大腸菌（E. coli）などのＳＳＢ産生生物から抽出され得る。目的の配列をコードしている遺伝子は、特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いでクローニングベクターなどの組換え複製可能ベクターに組み込まれてよい。ベクターは、適合性の宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。したがってポリヌクレオチド配列は、目的の配列をコードしているポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入し、ベクターを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製され得る。ベクターは宿主細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニングのために好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、下により詳細に記載される。
ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターにクローニングされてよい。発現ベクターではポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結される。そのような発現ベクターは構築物を発現するために使用され得る。
用語「作動可能に連結する」は、記載される構成成分がそれらが意図する様式で機能する関係の近位にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性である条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。同じまたは異なるポリヌクレオチドの複数のコピーは、ベクターに導入されてよい。
発現ベクターは、次いで好適な宿主細胞に導入されてよい。それにより構築物は、構築物をコードしているポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性の細菌宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって産生され得る。
ベクターは、複製開始点、場合により前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供される例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、例えばアンピリシン耐性遺伝子を含有してよい。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞に適合性であるように選択されてよい。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターは典型的には使用される。
宿主細胞は、典型的には高いレベルで構築物を発現する。ポリヌクレオチド配列で形質転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用される発現ベクターに適合性であるように選ばれる。宿主細胞は、典型的には細菌性、好ましくは大腸菌（E. coli）である。λＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えばＣ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現できる。
本発明の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、好ましくはポアに電位が印加されて実行される。下により詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアとヘリカーゼまたは構築物との複合体の形成を典型的には生じる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に印加された電位は、化学電位であってよい。この一例は、両親媒性層全体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。
本発明は標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物に接触させて、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップも含む。
ステップ（ａ）および（ｂ）は、上に考察したとおり好ましくはポアに電位が印加されて実行される。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流が標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは、鎖配列決定法である。
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためである。ポリヌクレオチドは上に定義されている。
標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。
標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る。
試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典型的には古細菌のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界の１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましくは液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜などの商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。
試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。
試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子または細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７０℃より低くで、保存されてもよい。
膜貫通ポアは、ある程度膜を超える構造である。それは印加された電位によって駆動された水和イオンが膜を超えてまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を超え、それにより水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れられる。しかし膜貫通ポアは、膜を超えている必要はない。それは、一方の端で閉じていてもよい。例えばポアは、水和イオンが膜に沿ってまたは膜内に流れ得る穴であってもよい。
任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工であってよい。好適なポアは、これだけに限らないが、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポアおよびソリッドステートポアを含む。
任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性の部分および少なくとも１つの親油性または疎水性の部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は合成または天然に存在するものでよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は当技術分野において公知であり、例えば７ｓ（Gonzalez-Perezら、Langmuir、2009、25、10447-10450）を含む。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが１本のポリマー鎖を作るように併せて重合されている重合体材料である。ブロック共重合体は、典型的には各単量体サブユニットによって寄与される特徴を有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが有さない特有の特徴を有する場合がある。ブロック共重合は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）である一方で他のサブユニット（複数可）が水性媒体中では親水性であるように操作されてよい。この場合ブロック共重合体は、両親媒性特徴を有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロック共重合体は、ジブロック（２個の単量体サブユニットからなる）であってよいが、両親媒性物質として振る舞うさらに複雑な配置を形成するために２個より多い単量体サブユニットから構築されてもよい。共重合体はトリブロック、テトラブトックまたはペンタブロック共重合体であってもよい。
両親媒性層は、単層または二重層であってよい。両親媒性層は、典型的には平面状脂質二重層または支持された二重層である。
両親媒性層は典型的には、脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さまざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。
好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。
別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２０３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層は、グラフェン（graphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成され得る。好適なグラフェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。
方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を用いて典型的には実行される。両親媒性層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される。
ポリヌクレオチドは、膜にカップリングされ得る。これは、任意の公知の方法を用いてされ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合は（下に詳細に考察されるとおり）、ポリヌクレオチドは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に好ましくはカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。
ポリヌクレオチドは膜に直接カップリングされ得る。ポリヌクレオチドは好ましくは膜にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とヘリカーゼとの間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。リンカーが用いられる場合、リンカーはポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに典型的には付着される。
カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに直接付着された場合、二重層とヘリカーゼ活性部位との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に二重層から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロール（cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、両親媒性層にカップリングされる。合成脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表７に要約する。
ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、二重層へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。
ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡの５’に付加され得る(Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77)。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る(Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。
代替的に反応基は、二重層に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5)。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡにライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離された。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が融解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしくは修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一重鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、カップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。ここ例えばポリヌクレオチドは、付着された反応基を有するプライマーを用いて合成され得る。
ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール（cholesterol）、チオール（thiol）、ビオチン（biotin）または脂質などの反応基を有するアンチセンスプライマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングのための反応基を含有する。
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層など）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。
膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、いくつかの反復サブユニット（６、７、８または９サブユニット）から好ましくは作られる。ポアは好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。
膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。
Ｍｓｐ由来の単量体は典型的には、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入され得る。
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。
相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ましくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−（Ｂ１）８の全変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。さらに好ましい変種は、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む。配列番号２の変種は変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６ＲをＭＳ−（Ｂ１）８の全ての変異に加えて含み、ＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８と称される。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表８に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表９におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定され得る。
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加され得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。
上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。
Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、上に記載されている。
Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。
そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。
配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層などの両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。
変種は、ヘリカーゼまたは構築物への共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、ヘリカーゼまたは構築物への付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。
変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。
変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとおり決定され得る。
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考察の通り作出され得る。
配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。
上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。
配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。
α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。
システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。
（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、またはリンカーを介して付着され得る。
ヘリカーゼまたは構築物は、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。ヘリカーゼまたは構築物は、好ましくはポアに共有結合的に付着されていない。ポアおよびヘリカーゼまたは構築物への電圧の印加は、典型的には標的ポリヌクレオチドを配列決定できるセンサーの形成を生じる。これは、下により詳細に考察される。
本明細書に記載の任意のタンパク質、すなわちヘリカーゼ、膜貫通タンパク質ポアまたは構築物は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ヘリカーゼ、ポアまたは構築物上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば125I、35S）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。
タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る。
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたは構築物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、他の非特異的修飾もそれらがポア形成またはヘリカーゼまたは構築物機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
ヘリカーゼ、ポアおよび構築物は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて得られ、複製され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現され得る。ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成され得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。
ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、大規模に生成されることができ、タンパク質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍを含む。
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定するステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により測定され得る。
（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、例えば標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数または標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を測定することによって測定され得る。
（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来であるとして同定できる。
（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流における変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区別できるようにする。
（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシンは、各ヌクレオチドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る。
種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に:電気的測定および光学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定(Soni GVら、Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301)と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。
電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出され得る。
好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と、標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む。
方法は、ポアが膜内に存在している膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障壁を含むチャンバーを含む。障壁は典型的にはポアを含有する膜が形成される開口部を有する。代替的に障壁は、ポアが存在する膜を形成する。
方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載の装置を用いて実行され得る。
方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップを含んでよい。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。
方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチルイミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は 好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。Ｈｅｌ３０８、ＸＰＤ、ＲｅｃＤおよびＴｒａＩヘリカーゼは、高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。
方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。
方法は、０ｏＣから１００ｏＣまで、１５ｏＣから９５ｏＣまで、１６ｏＣから９０ｏＣまで、１７ｏＣから８５ｏＣまで、１８ｏＣから８０ｏＣまで、１９ｏＣから７０ｏＣまでまたは２０ｏＣから６０ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。
方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物および／またはヘリカーゼもしくは構築物の作用を促進する酵素補因子の存在下で実行されてもよい。方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物の非存在下でおよび酵素補因子の非存在下で実行されてもよい。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ヘリカーゼまたは構築物を機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
標的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼまたは構築物およびポアと任意の順序で接触され得る。標的ポリヌクレオチドがヘリカーゼまたは構築物およびポアと接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初にヘリカーゼまたは構築物と複合体を形成することは好ましい。ポアに電圧が印加される場合、標的ポリヌクレオチド／ヘリカーゼまたは構築物複合体は次いでポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
上に考察したとおり、ヘリカーゼは、ポアに関して２つのモードで作動できる。本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物は、２つのモードでも作動できる。第一に、方法は、印加された電圧から生じる場に沿ってポアを通って標的配列を移動させるようにヘリカーゼまたは構築物を用いて好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの３’末端が最初にポア（３’から５’ヘリカーゼ）に捕捉され、標的配列が最終的に二重層のｔｒａｎｓ側に移行されるまで場に沿ってポアを通るようにヘリカーゼまたは構築物は、ＤＮＡをポア中に移動させる（図８を参照されたい）。代替的に、方法は、印加された電圧から生じる場とは反対にヘリカーゼまたは構築物が標的配列をポアを通して移動させるように好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの５’末端が最初にポア（３’から５’ヘリカーゼ）に捕捉され、ヘリカーゼまたは構築物は、標的配列が最終的に二重層のｃｉｓ側に戻って放されるまで印加された場とは反対にポアの外側へ引かれるようにＤＮＡをポアを通して移動させる（図７を参照されたい）。
他の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する。方法は、ポアと本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との複合体を形成するステップを含む。複合体は、ポアとヘリカーゼまたは構築物とを標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップによって形成され得る。印加される電位は、上に記載のとおり化学電位または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポアをヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによっても形成され得る。共有結合付着のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーである。方法は、Ｍｓｐ由来のポアと本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との複合体を形成するステップを好ましくは含む。本発明の方法を参照して上に考察した任意の実施形態は、この方法に等しく適用される。本発明は、本発明の方法を使用して産生されるセンサーも提供する。
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。キットは、（ａ）ポアおよび（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、キットに等しく適用する。
キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構成成分をさらに含んでよい。
本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌクレオチドを含み得る。
装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置も提供する。装置は、複数のポアおよび複数の本発明のヘリカーゼまたは複数の本発明の構築物を含む。装置は、本発明の方法を実行するための説明書を好ましくはさらに含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、本発明の装置に等しく適用可能である。
装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。
装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。
装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。
装置は、
膜および複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器を好ましくは含み、
流体系は、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）において記載の任意のものであってよい。
本発明のヘリカーゼを産生する方法
本発明は、本発明のヘリカーゼを産生する方法も提供する。一実施形態では方法は、１つまたは複数の単量体から形成され、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼを提供するステップを含む。上に考察した任意のヘリカーゼは、方法において使用できる。
方法は、ヘリカーゼの同じ単量体上の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するようにヘリカーゼを修飾するステップも含む。接続の部位および方法は、上に考察したとおり選択される。
別の実施形態では方法は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを提供するステップを含む。上に考察した任意のＨｅｌ３０８ヘリカーゼは使用できる。
方法は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を導入するステップをさらに含む。
方法は、（ｃ）例えば５０℃、１０分間加熱することにより修飾ヘリカーゼを加熱するステップ、（ｄ）例えば修飾ヘリカーゼを高強度ＵＶ光に２５４ｎｍで約１０から約１５分間曝露することによる修飾ヘリカーゼをＵＶ光に曝露するステップ、または（ｅ）フェロシアン化カリウムおよびフェリシアン化カリウムなどのフェロシアン化物およびフェリシアン化物に修飾ヘリカーゼを曝露するステップを好ましくはさらに含む。ステップ（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の任意の組合せ、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｃ）および（ｄ）、（ｄ）および（ｅ）、（ｃ）および（ｅ）または（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）などは実施できる。
方法は、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼは正しく修飾されており、本発明のヘリカーゼが産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明のヘリカーゼは産生されていない。
本発明の構築物を産生する方法
本発明は、本発明の構築物を産生する方法も提供する。方法は、本発明のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着、好ましくは共有結合的に付着させるステップを含む。上に考察した任意のヘリカーゼおよび成分が方法において使用できる。共有結合的付着の部位および方法は上に考察したとおり選択される。
方法は、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼおよび成分は正しく付着され、本発明の構築物が産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明の構築物は産生されていない。
次の実施例は本発明を例示する。
実施例
本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を合成する方法を記載する。この場合、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）の一次配列中の位置２８４および６１５のシステイン間の共有結合は、これらの位置をビスマレイミドＰＥＧ３リンカー（長さおよそ３．７ｎｍ）と反応させることによって作製した。
詳細には、１Ｍ ＤＴＴ ６μｌをＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、４２１ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ中に保存）６００μＬに加え、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホイールで３０分間インキュベートした。この混合物をＰｉｅｒｃｅ ２ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩カラム７ｋ ＭＷＣＯを通して、１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０ ｐＨ８．０に緩衝液交換し、試料５５０μＬを得た。これにビスマレイミドＰＥＧ３（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ、製品番号＝１０２１５）５．５μＬを加え、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホイールで１２０分間インキュベートした。反応を止めるために、残っているマレイミドを消光するための１Ｍ ＤＴＴ ５．５μＬを添加した。反応の分析は、７．５％ポリアクリルアミドゲルによってまたは逆相ＨＰＬＣ（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ５ ３００Ａ ５μｍ １５０ｘ４．６ｍｍカラムでのクロマトグラフ、０．１％ ＴＦＡ中のアセトニトリルグラジエントを使用）によってであった。図１は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）反応混合物のクーマシー染色７．５％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液で添加された）を示す。レーンＸは、適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示す。レーンａ〜ｃは、２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）単量体（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。レーンｄ〜ｆは２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有し、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーに付着させる反応がほとんど１００％収率に進んだことはゲルから明らかであった。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールｐＨ８．０に緩衝液交換した。
本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミドによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、配列番号１０９はペプチド配列ＳＲＤＦＷＲＳに対応する））を合成する方法を記載する。この場合Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）の一次配列中の位置２８４および６１５のシステイン間に共有結合を、これらの位置をビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド、配列番号１０９はペプチド配列ＳＲＤＦＷＲＳに対応する）と反応させることによって作製した。
詳細には、１Ｍ ＤＴＴ ２μＬをＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、４２１ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ中に保存）２００μＬに加え、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホイールで３０分間インキュベートした。混合物をＰｉｅｒｃｅ ２ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩カラム７ｋ ＭＷＣＯを通して、１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０ ｐＨ８．０に緩衝液交換し、試料５４０μＬを得た。１００ｕｌの一定分量に、１０ｍＭマレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド（ＰＰＲＬ、製品番号＝１６４５０）０．５ｕｌを添加し、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホールで１２０分間インキュベートした。反応を止めるために、残っているマレイミドを消光するための１Ｍ ＤＴＴ １ｕＬを添加した。反応の分析は７．５％ ポリアクリルアミドゲルによってまたは逆相ＨＰＬＣ（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ５ ３００Ａ ５μｍ １５０ｘ４．６ｍｍカラムでのクロマトグラフ、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルグラジエントを使用）によってである。図２は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）反応混合物のクーマシー染色７．５％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルを示す。レーンＸは適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示す。レーンＡは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を基準として含有する。上のバンドはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３に対応し、下のバンドはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応する。レーンＢは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有し、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）（上のバンド）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）（下のバンド）に対するバンドが観察されることから、ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌリンカーに付着する反応が完了まで進まなかったことはゲルから明らかであった。レーンＣはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミドによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、配列番号１０９はペプチド配列ＳＲＤＦＷＲＳに対応する））を次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールｐＨ８．０に緩衝液交換した。
本実施例は、その開口部が閉じている２つのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３）（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）の酵素前進性をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）のものと蛍光に基づくアッセイを使用して比較する。
材料および方法
配列番号１１０から１１４。配列番号１１２は５’末端にカルボキシフルオレセインを、および３’末端にブラックホールクエンチャーを有する。
通例の蛍光基質をハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッセイするために用いた（図３）。蛍光基質（最終５０ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバーハングならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの８０および３３塩基対セクション（図３セクションＡ、配列番号１１０）を有する。主要な下部「テンプレート」鎖は、８０ｎｔ「ブロッカー」鎖（配列番号１１１）にハイブリダイズされ、その３’オーバーハングおよび３３ｎｔ蛍光プローブに隣接し、その５’および３’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基でそれぞれ標識される（配列番号１１２）。ハイブリダイズされると、ＦＡＭはＢＨＱ−１から離れ、基質は基本的に蛍光性である。ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）の存在下でヘリカーゼ（１０ｎＭ）は、図３セクションＢに示すとおり基質の３’オーバーハング（配列番号１１０）に結合し、下部鎖に沿って移動し、８０ｎｔブロッカー鎖（配列番号１１１）を置換し始める。前進性である場合、ヘリカーゼは、蛍光プローブ（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号１１２）も置換する（図３セクションＣ）。蛍光プローブは、その５’および３’末端が自己相補的であり、それにより一度置換されると動力学的に安定なヘアピンを形成し、プローブのテンプレート鎖への再アニーリングを防ぐように設計される（図３セクションＤ）。ヘアピン産物の形成ではＦＡＭはＢＨＱ−１の近傍に運ばれ、その蛍光は消光される。８０塩基長「ブロッカー」（配列番号１１１）および蛍光（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号１１２）鎖を置換できる前進性酵素は、したがって経時的な蛍光における減少をもたらす。しかし酵素が８０ｎｔ未満の前進性を有する場合は、蛍光鎖（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号１１２）を置換することができず、それにより「ブロッカー」鎖（配列番号１１１）は主要な下部鎖（図３セクションＥ、配列番号１１０）に再アニールする。
追加的な通例の蛍光基質を対照目的のためにも使用した。陰性対照として使用した基質は、図３に記載のものと同一であったが、３’オーバーハング（図４セクションＡ（配列番号１１１、１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、その３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）ならびに１１３））を欠失している。図３に記載のものと同様だが８０塩基対セクションを欠失している基質を活性だが前進性である必要はないヘリカーゼ（図４セクションＢ、（配列番号１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、その３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）および１１４））の陽性対照として使用した。
図５は、緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１１０、１１１および１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）中での図３に示す前進性基質に対するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）の試験での時間依存性蛍光変化のグラフを示す。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）によって示された蛍光の減少は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）と比較したこれらの複合体の前進性の増大を示す。図６は、全ての試料に関して蛍光が減少したことから全てのヘリカーゼが実際に活性であったことを実証する陽性対照を示す。
本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（９００塩基長）の移動を制御するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）の能力をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、次の変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）のものと比較する。図７に場と反対および図８に場に沿ったＤＮＡ移行の制御のための一般的方法を示す。
材料および方法
５０−ポリＴ５’リーダーをＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの約９００塩基断片にライゲーションすることによって、ＤＮＡを形成した。リーダーは、ＤＮＡが二重層に挿入されるようにするために配列番号１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する）がハイブリダイズされた相補性セクションも含有する。最後にＡＣＧＴの４ｎｔ ３’−オーバーハングを得るためにＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの３’末端をＡａｔＩＩ消化酵素で消化した（ＤＮＡ基質設計の図に関して図９を参照されたい）。
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕについて使用した緩衝溶液：４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ フェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２，
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３について使用した緩衝溶液： ４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２，
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）
酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）は最終２００ｎＭで加え、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミド３ＰＥＧリンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）は最終１０ｎＭで添加した。
１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポアから電気計測値を得た。二重層は、モンタル−ミューラー技術によって開口部直径約１００ｕｍ、厚さ２０ｕｍのＰＴＦＥフィルム（Ｄｅｌｒｉｎ ｃｈａｍｂｅｒｓ注文生産）で形成され、２個の１ｍＬ緩衝溶液に分けた。全ての実験は、上記の緩衝溶液中で実行した。単一チャネル電流を１４４０Ａデジタイザーを備えたＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。白金電極を緩衝溶液に繋ぎ、ｃｉｓコンパートメント（ナノポアおよび酵素／ＤＮＡの両方が添加されている）をＡｘｏｐａｔｃｈ ｈｅａｄｓｔａｇｅのアースに繋ぎ、ｔｒａｎｓコンパートメントをｈｅａｄｓｔａｇｅの探査電極に繋ぐ。
二重層中に単一ポアを達成後、ＤＮＡ複合体（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、ＤＮＡ＝Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）について０．１ｎＭおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）について０．０５ｎＭ、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）ならびにＡＴＰ（２ｍＭ）を電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。対照実験を＋１４０ｍＶで行った。次いでヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０、２００ｎＭ）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、１０ｎＭ）をｃｉｓコンパートメントに添加した。実験は、＋１４０ｍＶの一定電位で実行した。
結果および考察
図１０に示すとおり、ヘリカーゼ−単量体ＤＮＡ基質のＭｓｐＡナノポア（図７に示す）への添加は、特徴的電流遮断を生じる。ヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）は制御された様式でナノポアを通してＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（２００ｎＭ、配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．１ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を図１０に示す。最も上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（２０〜５０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す（図１０を参照されたい）。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、１つ（Ｈ）だけが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポアを通して移動させることを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）での完全な実行において、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約３０％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝１９ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）は、場とは反対に制御された様式でナノポアを通してＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３リンカー（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．０５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）を図１１に示す。最も上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１１５ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜４０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す（図１１を参照されたい）。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動のどれもが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポアを通して移動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、場と反対（５’が下）のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約８５％がポリＴで完了することが見出され（ｎ＝２７ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）、それにより未修飾Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕと比較して前進性の実質的な改善を実証している。この実験は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を観察するために酵素１０ｎＭだけを必要とする、しかしＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）実験は２００ｎＭ酵素を使用した。したがって、開口部が閉じられているヘリカーゼのより低い酵素濃度が長い読み取り長を達成しながら使用できる。
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）は印加された場の力に沿ってナノポアを通してＤＮＡを移動させることができる増強された能力を示し（詳細は図８を参照されたい）、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．０５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）を図１２に示す。最も上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜４０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ−Ｄと印を付けた一連の４個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す（図１２を参照されたい）。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場に沿って（ＤＮＡは３’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図８を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。３’が下のＤＮＡは、配列に関連して異なる電流および異なる変動を有して５’が下のＤＮＡとは特徴的に異なるサインを示す。このセクションにおける４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動のどれもが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポアを通して移動させることを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、場に沿った（３’が下）ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約８７％がポリＴで完了することが見出された（ｎ＝１５ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。比較して、３’が下のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）を使用する場合にはほとんど観察されず、その場合移動は典型的には５０未満の状態が観察されて短く、この方向での高いレベルでの酵素解離を示唆している。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での３’が下の長いリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、３’が下のモードでの前進性における驚くべき改善を示す。
本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）がナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（その３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサーに付着している配列番号１２７、その最後は配列番号１２８の５’末端に付着している）の移動を制御する能力を有することを示す。図７に場と反対におよび図８に場に沿った制御されたＤＮＡ移行のための一般的方法を示す。
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ（０．５ｎＭ、（その３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサーに付着している配列番号１２７、その最後は配列番号１２８の５’末端に付着している）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を合わせて１時間、予備インキュベートした。
緩衝液（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）から電気測定値を得た。ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびＡＴＰ（１ｍＭ）を緩衝液（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と一緒に混合し、次いでＤＮＡ（その３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサーに付着している配列番号１２７、その最後は配列番号１２８の５’末端に付着している）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）予備混合物と合わせて混合した。二重層中に単一ポアを達成した後、予備混合物を単一ナノポア実験系に添加した。実験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を閉じた複合体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）について観察した。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の一例を図１３に示す。
本実施例は、ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ＰＥＧ１１（ＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）を合成する方法を記載する。この場合ＴｒｗＣ Ｃｂａ（配列番号１２６）の一次配列中の位置３４６および６９１のシステイン間に共有結合を、これらの位置をＰＥＧ１１リンカーと反応させることによって作製した。
材料および方法
詳細には、ＤＴＴ（２μｌ、１Ｍ）をＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ（２００μｌ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ、６９２ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中に保存）に添加し、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホールで３０分間インキュベートした。この混合物をＰｉｅｒｃｅ ２ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩カラム７ｋ ＭＷＣＯを通して、１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０ ｐＨ８．０に緩衝液交換し、同じ緩衝液に希釈し、１０μＬ一定分量の試料を得た。マレイミド−ＰＥＧ１１−マレイミド（５０ｕＭ最終濃度、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、製品番号１０３９７）を一定分量の１つに添加し、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホールで１２０分間インキュベートした。反応を止めるために、残っているマレイミドを消光するためのＤＴＴ（１Ｍを１ｕｌ）を添加した。反応の分析は７．５％ポリアクリルアミドゲルによってである。図１４は、ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌ（ビスマレイミドポリエチレングリコールリンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）反応混合物の７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルのクーマシー染色を示す。ゲルの右側のレーン（Ｍと標識）は適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの右に示されている）を示す。レーン１は、およそ１０μＭ ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｄ６５７Ｃ／Ｒ３３９Ｃ単独（変異Ｄ６５７Ｃ／Ｒ３３９Ｃを有する配列番号１２６）の５μＬを基準として含有する。レーン２は、およそ１０μＭ ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）の５μＬを含有する。レーン２に示すとおり、上のバンドは二量体酵素分子種（Ａと標識）に対応する、中央のバンドは閉じた複合体（Ｂと標識）ＴｒａＩ−Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）に対応する。未修飾出発材料（Ｃと標識）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ（変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）に対するバンドが観察されたことから、ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌリンカーに付着する反応が完了まで進まなかったことはゲルから明らかであった。
ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ＰＥＧ１１（ＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）を次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。
本実施例において記載したものと類似の手順を使用して、下の表１０に列挙する次の閉じた複合体を作製できる。
本実施例は多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０）を蛍光アッセイを使用してｄｓＤＮＡ分子の代謝回転速度（分−１酵素−１）について調査した場合に、検査した変異体ヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０））がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較してｄｓＤＮＡ分子の増大した代謝回転速度（分−１酵素−１）を有することを例示する。
材料および方法
通例の蛍光基質を多数のＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０））のハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換する能力をアッセイするために使用した。図１５の１）に示すとおり、蛍光基質鎖（最終５０ｎＭ）は３’および５’ｓｓＤＮＡオーバーハングの両方、ならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４４塩基セクションを有する。３’ｓｓＤＮＡオーバーハングを含有する上部鎖は、カルボキシフルオレセイン塩基（カルボキシフルオレセイン（図１５においてｃと標識）が配列番号１５１中の位置６でチミンに付着している）を５’末端に有し、ハイブリダイズされた相補物は、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、図１５においてｅと標識）塩基（ブラックホールクエンチャーは配列番号１５２中の位置８１でチミンに付着している）を３’末端に有する。２本の鎖がハイブリダイズされると、フルオレセインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は実質的に非蛍光性である。さらに下の蛍光基質鎖に部分的に相補的である捕捉鎖（配列番号１５３）１μＭはアッセイに含まれる。２）に示すとおりＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（１ｍＭ）の存在下で、基質に添加された適切なヘリカーゼ（１０ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖に沿って移動し、相補鎖を置換する。３）に示すとおりＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４）に示すとおり置換された鎖は過剰量の捕捉鎖に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。
結果および考察
図１６および１７のグラフは、多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（図１６および１７で１と標識、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（図１６および１７で２と標識、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（図１６で３と標識、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（図１６で４と標識、変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（図１６で５と標識、変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）ならびにＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（図１７で６と標識、変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０））について緩衝液（４００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１５１および１５２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号１５３））中でのｄｓＤＮＡ代謝回転（酵素−１分−１）を示す。調査した塩濃度（４００ｍＭ ＫＣｌ）では、次のヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（図１６および１７で２と標識、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（図１６で３と標識、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（図１６で４と標識、変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（図１６で５と標識、変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（図１７で６と標識、変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０）は、対照Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（図１６および１７で１と標識、配列番号１０）よりも高いｄｓＤＮＡ代謝回転速度を示した（図１６および１７を参照されたい）。これは、調査した条件下でＨｅｌ３０８Ｍｂｕ対照（配列番号１０）と比較した場合にこれらの酵素がｄｓＤＮＡ分子の増大した代謝回転速度（分−１酵素−１）を示すことを示唆している。
本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｓ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）の光処置のための２つの手順を記載する。
手順１−ＵＶ光への曝露
保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、４℃、ＮａＣｌ（３６０〜３９０ｍＭ）および５％グリセロール）中のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）をＰＣＲチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ０．２ｍＬ ｔｈｉｎ ｗａｌｌチューブ）にピペットで取った。試料を氷上に置き、２５４ｎｍの高強度ＵＶ光（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ Ｌｏｎｇｌｉｆｅ Ｆｉｌｔｅｒ ｌａｍｐ（２５４ｎｍおよび３６５ｎｍ）に４．５ｃｍの距離で上から曝露した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を１５分間曝露し、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を１０分間曝露した。次いであらゆる沈殿タンパク質を除去するために両方の試料を５分間、１６０００ｇで遠心分離した。可溶性画分を不溶性沈殿からピペットで慎重に除去した。
手順２−白色光への曝露（ＬＥＤ源）
保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、４℃、ＮａＣｌ（３７０ｍＭ）および５％グリセロール）中のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）を微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、１．５ｍＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏ Ｂｉｎｄ）にピペットで取った。試料を（キャップを開けて）氷上に置き、ＬＥＤ光源（Ｓｃｈｏｔｔ Ａ２０９６０．１）に全出力で３ｃｍの距離で上から曝露した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を３時間曝露した。
手順３−白色光（ＬＥＤ源）への曝露および加熱
保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、４℃、ＮａＣｌ（３７０ｍＭ）および５％グリセロール）中のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）を微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、１．５ｍＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏ Ｂｉｎｄ）にピペットで取った。試料を（キャップを開けて）氷上に置き、ＬＥＤ光源（Ｓｃｈｏｔｔ Ａ２０９６０．１）に全出力で１ｃｍの距離で上から曝露した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を１時間曝露した。試料をＰＣＲチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ０．２ｍＬ ｔｈｉｎ ｗａｌｌチューブ）に移し、４℃にする前に５０℃で１０分間加熱し、次いであらゆる沈殿タンパク質を除去するために５分間、１６０００ｇで遠心分離した。可溶性画分を不溶性沈殿からピペットで慎重に除去した。
本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（３．６ｋｂ）の移動を制御するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）の能力を、多数のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ変異体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された））のものと比較する。図１８に場と反対の制御されたＤＮＡ移行のための一般的方法を示す。
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ（０．２ｎＭ、（その５’末端で４個のニトロインドールに付着している配列番号１５４（図１８においてｘと標識）、その最後は配列番号１５５の３’末端に付着している）、配列番号１５６および配列番号１１７）ならびに適切なヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（１００ｎＭ、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（１００ｎＭ、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（１００ｎＭ、変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（１００ｎＭ、変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（５００ｎＭ、変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された））を緩衝液（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＡＴＰ）中に溶解した。
緩衝液（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）から電気測定値を得た。ブロック共重合体中に単一ポアを達成した後、次いで緩衝液（３ｍＬ ９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０）を系を通して流した。最終に、予備混合物（上に記載）を単一ナノポア実験系に添加した。実験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
結果および考察
検査した全ての酵素、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された）からヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を観察した。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す電流トレース例を図１９〜２３に示す。しかし変異体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された））はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較して増大した前進性を示した、表１１を参照されたい。実験において観察されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、鎖の末端（ポリＴ領域に）まで全てＤＮＡを処理した移動の％は変異体ヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された））についてＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較した場合に顕著に高かった。


本発明はまた以下を提供する。
［１］ １つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているヘリカーゼ。
［２］ ２つ以上の部分が開口部を閉じるように繋がれている、［１］に記載のヘリカーゼ。
［３］ いかなるコンホメーション状態でも開口部を含まないように修飾されている、［１］または［２］に記載のヘリカーゼ。
［４］ ポリヌクレオチド周囲の共有結合的に閉じた構造を形成できるように修飾されている、［１］から［３］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［５］ ２つ以上の部分が一過的に繋がれている、［１］から［３］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［６］ ポリヌクレオチド結合ドメインが、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含む、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［７］ ２つ以上の部分の少なくとも１つが開口部の部分を形成する、開口部に隣接しているまたは開口部に近い、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［８］ 開口部の部分を形成するまたは開口部に隣接している２つ以上アミノ酸を連結することによって修飾されている、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［９］ ２つ以上の部分が親和性分子によって繋がれている、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１０］ 親和性分子が、（ａ）相補的ポリヌクレオチド、（ｂ）抗体またはその断片および相補的エピトープ、（ｃ）ペプチドジッパー、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン、（ｇ）アプタマーおよび相補的タンパク質または（ｈ）ハーフキレーターである、［９］に記載のヘリカーゼ。
［１１］ ２つ以上の部分が１つまたは複数のリンカーを使用して繋がれている、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１２］ １つもしくは複数のリンカーがアミノ酸配列および／または１つもしくは複数の化学的架橋剤である、［１１］に記載のヘリカーゼ。
［１３］ アミノ酸配列がポリヌクレオチド結合成分を含む、［１２］に記載のヘリカーゼ。
［１４］ １つまたは複数のリンカーの一方の末端または両方の末端がヘリカーゼに共有結合的に付着されている、［１１］から［１２］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１５］ ２つ以上の部分の少なくとも１つが、１つまたは複数のリンカーの付着を促進するために修飾されている、［１１］から［１３］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１６］ ２つ以上の部分の少なくとも１つのアミノ酸がシステインまたは非天然アミノ酸で置換されている、［１５］に記載のヘリカーゼ。
［１７］ 非天然アミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である、［１６］に記載のヘリカーゼ。
［１８］ ２つ以上の部分が、単量体の表面上にあるおよび／または単量体のループ領域である、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１９］ ２つ以上の部分が単量体中で空間的に近接している、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２０］ スーパーファミリー１またはスーパーファミリー２由来である、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２１］ Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはその変種である、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２２］ Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが表１に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、またはＴｒａＩヘリカーゼが表３に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、［２１］に記載のヘリカーゼ。
［２３］ １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入されているＨｅｌ３０８ヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ。
［２４］ ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するようにさらに修飾されている、［２３］に記載のヘリカーゼ。
［２５］ ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するように修飾されていない、［２４］に記載のヘリカーゼ。
［２６］ １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸が、（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置の１つもしくは複数に、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つもしくは複数にまたは（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に導入されている、［２３］から［２５］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２７］ 配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８のいずれか１つに示す配列の変種を含み、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置が表４ａおよび４ｂに示されている、［２６］に記載のヘリカーゼ。
［２８］ （ａ）位置Ｌ２６５、Ｅ２７５、Ｌ２７６、Ｓ２７９、Ｐ５８５、Ｋ６９０およびＥ６９３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１３（Ｈｅｌ３０８Ｐｆｕ）に示す配列の変種；
（ｂ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｖ２９７、Ｄ６７１、Ｋ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１６（Ｈｅｌ３０８Ｈｖｏ）に示す配列の変種；
（ｃ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｇ２９７、Ｄ６６８、Ｒ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１９（Ｈｅｌ３０８Ｈｌａ）に示す配列の変種；
（ｄ）位置Ｄ２８０、Ｋ２９０、Ｉ２９１、Ｓ２９４、Ｐ５８９、Ｔ６９４およびＮ６９７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２２（Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ）に示す配列の変種；
（ｅ）位置Ｌ２８１、Ｋ２９１、Ｑ２９２、Ｄ２９５、Ｄ５９６、Ｋ７０２およびＱ７０５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２５（Ｈｅｌ３０８Ｓｓｏ）に示す配列の変種；
（ｆ）位置Ｈ２６４、Ｅ２７２、Ｋ２７３、Ａ２７６、Ｇ５７６、Ｋ６７８およびＥ６８１の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２８（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｒ）に示す配列の変種；
（ｇ）位置Ｓ２７９、Ｌ２８９、Ｓ２９０、Ｄ２９３、Ｐ６４９、Ｋ７５３およびＲ７５６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２９（Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ）に示す配列の変種；
（ｈ）位置Ｙ２７６、Ｌ２８６、Ｓ２８７、Ｄ２９０、Ｐ５７９、Ｋ６７９およびＫ６８２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３２（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｇ）に示す配列の変種；
（ｉ）位置Ｌ２６６、Ｓ２７６、Ｌ２７７、Ｑ２８０、Ｐ５８３、Ｋ６８９およびＤ６９２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３３（Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ）に示す配列の変種；
（ｊ）位置Ｌ２８７、Ｅ２９７、Ｌ２９８、Ｓ３０１、Ｓ６０４、Ｋ７１０およびＥ７１３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３４（Ｈｅｌ３０８Ｔｂａ）に示す配列の変種；
（ｋ）位置Ｌ２８９、Ｑ２９９、Ｌ３００、Ｇ３０３、Ｎ６０６、Ｇ７１２およびＥ７１５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３７（Ｈｅｌ３０８Ｔｓｉ）に示す配列の変種；
（ｌ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｓ５８９、Ｋ６９１およびＤ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３８（Ｈｅｌ３０８Ｍｂａ）に示す配列の変種；
（ｍ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３９（Ｈｅｌ３０８Ｍａｃ）に示す配列の変種；
（ｎ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４０（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｈ）に示す配列の変種；
（ｏ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４１（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｚ）に示す配列の変種；
（ｐ）位置Ａ２６９、Ｌ２７９、Ａ２８０、Ｌ２８３、Ｈ５７５、Ｋ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４２（Ｈｅｌ３０８Ｍｔｈ）に示す配列の変種；
（ｑ）位置Ｈ２７４、Ｑ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９６、Ｋ６９９およびＱ７０２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４３（Ｈｅｌ３０８Ｍｚｈ）に示す配列の変種；
（ｒ）位置Ｇ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｔ５９０、Ｋ６９１およびＹ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４４（Ｈｅｌ３０８Ｍｅｖ）に示す配列の変種；
（ｓ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号４５（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａ）に示す配列の変種；
（ｔ）位置Ｇ２７７、Ｔ２８７、Ｅ２８８、Ｅ２９１、Ｄ６３４、Ｋ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４６（Ｈｅｌ３０８Ｎｍａ）に示す配列の変種；
（ｕ）位置Ａ２７０、Ｅ２７７、Ｒ２７８、Ｅ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＥ６８８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４７（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｏ）に示す配列の変種；
（ｖ）位置Ｑ２６４、Ｆ２６７、Ｅ２６８、Ｅ２７１、Ｐ５５９、Ｋ６６３およびＫ６６６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４８（Ｈｅｌ３０８Ｆａｃ）に示す配列の変種；
（ｗ）位置Ｒ２７５、Ｌ２８５、Ｓ２８６、Ｅ２８９、Ｐ５７６、Ｋ６７６およびＫ６７９の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４９（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｅ）に示す配列の変種；
（ｘ）位置Ｉ２７３、Ｌ２８３、Ｓ２８４、Ｅ２８７、Ｐ５７４、Ｋ６７４およびＫ６７７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５０（Ｈｅｌ３０８Ｍｊａ）に示す配列の変種；
（ｙ）位置Ｒ２５７、Ｌ２６７、Ｓ２６８、Ｄ２７１、Ｐ５５４、Ｋ６５１およびＫ６５４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５１（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｎ）に示す配列の変種；
（ｚ）位置Ｓ２６９、Ｑ２７７、Ｅ２７８、Ｒ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＲ６８８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号５２（Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ）に示す配列の変種；
（ａａ）位置Ｋ２６８、Ｋ２７７、Ａ２７８、Ｅ２８１、Ｄ５７５、Ｒ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５３（Ｈｅｌ３０８Ａｆｕ）に示す配列の変種；
（ａｂ）位置Ｄ２７７、Ｄ２８７、Ｄ２８８、Ｄ２９１、Ｄ６２６、Ｋ７２９およびＥ７３２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５４（Ｈｅｌ３０８Ｈｔｕ）に示す配列の変種；
（ａｃ）位置Ｄ２７６、Ｄ２８６、Ｑ２８７、Ｄ２９０、Ｄ５９５、Ｋ７０７およびＥ７１０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５５（Ｈｅｌ３０８Ｈｐａ）に示す配列の変種；
（ａｄ）位置Ｅ２８６、Ｅ２９６、Ｉ２９７、Ｖ３００、Ｄ６３３、Ａ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５８（Ｈｅｌ３０８Ｈｓｐ（ｓｋｉ２様ヘリカーゼ））に示す配列の変種；または
（ａｅ）Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１０に示す配列の変種
を含む、［２６］に記載のヘリカーゼ。
［２９］ １つまたは複数の非天然アミノ酸が、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ ６ −｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ ６ −［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ ６ −［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ ６ −（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ ６ −［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ ６ −Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸およびＮ ６ −［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンから選択される、［２３］から［２８］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［３０］ ［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
［３１］ ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法。
［３２］ 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物と、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
［３３］ １つまたは複数の特性が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、［３２］に記載の方法。
［３４］ 標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されている、［３３］に記載の方法。
［３５］ 標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定される、［３２］から［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３６］ 電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、［３５］に記載の方法。
［３７］ （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物に接触させて、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにするステップ；および
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、［３５］に記載の方法。
［３８］ ポアに電圧を印加して、ポアとヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含む、［３２］から［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］ ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、［３２］から［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］ ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、［３２］から［３９］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］ 膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、［４０］に記載の方法。
［４２］ 膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）８個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、［４１］に記載の方法。
［４３］ 膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す７個の同一サブユニットから形成されているα−ヘモリジンである、または（ｂ）７個のサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、［４１］に記載の方法。
［４４］ （ａ）ポアと、（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物との複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法。
［４５］ 複合体が、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下でポアとヘリカーゼまたは構築物とを接触させるステップおよび（ａ）ポアに電位を印加するステップによって形成される、［４４］に記載の方法。
［４６］ 電位が、電圧電位または化学電位である、［４５に記載の方法。
［４７］ 複合体が、ポアをヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによって形成される、［４５］に記載の方法。
［４８］ （ａ）ポアと、（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー。
［４９］ ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物の使用。
［５０］ （ａ）ポアおよび（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
［５１］ 両親媒性膜を含むチップをさらに含む、［５０］に記載のキット。
［５２］ （ａ）複数のポア、および（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載の複数のヘリカーゼまたは［３０］に記載の複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置。
［５３］ 複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を使用してポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー
を含む、［５２］に記載の装置。
［５４］ 複数のポアを支持でき、前記ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器
を含み、前記流体系が１つまたは複数の容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給するように構成されている、［５２］または［５３］に記載の装置。
［５５］ ［１］から［２２］または［２４］のいずれか一項に記載のヘリカーゼを産生する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の単量体から形成され、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼを提供するステップ、ならびに
（ｂ）ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するようにヘリカーゼを修飾し、それにより［１］から［２２または２４］のいずれか一項に記載のヘリカーゼを産生するステップ
を含む方法。
［５６］ ［２３］に記載のヘリカーゼを産生する方法であって、
（ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを提供するステップ；ならびに
（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を導入し、それにより［２３に記載のヘリカーゼを産生するステップを含む方法。
［５７］ （ｃ）得られたヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含む、［５５］または［５６］に記載の方法。
［５８］ ［３０］に記載の構築物を産生する方法であって、［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着させ、それにより本発明の構築物を産生するステップを含む方法。
［５９］ 得られた構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含む、［５８］に記載の方法。

Claims (26)

  1. 増大した前進性を有するヘリカーゼを製造する方法であって、
    （ａ）１つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むスーパーファミリー１またはスーパーファミリー２ヘリカーゼを提供するステップ、
    （ｂ）前記ヘリカーゼを修飾し、前記開口部の反対側にある前記単量体の２つ以上の部分を繋ぎ、前記開口部を閉じるステップ、
    （ｃ）前記ヘリカーゼが、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているかを決定するステップ、
    （ｄ）ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するときのポリヌクレオチドの読み取り長さを決定するステップであって、ポリヌクレオチドの読み取り長さが、ステップ（ａ）で提供されるヘリカーゼと比べて増大している場合に、ヘリカーゼは増大した前進性を有する、ステップ
    を含む、方法。
  2. ２つ以上の部分が、単量体の表面上にある、および／または、単量体のループ領域にある、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ｂ）の前に、タンパク質モデリング、Ｘ線回折、ＮＭＲ分光法またはクリオ電子顕微鏡を用いて１つまたは複数のアミノ酸を選択し、開口部、表面部分および／またはループ領域を同定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ２つ以上の部分が、（ａ）相互に相補的なポリヌクレオチド、（ｂ）抗体またはその断片およびそのエピトープ、（ｃ）ロイシンジッパー、（ｄ）β−シート増強、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋、（ｆ）ロタキサン、（ｇ）アプタマーおよびこれに結合するタンパク質または（ｈ）ハーフキレーター、によって繋がれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ２つ以上の部分が１つまたは複数のリンカーを使用して繋がれており、前記リンカーが、アミノ酸リンカー、および／または１つもしくは複数の化学的架橋剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ２つ以上の部分の少なくとも１つが、１つまたは複数のリンカーの前記２つ以上の部分への付着を促進するために修飾されている、または２つ以上の部分の少なくとも１つのアミノ酸がシステインもしくは非天然アミノ酸で置換されている、請求項５に記載の方法。
  7. ヘリカーゼが、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、またはＸＰＤヘリカーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により製造されたヘリカーゼ。
  9. 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
    （ａ）標的ポリヌクレオチドを、膜貫通ポアおよびスーパーファミリー１またはスーパーファミリー２ヘリカーゼと接触させるステップであって、前記ヘリカーゼは、１つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含み、前記ポアを通るポリヌクレオチドの移動を、未修飾ヘリカーゼに比べ前記ポリヌクレオチドのより長い長さにわたって制御することができるように、前記開口部の反対側にある前記単量体の２つ以上の部分が修飾により繋がれて前記開口部が閉じている、ステップ、ならびに
    （ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定する、ステップ
    を含む方法。
  10. ステップ（ａ）および（ｂ）が、ポアに電位を印加して実行される、請求項９に記載の方法。
  11. ポアに電位を印加し、ポアとヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. １つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むスーパーファミリー１またはスーパーファミリー２ヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が、開口部の反対側にある、開口部の部分を形成するまたは開口部に隣接している２つ以上のアミノ酸を連結することによって繋がれて、開口部を閉じるように修飾されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しており、未修飾ヘリカーゼに比べポリヌクレオチドからの解離が低減しているヘリカーゼ。
  13. ２つ以上の部分が、単量体中で空間的に近接しており、単量体の表面上にあるおよび／または単量体のループ領域であり、かつ、開口部を閉じるように繋がれている、請求項１２に記載のヘリカーゼ。
  14. ポリヌクレオチド周囲の共有結合的に閉じた構造を形成できるように修飾されている、または２つ以上の部分が一過的に繋がれている、請求項１２または１３に記載のヘリカーゼ。
  15. ２つ以上の部分が、（ａ）相互に相補的なポリヌクレオチド、（ｂ）抗体またはその断片およびそのエピトープ、（ｃ）ロイシンジッパー、（ｄ）β−シート増強、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋、（ｆ）ロタキサン、（ｇ）アプタマーおよびこれに結合するタンパク質または（ｈ）ハーフキレーター、によって繋がれている、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
  16. ２つ以上の部分が１つまたは複数のリンカーを使用して繋がれており、前記リンカーが、アミノ酸リンカー、および／または１つもしくは複数の化学的架橋剤である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
  17. ２つ以上の部分の少なくとも１つが、１つまたは複数のリンカーの前記２つ以上の部分への付着を促進するために修飾されている、または２つ以上の部分の少なくとも１つのアミノ酸がシステインもしくは非天然アミノ酸で置換されている、請求項１６に記載のヘリカーゼ。
  18. ドメイン２中のアミノ酸とドメイン４中のアミノ酸とが連結されている、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
  19. Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、またはＸＰＤヘリカーゼである、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
  20. 請求項１２〜１９のいずれか一項に記載のヘリカーゼであって、ヘリカーゼが、ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部が閉じるように、１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入された、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼであり、ヘリカーゼが、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、前記ヘリカーゼ。
  21. １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸が、（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置の１つもしくは複数に、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つもしくは複数にまたは（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に導入されている、請求項２０に記載のヘリカーゼ。
  22. （ａ）位置Ｌ２６５、Ｅ２７５、Ｌ２７６、Ｓ２７９、Ｐ５８５、Ｋ６９０およびＥ６９３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１３（Ｈｅｌ３０８Ｐｆｕ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１３に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｂ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｖ２９７、Ｄ６７１、Ｋ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１６（Ｈｅｌ３０８Ｈｖｏ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１６に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｃ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｇ２９７、Ｄ６６８、Ｒ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１９（Ｈｅｌ３０８Ｈｌａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１９に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｄ）位置Ｄ２８０、Ｋ２９０、Ｉ２９１、Ｓ２９４、Ｐ５８９、Ｔ６９４およびＮ６９７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２２（Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号２２に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｅ）位置Ｌ２８１、Ｋ２９１、Ｑ２９２、Ｄ２９５、Ｄ５９６、Ｋ７０２およびＱ７０５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２５（Ｈｅｌ３０８Ｓｓｏ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号２５に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｆ）位置Ｈ２６４、Ｅ２７２、Ｋ２７３、Ａ２７６、Ｇ５７６、Ｋ６７８およびＥ６８１の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２８（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｒ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号２８に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｇ）位置Ｓ２７９、Ｌ２８９、Ｓ２９０、Ｄ２９３、Ｐ６４９、Ｋ７５３およびＲ７５６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２９（Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号２９に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｈ）位置Ｙ２７６、Ｌ２８６、Ｓ２８７、Ｄ２９０、Ｐ５７９、Ｋ６７９およびＫ６８２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３２（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｇ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３２に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｉ）位置Ｌ２６６、Ｓ２７６、Ｌ２７７、Ｑ２８０、Ｐ５８３、Ｋ６８９およびＤ６９２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３３（Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３３に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｊ）位置Ｌ２８７、Ｅ２９７、Ｌ２９８、Ｓ３０１、Ｓ６０４、Ｋ７１０およびＥ７１３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３４（Ｈｅｌ３０８Ｔｂａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３４に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｋ）位置Ｌ２８９、Ｑ２９９、Ｌ３００、Ｇ３０３、Ｎ６０６、Ｇ７１２およびＥ７１５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３７（Ｈｅｌ３０８Ｔｓｉ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３７に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｌ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｓ５８９、Ｋ６９１およびＤ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３８（Ｈｅｌ３０８Ｍｂａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３８に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｍ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３９（Ｈｅｌ３０８Ｍａｃ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３９に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｎ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４０（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｈ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４０に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｏ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４１（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｚ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４１に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｐ）位置Ａ２６９、Ｌ２７９、Ａ２８０、Ｌ２８３、Ｈ５７５、Ｋ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４２（Ｈｅｌ３０８Ｍｔｈ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４２に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｑ）位置Ｈ２７４、Ｑ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９６、Ｋ６９９およびＱ７０２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４３（Ｈｅｌ３０８Ｍｚｈ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４３に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｒ）位置Ｇ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｔ５９０、Ｋ６９１およびＹ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４４（Ｈｅｌ３０８Ｍｅｖ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４４に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｓ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号４５（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４５に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｔ）位置Ｇ２７７、Ｔ２８７、Ｅ２８８、Ｅ２９１、Ｄ６３４、Ｋ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４６（Ｈｅｌ３０８Ｎｍａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４６に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｕ）位置Ａ２７０、Ｅ２７７、Ｒ２７８、Ｅ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＥ６８８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４７（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｏ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４７に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｖ）位置Ｑ２６４、Ｆ２６７、Ｅ２６８、Ｅ２７１、Ｐ５５９、Ｋ６６３およびＫ６６６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４８（Ｈｅｌ３０８Ｆａｃ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４８に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｗ）位置Ｒ２７５、Ｌ２８５、Ｓ２８６、Ｅ２８９、Ｐ５７６、Ｋ６７６およびＫ６７９の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４９（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｅ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号４９に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｘ）位置Ｉ２７３、Ｌ２８３、Ｓ２８４、Ｅ２８７、Ｐ５７４、Ｋ６７４およびＫ６７７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５０（Ｈｅｌ３０８Ｍｊａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号５０に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｙ）位置Ｒ２５７、Ｌ２６７、Ｓ２６８、Ｄ２７１、Ｐ５５４、Ｋ６５１およびＫ６５４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５１（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｎ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号５１に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ｚ）位置Ｓ２６９、Ｑ２７７、Ｅ２７８、Ｒ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＲ６８８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号５２（Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号５２に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ａａ）位置Ｋ２６８、Ｋ２７７、Ａ２７８、Ｅ２８１、Ｄ５７５、Ｒ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５３（Ｈｅｌ３０８Ａｆｕ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号５３に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ａｂ）位置Ｄ２７７、Ｄ２８７、Ｄ２８８、Ｄ２９１、Ｄ６２６、Ｋ７２９およびＥ７３２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５４（Ｈｅｌ３０８Ｈｔｕ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号５４に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ａｃ）位置Ｄ２７６、Ｄ２８６、Ｑ２８７、Ｄ２９０、Ｄ５９５、Ｋ７０７およびＥ７１０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５５（Ｈｅｌ３０８Ｈｐａ）に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号５５に対して少なくとも９０％同一である変種；
    （ａｄ）位置Ｅ２８６、Ｅ２９６、Ｉ２９７、Ｖ３００、Ｄ６３３、Ａ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５８（Ｈｅｌ３０８Ｈｓｐ（ｓｋｉ２様ヘリカーゼ））に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号５８に対して少なくとも９０％同一である変種；または
    （ａｅ）Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１０に示す配列の変種であって、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１０に対して少なくとも９０％同一である変種
    を含む、請求項２１に記載のヘリカーゼ。
  23. 請求項１２から２２のいずれか一項に記載のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
  24. 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって
    （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび請求項１２から２２のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２３に記載の構築物と、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
    （ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
    を含む方法。
  25. （ａ）ポアと、（ｂ）請求項１２から２２のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２３に記載の構築物とを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー。
  26. ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための請求項１２から２２のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２３に記載の構築物の使用。
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