KR20040023596A - 신규 맥시자임 - Google Patents

신규 맥시자임 Download PDF

Info

Publication number
KR20040023596A
KR20040023596A KR10-2003-7014258A KR20037014258A KR20040023596A KR 20040023596 A KR20040023596 A KR 20040023596A KR 20037014258 A KR20037014258 A KR 20037014258A KR 20040023596 A KR20040023596 A KR 20040023596A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
maxizyme
sequence
nucleotide sequence
molecule
rna
Prior art date
Application number
KR10-2003-7014258A
Other languages
English (en)
Inventor
다이라가즈나리
와라시나토모코
와라시나마사키
가와사키히로아키
하라도시후미
노자와이와오
Original Assignee
도꾸리쯔교세이호진 상교기쥬쯔 소고겡뀨죠
다이쇼 세이야꾸 가부시끼가이샤
제노펑션 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도꾸리쯔교세이호진 상교기쥬쯔 소고겡뀨죠, 다이쇼 세이야꾸 가부시끼가이샤, 제노펑션 인코포레이티드 filed Critical 도꾸리쯔교세이호진 상교기쥬쯔 소고겡뀨죠
Publication of KR20040023596A publication Critical patent/KR20040023596A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)

Abstract

본 발명의 목적은 표적 mRNA의 고차구조(conformation)에 관계없이 결합하고, 효과적으로 절단할 수 있는 맥시자임을 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 것을 특징으로 하는 맥시자임이 제공된다.

Description

신규 맥시자임{Novel Maxizyme}
1980년대 초, 미국 컬럼비아 대학의 Cech 등에 의한 테트라히메나 피리포미스(Tetrahymena pyriformis)의 rRNA의 셀프스플라이싱 현상의 발견(참조: K. Kruger, Cell, 31:147-157(1982)), 미국 예일 대학의 Altman이 수행한 RNA 및 단백질의 복합체 효소인 리보뉴클리아제 P의 해석결과(참조: C. Guerrier-Takada, Cell, 35:849-857(1983))으로부터, 촉매기능을 갖는 RNA인 리보자임(ribozyme: nucleotide acid + enzyme)이 발견되었다.
그 이후, 다양한 리보자임이 발견되어 오고 있지만, 그중에서도 햄머헤드(hammerhead)형 리보자임은 가장 우수한 연구가 진행되어 온 리보자임 중 하나이다. 햄머헤드형 리보자임은 천연에서는 자기절단반응(시스형)으로 기능하는 리보자임이지만, Uhlenbeck 등 및 Hasehoff 등의 그룹에 의해 2본의 RNA쇄(기질영역과 효소활성 보존영역)으로 분할(트랜스화)된 것으로부터(참조: O. C.Uhlenbeck, Nature, 328, 596(1987); J. Hasehoff, W. L. Gerlach, Nature, 334, 585(1988)), 리보자임에 의한 유전자 치료의 응용가능성이 시사되었다.
그리고, 암 또는 에이즈 등을 표적으로 한 다양한 응용연구가 많이 보고되었고(참조: M. Cotten, M. L. Bimstlel, EMBO J8, 861(1989)), 본 발명자 등도 매우 높은 기질 특이성을 갖고, 정상적인 mRNA에는 전혀 영향을 끼치지 않는 이상형의 접합(junction) 서열을 갖는 mRNA만을 절단하는 맥시자임을 개발하였다(참조: 국제공개 제 WO99/46388호).
그러나, 표적으로 된 mRNA는 2차구조 또는 3차구조를 갖기 때문에, 맥시자임의 기질결합 영역이 스템(stem) 구조 등에 가려진 경우, 맥시자임의 표적부위의 접근 장애가 되어 충분한 효과를 얻을 수 없다는 문제가 있었다.
본 발명은 맥시자임 및 그의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표적 RNA에 대하여 우수한 RNA 절단활성을 나타내는 맥시자임 및 그의 이용에 관한 것이다.
도 1은 CTE(constitutive transport element)의 2차구조를 나타낸다.
도 2는 CTE-Mz의 개요도를 나타낸다.
도 3은 LTR-luciferase mRNA의 2차구조를 나타낸다.
도 4는 Luc homo Mz가 2개의 mRNA의 Luc 절단부위에 결합한 경우의 그림을 나타낸다.
도 5는 Luc homo Mz가 2개의 mRNA의 TAR 절단부위에 결합한 경우의 그림을 나타낸다.
도 6은 Luc homo Mz가 1개의 mRNA의 Luc 절단부위 및 TAR 절단부위에 결합한 경우의 그림을 나타낸다.
도 7은 맥시자임 및 CTE-맥시자임이 1개의 LTR-luciferase mRNA에 결합한 그림을 나타낸다(시스형 맥시자임)
도 8은 맥시자임 및 CTE-맥시자임이 2개의 LTR-luciferase mRNA에 결합한 그림을 나타낸다(트랜스형 맥시자임)
도 9는 루시페라제 활성의 결과를 나타낸다(호모다이머형 맥시자임)
도 10은 루시페라제 활성의 결과를 나타낸다(헤테로다이머형 맥시자임)
본 발명의 목적은 표적 mRNA의 고차구조(conformation)에 관계없이 결합하고, 효과적으로 절단할 수 있는 맥시자임을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 맥시자임을 헬리카제 활성을 갖는 분자와 함께 작용시킴으로써 우수한 RNA 절단활성이 수득되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (19)에 개시된 발명에 관한 것이다.
(1) 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 것을 특징으로 하는 맥시자임.
(2) 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역을 포함하는 맥시자임.
(3) 하기의 뉴클레오티드 서열 (a)를 포함하는 RNA 분자 및 하기의 뉴클레오티드 서열 (b)를 포함하는 RNA 분자가 형성하는 2량체의 구조로 이루어지는 맥시자임:
5' X1 1…X1 hY1 1…Y1 iZ1 1…Z1 jB1 1…B1 p3'(a)
5' Z2 1…Z2 nY2 1…Y2 mX2 1…X2 kB2 1…B2 q3'(b)
상기 서열에서,
X1 1…X1 h, X2 1…X2 k, Y1 1…Y1 i, Y2 1…Y2 m, Z1 1…Z1 j, Z2 1…Z2 n, B1 1…B1 p및 B2 1…B2 q는 각각 독립적으로 A, U, T, C 또는 G 중 임의의 것이고;
h 및 k는 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이며;
i 및 m은 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이고;
j 및 n은 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이며;
p 및 q는 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이고;
X1 1…X1 h및 X2 1…X2 k는 표적 RNA 중의 특이적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이거나 또는 표적 RNA의 절단부위 주변의 서열에 상보적인 영역 및 표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+(마그네슘 이온)을 포착하는 공동(cavity)을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열이며;
Y1 1…Y1 i및 Y2 1…Y2 m은 스템을 형성하는 뉴클레오티드 서열이고;
Z1 1…Z1 j및 Z2 1…Z2 n은 표적 RNA의 절단부위의 주변 서열에 상보적인 영역 및 표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열이며; 및,
B1 1…B1 p및 B2 1…B2 q는 일방 또는 양방에 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
(4) 표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+(마그네슘 이온)을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열로서, Z1 1…Z1 j가 서열 GAA를 포함하는 것이고, Z2 1…Z2 n이 서열 CUGAYzGA(Yz는 A, G, U, C 중 임의의 모노뉴클레오티드를 나타낸다)를 포함하는 것인 (3)에 개시된 맥시자임.
(5) 표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열로서, X2 1…X2 k가 서열 GAA를 포함하는 것이고, X1 1…X1 h의 서열 CUGAYxGA(Yx는 A, G, U, C 중 임의의 모노뉴클레오티드를 나타낸다)를 포함하는 것인 (3) 또는 (4)에 개시된 맥시자임.
(6) 헬리카제 활성을 갖는 분자가 RNA 헬리카제인 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임.
(7) 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역이 서열번호 1(CTE)로 표시되는 뉴클레오티드인 (6)에 개시된 맥시자임.
(8) 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역이 서열번호 2(TAR)로 표시되는 뉴클레오티드인 (6)에 개시된 맥시자임.
(9) 뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각의 상류에 링커 서열 및 tRNAval프로모터 서열이 부가되어 있는 (3) 내지 (8) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임.
(10) 뉴클레오티드 서열 (a)의 상류에 부가되어 있는 링커 서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (e)를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 (b)의 상류에 부가된 링커 서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (f)를 포함하는 (9)에 개시된 맥시자임:
5' AAA 3' (e)
5' UUU 3' (f)
(11) 뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각 상류에 부가되어 있는 tRNAval프로모터 서열이 서열번호 3인 (9)에 개시된 맥시자임.
(12) 뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각 하류에 부가서열 및 터미네이터 서열이 부가되어 있는 (9)에 개시된 맥시자임.
(13) 뉴클레오티드 서열이 (a)의 하류에 부가되어 있는 부가서열이 하기의뉴클레오티드 서열 (g)를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 (b)의 하류에 부가되어 있는 부가서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (h)를 포함하며, 뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각의 하류에 부가되어 있는 터미네이터 서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (i)를 포함하는 (12)에 개시된 맥시자임:
5' AAA 3' (g)
5' AACCGUA 3' (h)
5' UUUUU 3' (i)
(14) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터.
(15) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임과 헬리카제 활성을 갖는 분자의 복합체.
(16) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, (14)에 개시된 발현벡터 또는 (15)에 개시된 복합체를 유효성분으로 함유하는 의약 조성물.
(17) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, (14)에 개시된 발현벡터 또는 (15)에 개시된 복합체를 사용하여 표적 핵산을 절단하는 방법.
(18) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, (14)에 개시된 발현벡터 또는 (15)에 개시된 복합체를 사용하여 표적 핵산의 생물학적 기능을 특이적으로 저해 또는 억제하는 방법.
(19) (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, (14)에 개시된 발현벡터 또는 (15)에 개시된 복합체를 사용하여 표적 핵산을 특이적으로 절단하거나또는 표적 핵산의 생물학적 기능을 특이적으로 저해하고, 전기 절단 또는 전기 저해가 생물학적 활성에 미치는 영향을 조사하는 것을 포함하는, 표적 핵산의 생물학적 기능의 해석방법.
[발명을 실시하기 위한 최상의 형태]
본 발명의 맥시자임은 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 당초 맥시자임에 헬리카제 활성을 갖는 분자가 결합한 경우, 그 입체장애에 의해 2량체 형성이 불가능할 것이라고 추측하였다. 특히 발현계로서 pol Ⅲ계를 사용한 경우에 있어서는, 5' 말단에 tRNAval이 부가되기 때문에 맥시자임의 입체장애는 더욱 커진다. 그러나, 놀랍게도 맥시자임은 2량체를 형성하고, 종래의 맥시자임에 비해 우수한 RNA 절단활성을 갖는 것이 확인되었다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
(맥시자임)
본 발명에서 맥시자임은 2량체로 기능하는 소형화한 햄머헤드(hammerhead)형 리보자임을 의미한다. 그의 소형화는 통상, 안티센스 영역(stemⅠ 및 stemⅡ), 활성중심 영역, stem-loopⅡ 영역으로 이루어진 햄머헤드형 리보자임의 stem-loopⅡ영역을 단쇄의 리카제로 치환시킴으로써 구축한다. 맥시자임은 그 활성발현에 Mg2+(마그네슘 이온)을 필요로 하고, 또한 다이머를 형성하기 위해서는 stemⅡ 부분의 G-C 염기부가 중요하다. 또한, 햄머헤드형 리보자임 및 맥시자임의 서열설계에 대해서는 생물물리, p99-104, Vol. 40 No.2(2000)에도 개시되어 있는, 본 문헌의 내용은 모두 본 명세서에 개시되어 인용된 것으로 한다.
마그네슘 이온을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 부위, 즉 활성중심 영역은 맥시자임 1개 당 1개이거나 2개이어도 무방하다. 활성중심 영역이 2개인 맥시자임은 1개의 기질에 동시에 2개소에 결합하고, 그 2개소의 NUX 트리플릿(triplet)(N은 A, G, C 또는 U이고, X는 A, C 또는 U이다)의 뒤에서 기질을 절단할 수 있는 것이면 기질의 절단효율이 높아진다.
맥시자임은 그의 2량체형(다이머) 구조 때문에 2개소에서 표적 mRNA와 결합한다. 2량체 형성의 경우에 1종류의 모노머가 2개 결합한 호모 다이머형 맥시자임(도 4, 도 5), 2종류의 다른 모노머가 결합한 헤테로 다이머형 맥시자임(도 6)을 디자인할 수 있다. 호모 다이머형 맥시자임은 설정된 결합부위를 가진 mRNA와 2개소에서 결합한다. 이 경우 2개의 mRNA가 1개의 맥시자임으로 분자내에서 결합하게 된다(트랜스형 맥시자임, 도 7). 한편, 헤테로 다이머형 맥시자임은 2개의 다른 서열부분에 결합할 수 있게 되고, 1개의 mRNA내의 다른 개소에 동시에 결합하는 경우(시스형 맥시자임, 도 8) 및, 각각의 서열부분이 개별적으로 한개의 맥시자임과 분자간(2개의 mRN)에서 결합하는 경우(트랜스형 맥시자임)이 있다.
(헬리카제 활성을 갖는 분자)
본 발명에서 헬리카제 활성을 갖는 분자는 mRNA에서 작용하고, RNA의 나선 구조(helical structure)를 불안정화시킴으로써 이중쇄 RNA를 포함하는 고차구조를 여는 작용을 갖는 것을 의미하고, 구체적으로는, 예컨대 RNA 헬리카제, 리보좀, 제한효소(EcoRI, EcoRV 등) 등을 예로 들 수 있다. 이와 같은 헬리카제 활성을 갖는 분자는 맥시자임에 직접 결합하거나, 어댑터 분자를 통해 결합해도 무방하다. 헬리카제 활성을 갖는 분자의 맥시자임의 결합부위는 맥시자임의 절단활성을 손상시키지 않는 장소라면 특별히 제한되지는 않지만, 맥시자임의 3'말단 부근인 것이 바람직하다.
맥시자임에 헬리카제 활성을 갖는 분자가 결합하기 위해서는 헬리카제 활성을 갖는 분자 또는 상기 어댑터 분자가 맥시자임에 안정적으로 결합하도록 새로운 결합영역을 부가할 필요가 있다. 헬리카제 활성을 갖는 분자 등의 결합영역은 대상이 되는 헬리카제 활성을 갖는 분자 또는 어댑터에 따라 다르지만, 헬리카제 활성을 갖는 분자의 RNA 2본쇄 결합영역으로부터 설계하는 것은 가능하다. 예컨대, 구성성 트랜스포트 엘리먼트(constitutive transport element: CTE, 서열번호 1, 도 1), HIV TAR RNA, POLY A RNA 등을 헬리카제 활성을 갖는 분자의 결합영역으로서 부가하는 것이 바람직하다.
CTE는 바이러스 구조 단백질의 발현 및 패키징(packaging)을 위하여, 스플라이싱(splicing)을 받지 않는 게놈 RNA를 세포질에 수송하기 위한 시스(cis) 작용성바이러스 RNA를 나타낸다. CTE는 Mason-Pfizer monkey virus(MPLV) 등의 원숭이 D형 레트로바이러스(monkey type D retrovirus)가 본래 가지고 있는 RNA이고, 이러한 바이러스는 스플라이싱을 받지 않는 RNA를 핵외로 수송하기 위해서 이 CTE라고 하는 RNA 모티브를 가지고 있다고 알려져 있다(참조: H. Tang et al,(1997) Science 276:1412-1415; J. Li et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:709-714; H. Tang et al., (1999) Mol. Cell Biol. 19:3540-3550).
본 발명의 적합한 실시태양에서는, 상기 CTE 또는 전기 CTE와 실질적으로 동일한 기능을 갖는 RNA 또는 전기 CTE와 실질적으로 동일한 기능을 갖는 CTE 서열의 변이체를 사용할 수 있다. 여기서「CTE와 실질적으로 동일한 기능을 갖는 RNA(RNA having functionally equivalent to those of CTE)」는 RNA 헬리카제와 결합 친화성을 갖는 CTE 이외의 분자, 에컨대 SELEX법으로 인공적으로 만든 헬리카제에 결합하는 아프타머(aptamer) 등의 분자를 의미한다. 또한, 「변이체(mutant)」는 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 개변(치환, 결실, 부가 또는 삽입)을 의미한다. 이와 같은 개변은 J. Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 등의 일반적 문헌에 개시된 방법에 의해 실시가능하다.
poly A RNA는 폴리 A 결합 단백질(PABP) 및 PABP와 상호작용을 하는 프로테인-1과의 상호작용을 통해 RNA 헬리카제와 상호작용한다.
또한, 헬리카제 활성을 갖는 분자의 결합영역은 맥시자임(호모 다이머, 헤테로 다이머)의 일방의 모노머에만 존재하는 것이라도, 양자에 존재하는 것이라도 무방하다(도 7). 맥시자임의 양자의 모노머에 존재하는 경우, 매우 큰 입체장애가 예상되지만, 이 경우에도 우수한 mRNA 절단활성이 확인되고 있다.
(헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 맥시자임)
본 발명의 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 것을 특징으로 하는 맥시자임 또는 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역을 포함하는 맥시자임의 구체적 예는 예컨대, 헬리카제 또는 그것과 복합체를 형성하는 분자와 결합 친화성을 갖는 맥시자임, 바람직하게는 RNA 헬리카제 또는 그것과 복합체를 형성하는 분자(어댑터)와 결합 친화성을 갖는 맥시자임, 예컨대 RNA 헬리카제 A와 결합하는 CTE(constitutive transport element)로 명명되는 RNA 서열, HIV TAR RNA 또는 POLY A RNA 서열을 갖는 맥시자임 등이지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 맥시자임은 통상, 헬리카제 또는 그것과 복합체를 형성하는 분자와 결합 친화성을 갖는 핵산서열, 맥시자임의 핵산서열을 직접적 또는 간접적으로 결합한 것이기 때문에, 예컨대, DNA/RNA 합성기(예컨대, Applied Biosystems사제의 모델 394 등)을 사용함으로써 화학합성할 수 있다. 양 핵산서열의 결합방법은 헬리카제 또는 그것과 복합체를 형성하는 분자와 결합 친화성을 갖는 핵산서열이 맥시자임의 핵산서열의 상류측에 있어도 무방하고, 또는 하류측에 있어도 무방하지만, 바람직하게는 맥시자임의 핵산서열의 하류측에 헬리카제 또는 그것과 복합체를 형성하는 분자와 결합 친화성을 갖는 핵산서열이 결합된다. 이에 따라, 맥시자임의 활성효율이 보다 향상된다.
(맥시자임의 발현계)
본 발명의 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 맥시자임을 세포내에서 고발현시키기 위해서는 프로모터 서열이 맥시자임 서열의 상류에 있는 것이 필요하다. pol Ⅲ의 발현계를 사용하는 경우, 이 발현계에서는 tRNAval서열이 여분인 서열(맥시자임 부분 이외의 프로모터 서열)로서 부가되어 간다. 실제로 본 맥시자임의 발현 벡터를 구축한 것이지만, 이 벡터로부터 발현하는 구조체는 tRNAval서열의 하류에 단쇄의 링커를 통해 맥시자임의 서열이 연결된 것이다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 3'말단에 결합하는 헬리케이스와 5'말단의 tRNAval은 맥시자임에 있어서 매우 큰 입체장애가 된다는 것이 예상되었다. 그러나, tRNAval서열이 부가된 타입의 맥시자임에서 명확한 절단활성을 확인할 수 있고, 본 발명의 맥시자임은 효율적인 2량체를 형성하는 것이 확인되었다.
(발현 벡터)
본 발명의 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 맥시자임을 코딩하는 발현 벡터는 예컨대, 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 전기 맥시자임을 코딩하는 DNA를 서열연결한 것을 적당한 벡터에 조합함으로써 작제할 수 있다.
발현 벡터는 pUC19(다카라 주조, 쿄토), pGREEN LANTERN(라이프 테크 오리엔탈(주), 도쿄), pHaMDR(HUMAN GENE THERAPY 6:905-915(July 1995)) 등의 플라즈미드 벡터, 유전자 치료용 벡터로서의 아데노 바이러스 벡터 또는 레트로 바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다.
상기 벡터에서, 맥시자임을 코딩하는 DNA의 상류에 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 전기 DNA의 발현을 조절하는 요소이고, 바이러스 프로모터(SV40 프로모터 등), 파지 프로모터(λPL 프로모터 등), polⅢ 프로모터(인간 tRNA 프로모터(예컨대, tRNAval프로모터), 아데노 바이러스 VA1 프로모터 등) 등이 포함된다. 본 발명에서는 polⅢ 프로모터, 특히 tRNA 프로모터를 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터에서는 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 맥시자임을 코딩하는 DNA의 하류에 터미네이터 서열을 더 포함할 수 있다. 터미네이터는 전사를 종결시키는 서열이면, 임의의 서열도 사용할 수 있다. 벡터에는 필요에 따라 항생물질 내성 유전자(예컨대, Ampr, Neor), 영양요구성을 상보(相補)하는 유전자 등의 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥시자임을 코딩하는 핵산은 DNA/RNA 합성기에 의해 화학합성해도 무방하고, 또는 상기 발현 벡터 DNA를 주형으로 하여 DNA 의존성 RNA 폴리머라제 효소의 존재하에 RNA를 합성하고, 생성한 RNA를 회수함으로써도 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 발현벡터는 세포내에 도입된 경우에는 상동재조합에 의해 염색체 상에 삽입된 후, 본 발명의 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 맥시자임을 발현할 수 있다. 상동재조합을 일으키기 위해서 숙주세포 게놈의 일부와 상동인 서열의 내부에 본 발명의 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합할 수 있는 맥시자임을 코딩하는 DNA를 삽입한 것을 벡터 DNA에 조합시킬 수 있다. 염색체로의 조합은 유전자 치료법에서 사용되는 아데노 바이러스 벡터 또는 레트로 바이러스 벡터 뿐만 아니라, 플라즈미드 벡터에 의해서도 수행할 수 있다.
(본 발명의 맥시자임과 헬리카제 활성을 갖는 분자의 복합체)
본 발명은 또한, 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 것을 특징으로 하는 매시자임과 헬리카제 활성을 갖는 분자의 복합체를 포함한다. 헬리카제 활성을 갖는 분자의 구체예는 RNA 헬리카제, 리보좀, 제한 효소(EcoRI, EcoRV 등) 등을 예로 들 수 있지만, 바람직하게는 RNA 헬리카제이다. 맥시자임과 헬리카제 활성을 갖는 분자의 결합은 각 성분의 기능을 손상시키지 않는 한, 공유결합 또는 비공유결합 어느 것이어도 무방하다. 비공유결합의 경우에는 헬리카제에 특이적으로 결합하는 어댑터를 통해 CTE 또는 폴리A서열에 결합할 수 있다. 또한, 공유결합의 경우에는 필요에 따라 링커를 통해 결합할 수 있다.
(의약 조성물)
본 발명은 또한, 상기한 맥시자임, 발현벡터 또는 복합체를 유효성분으로 함유하는 의약 조성물을 포함한다. 본 발명의 의약 조성물은 필요에 따라 의약상 허용되는 담체(예컨대, 생리 식염수, 완충액 등의 희석제)를 포함할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 적용은 맥시자임의 기능의 종류에 의존하고 있다. 즉, 본 발명의 의약 조성물은 맥시자임의 표적 RNA가 원인이 되어 발생하는 질병을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 예컨대, 에이즈 바이러스(HIV), C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 등의 바이러스를 원인으로 하는 질환, 세포자멸(apoptosis) 관련 질환(예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 등), 암, 자기면역질환, 염증, 유전자 질환 등의 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.
본 발명에서 사용되는 맥시자임은 질환의 원인물질의 핵산을 절단하거나 또는 핵산에 상보적으로 결합하여 기능저해를 일으키기도 하고, 병원 단백질에 특이적으로 결합하여 기능저해를 일으킴으로써 원인물질의 정상기능을 손상시킬 수 있다.
본 발명의 맥시자임 또는 그것을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입하는 방법은 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 유전자총(銃)에 의한 방법, 리포솜에 의한 방법(예컨대, 마모루 나카니시, 단백질 핵산 효소 Vol,44, No.11, 1590-1596(1999)) 등의 방법이 있다. 벡터를 사용하는 경우에는 벡터를 세포에 상기 방법으로 도입할 수 있다. 예컨대, 질환부위의 세포를 일부 잘라내어 in vitro에서 유전자 도입한 후, 전기 세포를 다시 조직에 되돌리는 것도 가능하고, 또는 질환부의 조직에 직접 벡터를 도입할 수도 있다. 바이러스 벡터로 감염시키는 경우의 바이러스 벡터는 통상 약 107pfu/ml 이상이다.
(본 발명의 맥시자임, 발현벡터 또는 복합체의 이용)
본 발명은 또한, 본 발명의 맥시자임, 발현벡터 또는 복합체를 사용하여 표적핵산을 특이적으로 절단 또는 표적 핵산의 생물학적 기능을 저해 또는 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 예컨대, 표적 핵산의 생물학적 기능을 해명하기 위해서도 사용할 수 있다. 맥시자임의 표적 결합부위(stemⅠ및 Ⅲ)의 서열을 랜덤화하면 어떤 종의 생물학적 기능에 필요한 유전자를 해명할 수 있다.
구체적으로는, 세포에 상기와 같이 랜덤화한 표적 결합 부위를 갖는 맥시자임을 도입한다. 예컨대, 정상적인 세포에 도입한 결과, 암(癌)화시키거나 또는 이상한 암세포에 도입한 결과, 정상세포에 되돌릴 수 있는 경우, 이에 따라 암화에 관한 유전자를 명확하게 할 수 있다. 필요에 따라, 진뱅크(GenBank) 등으로 그 서열을 조사함으로써, 그 유전자의 전 서열 및 기능을 해명할 수 있다. 유전자가 알려지지 않은 경우는 표적 결합 부위의 서열을 단서로 표적이 된 유전자의 클로닝을 수행함으로써, 전 서열을 결정할 수 있다. 상기의 랜덤한 서열이 만일 중요한 유전자와 상보적이었다고 해도 상대의 고차구조로 인해 많은 경우는 표적과 상호작용할 수 없고 절단할 수 없기 때문에 종결되어 버린다. 본 발명에서는 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합할 수 있는 맥시자임을 사용함으로써 상기 문제를 회피하고, 효율을 매우 향상시킬 수 있다.
본 출원의 우선권 주장의 기초가 되는 출원인 특원 제 2001-134469호의 명세서에 개시된 내용은 모두 본 명세서의 개시의 일부로서 본 명세서에 인용된 것으로한다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에서는 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 염기서열을 갖는 맥시자임의 표적 mRNA에 대한 세포내에서의 활성을 평가하였다. 본 실시예에서는 헬리카제 활성을 갖는 분자로서 RNA 헬리카제 A를 선택하고, 이 분자가 결합할 수 있는 모티브로서 CTE RNA를 맥시자임의 하류에 연결시킨 맥시자임(CTE-Mz)을 사용하였다.
실시예 1: 헬리카제 활성을 갖는 단백질과 연결하는 염기서열을 갖는 맥시자임 발현벡터(CTE-Mz 발현 벡터)의 작제
본 발명의 맥시자임을 작제함에 있어서, HIV-1 유래 Long Terminal Repeat(LTR) 유전자 내의 TAR RNA 영역(강한 이차구조를 가지는 것으로 알려져 있다) 및, 루시페라제 mRNA(정량적인 평가를 가능하게 하기 위해)을 표적부위로 하도록 맥시자임의 서열을 결정하였다.
CTE-Mz 발현벡터의 작제는 문헌(참조: J. Virol. 73:1868-1877(1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1886-1891(1999))에 개시된 방법에 따라 수행하였다. 5' 및 3' 말단에 각각 제한 사이트 Csp451 및 SalⅠ을 갖고, 중간에 상류로부터 맥시자임(서열번호 4, 5, 6, 7)을 코딩하는 DNA 서열, 제한 사이트 KpnⅠ및 EcoRV, 3' 말단에 터미네이터 서열(TTTTT)을 갖는 1본쇄의 올리고 뉴클레오타이드를 화학합성하여, 이것을 주형으로 한 폴리머라제 연쇄반응에 의해 2본쇄 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다. 이 2본쇄 올리고 뉴클레오타이드를 제한효소 Csp45Ⅰ및 SalⅠ로 처리한 후, 마찬가지로 제한효소 Csp45Ⅰ및 SalⅠ로 처리한 플라즈미드 pUC-dt의 tRNAval의 하류에 삽입하였다. 이것을 제한효소 KpnⅠ및 EcoRV로 처리한 후, Simian type D 레트로 바이러스(SRV) 유전자 유래의 constitutive transport elemet(CTE, 도 1)을 코딩하는 DNA 서열을 삽입하고, CTE-Mz 발현벡터를 수득하였다(도 2).
실시예 2: 루시페라제 활성에 의한 Mz 활성의 평가
본 평가에는 Long terminal repeat(LTR) 유전자와 루시페라제(Luc) 유전자를 연결한 키메라 유전자(서열번호 8)를 안정발현시킨 HeLa 세포(LTR-Luc HeLa)을 사용하였다. 1 ×105개의 LTR-Luc HeLa를 12혈(well) 플레이트에 파종하고, 5% 탄산가스 인큐베이터 내의 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 세포에 실시예 1에서 수득한 CTE-Mz 발현 벡터 MzL 및 MzR 각각 2㎍(호모 맥시자임의 경우는 모노머 맥시자임을 4㎍), HIV-1 유래 Tat 유전자 발현 플라즈미드 100ng(LTR-Luc의 발현에는 Tat 단백질이 필요하다), pSVβ-갈락토시다제(Promega) 50ng을 4㎕의 리포펙틴 시약(GIBCO/BRL, Rockville, MD)을 포함하는 Optimem Ⅰ배양 중(GIBCO/BRL)에 가하여, 실온에서 30분 이상 배양한 후, 12혈 플레이트 상의 세포에 적하하고, 트랜스펙션(transfection) 하였다. 탄산가스 인큐베이터 내의 37℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 회수하고, PicaGene 킷트(동경 잉크, 동경, 일본)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 세포를 150㎕의 세포 용해액(100mM K2HPO4, 100mM KH2PO4, 0.2% Trition X-100, 1mM DTT; pH 7.8)에서 용해하고, 4℃에서 10,000 xg로 1분 동안 원심분리하였다. 그것의 상등액 10㎕을 100㎕의 루시페라제 활성측정 시약(20mM Tricine, 1.07mM (MgCO3)4Mg(OH)2, 2.67mM MgSO4, 0.1mM EDTA, 33.3mM DTT, 270μM coenzyme A, 470μM luciferin, 530μM ATP)에 첨가하고, 3초 내지 10초 동안 형광강도를 형광광도계(Lumant LB 9501, Berthold, Bad Wildbad, Germany)을 사용하여 측정하였다. 트랜스펙션 효율의 루시페라제 활성으로의 영향은 동시에 트랜스펙션한 pSVβ-갈락토시다제 유래의 β-갈락토시다제 활성에 의해 보정하였다.
이 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다. 대조군(pCD-SRα/tat)을 작용시킨 경우의 루시페라제 활성을 100%로 하고, 그 상대활성으로서 나타내었다.
LTR-루시페라제 mRNA에 CTE-Mz을 작용시킨 경우, 통상의 Mz을 작용시킨 경우와 비교하여 매우 낮은 루시페라제 활성을 나타내었다. 즉, CTE-Mz은 통상의 Mz로는 절단이 곤란한 TAR 및 Luc에 대해서도 우수한 절단활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 의해 표적 mRNA의 고차구조에 관계없이 결합하고, 효과적으로 절단할 수 있는 맥시자임을 제공하는 것이 가능하게 되었다. 본 발명의 맥시자임은 의약으로서 유용하고, 또한 표적 핵산을 특이적으로 절단하는 방법 및 표적 핵산의 생물학적 기능을 저해 또는 억제하는 방법에 있어서도 유용하며, 이 방법을 사용하여 표적 핵산의 생물학적 기능을 해명하는 것도 가능하다.

Claims (19)

  1. 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 것을 특징으로 하는 맥시자임.
  2. 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역을 포함하는 맥시자임.
  3. 하기의 뉴클레오티드 서열 (a)를 포함하는 RNA 분자 및 하기의 뉴클레오티드 서열 (b)를 포함하는 RNA 분자가 형성하는 2량체의 구조로 이루어지는 맥시자임:
    5' X1 1…X1 hY1 1…Y1 iZ1 1…Z1 jB1 1…B1 p3'(a)
    5' Z2 1…Z2 nY2 1…Y2 mX2 1…X2 kB2 1…B2 q3'(b)
    상기 서열에서,
    X1 1…X1 h, X2 1…X2 k, Y1 1…Y1 i, Y2 1…Y2 m, Z1 1…Z1 j, Z2 1…Z2 n, B1 1…B1 p및 B2 1…B2 q는 각각 독립적으로 A, U, T, C 또는 G 중 임의의 것이고;
    h 및 k는 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이며;
    i 및 m은 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이고;
    j 및 n은 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이며;
    p 및 q는 1이상의 정수(예컨대, 1 내지 100의 정수)이고;
    X1 1…X1 h및 X2 1…X2 k는 표적 RNA 중의 특이적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이거나 또는 표적 RNA의 절단부위 주변의 서열에 상보적인 영역 및 표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+(마그네슘 이온)을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열이며;
    Y1 1…Y1 i및 Y2 1…Y2 m은 스템을 형성하는 뉴클레오티드 서열이고;
    Z1 1…Z1 j및 Z2 1…Z2 n은 표적 RNA의 절단부위의 주변 서열에 상보적인 영역 및 표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열이며; 및,
    B1 1…B1 p및 B2 1…B2 q는 일방 또는 양방에 헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
  4. 제 3항에 있어서,
    표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+(마그네슘 이온)을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열로서, Z1 1…Z1 j가 서열 GAA를 포함하는 것이고, Z2 1…Z2 n이 서열 CUGAYzGA(Yz는 A, G, U, C 중 임의의 모노뉴클레오티드를 나타낸다)를 포함하는
    맥시자임.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    표적 RNA의 존재하에서만 Mg2+을 포착하는 공동을 형성할 수 있는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열로서, X2 1…X2 k가 서열 GAA를 포함하는 것이고, X1 1…X1 h의 서열 CUGAYxGA(Yx는 A, G, U, C 중 임의의 모노뉴클레오티드를 나타낸다)를 포함하는 것인
    맥시자임.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    헬리카제 활성을 갖는 분자가 RNA 헬리카제인
    맥시자임.
  7. 제 6항에 있어서,
    헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역이 서열번호 1(CTE)로 표시되는 뉴클레오티드인
    맥시자임.
  8. 제 6항에 있어서,
    헬리카제 활성을 갖는 분자와 결합하는 영역이 서열번호 2(TAR)로 표시되는 뉴클레오티드인
    맥시자임.
  9. 제 3항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각의 상류에 링커 서열 및 tRNAval프로모터 서열이 부가되어 있는
    맥시자임.
  10. 제 9항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열 (a)의 상류에 부가되어 있는 링커 서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (e)를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 (b)의 상류에 부가된 링커 서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (f)를 포함하는
    맥시자임:
    5' AAA 3' (e)
    5' UUU 3' (f)
  11. 제 9항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각 상류에 부가되어 있는 tRNAval프로모터 서열이 서열번호 3인
    맥시자임.
  12. 제 9항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각 하류에 부가서열 및 터미네이터서열이 부가되어 있는
    맥시자임.
  13. 제 12항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열이 (a)의 하류에 부가되어 있는 부가서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (g)를 포함하고, 뉴클레오티드 서열 (b)의 하류에 부가되어 있는 부가서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (h)를 포함하며, 뉴클레오티드 서열 (a) 및 (b)의 각각의 하류에 부가되어 있는 터미네이터 서열이 하기의 뉴클레오티드 서열 (i)를 포함하는
    맥시자임:
    5' AAA 3' (g)
    5' AACCGUA 3' (h)
    5' UUUUU 3' (i)
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나에 개시된 맥시자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터.
  15. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나에 개시된 맥시자임과 헬리카제 활성을 갖는 분자의 복합체.
  16. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, 제 14항에 개시된 발현벡터 또는 제 15항에 개시된 복합체를 유효성분으로 함유하는 의약 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, 제 14항에 개시된 발현벡터 또는 제 15항에 개시된 복합체를 사용하여 표적 핵산을 절단하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, 제 14항에 개시된 발현벡터 또는 제 15항에 개시된 복합체를 사용하여 표적 핵산의 생물학적 기능을 특이적으로 저해 또는 억제하는 방법.
  19. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 하나에 개시된 맥시자임, 제 14항에 개시된 발현벡터 또는 제 15항에 개시된 복합체를 사용하여 표적 핵산을 특이적으로 절단하거나 또는 표적 핵산의 생물학적 기능을 특이적으로 저해하고, 전기 절단 또는전기 저해가 생물학적 활성에 미치는 영향을 조사하는 것을 포함하는, 표적 핵산의 생물학적 기능의 해석방법.
KR10-2003-7014258A 2001-05-01 2002-04-30 신규 맥시자임 KR20040023596A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2001-00134469 2001-05-01
JP2001134469 2001-05-01
PCT/JP2002/004322 WO2002092821A1 (fr) 2001-05-01 2002-04-30 Nouveau maxizyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20040023596A true KR20040023596A (ko) 2004-03-18

Family

ID=18982145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7014258A KR20040023596A (ko) 2001-05-01 2002-04-30 신규 맥시자임

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20040248114A1 (ko)
EP (1) EP1384783A4 (ko)
JP (1) JPWO2002092821A1 (ko)
KR (1) KR20040023596A (ko)
CN (1) CN1522300A (ko)
CA (1) CA2446075A1 (ko)
WO (1) WO2002092821A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2514826A3 (en) * 2003-11-21 2013-04-03 Revivicor Inc. Use of interfering RNA molecules to down regulate the expression of specific genes or family of genes
BR112014009579B1 (pt) 2011-10-21 2021-06-22 Oxford Nanopore Technologies Limited Métodos para caracterizar um polinucleotídeo alvo, e para formar um sensor, uso de uma helicase, kit, e, aparelho de análise
US10385382B2 (en) 2011-12-29 2019-08-20 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Enzyme method
CA2879261C (en) 2012-07-19 2022-12-06 Oxford Nanopore Technologies Limited Modified helicases
EP2875152B1 (en) * 2012-07-19 2019-10-09 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme construct
GB201406151D0 (en) 2014-04-04 2014-05-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
JP6677640B2 (ja) 2013-10-18 2020-04-08 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 修飾酵素
GB201417712D0 (en) 2014-10-07 2014-11-19 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CN104611419B (zh) * 2014-12-29 2016-08-24 江苏大学 一种基于石墨烯氧化物芯片dna解旋酶的检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US199471A (en) * 1878-01-22 Improvement in marking-pens
US5663064A (en) * 1995-01-13 1997-09-02 University Of Vermont Ribozymes with RNA protein binding site
EP1063296A1 (en) * 1998-03-12 2000-12-27 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd Nucleic acid enzyme showing allosteric rna-cleaving activity on target rna
EP1097993A3 (en) * 1999-11-05 2004-01-07 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Functional ribozyme chimeric molecules capable of sliding

Also Published As

Publication number Publication date
CN1522300A (zh) 2004-08-18
CA2446075A1 (en) 2002-11-21
EP1384783A4 (en) 2005-04-20
EP1384783A1 (en) 2004-01-28
US20040248114A1 (en) 2004-12-09
JPWO2002092821A1 (ja) 2004-09-02
WO2002092821A1 (fr) 2002-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10041071B2 (en) Cell-type specific aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy
EP0581848B1 (fr) Oligonucleotides fermes, antisens et sens, et leurs applications
US6852535B1 (en) Polymerase III-based expression of therapeutic RNAS
US8546346B2 (en) Methods to reprogram splice site selection in pre-messenger RNAs
US20060035344A1 (en) Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
JPH10508181A (ja) リボヌクレアーゼｐ標的化および切断配列を用いるｒｎａの標的化切断
HU211868A9 (en) Genetic units for inhibiting the function of rna
AU2003284323A2 (en) Double-stranded RNA structures and constructs, and methods for generating and using the same
CA2433680A1 (en) Double-stranded rna-mediated gene suppression
JP2006500012A (ja) 二本鎖ｒｎａの構造および構築物、並びにその作製法および使用法
JPH09501047A (ja) アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒト免疫不全ウイルス感染におけるその使用
JPH1052264A (ja) Ｎ‐ｒａｓ発現阻害剤およびその方法
KR20040023596A (ko) 신규 맥시자임
AU2010201034A1 (en) Self-cleaving ribozymes and uses thereof
CA2470033A1 (en) Intracellular generation of single-stranded dna
US20030082800A1 (en) In vivo ssDNA expression vectors for altering gene expression
AU2004205192B2 (en) Production of ssDNA in vivo
WO2003093424A2 (en) In vivo ssdna expression vectors for altering gene expression
Breithaupt Retroviral-Medicated Transfer of Suppressor tRNA Genes Into Human Cells
IL142492A (en) Genetic structures for producing ssDNA transcripts are regulated within a cell, compositions, and methods of use
AU2003265907A1 (en) In vivo ssdna expression vectors for altering gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid