JPH1052264A - Ｎ‐ｒａｓ発現阻害剤およびその方法 - Google Patents
Ｎ‐ｒａｓ発現阻害剤およびその方法Info
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- JPH1052264A JPH1052264A JP9135421A JP13542197A JPH1052264A JP H1052264 A JPH1052264 A JP H1052264A JP 9135421 A JP9135421 A JP 9135421A JP 13542197 A JP13542197 A JP 13542197A JP H1052264 A JPH1052264 A JP H1052264A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
Abstract
(57)【要約】
【課題】 変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡを標的とするリボ
ザイムの提供。 【解決手段】 変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡをＮＵＸ開裂
部位（Ｎ＝いずれかの塩基、Ｘ＝Ａ、ＣまたはＵ）にお
いて開裂する酵素ＲＮＡ分子。酵素ＲＮＡ分子は、好ま
しくは塩基配列５′‐ＣＣＡＡＣＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧ
ＣＧＵＵＡＧＣＧＡＡＡＣＣＵＧＣＵ‐３′または５′
‐ＵＣＣＣＡＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＡＧＣＧＡ
ＡＡＣＡＣＣＵＧ‐３′を有する。
ザイムの提供。 【解決手段】 変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡをＮＵＸ開裂
部位（Ｎ＝いずれかの塩基、Ｘ＝Ａ、ＣまたはＵ）にお
いて開裂する酵素ＲＮＡ分子。酵素ＲＮＡ分子は、好ま
しくは塩基配列５′‐ＣＣＡＡＣＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧ
ＣＧＵＵＡＧＣＧＡＡＡＣＣＵＧＣＵ‐３′または５′
‐ＵＣＣＣＡＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＡＧＣＧＡ
ＡＡＣＡＣＣＵＧ‐３′を有する。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、好ましくはＮＵＸ開裂部位（Ｎ＝いずれかの
塩基、Ｘ＝Ａ、ＣまたはＵ）で変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮ
Ａを開裂する酵素ＲＮＡ分子（リボザイム）、このよう
な分子を含有した薬剤、並びに異常細胞増殖および／ま
たは分化を伴う疾患の治療用薬剤の製造のためのこのよ
うな分子の使用に関する。
塩基、Ｘ＝Ａ、ＣまたはＵ）で変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮ
Ａを開裂する酵素ＲＮＡ分子（リボザイム）、このよう
な分子を含有した薬剤、並びに異常細胞増殖および／ま
たは分化を伴う疾患の治療用薬剤の製造のためのこのよ
うな分子の使用に関する。
【０００２】背景技術 細胞の増殖および分化は、様々なパラメーターおよびシ
グナル経路に依存している。あるシグナルトランスダク
ションタンパク質の発現の阻害は有効な治療に至る。ｒ
ａｓタンパク質についてコードする３つのｒａｓ遺伝子
（Ｈａ‐ｒａｓ、Ｎ‐ｒａｓ、Ｋｉ‐ｒａｓ）は細胞シ
グナルトランスダクションに本質的に関与しており、小
さなＧＴＰ／ＧＤＰ結合タンパク質のスーパー遺伝子フ
ァミリーのメンバーである。Ｒａｓ変異は膵臓がん、胃
および乳房の腫瘍のような様々な腫瘍で検出された（Bo
s,J.L.(1989) Cancer Research 49,4682-4689 ）。Ｎ‐
ｒａｓ変異は神経芽腫、黒色腫、急性骨髄芽球性白血病
（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および多発性
骨髄種でみられた（Portier,M.,Moles,J.P.,Mazars,G.
R.,Jeanteur,P.,Bataille,R.,Klein,C.(1992) Oncogene
7,2539-2543 ）。腫瘍のｒａｓ‐がん遺伝子の研究で
は、点変異がアミノ酸置換に至ることを明らかにした。
コドン１２、１３、５９および６１における点変異はＧ
ＴＰ結合部位の構造変化とＧＴＰアーゼ活性減少を生じ
る。
グナル経路に依存している。あるシグナルトランスダク
ションタンパク質の発現の阻害は有効な治療に至る。ｒ
ａｓタンパク質についてコードする３つのｒａｓ遺伝子
（Ｈａ‐ｒａｓ、Ｎ‐ｒａｓ、Ｋｉ‐ｒａｓ）は細胞シ
グナルトランスダクションに本質的に関与しており、小
さなＧＴＰ／ＧＤＰ結合タンパク質のスーパー遺伝子フ
ァミリーのメンバーである。Ｒａｓ変異は膵臓がん、胃
および乳房の腫瘍のような様々な腫瘍で検出された（Bo
s,J.L.(1989) Cancer Research 49,4682-4689 ）。Ｎ‐
ｒａｓ変異は神経芽腫、黒色腫、急性骨髄芽球性白血病
（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および多発性
骨髄種でみられた（Portier,M.,Moles,J.P.,Mazars,G.
R.,Jeanteur,P.,Bataille,R.,Klein,C.(1992) Oncogene
7,2539-2543 ）。腫瘍のｒａｓ‐がん遺伝子の研究で
は、点変異がアミノ酸置換に至ることを明らかにした。
コドン１２、１３、５９および６１における点変異はＧ
ＴＰ結合部位の構造変化とＧＴＰアーゼ活性減少を生じ
る。
【０００３】酵素ＲＮＡ分子にはグループＩおよびグル
ープII‐イントロン：ハンマーヘッドリボザイム、ヘア
ピンリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザイム（“オ
ノヘッド”）、自己スプライシングイントロンおよびＲ
ＮアーゼＰのサブユニットがある。ハンマーヘッドタイ
プのリボザイムは、これまでにみられた最小の触媒ＲＮ
Ａである。それらは、ハンマーヘッド構造の一部である
共通配列を含んでいる。それらはＮＵＸ塩基トリプレッ
ト（Ｎはいずれかの塩基であり、ＸはＡ、ＣまたはＵで
ある）を含む基質を認識して、Ｘの３′側においてトラ
ンス位置で特異的にホスホジエステル結合を開裂させ
る。ＧＵＣ塩基トリプレットは最も効率的に開裂される
（Dahm,S.C.and Uhlenbeck,O.C.(1991) Biochemistry 3
0,9464-9469 ）。ハンマーヘッドリボザイムは、３つの
ステムと１３のうち１１の保存ヌクレオチドからなる。
ープII‐イントロン：ハンマーヘッドリボザイム、ヘア
ピンリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザイム（“オ
ノヘッド”）、自己スプライシングイントロンおよびＲ
ＮアーゼＰのサブユニットがある。ハンマーヘッドタイ
プのリボザイムは、これまでにみられた最小の触媒ＲＮ
Ａである。それらは、ハンマーヘッド構造の一部である
共通配列を含んでいる。それらはＮＵＸ塩基トリプレッ
ト（Ｎはいずれかの塩基であり、ＸはＡ、ＣまたはＵで
ある）を含む基質を認識して、Ｘの３′側においてトラ
ンス位置で特異的にホスホジエステル結合を開裂させ
る。ＧＵＣ塩基トリプレットは最も効率的に開裂される
（Dahm,S.C.and Uhlenbeck,O.C.(1991) Biochemistry 3
0,9464-9469 ）。ハンマーヘッドリボザイムは、３つの
ステムと１３のうち１１の保存ヌクレオチドからなる。
【０００４】特異的にｍＲＮＡを開裂する酵素ＲＮＡ分
子は以前に記載されていた（ＷＯ９３／２３０５７）。
ｒａｓ ｍＲＮＡの酵素開裂がこの出願で述べられてい
るが、どのタイプのｒａｓ遺伝子（Ｈａ‐ｒａｓ、Ｋｉ
‐ｒａｓまたはＮ‐ｒａｓ）が開裂されるかは開示され
ておらず、更に重要なことにｒａｓ ｍＲＮＡ配列内の
どの領域が開裂されるかも示されていなかった。更に、
野生型ｒａｓ遺伝子だけが標的として示唆されており、
変異ｒａｓ遺伝子は標的として示唆されていない。もう
１つの出願（ＷＯ９１／１８９１３）では、Ｈａ‐ｒａ
ｓ ｍＲＮＡをコドン１２で開裂させるリボザイムが記
載されていた。しかしながら、そこで記載されたリボザ
イムはＮ‐ｒａｓのような他のｒａｓタイプの開裂を行
わない。しかも、そこで記載されたリボザイムはインビ
ボ条件下で安定でない。
子は以前に記載されていた（ＷＯ９３／２３０５７）。
ｒａｓ ｍＲＮＡの酵素開裂がこの出願で述べられてい
るが、どのタイプのｒａｓ遺伝子（Ｈａ‐ｒａｓ、Ｋｉ
‐ｒａｓまたはＮ‐ｒａｓ）が開裂されるかは開示され
ておらず、更に重要なことにｒａｓ ｍＲＮＡ配列内の
どの領域が開裂されるかも示されていなかった。更に、
野生型ｒａｓ遺伝子だけが標的として示唆されており、
変異ｒａｓ遺伝子は標的として示唆されていない。もう
１つの出願（ＷＯ９１／１８９１３）では、Ｈａ‐ｒａ
ｓ ｍＲＮＡをコドン１２で開裂させるリボザイムが記
載されていた。しかしながら、そこで記載されたリボザ
イムはＮ‐ｒａｓのような他のｒａｓタイプの開裂を行
わない。しかも、そこで記載されたリボザイムはインビ
ボ条件下で安定でない。
【０００５】
【発明の概要】本発明は、Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対し
て標的とする酵素ＲＮＡ分子、特にハンマーヘッドリボ
ザイムの用途について記載している。本発明の酵素ＲＮ
Ａ分子は変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対するものであっ
て、好ましくはコドン１３の後でＮ‐ｒａｓ ｍＲＮＡ
を開裂する。コドン１３での開裂はいかなるｒａｓ ｍ
ＲＮＡについても以前に行えなかった。意外にも、イン
ビボ条件下で安定であって、変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡ
のコドン１３で選択的に開裂する酵素ＲＮＡ分子が得ら
れた。特に、本発明はＮＵＸ開裂部位（Ｎはいずれかの
塩基であり、ＸはＡ、ＣまたはＵである）で変異Ｎ‐ｒ
ａｓ ｍＲＮＡを開裂する酵素ＲＮＡ分子に関する。
て標的とする酵素ＲＮＡ分子、特にハンマーヘッドリボ
ザイムの用途について記載している。本発明の酵素ＲＮ
Ａ分子は変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対するものであっ
て、好ましくはコドン１３の後でＮ‐ｒａｓ ｍＲＮＡ
を開裂する。コドン１３での開裂はいかなるｒａｓ ｍ
ＲＮＡについても以前に行えなかった。意外にも、イン
ビボ条件下で安定であって、変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡ
のコドン１３で選択的に開裂する酵素ＲＮＡ分子が得ら
れた。特に、本発明はＮＵＸ開裂部位（Ｎはいずれかの
塩基であり、ＸはＡ、ＣまたはＵである）で変異Ｎ‐ｒ
ａｓ ｍＲＮＡを開裂する酵素ＲＮＡ分子に関する。
【０００６】ＮＵＸ開裂部位（Ｎはいずれかの塩基であ
り、ＸはＡ、ＣまたはＵである）で変異Ｎ‐ｒａｓ ｍ
ＲＮＡを開裂できる、１３〜５０のヌクレオチドからな
る酵素ＲＮＡ分子が好ましい。このＲＮＡがハンマーヘ
ッドモチーフを有している酵素ＲＮＡ分子が特に好まし
い。
り、ＸはＡ、ＣまたはＵである）で変異Ｎ‐ｒａｓ ｍ
ＲＮＡを開裂できる、１３〜５０のヌクレオチドからな
る酵素ＲＮＡ分子が好ましい。このＲＮＡがハンマーヘ
ッドモチーフを有している酵素ＲＮＡ分子が特に好まし
い。
【０００７】更に、ＲＮＡが耐ヌクレアーゼ部分として
修飾された酵素ＲＮＡ分子について特に言及されてい
る。好ましい酵素分子は、ヌクレオシド間リン酸残基お
よび／またはヌクレオチドのリボース単位の２′位に修
飾を有している。この２′位で特に好ましい修飾は２′
‐アミノおよび２′‐フルオロ基である。
修飾された酵素ＲＮＡ分子について特に言及されてい
る。好ましい酵素分子は、ヌクレオシド間リン酸残基お
よび／またはヌクレオチドのリボース単位の２′位に修
飾を有している。この２′位で特に好ましい修飾は２′
‐アミノおよび２′‐フルオロ基である。
【０００８】特に好ましいリボザイムは、下記塩基配列 ５′‐ＣＣＡＡＣＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＡＧＣ
ＧＡＡＡＣＣＵＧＣＵ‐３′（ＭＲＥ７６３ Ｃ、配列
番号：１）または ５′‐ＵＣＣＣＡＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＡＧＣ
ＧＡＡＡＣＡＣＣＵＧ‐３′（ＭＲＥ７６４ Ｕ、配列
番号：２） を有している。
ＧＡＡＡＣＣＵＧＣＵ‐３′（ＭＲＥ７６３ Ｃ、配列
番号：１）または ５′‐ＵＣＣＣＡＡＣＣＵＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＡＧＣ
ＧＡＡＡＣＡＣＣＵＧ‐３′（ＭＲＥ７６４ Ｕ、配列
番号：２） を有している。
【０００９】本発明は、また、生理学上許容される補助
物質および／またはビヒクルと適宜一緒に１以上の酵素
ＲＮＡ分子を含有している薬剤を提供する。好ましいビ
ヒクルはリポソーム、免疫リポソーム、マイクロ粒子お
よびナノ粒子である。更に、本発明は、異常細胞増殖お
よび／または分化を伴うＮ‐ｒａｓの発現に起因するか
またはそれに関係した疾患の治療用薬剤の製造のための
このような分子の使用を提供する。
物質および／またはビヒクルと適宜一緒に１以上の酵素
ＲＮＡ分子を含有している薬剤を提供する。好ましいビ
ヒクルはリポソーム、免疫リポソーム、マイクロ粒子お
よびナノ粒子である。更に、本発明は、異常細胞増殖お
よび／または分化を伴うＮ‐ｒａｓの発現に起因するか
またはそれに関係した疾患の治療用薬剤の製造のための
このような分子の使用を提供する。
【００１０】
【発明の具体的説明】“酵素ＲＮＡ分子”とは、標的ｍ
ＲＮＡで特定領域と予測どおりに結合して、そのｍＲＮ
Ａを予測しうる部位で開裂させることができる核酸また
は核酸アナログである。酵素ＲＮＡ分子にはグループＩ
およびグループII‐イントロン：ハンマーヘッドリボザ
イム、ヘアピンリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザ
イム（“オノヘッド”）、自己スプライシングイントロ
ンおよびＲＮアーゼＰのサブユニットがある。本発明の
好ましいリボザイムはハンマーヘッドタイプのものであ
る。
ＲＮＡで特定領域と予測どおりに結合して、そのｍＲＮ
Ａを予測しうる部位で開裂させることができる核酸また
は核酸アナログである。酵素ＲＮＡ分子にはグループＩ
およびグループII‐イントロン：ハンマーヘッドリボザ
イム、ヘアピンリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザ
イム（“オノヘッド”）、自己スプライシングイントロ
ンおよびＲＮアーゼＰのサブユニットがある。本発明の
好ましいリボザイムはハンマーヘッドタイプのものであ
る。
【００１１】リボザイムは外来または内在的に細胞中に
デリバリーすることができる。外来とは、化学合成され
たリボザイムまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼでのインビ
トロ転写物が細胞に直接適用されることを意味する。内
在法では、遺伝子発現により対応リボザイムを産生する
プラスミドまたはウイルスベクターを要する。合成また
はベクターエンコードされた双方のタイプのリボザイム
が本発明の範囲内である。
デリバリーすることができる。外来とは、化学合成され
たリボザイムまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼでのインビ
トロ転写物が細胞に直接適用されることを意味する。内
在法では、遺伝子発現により対応リボザイムを産生する
プラスミドまたはウイルスベクターを要する。合成また
はベクターエンコードされた双方のタイプのリボザイム
が本発明の範囲内である。
【００１２】外来デリバリーから生じる問題は、ヌクレ
アーゼによる分解が細胞培養上澄で生じることによる、
リボザイムの低安定性である。２′‐ヒドロキシ基はヌ
クレアーゼによる分解メカニズムで重要な役割を果た
し、結果的にＲＮＡは２′修飾により安定化させること
ができる。したがって、２′‐デスオキシリボヌクレオ
チド（Tayler,N.R.,Kaplan,B.E.,Seiderski,O.P.,Li,
H.,and Rossi,J.J.(1992)Nucleic Acids Res.20,4559-4
565；Yang,J.H.,Usman,N.,Chartrand,P.,and Cedergre
n,R.(1992) Biochemistry 31,5005-5009）、２′‐Ｏ‐
メチル基（Goodchild,J.(1992) Nucleic Acids Res.20,
4607-4612 ）、２′‐フルオロおよび／または２′‐ア
ミノ基（Heidenreich,O.,Benseler,F.,Fahrenholz,A.,a
nd EcksteinF.(1994) J.Biol.Chem.269,2131-2138）ま
たはホスホロチオアト(phosphorothioat)結合鎖と一緒
に２′‐デスオキシリボヌクレオチド（Shibahara,S.,M
ukai,S.,Morisawa,H.,Nakashima,H.,Kobayashi,S.,and
Yamamoto,N.(1989) Nucleic Acids Res.17,239-252）が
導入された。
アーゼによる分解が細胞培養上澄で生じることによる、
リボザイムの低安定性である。２′‐ヒドロキシ基はヌ
クレアーゼによる分解メカニズムで重要な役割を果た
し、結果的にＲＮＡは２′修飾により安定化させること
ができる。したがって、２′‐デスオキシリボヌクレオ
チド（Tayler,N.R.,Kaplan,B.E.,Seiderski,O.P.,Li,
H.,and Rossi,J.J.(1992)Nucleic Acids Res.20,4559-4
565；Yang,J.H.,Usman,N.,Chartrand,P.,and Cedergre
n,R.(1992) Biochemistry 31,5005-5009）、２′‐Ｏ‐
メチル基（Goodchild,J.(1992) Nucleic Acids Res.20,
4607-4612 ）、２′‐フルオロおよび／または２′‐ア
ミノ基（Heidenreich,O.,Benseler,F.,Fahrenholz,A.,a
nd EcksteinF.(1994) J.Biol.Chem.269,2131-2138）ま
たはホスホロチオアト(phosphorothioat)結合鎖と一緒
に２′‐デスオキシリボヌクレオチド（Shibahara,S.,M
ukai,S.,Morisawa,H.,Nakashima,H.,Kobayashi,S.,and
Yamamoto,N.(1989) Nucleic Acids Res.17,239-252）が
導入された。
【００１３】基本的には、いかなる化学的修飾も本発明
のリボザイムに導入することができて、一般的に触媒活
性リボザイムとなる（Beigelman et al.(1995) J.Biol.
Chem.270,25702-25708；Shimayama et al.(1993) Nucle
ic Acids Res.21,2606-2611；Dong-Jing Fu and Mc Lau
ghin (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.89,3985-3989；Olsen
et al.(1991) Biochemistry 30,9735-9741；Williams
et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.89,918-921 ；Paole
lla et al.(1992) The Embo Journal 11,1913-1919
）。
のリボザイムに導入することができて、一般的に触媒活
性リボザイムとなる（Beigelman et al.(1995) J.Biol.
Chem.270,25702-25708；Shimayama et al.(1993) Nucle
ic Acids Res.21,2606-2611；Dong-Jing Fu and Mc Lau
ghin (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.89,3985-3989；Olsen
et al.(1991) Biochemistry 30,9735-9741；Williams
et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.89,918-921 ；Paole
lla et al.(1992) The Embo Journal 11,1913-1919
）。
【００１４】リボザイムは公知の方法を用いて化学的に
合成できる（例えば、Gait,M.J."Oigonucleotide Synth
esis - a practical approach",IRL Press,1984 ；Beau
cageand lyer (1993) Tetrahedron 49,1925 & 2223 & 6
123；Uhlmann and Peyman (1990) Chemical Reviews 9
0,543 ；ＥＰ‐Ａ ０ ５５２ ７６６；ＥＰ‐Ａ０
５９３ ９０１参照；上記修飾の参考文献）。ベクター
エンコードリボザイムの構築は以前に記載されている
（Stull et al.(1995) Pharmaceutical Research 12,46
5483；J.A.H.Murray (Ed.)"Antisense RNA and DNA" 19
92,Wiley-Liss,lnc.,New York ；R.Baserga and D.Denh
ardt (Ed.) "Annals of the New York Academy of Scie
nces - Antisense Strategies" Vol.660,1992,The New
Yark Academy of Sciences,New York ）。
合成できる（例えば、Gait,M.J."Oigonucleotide Synth
esis - a practical approach",IRL Press,1984 ；Beau
cageand lyer (1993) Tetrahedron 49,1925 & 2223 & 6
123；Uhlmann and Peyman (1990) Chemical Reviews 9
0,543 ；ＥＰ‐Ａ ０ ５５２ ７６６；ＥＰ‐Ａ０
５９３ ９０１参照；上記修飾の参考文献）。ベクター
エンコードリボザイムの構築は以前に記載されている
（Stull et al.(1995) Pharmaceutical Research 12,46
5483；J.A.H.Murray (Ed.)"Antisense RNA and DNA" 19
92,Wiley-Liss,lnc.,New York ；R.Baserga and D.Denh
ardt (Ed.) "Annals of the New York Academy of Scie
nces - Antisense Strategies" Vol.660,1992,The New
Yark Academy of Sciences,New York ）。
【００１５】本発明は、主鎖の天然Ｌ‐リボフラノシド
またはリン酸単位、あるいは認識部分の天然塩基に限定
されない。主鎖、糖または塩基のおけるいかなる修飾
も、酵素開裂活性が留められているかぎり、本発明の範
囲内である。糖の修飾にはα‐およびＤ‐フラノシド、
炭素環式五員環アナログ、環拡大および環縮小糖と、非
環式糖がある。これらの修飾はリボザイムの結合領域で
あることが好ましい。糖は２′‐Ｏ‐メチル、２′‐Ｏ
‐ブチル、２′‐Ｏ‐アリル、２′‐Ｏ‐メトキシエト
キシのような２′‐Ｏ‐アルキルリボース、あるいは
２′‐フルオロ‐２′‐デオキシリボース、２′‐アミ
ノ‐２′‐デオキシリボースとして修飾してよい。リン
酸ヌクレオシド間残基の修飾には、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ア
リールホスホネート、アリールアルキルホスホルアミデ
ート、ホスフェートエステル、あるいはこれらの修飾と
ホスホジエステルまたはそれら自体との組合せがある。
リン酸架橋は、ホルムアセタール、３′‐チオホルムア
セタールおよびメチルヒドロキシルアミンで置換させて
もよい。塩基の修飾には５‐プロピニル‐Ｕ、５‐プロ
ピニル‐Ｃ、７‐デアザ‐７‐プロピニル‐Ａ、７‐デ
アザ‐７‐プロピニル‐Ｇ、５‐メチル‐Ｃ、５‐フル
オロ‐Ｕがあり、ここで塩基はリボ‐またはデオキシヌ
クレオチドである。非常に好ましいリン酸修飾は、ＥＰ
‐Ａ ０ ５９３ ９０１に記載されたような３′３′
または５′５′‐転換である。ＥＰ‐Ａ ０ ６７２
６７７に記載されたようなポリアミド核酸によるリン酸
／糖主鎖の部分置換も、本発明の好ましい態様である。
またはリン酸単位、あるいは認識部分の天然塩基に限定
されない。主鎖、糖または塩基のおけるいかなる修飾
も、酵素開裂活性が留められているかぎり、本発明の範
囲内である。糖の修飾にはα‐およびＤ‐フラノシド、
炭素環式五員環アナログ、環拡大および環縮小糖と、非
環式糖がある。これらの修飾はリボザイムの結合領域で
あることが好ましい。糖は２′‐Ｏ‐メチル、２′‐Ｏ
‐ブチル、２′‐Ｏ‐アリル、２′‐Ｏ‐メトキシエト
キシのような２′‐Ｏ‐アルキルリボース、あるいは
２′‐フルオロ‐２′‐デオキシリボース、２′‐アミ
ノ‐２′‐デオキシリボースとして修飾してよい。リン
酸ヌクレオシド間残基の修飾には、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ア
リールホスホネート、アリールアルキルホスホルアミデ
ート、ホスフェートエステル、あるいはこれらの修飾と
ホスホジエステルまたはそれら自体との組合せがある。
リン酸架橋は、ホルムアセタール、３′‐チオホルムア
セタールおよびメチルヒドロキシルアミンで置換させて
もよい。塩基の修飾には５‐プロピニル‐Ｕ、５‐プロ
ピニル‐Ｃ、７‐デアザ‐７‐プロピニル‐Ａ、７‐デ
アザ‐７‐プロピニル‐Ｇ、５‐メチル‐Ｃ、５‐フル
オロ‐Ｕがあり、ここで塩基はリボ‐またはデオキシヌ
クレオチドである。非常に好ましいリン酸修飾は、ＥＰ
‐Ａ ０ ５９３ ９０１に記載されたような３′３′
または５′５′‐転換である。ＥＰ‐Ａ ０ ６７２
６７７に記載されたようなポリアミド核酸によるリン酸
／糖主鎖の部分置換も、本発明の好ましい態様である。
【００１６】ＥＰ‐Ａ ０ ５５２ ７６６に記載され
たような５′または３′（２′）末端における末端基修
飾も好ましい。末端修飾の例は‐Ｏ‐（ＣＨ２）ｎＣＨ
３（ｎ＝６〜１８）のような親油基、ステロイド残基、
ビタミンＥ、ＡまたはＤ、あるいは胆汁酸、葉酸、マン
ノースまたはペプチドのような天然キャリア系を利用し
た複合体である。他の末端基は、プソラレンおよびアク
リジン誘導体のような標的への結合性を高めるインター
カレーター（挿入）部分である。
たような５′または３′（２′）末端における末端基修
飾も好ましい。末端修飾の例は‐Ｏ‐（ＣＨ２）ｎＣＨ
３（ｎ＝６〜１８）のような親油基、ステロイド残基、
ビタミンＥ、ＡまたはＤ、あるいは胆汁酸、葉酸、マン
ノースまたはペプチドのような天然キャリア系を利用し
た複合体である。他の末端基は、プソラレンおよびアク
リジン誘導体のような標的への結合性を高めるインター
カレーター（挿入）部分である。
【００１７】上記すべての修飾はあるＲＮＡ‐分子で１
回以上行ってもよく、修飾は極めて安定で生物学的に活
性なリボザイムを得るために組み合わせてもよいことに
留意されねばならない。
回以上行ってもよく、修飾は極めて安定で生物学的に活
性なリボザイムを得るために組み合わせてもよいことに
留意されねばならない。
【００１８】変異Ｎ‐ｒａｓの発現を阻害するために、
変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡのコドン１３に対する異なる
リボザイムが合成された。リボザイムＭＲＥ７６３Ｃは
点変異〔ＧＧＴ（ｇｌｙ）→ＣＧＴ（ａｒｇ）トランジ
ション〕に対するものであり、リボザイムＭＲＥ７６４
Ｕは〔ＧＧＴ（ｇｌｙ）→ＧＴＴ（ｖａｌ）トランジシ
ョン〕に対するものである（図１Ａ）。更に、野生型Ｎ
‐ｒａｓ ｍＲＮＡのコドン６４（ＲＥ９１７、配列番
号：１４）、コドン８９（ＲＥ９９０、配列番号：１
５）およびコドン１０３（ＲＥ１０３５、配列番号：１
６）のＧＵＣおよびＧＵＡ‐トリプレットに対するリボ
ザイムが研究された（図１Ｂ）。
変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡのコドン１３に対する異なる
リボザイムが合成された。リボザイムＭＲＥ７６３Ｃは
点変異〔ＧＧＴ（ｇｌｙ）→ＣＧＴ（ａｒｇ）トランジ
ション〕に対するものであり、リボザイムＭＲＥ７６４
Ｕは〔ＧＧＴ（ｇｌｙ）→ＧＴＴ（ｖａｌ）トランジシ
ョン〕に対するものである（図１Ａ）。更に、野生型Ｎ
‐ｒａｓ ｍＲＮＡのコドン６４（ＲＥ９１７、配列番
号：１４）、コドン８９（ＲＥ９９０、配列番号：１
５）およびコドン１０３（ＲＥ１０３５、配列番号：１
６）のＧＵＣおよびＧＵＡ‐トリプレットに対するリボ
ザイムが研究された（図１Ｂ）。
【００１９】１つの研究では、１５ヌクレオチド鎖長の
短い合成オリゴリボヌクレオチドが基質として働いた。
すべてのリボザイムの開裂動態はMichaelis-Menten条件
下で調べられた。得られたＫｍおよびｋcat 値は表１に
示されている。表ＩＡ： リボザイム ｋcat Ｋｍ ｋcat ／Ｋｍ 〔ｓ-1〕 〔ｎＭ〕 〔１０６×ｓ-1×Ｍ-1〕 ＲＥ９１７ ０．０１３ ７８ ０．２ ＲＥ９９０ ０．００４ ４０４ ０．００９ ＲＥ１０３５ ０．０１３ ２７７ ０．０５ ＭＲＥ７６３Ｃ ０．０１５ ８２ ０．２ＭＲＥ７６４Ｕ ０．０１２ ６５ ０．２ 合成基質に対するリボザイムのＫｍおよびｋcat 値。ｋ
cat およびＫｍ値は実施例４で記載されたようにMichae
lis-Menten条件下で調べた。表ＩＢ： リボザイム 修飾 ｋcat Ｋｍ kcat/Km kcat/Km [min-1] [nM] [min-1nM-1] （相対比） MRE763C 3.760 72 0.05100 1 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 0.530 22 0.02400 0.470 FU,FC,U4U7-NH2 0.300 16 0.01900 0.380 S,EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 0.220 18 0.01200 0.230 EtOMeU,EtOMeC 0.027 105 0.00026 0.005 表１に掲載された動態データの分析ではリボザイムＭＲ
Ｅ７６３Ｃ、ＭＲＥ７６４ＵおよびＲＥ９１７に関して
約０．２×１０６ｓ-1×Ｍ-1の等しいｋcat ／Ｋｍ値を
示し、リボザイムＲＥ９９０はかなり低い触媒効率を有
している。合成基質に対するリボザイムＭＲＥ７６３Ｃ
の結合性は、溶融温度（Ｔｍ）を測定することにより調
べられる。約４８℃のＴｍ値はＭＲＥ７６３ＣおよびＭ
ＲＥ７６４Ｕ複合体について得られた。野生型ｍＲＮＡ
に対するリボザイムＲＥ９９０またはＲＥ１０３５とそ
れらの基質複合体は、他方で約５２℃のＴｍ値を示す。
別の研究では、転写開始部位から終結部位までの変異ま
たは野生型Ｎ‐ｒａｓ配列を含んだＲＮＡがインビトロ
転写により合成された。効率的なｍＲＮＡ開裂を行うた
めに、基質の標的配列（ＮＵＸ‐トリプレット、Ｎ＝
Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ；Ｘ＝Ｃ、Ａ、Ｕ）が二本鎖または安定
なヘアピンの一部であることは許容されない。インビト
ロ転写されたＲＮＡは上記５つのリボザイムの基質とし
て働いた。触媒効率はスプライス産物を検出するために
“シングルターンオーバー”(single-turnover)条件下
で試験された。
短い合成オリゴリボヌクレオチドが基質として働いた。
すべてのリボザイムの開裂動態はMichaelis-Menten条件
下で調べられた。得られたＫｍおよびｋcat 値は表１に
示されている。表ＩＡ： リボザイム ｋcat Ｋｍ ｋcat ／Ｋｍ 〔ｓ-1〕 〔ｎＭ〕 〔１０６×ｓ-1×Ｍ-1〕 ＲＥ９１７ ０．０１３ ７８ ０．２ ＲＥ９９０ ０．００４ ４０４ ０．００９ ＲＥ１０３５ ０．０１３ ２７７ ０．０５ ＭＲＥ７６３Ｃ ０．０１５ ８２ ０．２ＭＲＥ７６４Ｕ ０．０１２ ６５ ０．２ 合成基質に対するリボザイムのＫｍおよびｋcat 値。ｋ
cat およびＫｍ値は実施例４で記載されたようにMichae
lis-Menten条件下で調べた。表ＩＢ： リボザイム 修飾 ｋcat Ｋｍ kcat/Km kcat/Km [min-1] [nM] [min-1nM-1] （相対比） MRE763C 3.760 72 0.05100 1 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 0.530 22 0.02400 0.470 FU,FC,U4U7-NH2 0.300 16 0.01900 0.380 S,EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 0.220 18 0.01200 0.230 EtOMeU,EtOMeC 0.027 105 0.00026 0.005 表１に掲載された動態データの分析ではリボザイムＭＲ
Ｅ７６３Ｃ、ＭＲＥ７６４ＵおよびＲＥ９１７に関して
約０．２×１０６ｓ-1×Ｍ-1の等しいｋcat ／Ｋｍ値を
示し、リボザイムＲＥ９９０はかなり低い触媒効率を有
している。合成基質に対するリボザイムＭＲＥ７６３Ｃ
の結合性は、溶融温度（Ｔｍ）を測定することにより調
べられる。約４８℃のＴｍ値はＭＲＥ７６３ＣおよびＭ
ＲＥ７６４Ｕ複合体について得られた。野生型ｍＲＮＡ
に対するリボザイムＲＥ９９０またはＲＥ１０３５とそ
れらの基質複合体は、他方で約５２℃のＴｍ値を示す。
別の研究では、転写開始部位から終結部位までの変異ま
たは野生型Ｎ‐ｒａｓ配列を含んだＲＮＡがインビトロ
転写により合成された。効率的なｍＲＮＡ開裂を行うた
めに、基質の標的配列（ＮＵＸ‐トリプレット、Ｎ＝
Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ；Ｘ＝Ｃ、Ａ、Ｕ）が二本鎖または安定
なヘアピンの一部であることは許容されない。インビト
ロ転写されたＲＮＡは上記５つのリボザイムの基質とし
て働いた。触媒効率はスプライス産物を検出するために
“シングルターンオーバー”(single-turnover)条件下
で試験された。
【００２０】リボザイムＭＲＥ７６３Ｃの特異性を証明
するために、開裂反応に続いてポリアクリルアミドゲル
電気泳動が行われた。ｍＲＮＡで得られた双方の開裂産
物は予想されたサイズを示した。表IIは“シングルター
ンオーバー”条件下におけるリボザイムの動態性質を表
している。表IIＡ： リボザイム ｋcat Ｋｍ ｋcat ／Ｋｍ 〔１０６×ｓ-1〕 〔ｎＭ〕 〔ｓ-1×Ｍ-1〕 ＲＥ９１７ ５９ ６３ ９３８ ＲＥ９９０ ７２ ２３４ ３０７ ＲＥ１０３５ ４４ ４２５ １０３ ＭＲＥ７６３Ｃ ２６６ ７１ ３７５２ＭＲＥ７６４Ｕ １３７ １１３ １２１２ 基質として転写Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対するいくつか
のリボザイムのＫｍおよびｋcat 値。触媒値は実施例５
で記載されたように“シングルターンオーバー”条件下
で調べる。表IIＢ： リボザイム 修飾 ｋreact Ｋm kreact /Km kreact /Km [10-6ｓ-1] [nM] [ｓ-1Ｍ-1] （相対比） RE917 ５９ ６３ ９３８ １ Ｓ ８８ １２０ ７３３ ０．７８ Ｓ，ＦＵ ６０ ４００ １５０ ０．１６ Ｓ，ｄＵ，ｄＣ ２０ １４２０ １４ ０．０１５ ＦＵ，ＦＣ ６６ ２０２ ３２６ ０．３５ MRE764U １３７ １１３ １２１２ １ ＦＵ，ＦＣ ６２ １２０ ５１６ ０．４２ 表IIＣ： リボザイム 修飾 ｋreact Ｋm kreact /Km kreact /Km [10-6ｓ-1] [nM] [ｓ-1Ｍ-1] （相対比） MRE763C 266 71 3748 1 FU,FC 50 39 1266 0.340 FU,FC,U4U7-NH2 173 71 2437 0.650 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-OH 147 51 2882 0.770 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 173 73 2370 0.630 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-F 39 135 288 0.077 S,FU,FC 51 44 1159 0.300 S,EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 27 190 142 0.038 合成短鎖基質と長鎖転写基質の双方に対する結合親和性
は似たＫｍ値で反映されるようにほぼ同様であるが、転
写基質ｍＲＮＡは短鎖合成基質よりもかなり遅い速度で
スプライスされる（表ＩおよびII）。リボザイムＭＲＥ
７６３ＣまたはＭＲＥ７６４Ｕは変異ｍＲＮＡに対する
もので、野生型Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡを開裂しないこと
もわかった。したがって、新規リボザイムは、Ｎ‐ｒａ
ｓがん原遺伝子の発現に影響を与えることなく、Ｎ‐ｒ
ａｓがん遺伝子の発現を阻害することができる。ｋcat
／Ｋｍ値によれば、最も有効なリボザイム（ＭＲＥ７６
３Ｃ、ＭＲＥ７６４ＵおよびＲＥ９１７）が異なる化学
的修飾を加えて別の研究のために選択された。
するために、開裂反応に続いてポリアクリルアミドゲル
電気泳動が行われた。ｍＲＮＡで得られた双方の開裂産
物は予想されたサイズを示した。表IIは“シングルター
ンオーバー”条件下におけるリボザイムの動態性質を表
している。表IIＡ： リボザイム ｋcat Ｋｍ ｋcat ／Ｋｍ 〔１０６×ｓ-1〕 〔ｎＭ〕 〔ｓ-1×Ｍ-1〕 ＲＥ９１７ ５９ ６３ ９３８ ＲＥ９９０ ７２ ２３４ ３０７ ＲＥ１０３５ ４４ ４２５ １０３ ＭＲＥ７６３Ｃ ２６６ ７１ ３７５２ＭＲＥ７６４Ｕ １３７ １１３ １２１２ 基質として転写Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対するいくつか
のリボザイムのＫｍおよびｋcat 値。触媒値は実施例５
で記載されたように“シングルターンオーバー”条件下
で調べる。表IIＢ： リボザイム 修飾 ｋreact Ｋm kreact /Km kreact /Km [10-6ｓ-1] [nM] [ｓ-1Ｍ-1] （相対比） RE917 ５９ ６３ ９３８ １ Ｓ ８８ １２０ ７３３ ０．７８ Ｓ，ＦＵ ６０ ４００ １５０ ０．１６ Ｓ，ｄＵ，ｄＣ ２０ １４２０ １４ ０．０１５ ＦＵ，ＦＣ ６６ ２０２ ３２６ ０．３５ MRE764U １３７ １１３ １２１２ １ ＦＵ，ＦＣ ６２ １２０ ５１６ ０．４２ 表IIＣ： リボザイム 修飾 ｋreact Ｋm kreact /Km kreact /Km [10-6ｓ-1] [nM] [ｓ-1Ｍ-1] （相対比） MRE763C 266 71 3748 1 FU,FC 50 39 1266 0.340 FU,FC,U4U7-NH2 173 71 2437 0.650 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-OH 147 51 2882 0.770 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 173 73 2370 0.630 EtOMeU,EtOMeC,U4U7-F 39 135 288 0.077 S,FU,FC 51 44 1159 0.300 S,EtOMeU,EtOMeC,U4U7-NH2 27 190 142 0.038 合成短鎖基質と長鎖転写基質の双方に対する結合親和性
は似たＫｍ値で反映されるようにほぼ同様であるが、転
写基質ｍＲＮＡは短鎖合成基質よりもかなり遅い速度で
スプライスされる（表ＩおよびII）。リボザイムＭＲＥ
７６３ＣまたはＭＲＥ７６４Ｕは変異ｍＲＮＡに対する
もので、野生型Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡを開裂しないこと
もわかった。したがって、新規リボザイムは、Ｎ‐ｒａ
ｓがん原遺伝子の発現に影響を与えることなく、Ｎ‐ｒ
ａｓがん遺伝子の発現を阻害することができる。ｋcat
／Ｋｍ値によれば、最も有効なリボザイム（ＭＲＥ７６
３Ｃ、ＭＲＥ７６４ＵおよびＲＥ９１７）が異なる化学
的修飾を加えて別の研究のために選択された。
【００２１】ＲＮアーゼによるリボザイム分解を防ぐた
めに、それらは異なる基によるリボースの２′位の修飾
で安定化された。新規リボザイムは質量スペクトル（Ｍ
ＡＬＤＩ）により特徴付けられた。それらの触媒性質と
細胞培養上澄中での安定性が調べられた。２′‐Ｏ‐メ
チル‐２′‐デスオキシウリジン／シチジン、２′‐デ
スオキシウリジン／シチジン、２′‐フルオロ‐２′‐
デスオキシウリジン／シチジンのようなオリゴリボヌク
レオチドにおける２′修飾が末端ホスホロチオエート結
合鎖などと組み合わされた（表III 参照）。表III: リボザイム 細胞培養物の上澄中における 安定性（半減期） 未修飾 ０．５ min Ｓ ３．０ min Ｓ，ＦＵ １０．０ min ＦＵ，ＦＣ ５０ｈ ＦＵ，ＦＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＮＨ２ ５０ｈ Ｓ，ＦＵ，ＯＭｅＣ ８０ｈ Ｓ，ＯＭｅＵ，ＯＭｅＣ ８０ｈ Ｓ，ｄＵ，ｄＣ ８０ｈ Ｓ，ＦＵ，ＦＣ ８０ｈ ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＯＨ ３０ min ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＮＨ２ ８０ｈ ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐Ｆ ８０ｈ ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ ８０ｈ Ｓ，ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＮＨ２ ８０ｈＳ，ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐Ｆ ８０ｈ 細胞培養上澄中における化学的に修飾されたリボザイム
の安定性。反応条件は例６で記載されたように行った。
めに、それらは異なる基によるリボースの２′位の修飾
で安定化された。新規リボザイムは質量スペクトル（Ｍ
ＡＬＤＩ）により特徴付けられた。それらの触媒性質と
細胞培養上澄中での安定性が調べられた。２′‐Ｏ‐メ
チル‐２′‐デスオキシウリジン／シチジン、２′‐デ
スオキシウリジン／シチジン、２′‐フルオロ‐２′‐
デスオキシウリジン／シチジンのようなオリゴリボヌク
レオチドにおける２′修飾が末端ホスホロチオエート結
合鎖などと組み合わされた（表III 参照）。表III: リボザイム 細胞培養物の上澄中における 安定性（半減期） 未修飾 ０．５ min Ｓ ３．０ min Ｓ，ＦＵ １０．０ min ＦＵ，ＦＣ ５０ｈ ＦＵ，ＦＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＮＨ２ ５０ｈ Ｓ，ＦＵ，ＯＭｅＣ ８０ｈ Ｓ，ＯＭｅＵ，ＯＭｅＣ ８０ｈ Ｓ，ｄＵ，ｄＣ ８０ｈ Ｓ，ＦＵ，ＦＣ ８０ｈ ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＯＨ ３０ min ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＮＨ２ ８０ｈ ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐Ｆ ８０ｈ ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ ８０ｈ Ｓ，ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐ＮＨ２ ８０ｈＳ，ＥｔＯＭｅＵ，ＥｔＯＭｅＣ，Ｕ４Ｕ７‐Ｆ ８０ｈ 細胞培養上澄中における化学的に修飾されたリボザイム
の安定性。反応条件は例６で記載されたように行った。
【００２２】リボザイム安定性は約１２０時間の時間範
囲内で細胞培地で試験された。一部が異なる時間に取り
出され、ゲル上におかれ、分解バンドが銀染色により検
出できた。未修飾リボザイムは１／２分以内に切断され
た。３′および５′部位に末端ホスホロチオエート結合
鎖の導入があると、２〜３分間の半減期になった。別な
修飾（例えば、２′‐フルオロ‐２′‐デスオキシウリ
ジン）だと、約１０分間の安定性の増加になる。すべて
のピリミジンヌクレオチドの完全置換（例えば、２′‐
フルオロ‐２′‐デスオキシシチジン）だと、約８０時
間にわたり安定なリボザイムを生じる。
囲内で細胞培地で試験された。一部が異なる時間に取り
出され、ゲル上におかれ、分解バンドが銀染色により検
出できた。未修飾リボザイムは１／２分以内に切断され
た。３′および５′部位に末端ホスホロチオエート結合
鎖の導入があると、２〜３分間の半減期になった。別な
修飾（例えば、２′‐フルオロ‐２′‐デスオキシウリ
ジン）だと、約１０分間の安定性の増加になる。すべて
のピリミジンヌクレオチドの完全置換（例えば、２′‐
フルオロ‐２′‐デスオキシシチジン）だと、約８０時
間にわたり安定なリボザイムを生じる。
【００２３】修飾リボザイムの開裂動態は、インビトロ
転写ｍＲＮＡで“シングルターンオーバー”条件下で調
べられた。結果は表IVに示されている。表IV： リボザイム ｋcat Ｋｍ ｋcat ／Ｋｍ 〔１０６×ｓ-1〕 〔ｎＭ〕 〔ｓ-1×Ｍ-1〕 ＲＥ９１７ ５９ ６３ ９３８ ＲＥ９１７(tioat) ８８ １２０ ７３３ ＲＥ９１７(tioat,FU) ６０ ４００ １５０ ＲＥ９１７(FU,FC) ６６ ２０２ ３２６ ＲＥ９１７(tioat,dU,dC) ２０ １４２０ １４ ＭＲＥ７６３Ｃ ２６６ ７１ ３７５２ ＭＲＥ７６３Ｃ(tioat,FU,OMeU4U7) ５３ ６１ ８６９ ＭＲＥ７６３Ｃ(tioat,FU,FC) ５１ ４４ １１５９ ＭＲＥ７６３Ｃ(FU,FC) ５０ ３９ １２６６ ＭＲＥ７６４Ｕ １３７ １１３ １２１２ＭＲＥ７６４Ｕ(FU,FC) ６２ １２０ ５１６ 転写Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対する異なる修飾リボザイ
ムのｋcat およびＫｍ値。反応条件は例５に記載された
とおりであった。
転写ｍＲＮＡで“シングルターンオーバー”条件下で調
べられた。結果は表IVに示されている。表IV： リボザイム ｋcat Ｋｍ ｋcat ／Ｋｍ 〔１０６×ｓ-1〕 〔ｎＭ〕 〔ｓ-1×Ｍ-1〕 ＲＥ９１７ ５９ ６３ ９３８ ＲＥ９１７(tioat) ８８ １２０ ７３３ ＲＥ９１７(tioat,FU) ６０ ４００ １５０ ＲＥ９１７(FU,FC) ６６ ２０２ ３２６ ＲＥ９１７(tioat,dU,dC) ２０ １４２０ １４ ＭＲＥ７６３Ｃ ２６６ ７１ ３７５２ ＭＲＥ７６３Ｃ(tioat,FU,OMeU4U7) ５３ ６１ ８６９ ＭＲＥ７６３Ｃ(tioat,FU,FC) ５１ ４４ １１５９ ＭＲＥ７６３Ｃ(FU,FC) ５０ ３９ １２６６ ＭＲＥ７６４Ｕ １３７ １１３ １２１２ＭＲＥ７６４Ｕ(FU,FC) ６２ １２０ ５１６ 転写Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対する異なる修飾リボザイ
ムのｋcat およびＫｍ値。反応条件は例５に記載された
とおりであった。
【００２４】３つの３′と１つの５′末端ホスホロチオ
エート基の導入は、触媒効力の喪失をやや招いた。化学
的に修飾されたリボザイムの触媒ポテンシャルは、化学
的修飾のタイプ、特にリボース部分の２′‐ヒドロキシ
基の置換のタイプに応じて変わる。コドン１３に対する
修飾リボザイムの触媒活性は未修飾アナログと比較して
インビトロ開裂アッセイである程度低下したが、細胞培
養またはインビボでＮ‐ｒａｓ発現を阻害するそれらの
全体的生物活性はヌクレアーゼ分解に対するそれらの高
い安定性のためかなり高い。
エート基の導入は、触媒効力の喪失をやや招いた。化学
的に修飾されたリボザイムの触媒ポテンシャルは、化学
的修飾のタイプ、特にリボース部分の２′‐ヒドロキシ
基の置換のタイプに応じて変わる。コドン１３に対する
修飾リボザイムの触媒活性は未修飾アナログと比較して
インビトロ開裂アッセイである程度低下したが、細胞培
養またはインビボでＮ‐ｒａｓ発現を阻害するそれらの
全体的生物活性はヌクレアーゼ分解に対するそれらの高
い安定性のためかなり高い。
【００２５】細胞培養で修飾リボザイムの阻害効果を調
べるために、ルシフェラーゼリポーター遺伝子に融合さ
れたＮ‐ｒａｓ遺伝子を含むＨｅＬａ細胞系が用いられ
た（実施例８）。細胞外濃度１０μＭの修飾リボザイム
ＭＲＥ７６３Ｃ（ＦＵ、ＦＣ）またはＭＲＥ７６４Ｕ
（ＦＵ、ＦＣ）で、Ｎ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ融合遺
伝子の発現の４３〜６１％減少が得られた（表Ｖおよび
VI）。 表Ｖ： ＨｅＬａ細胞で１０μＭ ＭＲＥ７６３によるＮ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害 リボザイム 光単位（１０５） 減少（％） ナンセンス ２．５８ ０ＭＲＥ７６３Ｃ（ＦＵ，ＦＣ） １．０‐１．１ ５７〜６１ 表VI： ＨｅＬａ細胞で１０μＭ ＭＲＥ７６４によるＮ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害 リボザイム 光単位（１０５） 減少（％） ナンセンス ４．４ ０ＭＲＥ７６４Ｕ（ＦＵ，ＦＣ） ２．２‐２．５ ４３〜５０ 有効用量はリポフェクタミン（Ｒ）またはセルフェクチ
ン（Ｒ）（Fa．Life Technologies,Eggenstein；German
y ）のような取込みエンハンサーを用いるか、あるいは
リポソーム、マイクロ粒子またはナノ粒子処方を用いる
ことにより１０〜１００倍低下させることができた。活
性ハンマーヘッド構造を含んでいるが、Ｎ‐ｒａｓ ｍ
ＲＮＡに対するものではないリボザイム（ナンセンスコ
ントロール）はＮ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ融合の発現
を減少させなかった。
べるために、ルシフェラーゼリポーター遺伝子に融合さ
れたＮ‐ｒａｓ遺伝子を含むＨｅＬａ細胞系が用いられ
た（実施例８）。細胞外濃度１０μＭの修飾リボザイム
ＭＲＥ７６３Ｃ（ＦＵ、ＦＣ）またはＭＲＥ７６４Ｕ
（ＦＵ、ＦＣ）で、Ｎ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ融合遺
伝子の発現の４３〜６１％減少が得られた（表Ｖおよび
VI）。 表Ｖ： ＨｅＬａ細胞で１０μＭ ＭＲＥ７６３によるＮ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害 リボザイム 光単位（１０５） 減少（％） ナンセンス ２．５８ ０ＭＲＥ７６３Ｃ（ＦＵ，ＦＣ） １．０‐１．１ ５７〜６１ 表VI： ＨｅＬａ細胞で１０μＭ ＭＲＥ７６４によるＮ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ遺伝子発現の阻害 リボザイム 光単位（１０５） 減少（％） ナンセンス ４．４ ０ＭＲＥ７６４Ｕ（ＦＵ，ＦＣ） ２．２‐２．５ ４３〜５０ 有効用量はリポフェクタミン（Ｒ）またはセルフェクチ
ン（Ｒ）（Fa．Life Technologies,Eggenstein；German
y ）のような取込みエンハンサーを用いるか、あるいは
リポソーム、マイクロ粒子またはナノ粒子処方を用いる
ことにより１０〜１００倍低下させることができた。活
性ハンマーヘッド構造を含んでいるが、Ｎ‐ｒａｓ ｍ
ＲＮＡに対するものではないリボザイム（ナンセンスコ
ントロール）はＮ‐ｒａｓ‐ルシフェラーゼ融合の発現
を減少させなかった。
【００２６】本発明は薬剤としての酵素ＲＮＡ分子の使
用にも関する。これらの薬剤は、例えば錠剤、コーティ
ング錠剤、硬質または軟質寒天ゼラチンカプセル、溶
液、エマルジョンまたは懸濁液として経口投与できる、
例えば薬品の形で使用できる。場合によりタンパク質ま
たはペプチドのような成分を更に含有した、リポソーム
中への薬剤の含有も、同様に適切な投与形である。ナノ
およびマイクロ粒子も好ましい適用経路である。それら
は、例えば坐剤の形で直腸から、または例えば注射溶液
の形で非経口に投与することもできる。代わりの投与形
は局所適用、局部適用、例えば注射の形による。経鼻投
与も好ましい適用法である。
用にも関する。これらの薬剤は、例えば錠剤、コーティ
ング錠剤、硬質または軟質寒天ゼラチンカプセル、溶
液、エマルジョンまたは懸濁液として経口投与できる、
例えば薬品の形で使用できる。場合によりタンパク質ま
たはペプチドのような成分を更に含有した、リポソーム
中への薬剤の含有も、同様に適切な投与形である。ナノ
およびマイクロ粒子も好ましい適用経路である。それら
は、例えば坐剤の形で直腸から、または例えば注射溶液
の形で非経口に投与することもできる。代わりの投与形
は局所適用、局部適用、例えば注射の形による。経鼻投
与も好ましい適用法である。
【００２７】投与タイプは、治療すべきがんのタイプに
依存する。本発明は、Ｎ‐ｒａｓ発現、特にコドン１３
変異Ｎ‐ｒａｓ発現に起因するかまたはそれに関係した
疾患の治療に関する。Ｎ‐ｒａｓ特異的リボザイムは、
例えば神経芽腫、黒色腫、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭ
Ｌ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄種、甲
状腺腫瘍、リンパ球疾患および肝臓がんを治療するため
に使用できる。異なるタイプの白血病のようにほとんど
のタイプのがんでは、全身治療が好ましい。
依存する。本発明は、Ｎ‐ｒａｓ発現、特にコドン１３
変異Ｎ‐ｒａｓ発現に起因するかまたはそれに関係した
疾患の治療に関する。Ｎ‐ｒａｓ特異的リボザイムは、
例えば神経芽腫、黒色腫、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭ
Ｌ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄種、甲
状腺腫瘍、リンパ球疾患および肝臓がんを治療するため
に使用できる。異なるタイプの白血病のようにほとんど
のタイプのがんでは、全身治療が好ましい。
【００２８】
【実施例】本発明を下記実施例により説明するが、本発
明の範囲はこれらに限定されるものではない。
明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２９】実施例１：リボザイムの化学合成 オリゴリボヌクレオチドは１μmol 規模でApplied Bios
ystems 380B ＤＮＡ Synthesizerにより調製した。リボ
ヌクレオチドホスホルアミデートおよびコントロール多
孔質ガラスカラムは PerSeptive Biosystems（商標名）
から得た。最初の５′および最後の３つの３′‐リボヌ
クレオシドはホスホロチオエートにより安定化させた。
シトシン‐およびウラシル‐リボヌクレオチドは各２′
‐フルオロ、２′‐Ｏ‐メチルおよび２′‐デスオキシ
修飾リボヌクレオチドで置き換えた。オリゴリボヌクレ
オチドを５５℃で１６時間にわたる水性濃縮アンモニア
／エタノール（３：１ｖ／ｖ）３ｍｌとのガラス支持体
のインキュベートにより塩基脱保護した。Speed-Vac 蒸
発による溶媒の完全除去後、２′‐シリル基をＴＨＦ中
１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド中において室
温で一夜のインキュベートにより除去した。３Ｍ Ｎａ
ＯＡｃ溶液（ｐＨ５．２）０．５ｍｌの添加後、ＴＨＦ
をSpeed-Vac 濃縮器で除去し、酢酸エチル１ｍｌで２回
抽出した。オリゴリボヌクレオチドを２．５倍容量の無
水エタノールの添加により沈降させた。ＲＮＡを１３．
０００Ｕ/minで遠心し、ペレットを水１ｍｌに溶解し
た。溶液を２６０ｎｍでＵＶ吸収により完全ＲＮＡにつ
いてチェックした。ＲＮＡ溶液を８Ｍ尿素含有変性１２
または２０％ポリアクリルアミドゲルで精製した。ＵＶ
検出ＲＮＡを切り出し、その後関係のあるゲルピースを
一夜かけて０．０５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ溶液 （ｐＨ７．
０）で溶出させた。ＲＮＡ溶液をSephadex‐Ｇ２５（商
標名）カラムにのせた。１ｍｌのフラクションを集め、
溶液を−２０℃で凍結貯蔵した。リボザイムＲＮＡおよ
び基質ＲＮＡの等質性を質量スペクトル測定、５′‐32
Ｐ標識オリゴリボヌクレオチドの分析ＰＡＧＥと、その
後にオートラジオグラフィーによりチェックした。ＲＮ
Ａ濃度は６．６×１０３Ｍ／ｃｍの２６０ｎｍで吸光係
数をみることにより調べた。
ystems 380B ＤＮＡ Synthesizerにより調製した。リボ
ヌクレオチドホスホルアミデートおよびコントロール多
孔質ガラスカラムは PerSeptive Biosystems（商標名）
から得た。最初の５′および最後の３つの３′‐リボヌ
クレオシドはホスホロチオエートにより安定化させた。
シトシン‐およびウラシル‐リボヌクレオチドは各２′
‐フルオロ、２′‐Ｏ‐メチルおよび２′‐デスオキシ
修飾リボヌクレオチドで置き換えた。オリゴリボヌクレ
オチドを５５℃で１６時間にわたる水性濃縮アンモニア
／エタノール（３：１ｖ／ｖ）３ｍｌとのガラス支持体
のインキュベートにより塩基脱保護した。Speed-Vac 蒸
発による溶媒の完全除去後、２′‐シリル基をＴＨＦ中
１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド中において室
温で一夜のインキュベートにより除去した。３Ｍ Ｎａ
ＯＡｃ溶液（ｐＨ５．２）０．５ｍｌの添加後、ＴＨＦ
をSpeed-Vac 濃縮器で除去し、酢酸エチル１ｍｌで２回
抽出した。オリゴリボヌクレオチドを２．５倍容量の無
水エタノールの添加により沈降させた。ＲＮＡを１３．
０００Ｕ/minで遠心し、ペレットを水１ｍｌに溶解し
た。溶液を２６０ｎｍでＵＶ吸収により完全ＲＮＡにつ
いてチェックした。ＲＮＡ溶液を８Ｍ尿素含有変性１２
または２０％ポリアクリルアミドゲルで精製した。ＵＶ
検出ＲＮＡを切り出し、その後関係のあるゲルピースを
一夜かけて０．０５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ溶液 （ｐＨ７．
０）で溶出させた。ＲＮＡ溶液をSephadex‐Ｇ２５（商
標名）カラムにのせた。１ｍｌのフラクションを集め、
溶液を−２０℃で凍結貯蔵した。リボザイムＲＮＡおよ
び基質ＲＮＡの等質性を質量スペクトル測定、５′‐32
Ｐ標識オリゴリボヌクレオチドの分析ＰＡＧＥと、その
後にオートラジオグラフィーによりチェックした。ＲＮ
Ａ濃度は６．６×１０３Ｍ／ｃｍの２６０ｎｍで吸光係
数をみることにより調べた。
【００３０】実施例２：プラスミド構築 ｐｃＮ１プラスミド（A.Hall.MRC Laboratory for Mole
cular Cell Biology,London ）はＮ‐ｒａｓ遺伝子を含
んでいた。野生型Ｎ‐ｒａｓクローンをプライマー５′
‐ＡＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡ
ＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴ‐３′（フォワードプライマ
ー、配列番号：３）および５′‐ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴ
ＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＣ‐
３′（リバースプライマー、配列番号：４）を用いてＰ
ＣＲ増幅させた。制限エンドヌクレアーゼ部位をこれら
プライマーの５′‐領域中に工学的に作製した（リバー
スプライマーＥｃｏＲＩ；フォワードプライマーＢａｍ
ＨＩ）。Ｎ‐ｒａｓ遺伝子産物を含む６２９ｂｐＰＣＲ
産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで切断し、クローニング前にエタノー
ル沈降させた（図２参照）。２部分連結に際して、Ｎ‐
ｒａｓ ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩでｐBluescript II ＫＳ転写ベクターの多数クロー
ニング部位中にクローニングした。得られたプラスミド
はｐＭＳ１‐ＮＲＡＳと命名した。
cular Cell Biology,London ）はＮ‐ｒａｓ遺伝子を含
んでいた。野生型Ｎ‐ｒａｓクローンをプライマー５′
‐ＡＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡ
ＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴ‐３′（フォワードプライマ
ー、配列番号：３）および５′‐ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴ
ＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＣ‐
３′（リバースプライマー、配列番号：４）を用いてＰ
ＣＲ増幅させた。制限エンドヌクレアーゼ部位をこれら
プライマーの５′‐領域中に工学的に作製した（リバー
スプライマーＥｃｏＲＩ；フォワードプライマーＢａｍ
ＨＩ）。Ｎ‐ｒａｓ遺伝子産物を含む６２９ｂｐＰＣＲ
産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで切断し、クローニング前にエタノー
ル沈降させた（図２参照）。２部分連結に際して、Ｎ‐
ｒａｓ ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩでｐBluescript II ＫＳ転写ベクターの多数クロー
ニング部位中にクローニングした。得られたプラスミド
はｐＭＳ１‐ＮＲＡＳと命名した。
【００３１】Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡの二次構造を予測す
るために、２００ｂｐ断片をKhorana （３６）の方策に
従い５′翻訳開始部位でクローニングした。この目的の
ために、制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩおよびＢ
ａｍＨＩを含んだ鎖長９９〜１０２ヌクレオチドの４つ
のオリゴデスオキシヌクレオチドを合成した。 オリゴ１（センス）：５′‐ＣＴＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴ
ＣＣＣＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧ
ＴＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ
ＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧ
ＧＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＴ‐３′；（配列番号：５） オリゴ１（アンチセンス）：５′‐ＧＣＴＧＣＣＡＧＧ
ＣＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＧ
ＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＣＡＴＧＣ
ＧＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＣＴ
ＣＣＣＡＣＡＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＣＴ‐３′；（配列
番号：６） オリゴ２（センス）：５′‐ＧＧＣＡＧＣＣＧＡＣＴＧ
ＡＴＴＡＣＧＴＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧ
ＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣ
ＡＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴ
ＴＴＴＴＣＣＣＧＧＴＣＴＧＧ‐３′；（配列番号：
７） オリゴ２（アンチセンス）：５′‐ＧＡＴＣＣＣＡＧＡ
ＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＧＧ
ＡＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡ
ＧＧＡＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣＧ
ＣＴＡＣＧＴＡＡＴＣＡＧＴＣＧ‐３′；（配列番号：
８） それらをハイブリッド形成させ、制限酵素ＸｂａＩおよ
びＢａｍＨＩを用いてｐBluescript II ＫＳベクターの
多数クローニング部位中にサブクローニングした。得ら
れたプラスミドはｐＭＳ２‐ＮＲＡＳと命名した。
るために、２００ｂｐ断片をKhorana （３６）の方策に
従い５′翻訳開始部位でクローニングした。この目的の
ために、制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩおよびＢ
ａｍＨＩを含んだ鎖長９９〜１０２ヌクレオチドの４つ
のオリゴデスオキシヌクレオチドを合成した。 オリゴ１（センス）：５′‐ＣＴＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴ
ＣＣＣＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧ
ＴＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＴ
ＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧ
ＧＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＴ‐３′；（配列番号：５） オリゴ１（アンチセンス）：５′‐ＧＣＴＧＣＣＡＧＧ
ＣＧＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＧ
ＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＣＡＴＧＣ
ＧＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＣＴ
ＣＣＣＡＣＡＣＧＧＧＡＣＧＴＴＴＣＴ‐３′；（配列
番号：６） オリゴ２（センス）：５′‐ＧＧＣＡＧＣＣＧＡＣＴＧ
ＡＴＴＡＣＧＴＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧ
ＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣ
ＡＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴ
ＴＴＴＴＣＣＣＧＧＴＣＴＧＧ‐３′；（配列番号：
７） オリゴ２（アンチセンス）：５′‐ＧＡＴＣＣＣＡＧＡ
ＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＧＧ
ＡＡＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡ
ＧＧＡＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣＧ
ＣＴＡＣＧＴＡＡＴＣＡＧＴＣＧ‐３′；（配列番号：
８） それらをハイブリッド形成させ、制限酵素ＸｂａＩおよ
びＢａｍＨＩを用いてｐBluescript II ＫＳベクターの
多数クローニング部位中にサブクローニングした。得ら
れたプラスミドはｐＭＳ２‐ＮＲＡＳと命名した。
【００３２】転写開始部位から終結部位までのＮ‐ｒａ
ｓ配列を含んだプラスミドｐＭＳ５‐ＮＲＡＳは、サブ
クローニングされたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで合成遺伝
子断片と連結させて制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ
でｐBluescript II ＫＳ（＋／−）ベクター中にクロー
ニングさせる、３部分連結により得た。正確な配列は標
準操作を用いてＤＮＡ配列分析により確認した。ｐＭＳ
５‐ＮＲＡＳの転写から約９００ヌクレオチドの予想鎖
長のＲＮＡを得た。
ｓ配列を含んだプラスミドｐＭＳ５‐ＮＲＡＳは、サブ
クローニングされたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで合成遺伝
子断片と連結させて制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ
でｐBluescript II ＫＳ（＋／−）ベクター中にクロー
ニングさせる、３部分連結により得た。正確な配列は標
準操作を用いてＤＮＡ配列分析により確認した。ｐＭＳ
５‐ＮＲＡＳの転写から約９００ヌクレオチドの予想鎖
長のＲＮＡを得た。
【００３３】ＰＣＲ技術は、２つの内部プライマーペ
ア：５′‐ＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧ
ＣＧＣＡＣＴＧ‐３′（フォワードプライマー、配列番
号：９）；５′‐ＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡ
ＡＣＣＡＣＣＡＣ‐３′（第一変異を工学的に入れたリ
バースプライマー、配列番号：１０）および５′‐ＧＣ
ＡＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＴＧ
‐３′（フォワードプライマー、配列番号：１１）；
５′‐ＣＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣ
ＡＣＣＡＣ‐３′（第二変異を工学的に入れたリバース
プライマー、配列番号：１２）を適用して、２つのＮ‐
ｒａｓ活性化がん遺伝子（第一プラスミド：コドン１３
ＧＧＴ→ＧＴＴおよび第二プラスミド：コドン１３
ＧＧＴ→ＣＧＴ）を構築するために用いた。完全断片の
増幅のため、２つの外部プライマー５′‐ＡＧＴＧＣＴ
ＣＴＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴＣＣＣＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧ
ＧＧＣＧ‐３′（フォワードプライマー、配列番号：１
３）および５′‐ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＣＡ
ＣＣＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＣ‐３′（リバースプ
ライマー）を用いた。伸長ＰＣＲ産物をゲル精製し、制
限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、クローニン
グ前にエタノール沈降させた。次いで２ＰＣＲ産物の各
々を制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩでｐBluescript
II ＫＳベクターの多数クローニング部位中にクローニ
ングした。得られたプラスミドはｐＭＳ５Ａ‐ＮＲＡＳ
（第一変異ＧＧＴ→ＧＴＴの導入）およびｐＭＳ５Ｂ‐
ＮＲＡＳ（第二変異ＧＧＴ→ＣＧＴの導入）と命名し
た。後の配列分析から上記変異の正しい挿入を確認し
た。
ア：５′‐ＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧ
ＣＧＣＡＣＴＧ‐３′（フォワードプライマー、配列番
号：９）；５′‐ＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡ
ＡＣＣＡＣＣＡＣ‐３′（第一変異を工学的に入れたリ
バースプライマー、配列番号：１０）および５′‐ＧＣ
ＡＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＴＧ
‐３′（フォワードプライマー、配列番号：１１）；
５′‐ＣＣＣＡＡＣＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣ
ＡＣＣＡＣ‐３′（第二変異を工学的に入れたリバース
プライマー、配列番号：１２）を適用して、２つのＮ‐
ｒａｓ活性化がん遺伝子（第一プラスミド：コドン１３
ＧＧＴ→ＧＴＴおよび第二プラスミド：コドン１３
ＧＧＴ→ＣＧＴ）を構築するために用いた。完全断片の
増幅のため、２つの外部プライマー５′‐ＡＧＴＧＣＴ
ＣＴＡＧＡＧＡＡＡＣＧＴＣＣＣＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧ
ＧＧＣＧ‐３′（フォワードプライマー、配列番号：１
３）および５′‐ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＣＡ
ＣＣＡＣＡＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＣ‐３′（リバースプ
ライマー）を用いた。伸長ＰＣＲ産物をゲル精製し、制
限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、クローニン
グ前にエタノール沈降させた。次いで２ＰＣＲ産物の各
々を制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩでｐBluescript
II ＫＳベクターの多数クローニング部位中にクローニ
ングした。得られたプラスミドはｐＭＳ５Ａ‐ＮＲＡＳ
（第一変異ＧＧＴ→ＧＴＴの導入）およびｐＭＳ５Ｂ‐
ＮＲＡＳ（第二変異ＧＧＴ→ＣＧＴの導入）と命名し
た。後の配列分析から上記変異の正しい挿入を確認し
た。
【００３４】実施例３：インビトロ転写 インビトロ転写のために、ｐＭＳ５‐ＮＲＡＳ、ｐＭＳ
５Ａ‐ＮＲＡＳおよびｐＭＳ５Ｂ‐ＮＲＡＳをＥｃｏＲ
Ｉ切断により直鎖化し、フェノール抽出して、エタノー
ル沈降させた。転写は５０ ng/μｌ直鎖化プラスミドＤ
ＮＡ、１０ｍＭＤＴＴ、４０ｍＭ Tris-Ｃｌ ｐＨ７．
５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ
スペルミジン、５００μＭ ｒＮＴＰ、０．８Ｕ／μｌ
ＲＮアーゼインヒビター、２μCi／μｌ〔α‐32Ｐ〕‐
ＡＴＰおよび２．５Ｕ／μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
含有した１００μｌ混合液中で行った。３７℃で１時間
のインキュベートに続いてＤＮアーゼ ２５単位を加
え、混合液を３７℃で更に３０分間インキュベートし
た。次のフェノール抽出後、水相をCentricon-１００チ
ューブ中に入れ、３．４００Ｕ/minで３０分間遠心し
た。ＲＮＡ溶液をＵＶ吸収および６％分析ＰＡＧＥ（８
Ｍ尿素）により等質性についてチェックした。溶液を−
２０℃で凍結貯蔵した。
５Ａ‐ＮＲＡＳおよびｐＭＳ５Ｂ‐ＮＲＡＳをＥｃｏＲ
Ｉ切断により直鎖化し、フェノール抽出して、エタノー
ル沈降させた。転写は５０ ng/μｌ直鎖化プラスミドＤ
ＮＡ、１０ｍＭＤＴＴ、４０ｍＭ Tris-Ｃｌ ｐＨ７．
５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ
スペルミジン、５００μＭ ｒＮＴＰ、０．８Ｕ／μｌ
ＲＮアーゼインヒビター、２μCi／μｌ〔α‐32Ｐ〕‐
ＡＴＰおよび２．５Ｕ／μｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
含有した１００μｌ混合液中で行った。３７℃で１時間
のインキュベートに続いてＤＮアーゼ ２５単位を加
え、混合液を３７℃で更に３０分間インキュベートし
た。次のフェノール抽出後、水相をCentricon-１００チ
ューブ中に入れ、３．４００Ｕ/minで３０分間遠心し
た。ＲＮＡ溶液をＵＶ吸収および６％分析ＰＡＧＥ（８
Ｍ尿素）により等質性についてチェックした。溶液を−
２０℃で凍結貯蔵した。
【００３５】実施例４：合成基質の反応速度論 反応速度（動態）定数Ｋｍおよびｋcat を５′‐32Ｐ標
識基質で行われたEadie-Hofstee プロットから調べた。
ＲＮＡ基質をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび〔γ
‐32Ｐ〕‐ＡＴＰとの反応により標識した。５′‐末端
標識基質をCentricon-３００チューブで〔γ‐32Ｐ〕‐
ＡＴＰから精製した。リボザイムおよび基質を別々にｐ
Ｈ７．５の５０ｍＭ Tris-Ｃｌ中７５℃で１分間加熱し
た。３７℃で５分間冷却させた後、１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２を１０ｍＭの最終濃度まで加え、溶液を３７℃で更
に５分間インキュベートした。マルチターンオーバー反
応は、ｐＨ７．５の５０ｍＭ Tris-Ｃｌおよび１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２中に濃度２０〜５００ｎＭの基質と濃度２
〜５ｎＭのリボザイムを含有した１００μｌの容量中３
７℃で行った。反応はリボザイムの添加により開始させ
た。反応はリボザイムを等容量の停止溶液（８Ｍ尿素、
２５ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合することにより停止させ
た。開裂反応を２０％変性ポリアクリルアミドゲル（８
Ｍ尿素）で分析し、Molecular Dynamic Phosphorimagin
g システムで走査した。
識基質で行われたEadie-Hofstee プロットから調べた。
ＲＮＡ基質をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび〔γ
‐32Ｐ〕‐ＡＴＰとの反応により標識した。５′‐末端
標識基質をCentricon-３００チューブで〔γ‐32Ｐ〕‐
ＡＴＰから精製した。リボザイムおよび基質を別々にｐ
Ｈ７．５の５０ｍＭ Tris-Ｃｌ中７５℃で１分間加熱し
た。３７℃で５分間冷却させた後、１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２を１０ｍＭの最終濃度まで加え、溶液を３７℃で更
に５分間インキュベートした。マルチターンオーバー反
応は、ｐＨ７．５の５０ｍＭ Tris-Ｃｌおよび１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２中に濃度２０〜５００ｎＭの基質と濃度２
〜５ｎＭのリボザイムを含有した１００μｌの容量中３
７℃で行った。反応はリボザイムの添加により開始させ
た。反応はリボザイムを等容量の停止溶液（８Ｍ尿素、
２５ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合することにより停止させ
た。開裂反応を２０％変性ポリアクリルアミドゲル（８
Ｍ尿素）で分析し、Molecular Dynamic Phosphorimagin
g システムで走査した。
【００３６】実施例５：インビトロ転写ＲＮＡの反応速
度論 １０μｌの容量中“シングルターンオーバー”条件下に
おける開裂効率は、２０〜１２００ｎＭリボザイム、５
０ｍＭ Tris-Ｃｌ ｐＨ７．５および１０ｍＭＭｇＣｌ
２を用いて調べた。反応は１０ｎＭ基質の最終濃度まで
ＲＮＡ基質の添加により３７℃で開始させ、１時間かけ
た。反応は各反応液に８μｌのstoppmixを混合すること
により停止させた。反応は６％変性ポリアクリルアミド
ゲルで分析し、Molecular Dynamic Phosphor Imager で
走査した。シングルターンオーバーｋcat ／Ｋｍ値はHe
idenreich and Eckstein (1992),J.Biol.Chem.267: 190
4-1909に記載されたように調べた。
度論 １０μｌの容量中“シングルターンオーバー”条件下に
おける開裂効率は、２０〜１２００ｎＭリボザイム、５
０ｍＭ Tris-Ｃｌ ｐＨ７．５および１０ｍＭＭｇＣｌ
２を用いて調べた。反応は１０ｎＭ基質の最終濃度まで
ＲＮＡ基質の添加により３７℃で開始させ、１時間かけ
た。反応は各反応液に８μｌのstoppmixを混合すること
により停止させた。反応は６％変性ポリアクリルアミド
ゲルで分析し、Molecular Dynamic Phosphor Imager で
走査した。シングルターンオーバーｋcat ／Ｋｍ値はHe
idenreich and Eckstein (1992),J.Biol.Chem.267: 190
4-1909に記載されたように調べた。
【００３７】実施例６：リボザイムの安定性の分析 ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％熱不活化ＦＣＳおよび１００
単位／mlペニシリンで補充されたDulbecco's改変Eagle'
s 培地で単層として維持した。２×１０６細胞／mlの細
胞密度に達した後、上澄を細胞から除去した。異なる修
飾リボザイムを含有したリボザイム溶液（３２μｌ）を
細胞培養上澄（５２５μｌ）に加えて、５μＭの最終リ
ボザイム濃度に到達させた。一部（６７μｌ）を異なる
時間に取り出し、液体窒素中に入れて、ヌクレアーゼ活
性を停止させた。Speed-Vac 蒸発後、ペレットをホルム
アミドに再懸濁した。別々な部分を２０％ポリアクリル
アミドゲル（８Ｍ尿素）、その後銀染色により分析し
た。
単位／mlペニシリンで補充されたDulbecco's改変Eagle'
s 培地で単層として維持した。２×１０６細胞／mlの細
胞密度に達した後、上澄を細胞から除去した。異なる修
飾リボザイムを含有したリボザイム溶液（３２μｌ）を
細胞培養上澄（５２５μｌ）に加えて、５μＭの最終リ
ボザイム濃度に到達させた。一部（６７μｌ）を異なる
時間に取り出し、液体窒素中に入れて、ヌクレアーゼ活
性を停止させた。Speed-Vac 蒸発後、ペレットをホルム
アミドに再懸濁した。別々な部分を２０％ポリアクリル
アミドゲル（８Ｍ尿素）、その後銀染色により分析し
た。
【００３８】実施例７：溶融曲線 ＵＶ温度曲線はVarian Cary-１ ＵＶ／ＶＩＳスペクト
ル測定器を用いて２６０ｎｍで測定した。標的は５０ｍ
Ｍ Tris-Ｃｌ ｐＨ７．５および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２
を含有した緩衝液にリボザイムを溶解させることにより
調製した。サンプルを１０ｍｍ路長のキュベットに移し
た。リボザイムを８０℃で５分間かけて変性させ、その
後基質ＲＮＡおよび基質ＤＮＡを加え、全混合物を１℃
/minで復元させた。２６０ｎｍでの溶融曲線は、溶液を
キュベット中０．７５℃/minで加熱して、８０℃に達す
るまで０．５℃段階毎に吸光度データを得ることにより
調べた。Ｔｍ値と遷移の熱力学的パラメーターは、Mark
y and Breslauer の方法を用いて、Sigma Chemicals C
o. ソフトウェアからのGraFitバージョン２．０の２遷
移状態モデルのデータをあてはめることにより得た。
ル測定器を用いて２６０ｎｍで測定した。標的は５０ｍ
Ｍ Tris-Ｃｌ ｐＨ７．５および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２
を含有した緩衝液にリボザイムを溶解させることにより
調製した。サンプルを１０ｍｍ路長のキュベットに移し
た。リボザイムを８０℃で５分間かけて変性させ、その
後基質ＲＮＡおよび基質ＤＮＡを加え、全混合物を１℃
/minで復元させた。２６０ｎｍでの溶融曲線は、溶液を
キュベット中０．７５℃/minで加熱して、８０℃に達す
るまで０．５℃段階毎に吸光度データを得ることにより
調べた。Ｔｍ値と遷移の熱力学的パラメーターは、Mark
y and Breslauer の方法を用いて、Sigma Chemicals C
o. ソフトウェアからのGraFitバージョン２．０の２遷
移状態モデルのデータをあてはめることにより得た。
【００３９】実施例８：ＨｅＬａ細胞におけるＮ‐ｒａ
ｓの阻害 リボザイムの阻害効果を調べるために、Ｎ‐ｒａｓ‐ル
シフェラーゼリポーター遺伝子を構築した。約８０ｂｐ
の５′‐非翻訳配列、自然翻訳開始コドンと、変異また
は野生型Ｎ‐ｒａｓタンパク質の１３４アミノ酸につい
てコードするヌクレオチドを含んだＮ‐ｒａｓ遺伝子の
４５０ｂｐ断片を、ルシフェラーゼ遺伝子（Photinus p
yralis）とフレーム内で融合させた。Ｎ‐ｒａｓ‐ルシ
フェラーゼ融合タンパク質のルシフェラーゼ活性（光単
位）を測定する。
ｓの阻害 リボザイムの阻害効果を調べるために、Ｎ‐ｒａｓ‐ル
シフェラーゼリポーター遺伝子を構築した。約８０ｂｐ
の５′‐非翻訳配列、自然翻訳開始コドンと、変異また
は野生型Ｎ‐ｒａｓタンパク質の１３４アミノ酸につい
てコードするヌクレオチドを含んだＮ‐ｒａｓ遺伝子の
４５０ｂｐ断片を、ルシフェラーゼ遺伝子（Photinus p
yralis）とフレーム内で融合させた。Ｎ‐ｒａｓ‐ルシ
フェラーゼ融合タンパク質のルシフェラーゼ活性（光単
位）を測定する。
【００４０】実施例９：コロニー形成寒天アッセイ アッセイは半固体法である。形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞
は懸濁液中で容易にクローン化する。コロニーを一緒に
保つために、細胞を０．３％寒天（上層）に懸濁し、ペ
トリ皿の０．５％寒天層（下層）上に塗布した。細胞を
温寒天に懸濁して、ゲル化後３７℃でインキュベートし
たとき、２寒天濃度間の界面における個別の細胞は容易
に単離できるコロニーを形成する（Cowley et al.,Cell
77:841-852,1994）。各系を同様に４つ用意した。
は懸濁液中で容易にクローン化する。コロニーを一緒に
保つために、細胞を０．３％寒天（上層）に懸濁し、ペ
トリ皿の０．５％寒天層（下層）上に塗布した。細胞を
温寒天に懸濁して、ゲル化後３７℃でインキュベートし
たとき、２寒天濃度間の界面における個別の細胞は容易
に単離できるコロニーを形成する（Cowley et al.,Cell
77:841-852,1994）。各系を同様に４つ用意した。
【００４１】下層（０．５％寒天）の調製 ２．５％寒天は、脱イオン水に溶解してマイクロ波オー
ブンで加熱することにより調製した。寒天を水浴で４５
℃に冷却した（寒天は３７℃でゲルに変わる）。０．５
％寒天との寒天混合物を下記のように調製した： １×ＤＭＥＭ培地 ２５ｍｌ（５０％） ２．５％寒天 １０ｍｌ（２０％） ２×ＤＭＥＭ培地 １０ｍｌ（２０％） ＦＣＳ ５ｍｌ（１０％） 寒天混合液１ｍｌサンプルを３５ｍｍペトリ細胞培養皿
中にピペットで入れ、４℃で３０分間貯蔵した。
ブンで加熱することにより調製した。寒天を水浴で４５
℃に冷却した（寒天は３７℃でゲルに変わる）。０．５
％寒天との寒天混合物を下記のように調製した： １×ＤＭＥＭ培地 ２５ｍｌ（５０％） ２．５％寒天 １０ｍｌ（２０％） ２×ＤＭＥＭ培地 １０ｍｌ（２０％） ＦＣＳ ５ｍｌ（１０％） 寒天混合液１ｍｌサンプルを３５ｍｍペトリ細胞培養皿
中にピペットで入れ、４℃で３０分間貯蔵した。
【００４２】上層（０．３％寒天）の調製 寒天混合液を５×１０４細胞／ml懸濁液１ｍｌに加え
て、ＤＭＥＭ培地で１．７ｍｌの全容量に調製した。１
ｍｌサンプルを用意した底層上にピペットで入れ、３７
℃で１４〜２１日間インキュベートした。３０ｍｍ培養
皿の寒天調製物は、滅菌脱イオン水だけを含有したもう
１つのペトリ皿と一緒に、１００ｍｍペトリ皿に２グル
ープで入れた。
て、ＤＭＥＭ培地で１．７ｍｌの全容量に調製した。１
ｍｌサンプルを用意した底層上にピペットで入れ、３７
℃で１４〜２１日間インキュベートした。３０ｍｍ培養
皿の寒天調製物は、滅菌脱イオン水だけを含有したもう
１つのペトリ皿と一緒に、１００ｍｍペトリ皿に２グル
ープで入れた。
【００４３】クローンは顕微鏡下でピペットを用いて寒
天から２４ウェルプレート中に単離し、その後拡張させ
た。
天から２４ウェルプレート中に単離し、その後拡張させ
た。
【００４４】コロニー形成アッセイ 野生型および変異Ｎ‐ｒａｓ遺伝子（コドン１３）は、
アミノ酸交換を伴う点変異のみで異なる。この結果とし
て、タンパク質ｐ２１ras は細胞代謝を変化させる能力
を失っており、細胞の悪性形質転換を起こす。正常細胞
と対照的に、がん細胞は無血清培地および軟寒天（半固
体）で増殖することができて、それらは細胞集塊（フォ
ーカス）を群集化する。フォーカスは、細胞が完全にラ
ンダムで増殖する領域である。これは形質転換細胞の接
触阻止の喪失に起因する。
アミノ酸交換を伴う点変異のみで異なる。この結果とし
て、タンパク質ｐ２１ras は細胞代謝を変化させる能力
を失っており、細胞の悪性形質転換を起こす。正常細胞
と対照的に、がん細胞は無血清培地および軟寒天（半固
体）で増殖することができて、それらは細胞集塊（フォ
ーカス）を群集化する。フォーカスは、細胞が完全にラ
ンダムで増殖する領域である。これは形質転換細胞の接
触阻止の喪失に起因する。
【００４５】構成的Ｎ‐ｒａｓ発現クローン２および４
の細胞（前記のようなコドン１３の変異、ｐｃＤＮＡ３
‐ＮＲＡＳＣ、表VII 参照）を軟寒天で継代培養した。
軟寒天アッセイの場合、２．５×１０４細胞／mlをペト
リ皿に入れた。アッセイは半固体法である。変異Ｎ‐ｒ
ａｓクローンは軟寒天で約４〜６日間後に分離コロニー
を形成した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびｐｃＤＮＡ３プラ
スミド（In VitroGen市販）で安定的にトランスフェク
トされたＮＩＨ３Ｔ３細胞をコントロールとして軟寒天
上に接種した。２つのコントロールはフォーカスを形成
できなかった。
の細胞（前記のようなコドン１３の変異、ｐｃＤＮＡ３
‐ＮＲＡＳＣ、表VII 参照）を軟寒天で継代培養した。
軟寒天アッセイの場合、２．５×１０４細胞／mlをペト
リ皿に入れた。アッセイは半固体法である。変異Ｎ‐ｒ
ａｓクローンは軟寒天で約４〜６日間後に分離コロニー
を形成した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびｐｃＤＮＡ３プラ
スミド（In VitroGen市販）で安定的にトランスフェク
トされたＮＩＨ３Ｔ３細胞をコントロールとして軟寒天
上に接種した。２つのコントロールはフォーカスを形成
できなかった。
【００４６】形質転換細胞の数を増加させるために、Ｎ
‐ｒａｓ構築体の個別コロニーを２４ウェルプレートで
単離し、拡張させた。軟寒天アッセイを変異Ｎ‐ｒａｓ
遺伝子のクローン２および４で再び行った（２．５×１
０４細胞／ml）。このときには、４〜６日後に明らかに
もっと多くの形質転換細胞のコロニーが認められ、１４
日後だと細胞の約７０％はフォーカスからなっていた。
培養物中であっても、変異Ｎ‐ｒａｓ遺伝子の細胞は形
質転換細胞のコロニーを形成した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の
場合には、単一がん遺伝子がこれらをがん細胞に形質転
換させる上で十分であることが、軟寒天により認められ
る。悪性形質転換表現型への転換がトランスフェクショ
ンにより生じた。
‐ｒａｓ構築体の個別コロニーを２４ウェルプレートで
単離し、拡張させた。軟寒天アッセイを変異Ｎ‐ｒａｓ
遺伝子のクローン２および４で再び行った（２．５×１
０４細胞／ml）。このときには、４〜６日後に明らかに
もっと多くの形質転換細胞のコロニーが認められ、１４
日後だと細胞の約７０％はフォーカスからなっていた。
培養物中であっても、変異Ｎ‐ｒａｓ遺伝子の細胞は形
質転換細胞のコロニーを形成した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の
場合には、単一がん遺伝子がこれらをがん細胞に形質転
換させる上で十分であることが、軟寒天により認められ
る。悪性形質転換表現型への転換がトランスフェクショ
ンにより生じた。
【００４７】ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるレトロウイルス
媒介リボザイムでのｍＲＮＡの開裂によるＮ‐ｒａｓ発
現の減少 ここでは、軟寒天での悪性表現型の復帰が活性リボザイ
ムＭＲＥ７６３ＣでのＮ‐ｒａｓ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３
細胞の感染により生じるかどうかを調べることを目的と
する。この目的のため、活性リボザイムＭＲＥ７６３Ｃ
およびｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏプラスミドを構成的に発現
する既に樹立されたＧＰ＋ｅｎｖＡｍ‐１２プロデュー
サー細胞系のウイルス集団を、標的細胞、即ちＮ‐ｒａ
ｓ変異体（クローン２および４）を構成的に発現するＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞、中へ感染させることによる遺伝子トラ
ンスファーに用いた。
媒介リボザイムでのｍＲＮＡの開裂によるＮ‐ｒａｓ発
現の減少 ここでは、軟寒天での悪性表現型の復帰が活性リボザイ
ムＭＲＥ７６３ＣでのＮ‐ｒａｓ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３
細胞の感染により生じるかどうかを調べることを目的と
する。この目的のため、活性リボザイムＭＲＥ７６３Ｃ
およびｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏプラスミドを構成的に発現
する既に樹立されたＧＰ＋ｅｎｖＡｍ‐１２プロデュー
サー細胞系のウイルス集団を、標的細胞、即ちＮ‐ｒａ
ｓ変異体（クローン２および４）を構成的に発現するＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞、中へ感染させることによる遺伝子トラ
ンスファーに用いた。
【００４８】リボザイムまたはコントロールリボザイム
（１０位でＧの代わりにヌクレオチドＡを有する配列番
号：１）を発現する純粋細胞集団を得るために、プロマ
イシン選択（１．５μg/ml）を４８時間後に開始させ
た。１０日間の選択後、各構築体から３クローンを２４
ウェルプレートで単離し、Ｔ２５培養ボトルで拡張させ
た。
（１０位でＧの代わりにヌクレオチドＡを有する配列番
号：１）を発現する純粋細胞集団を得るために、プロマ
イシン選択（１．５μg/ml）を４８時間後に開始させ
た。１０日間の選択後、各構築体から３クローンを２４
ウェルプレートで単離し、Ｔ２５培養ボトルで拡張させ
た。
【００４９】３単離クローンのうち１つと、リボザイム
ＭＲＥ７６３ＣおよびｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏを構成的に
発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（（Morgenstern and Land,N
ucl.Acids Res.18: 3587-3596,1990）；Ｎ‐ｒａｓ変異
体（クローン２および４）で安定的にトランスフェクト
された）の混合集団を、軟寒天で継代培養した。２×１
０４細胞／mlをペトリ皿にもう１回入れた。用いられた
コントロールは２×１０４細胞／ml ＮＩＨ３Ｔ３細胞
（陰性コントロール）、ｐｃＤＮＡ３プラスミドで安定
的にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞（陰性コ
ントロール）と、レトロウイルス構築体ｐＢａｂｃ‐Ｐ
ｕｒｏＲＥＣおよびｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏで感染されて
いないＮ‐ｒａｓ変異体クローン２および４（陽性コン
トロール）であった。軟寒天調製物をインキュベーター
中３７℃および５％ＣＯ２で７〜１４日間インキュベー
トした。
ＭＲＥ７６３ＣおよびｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏを構成的に
発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（（Morgenstern and Land,N
ucl.Acids Res.18: 3587-3596,1990）；Ｎ‐ｒａｓ変異
体（クローン２および４）で安定的にトランスフェクト
された）の混合集団を、軟寒天で継代培養した。２×１
０４細胞／mlをペトリ皿にもう１回入れた。用いられた
コントロールは２×１０４細胞／ml ＮＩＨ３Ｔ３細胞
（陰性コントロール）、ｐｃＤＮＡ３プラスミドで安定
的にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞（陰性コ
ントロール）と、レトロウイルス構築体ｐＢａｂｃ‐Ｐ
ｕｒｏＲＥＣおよびｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏで感染されて
いないＮ‐ｒａｓ変異体クローン２および４（陽性コン
トロール）であった。軟寒天調製物をインキュベーター
中３７℃および５％ＣＯ２で７〜１４日間インキュベー
トした。
【００５０】減少は顕微鏡下で細胞集塊をカウントする
ことにより分析した。軟寒天調製物を各構築体について
同様に４つ作り、平均値を表VII に示されたように計算
した。表VII:リボザイムによる形質転換Ｎ‐ｒａｓ ＮＩＨ３Ｔ３細胞の減少 構築体 クローンの数（平均） 減少 クローン２／クローン４ （％） ＮＩＨ３Ｔ３（陰性コントロール） ３ ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３） ５（陰性コントロール） ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３‐ＮＲＡＳＣ） ９１／１０２ ０（陽性コントロール） リボザイムで感染された ４２／４９ ５４／５２ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３‐ＮＲＡＳＣ） ｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏで感染された ６５／６０ ２９／４１ ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３‐ＮＲＡＳＣ） リボザイムでの形質導入により悪性形質転換表現型の復
帰が起きたが、これはレトロウイルスベクターだけの存
在下でも生じる。
ことにより分析した。軟寒天調製物を各構築体について
同様に４つ作り、平均値を表VII に示されたように計算
した。表VII:リボザイムによる形質転換Ｎ‐ｒａｓ ＮＩＨ３Ｔ３細胞の減少 構築体 クローンの数（平均） 減少 クローン２／クローン４ （％） ＮＩＨ３Ｔ３（陰性コントロール） ３ ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３） ５（陰性コントロール） ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３‐ＮＲＡＳＣ） ９１／１０２ ０（陽性コントロール） リボザイムで感染された ４２／４９ ５４／５２ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３‐ＮＲＡＳＣ） ｐＢａｂｃ‐Ｐｕｒｏで感染された ６５／６０ ２９／４１ ＮＩＨ３Ｔ３（ｐｃＤＮＡ３‐ＮＲＡＳＣ） リボザイムでの形質導入により悪性形質転換表現型の復
帰が起きたが、これはレトロウイルスベクターだけの存
在下でも生じる。
【００５１】
配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＲＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３２ 配列 CCAACACCUG AUGAGCGUUA GCGAAACCUG CU 32
【００５２】配列番号：２ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＲＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３２ 配列 UCCCAACCUG AUGAGCGUUA GCGAAACACC UG 32
【００５３】配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３６ 配列 AGTGCGGATC CTAAATCTGT CCAAAGCAGA GGCAGT 36
【００５４】配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３３ 配列 CCGGAATTCT TACATCACCA CACATGGCAA TCC 33
【００５５】配列番号：５ 配列の長さ：５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．１００ 配列 CTAGAGAAAC GTCCCGTGTG GGAGGGGCGG GTCTGGGTGC GGCTGCCGCA TGACTCGTGG 60 TTCGGAGGCC CACGTGGCCG GGGCGGGGAC TCAGGCGCCT 100
【００５６】配列番号：６ 配列の長さ：１０２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．１０２ 配列 GCTGCCAGGC GCCTGAGTCC CCGCCCCGGC CACGTGGGCC TCCGAACCAC GAGTCATGCG 60 GCAGCCGCAC CCAGACCCGC CCCTCCCACA CGGGACGTTT CT 102
【００５７】配列番号：７ 配列の長さ：１０１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．１０１ 配列 GGCAGCCGAC TGATTACGTA GCGGGCGGGG CCGGAAGTGC CGCTCCTTGG TGGGGGCTGT 60 TCATGGCGGT TCCGGGGTCT CCAACATTTT TCCCGGTCTG G 101
【００５８】配列番号：８ 配列の長さ：９９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．９９ 配列 GATCCCAGAC CGGGAAAAAT GTTGGAGACC CCGGAACCGC CATGAACAGC CCCCACCAAG 60 GAGCGGCACT TCCGGCCCCG CCCGCTACGT AATCAGTCG 99
【００５９】配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．２７ 配列 GCAGGTGTTG TTGGGAAAAG CGCACTG 27
【００６０】配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．２５ 配列 CAACAACACC TGCTCCAACC ACCAC 25
【００６１】配列番号：１１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．２７ 配列 GCAGGTCGTG TTGGGAAAAG CGCACTG 27
【００６２】配列番号：１２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．２７ 配列 CCCAACACGA CCTGCTCCAA CCACCAC 27
【００６３】配列番号：１３ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３５ 配列 AGTGCTCTAG AGAAACGTCC CGTGTGGGAG GGGCG 35
【図１】化学的に合成されたハンマーヘッドリボザイム
を示した図である。（Ａ）は変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡ
に対する合成基質と複合化されたリボザイムについて示
している。（Ｂ）は野生型Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対す
る合成基質と複合化されたリボザイムについて示してい
る。開裂部位は矢印で示され、共通配列はボックスで囲
まれている。ステムはHertel et al.(1992),Nucl.Acids
Res.20: 3252 に従い番号付けしている。
を示した図である。（Ａ）は変異Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡ
に対する合成基質と複合化されたリボザイムについて示
している。（Ｂ）は野生型Ｎ‐ｒａｓ ｍＲＮＡに対す
る合成基質と複合化されたリボザイムについて示してい
る。開裂部位は矢印で示され、共通配列はボックスで囲
まれている。ステムはHertel et al.(1992),Nucl.Acids
Res.20: 3252 に従い番号付けしている。
【図２】プラスミドｐＭＳ５‐Ｎｒａｓのクローニング
ストラテジーを示した図である。ｐｃＮ１増幅物および
２００ｂｐ断片をｐBluescript II ＫＳに別々に連結し
た。３部分連結では、双方の断片をｐBluescript転写ベ
クターでＴ７プロモーターの後に連結した。
ストラテジーを示した図である。ｐｃＮ１増幅物および
２００ｂｐ断片をｐBluescript II ＫＳに別々に連結し
た。３部分連結では、双方の断片をｐBluescript転写ベ
クターでＴ７プロモーターの後に連結した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミハエラ、シェール ドイツ連邦共和国オーベルウルセル、ハイ ネシュトラーセ、３ (72)発明者 アルノルド、ガンザー ドイツ連邦共和国ハノーバー、カールスバ ーデルシュトラーセ、２
Claims (23)
- 【請求項１】ＮＵＸ開裂部位（ここで、Ｎはいずれかの
塩基であり、ＸはＡ、ＣまたはＵである）で変異Ｎ‐ｒ
ａｓ ｍＲＮＡを開裂する酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項２】１３〜５０ヌクレオチドからなる、請求項
１に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項３】ＲＮＡがハンマーヘッドモチーフを有して
いる、請求項１または２に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項４】ＲＮＡが耐ヌクレアーゼ部分として修飾さ
れた、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素ＲＮＡ
分子。 - 【請求項５】配列番号：１の塩基配列を有する、請求項
１〜４のいずれか一項に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項６】配列番号：２の塩基配列を有する、請求項
１〜５のいずれか一項に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項７】１以上の２′‐ヒドロキシ基が修飾され
た、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素ＲＮＡ分
子。 - 【請求項８】２′‐ヒドロキシ修飾が２′‐デオキシリ
ボ、２′‐Ｏ‐メチル、２′‐フルオロおよび／または
２′‐アミノ基である、請求項７に記載の酵素ＲＮＡ分
子。 - 【請求項９】リン酸／糖主鎖の１以上の糖残基が修飾さ
れた、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素ＲＮＡ
分子。 - 【請求項１０】糖の修飾がα‐およびＤ‐フラノシド、
炭素環式五員環アナログ、環拡大および環縮小糖、非環
式糖として規定される、請求項９に記載の酵素ＲＮＡ分
子。 - 【請求項１１】修飾が酵素ＲＮＡ分子の結合領域にあ
る、請求項１０に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項１２】糖の修飾が２′‐Ｏ‐メチル、２′‐Ｏ
‐ブチル、２′‐Ｏ‐アリル、２′‐Ｏ‐メトキシエト
キシのような２′‐Ｏ‐アルキルリボース、あるいは
２′‐フルオロ‐２′‐デオキシリボースおよび２′‐
アミノ‐２′‐デオキシリボースとして規定される、請
求項９に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項１３】１以上のリン酸ヌクレオシド間残基が修
飾された、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素Ｒ
ＮＡ分子。 - 【請求項１４】修飾がホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエート、アルキルホスホネート、アリールホスホネ
ート、アリールアルキルホスホルアミデート、ホスフェ
ートエステル、３′‐３′‐および５′‐５′‐転換と
して規定される、請求項１３に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項１５】ホルムアセタール、３′‐チオホルムア
セタールまたはメチルヒドロキシルアミンにより１以上
のリン酸架橋が置換された、請求項１〜７のいずれか一
項に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項１６】ポリアミド核酸によりリン酸／糖主鎖が
部分的に置換された、請求項１〜７のいずれか一項に記
載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項１７】１以上の修飾塩基を有する、請求項１〜
７のいずれか一項に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項１８】修飾塩基が５‐プロピニル‐Ｕ、５‐プ
ロピニル‐Ｃ、７‐デアザ‐７‐プロピニル‐Ａ、７‐
デアザ‐７‐プロピニル‐Ｇ、５‐メチル‐Ｃまたは５
‐フルオロ‐Ｕとして規定される、請求項１７に記載の
酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項１９】５′、３′および／または２′末端が置
換されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵
素ＲＮＡ分子。 - 【請求項２０】置換が、‐Ｏ‐（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ
＝６〜１８）のような親油基、ステロイド残基、ビタミ
ンＥ、ＡまたはＤ、胆汁酸、葉酸、マンノース、ペプチ
ドのような天然キャリア系を利用した複合体、プソラレ
ンおよびアクリジン誘導体のような標的への結合性を高
めるインターカレーター部分を有する末端基として規定
される、請求項１９に記載の酵素ＲＮＡ分子。 - 【請求項２１】請求項７〜２０に記載された組合せの修
飾を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素Ｒ
ＮＡ分子。 - 【請求項２２】請求項１〜２１のいずれか一項に記載の
１以上の酵素ＲＮＡ分子を、生理学上許容される補助物
質および／またはビヒクルとともに適宜含んでなる医薬
組成物。 - 【請求項２３】異常細胞増殖および／または分化を伴う
Ｎ‐ｒａｓの発現に起因するかまたはそれに関係した疾
患の治療用薬剤の製造のための、請求項１〜２１のいず
れか一項に記載の酵素ＲＮＡ分子の使用。
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