CN116601297A

CN116601297A - 一种经修饰的解旋酶及其应用

Info

Publication number: CN116601297A
Application number: CN202080107912.2A
Authority: CN
Inventors: 王慕旸; 张周刚; 吕伟丽; 王艳双; 陈呈尧
Original assignee: Qitan Technology Ltd Beijing
Current assignee: Qitan Technology Ltd Beijing
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2023-08-15
Also published as: WO2022126304A1

Abstract

本发明提供了一种经修饰的F8813解旋酶，包含经修饰的F8813解旋酶的构建体，以及在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用。本发明还提供了一种控制多核苷酸移动的方法或一种表征目标多核苷酸的方法。采用本发明所述的经修饰的F8813解旋酶可以实现在DNA链测序中控制其穿过跨膜孔的移位，也可以实现对RNA的直接测序，而且，该经修饰的解旋酶可以更长时间保持与多核苷酸的结合，降低从被测序的多核苷酸上解脱的现象。

Description

一种经修饰的解旋酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因测序、分子检测、临床检测技术领域，具体涉及一种经修饰的解旋酶，一种包含解旋酶的复合体结构及其在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用。

背景技术

纳米孔测序技术指以单个核酸分子为测量单元，利用纳米孔对其序列信息进行即时连续读取的基因测序技术。这种测序技术的优势在于建库简单，无需扩增；读取速度快，对单个分子可以达到每小时上万碱基的读取速度；读长非常长，通常在上千碱基；有可能可以对RNA和DNA甲基化进行直接测量。这些都是现有的二代测序技术所无法达到的。但是，纳米孔测序的常见问题是长链多核苷酸通过纳米孔的易位过快以至于单个核苷酸的电流电平过短而难以分辨。在对多核苷酸，尤其是500个核苷酸或更多个核苷酸的测序过程中存在的问题是控制多核苷酸移动的分子马达可能会从多核苷酸上解脱。这允许多核苷酸在施加的场的方向上以不受控的方式被迅速拉动穿过所述孔。

纳米孔测序利用了可以为离子电流提供通道的纳米孔。电泳驱动多核苷酸通过纳米孔，并且由于多核苷酸穿过纳米孔，因此它降低了通过纳米孔的电流。每个通过的核苷酸或一系列核苷酸获得了特征电流，并且对电流电平的记录对应于多核苷酸序列。在“链测序”方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并能实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用核苷酸处理蛋白，诸如解旋酶，以控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。例如，专利WO2013057495A3公开了一种新的表征目标多核苷酸的方法，所述的方法包括通过Hel308解旋酶或分子马达控制目标多核苷酸穿过孔的移动。专利US20150065354A1公开了一种使用XPD解旋酶表征目标多核苷酸的方法，所述的方法包括通过XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过孔的移动。专利CN107109380A公开了一种经修饰的酶，该酶为可以控制目标多核苷酸穿过孔的移动的经修饰的Dda解旋酶。但是，上述现有技术并没有公开本申请提供的既可以实现在DNA链测序中控制其穿过跨膜孔的移位，也可以实现对RNA的直接测序的经修饰的F8813解旋酶。

直接RNA测序的益处和应用是巨大的，比如直接信使RNA测序提供了对生物体动态的观察，包括用于健康筛查；例如某些癌症的转移过程和心脏病。直接RNA测序可快速确认病人、动物或农作物所感染RNA病毒的种类，另外，在调查农作物的抗病性中应用，确定农作物对应激因素，例如干旱、紫外线和盐度的反应，以及在胚胎发育过程的细胞分化和决定中应用。对于RNA，特别是500个或更多的核苷酸的RNA的直接测序中的问题是寻找合适的能够控制RNA穿过跨膜孔的移位的分子马达。对于表征或测序多核苷酸，需要RNA聚合物的持续移动和读取长片段聚合物的能力。

因此，本发明提供了一种经修饰的解旋酶，其既可以实现在DNA链测序中控制其穿过跨膜孔的移位，也可以实现对RNA的直接测序。

发明内容

基于纳米孔测序中多核苷酸通过纳米孔的易位过快、不能准确直接进行RNA多核苷酸的测序以及控制多核苷酸移动的分子马达会从多核苷酸上解脱的现象，本发明提供了一种经修饰的解旋酶，该解旋酶既可以实现在DNA链测序中控制其穿过跨膜孔的移位速度，也可以实现提高对RNA直接测序的准确性，而且，该经修饰的解旋酶可以更长时间保持与多核苷酸的结合，降低从被测序的多核苷酸上解脱的现象。

本发明发现：F8813解旋酶上多核苷酸结合结构域的开口大小的减小或者开闭并不能阻止其与多核苷酸的结合。因此，本发明在F8813解旋酶中引入半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸以使得两个或多个部分连接以减小开口的尺寸或者关闭开口。一旦根据本发明修饰的F8813解旋酶与多核苷酸结合，它就能够控制目标多核苷酸的运动速度，而不需要解开或分离。具体而言，根据本发明修饰的F8813解旋酶将与长多核苷酸(例如包含500个或更多个核苷酸的多核苷酸)强烈结合，并且将控制目标多核苷酸的移动速度，特别是在链测序过程中。具体方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种经修饰的F8813解旋酶，所述的F8813解旋酶包含多核苷酸结合结构域，所述的F8813解旋酶包括SEQ ID NO：1的变体，所述SEQ ID NO：1的变体包括在SEQ ID NO：1的2A结构域(优选第E250至H310位)、Ratchet结构域(优选第L580至G600位)和/或HLH结构域(优选第D680至I700位)中引入至少一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个)半胱氨酸残基和/或至少一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个)非天然氨基酸，以减小多核苷酸结合结构域的开口大小，其中所述F8813解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。

优选的，包括在下列任一组中引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸：

(a)2A结构域；

(b)Ratchet结构域；

(c)HLH结构域；

(d)2A结构域和Ratchet结构域；

(e)2A结构域和HLH结构域；

(f)Ratchet结构域和HLH结构域；

(g)2A结构域、Ratchet结构域和HLH结构域。

优选的，在SEQ ID NO：1中引入至少一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个)半胱氨酸残基，或者引入至少一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个)非天然氨基酸，或者引入至少一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个)半胱氨酸残基和非天然氨基酸。

优选的，包括在SEQ ID NO：1的S272、A273、E274、E281、D284、E285、L287、E288、N289、S290、E291、D293、T294、A300、R303、D284、T314、T315、P316、L317、R318、L320、E322、R326、G328、S589、S589、K691、D694、R695或K698中的任一种或两种以上的位置上引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。

进一步优选的，所述SEQ ID NO：1的变体包括在SEQ ID NO：1的D284和/或S589位置上引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。

更进一步优选的，所述SEQ ID NO：1的变体还包括在SEQ ID NO：1的S272、A273、E274、E281、D284、E285、L287、E288、N289、S290、E291、D293、T294、A300、R303、T314、T315、P316、L317、R318、L320、E322、R326、G328、S589、K691、D694、R695或K698中的任一种或两种以上的位置上引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。

为提高本发明所述的F8813解旋酶与目标多核苷酸结合的稳定性，降低从目标多核苷酸上解脱的能力：引入的半胱氨酸与半胱氨酸之间相互连接，引入的非天然氨基酸与非天然氨基酸之间相互连接，引入的半胱氨酸与非天然氨基酸之间相互连接，引入的半胱氨酸与天然氨基酸之间相互连接，或者引入的非天然氨基酸与天然氨基酸之间相互连接。

优选的，可以使任何数目和组合的两个以上引入的半胱氨酸与非天然氨基酸相互连接。例如，可以使3，4，5，6，7，8或更多个半胱氨酸和/或非天然氨基酸相互连接。一个或多个半胱氨酸可以与一个或多个半胱氨酸连接。一个或多个半胱氨酸可以与一个或多个非天然氨基酸诸如Faz连接。一个或多个非天然氨基酸诸如Faz可以与一个或多个非天然氨基酸诸如Faz连接。一个或多个半胱氨酸可以与一个或多个解旋酶上的天然氨基酸连接。一个或多个非天然氨基酸诸如Faz可以与一个或多个解旋酶上的天然氨基酸连接。

优选的，所述的连接可以是任何连接方式，包括暂时连接或者永久的连接方式。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的连接可以是暂时的，例如非共价连接。当然，即便是短暂的连接也足以降低目标多核苷酸从F8813解旋酶上的解脱。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的连接可以是永久的，例如共价连接。可以采用化学交联剂进行共价连接，其长度可以从一个碳(碳酰氯型连接器)到多个埃变化。例如马来酰亚胺、活性酯、琥珀酰亚胺、叠氮化物、炔烃(诸如二苯并环辛炔醇(DIBO或DBCO)，二氟环炔烃和线性炔烃)等。又例如聚乙二醇(PEGs)、多肽、多糖、脱氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、甘油核酸(GNA)、饱和的和不饱和的烃或聚酰胺等等的线性分子，又例如TMAD等等的催化试剂，可以通过 -S-S键进行连接。

在本发明的一个具体实施方式中，采用双马来酰亚胺PEG3和/或PEG4使得引入的半胱氨酸残基与半胱氨酸残基之间共价连接。

进一步优选的，所述SEQ ID NO：1的变体还包括SEQ ID NO：1的至少一个或多个半胱氨酸被取代。在本发明的一个具体实施方式中，用丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸取代半胱氨酸。

优选的，所述的被取代的一个或多个半胱氨酸为C172、C217、C246、C256、C301、C469、C527或C594中的一个或两个以上的组合。

优选的，所述的F8813解旋酶包括去除F8813解旋酶的C端HLH结构域。进一步优选的，包括去除C端HLH结构域的A644至Y729位氨基酸序列。

本发明所述的非天然氨基酸包括但不限于4-叠氮基-L-苯丙氨酸(Faz)，4-乙酰基-L-苯丙氨酸，3-乙酰基-L-苯丙氨酸，4-乙酰乙酰基-L苯丙氨酸，O-烯丙基-L-酪氨酸，3-(苯基硒烷基)-L-丙氨酸，O-2-丙炔-1-基-L-酪氨酸，4(二羟基硼基)-L-苯丙氨酸，4-[(乙基硫烷基)羰基]-L-苯丙氨酸，(2S)-2-氨基-3-{4-[(丙烷-2-基硫烷基)羰基]苯基}丙酸，(2S)-2-氨基-3-{4-[(2-氨基-3-硫烷基丙酰基)氨基]苯基}丙酸，O-甲基-L-酪氨酸，4-氨基-L-苯丙氨酸，4-氰基-L-苯丙氨酸，3-氰基-L-苯丙氨酸，4-氟-L-苯丙氨酸，4-碘-L-苯丙氨酸，4-溴-L-苯丙氨酸，O-(三氟甲基)酪氨酸，4-硝基L-苯丙氨酸，3-羟基-L-酪氨酸，3-氨基-L-酪氨酸，3-碘-L-酪氨酸，4-异丙基-L-苯丙氨酸，3-(2-萘基)-L-丙氨酸，4-苯基-L-苯丙氨酸，(2S)-2-氨基-3-(萘-2-基氨基)丙酸，6-(甲基硫烷基)正亮氨酸，6-氧-L-赖氨酸，D-酪氨酸，(2R)-2-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸，(2R)-2氨基辛酸酯3-(2，2′-二吡啶-5-基)-D-丙氨酸，2-氨基-3-(8-羟基-3-喹啉基)丙酸，4-苯甲酰-L-苯丙氨酸，S-(2-硝基苄基)半胱氨酸，(2R)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)硫烷基]丙酸，(2S)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)氧基]丙酸，O-(4，5-二甲氧基-2-硝基苄基)-L-丝氨酸，(2S)-2-氨基-6-({[(2-硝基苄基)氧基]羰基}氨基)己酸，O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸，2-硝基苯丙氨酸，4-[(E)-苯基二氮烯基]-L-苯丙氨酸，4-[3-(三氟甲基)-3H-二吖丙啶基-3基]-D-苯丙氨酸，2-氨基-3-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基氨基]丙酸，(2S)-2-氨基4-(7-羟基-2-氧-2H-色烯-4-基)丁酸，(2S)-3-[(6-乙酰基萘-2-基)氨基]-2-氨基丙酸，4(羧基甲基)苯丙氨酸，3-硝基-L-酪氨酸，O-硫基-L-酪氨酸，(2R)-6-乙酰氨基-2-氨基己酸酯，1-甲基组氨酸，2-氨基壬酸，2-氨基癸酸，L-同质半胱氨酸，5-硫烷基正缬氨酸，6-硫烷基-L-正亮氨酸，5-(甲基硫烷基)-L-正缬氨酸，N6-{[(2R，3R)-3-甲基-3，4-二氢-2H-吡咯2-基]羰基}-L-赖氨酸，N6-[(苄基氧基)羰基]赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-[(环戊基羰基)氨基]己酸，N6-[(环戊基氧基)羰基]-L-赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-{[(2R)-四氢呋喃-2-基羰基]氨基}己酸，(2S)-2-氨基-8-[(2R，3S)-3-乙炔基四氢呋喃-2-基]-8-氧基辛酸，N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸，(2S)-2-羟基-6-({[(2-甲基-2-丙烷基)氧基]羰基}氨基)己酸，N6-[(烯丙氧基)羰基]赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-({[(2-叠氮苄基)氧基]羰基}氨基)己酸，N6L-脯氨酰基-L-赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}己酸或N6-[(2叠氮乙氧基)羰基]-L-赖氨酸。

优选的，所述的F8813解旋酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1或其变体的氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的同源性，并具有控制多核苷酸移动的能力。

优选的，所述的F8813解旋酶进一步被修饰降低其表面的负电荷。

优选的，所述的F8813解旋酶还包含增加净正电荷的取代。优选的，所述的F8813解旋酶还包含对表面带负电的氨基酸、极性或非极性氨基酸进行取代或修饰。进一步优选的，所述的取代包括带正电的氨基酸、不带电荷的氨基酸取代带负电的氨基酸、不带电荷的氨基酸、芳香族氨基酸、极性或非极性氨基酸。

其中，所述的带正电的氨基酸、不带电荷的氨基酸、极性、非极性氨基酸或芳香族氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸，其可以是人工合成的或者经过修饰的天然氨基酸。

优选的，所述的F8813解旋酶还包含：

(a)至少一个与单链DNA、RNA或双链DNA、RNA中一个或多个核苷酸相互作用的氨基酸被取代；和/或，

(b)至少一个与跨膜孔相互作用的氨基酸被取代；

所述F8813解旋酶具有控制多核苷酸移动的能力。

进一步优选的，用包含较大侧链的氨基酸取代至少一个与单链DNA、RNA或双链DNA、RNA中一个或多个核苷酸的糖和/或碱基相互作用的氨基酸。

所述较大侧链包括增加数目的碳原子，具有增加的长度，增加的分子体积和/或具有增加的范德华体积。所述较大侧链增加了所述至少一个氨基酸与所述单链或双链DNA中一个或多个核苷酸之间的(i)静电相互作用；(ii)氢键和/或(iii)阳离子-pi相互作用。所述较大侧链的氨基酸不是丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、硒代半胱氨酸(U)、甲硫氨酸(M)、天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。

进一步优选的，至少一个与单链DNA、RNA或双链DNA、RNA中一个或多个核苷酸的磷酸基团相互作用的氨基酸被取代。

本发明的第二方面，提供了一种构建体，所述的构建体包含至少一个或多个本发明所述的F8813解旋酶。

优选的，所述的构建体还包含多核苷酸结合部分。

优选的，所述的F8813解旋酶连接至所述多核苷酸结合部分，且所述的构建体具有控制多核苷酸移动的能力。

优选的，所述的多核苷酸结合部分可以与多核苷酸的碱基结合的部分，和/或与多核苷酸的糖结合的部分，和/或与多核苷酸的磷酸结合的部分。

优选的，组成所述构建体的F8813解旋酶与多核苷酸结合部分可以单独制备，后直接连接。也可以通过遗传融合的方式直接制备构建体，例如将编码F8813解旋酶与多核苷酸结合部分的核苷酸连接，后转入宿主细胞中表达、纯化获得。

进一步优选的，所述的多核苷酸结合部分为能够与多核苷酸结合的多肽，包括但不限于真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生菌单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白或双链结合蛋白中的一种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的多核苷酸结合部分包括但不限于表1所示的任一种：

表1 与多核苷酸结合的结合部分

本发明的第三方面，提供了一种核酸，所述的核酸编码本发明所述的F8813解旋酶或所述的构建体。

本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含本发明所述的核酸。

优选的，所述的核酸可操作的连接至表达载体中的调控组件，其中所述的调控组件优选为启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的启动子选自T7、trc、lac、ara或λ _L。

优选的，所述的表达载体包括但不限于质粒、病毒或噬菌体。

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含本发明所述的核酸或本发明所述的表达载体。

优选的，所述的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的宿主细胞选自BL21(DE3)、JM109(DE3)、B834(DE3)、TUNER、C41(DE3)、Rosetta2(DE3)、Origami、Origami B等等。

本发明的第六方面，提供了一种本发明所述F8813解旋酶的制备方法，包括提供SEQ ID NO：1，在SEQ ID NO：1中引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸获得SEQ ID NO：1的变体，以减小F8813解旋酶的多核苷酸结合结构域的开口大小，其中所述F8813解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。

本发明的第七方面，提供了一种本发明所述F8813解旋酶的制备方法，包括培养本发明所述的宿主细胞，并进行诱导表达，纯化后获得F8813解旋酶。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括根据本发明所述F8813解旋酶的氨基酸序列，获得编码F8813解旋酶的核酸序列，酶切连接至表达载体后转化至大肠杆菌中，诱导表达和纯化，获得F8813解旋酶。

本发明的第八方面，提供了一种调节解旋酶的多核苷酸结合结构域开口大小的方法，所述的方法包括将本发明所述的F8813解旋酶或本发明所述的构建体与多核苷酸接触。优选为减小多核苷酸结合结构域开口的大小。

本发明的第九方面，提供了一种控制多核苷酸移动的方法，所述的方法包括将本发明所述的F8813解旋酶或本发明所述的构建体与多核苷酸接触。

优选的，所述的控制多核苷酸移动为控制多核苷酸穿过孔的移动。所述的孔为纳米孔，所述的纳米孔为跨膜孔。该孔可以是天然的或人造的，包括但不限于蛋白孔、多核苷酸孔或固态孔。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的跨膜孔选自生物孔、固态孔或生物与固态杂交的孔。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的孔包括但不限于衍生自耻垢分枝杆菌孔蛋白A、耻垢分枝杆菌孔蛋白B、耻垢分枝杆菌孔蛋白C、耻垢分枝杆菌孔蛋白D、溶血素、胞溶素、白细胞介素、外膜孔蛋白F、外膜孔蛋白G、外膜磷脂酶A、WZA或奈瑟氏菌自转运脂蛋白等等。

优选的，所述的方法可以包含一个或多个的F8813解旋酶共同控制多核苷酸的移动。

本发明的第十方面，提供了一种表征目标多核苷酸的方法，所述的方法包括：

I)将本发明所述的F8813解旋酶或本发明所述的构建体，与目标多核苷酸以及孔接触，使得F8813解旋酶或构建体控制目标多核苷酸穿过孔的移动；

并II)获取目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用时的一个或多个特征，以表征所述目标多核苷酸。

优选的，重复步骤I)和II)一次或多次。

优选的，所述的方法中可以使用任意数量的本发明所述的F8813解旋酶。优选可以为一个或多个，更优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个。其中，所述的两个以上本发明所述的F8813解旋酶可以相同或不同。也可以包含野生型F8813解旋酶或者其他类型的解旋酶。进一步的，两个以上解旋酶之间可以连接或者只是通过分别结合在多核苷酸上而排列发挥控制多核苷酸移动的功能。

优选的，所述的方法还包括横跨与所述解旋酶或构建体，和目标多核苷酸接触的孔施加势差的步骤。

优选的，所述的孔是允许水合离子在施加的电势的驱动下从膜的一侧流向膜的另一层的结构。进一步优选的，所述的孔为纳米孔，所述的纳米孔为跨膜孔。所述跨膜孔为目标多核苷酸的移动提供了通道。进一步优选的，所述的孔选自生物孔、固态孔或生物与固态杂交的孔。

所述的膜可以为任何现有技术中存在的膜，优选为两性分子层，即一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子诸如磷脂质形成的层，两性分子可以是合成的或天然存在的。进一步优选的，所述的膜为脂质双层膜。所述的目标多核苷酸可以使用任何已知的方法连接到膜上。如果膜是两性分子层，如脂质双分子层，所述多核苷酸优选通过在所述膜中存在的多肽或通过在所述膜中存在的疏水锚被连接到该膜上。其中，疏水锚优选为脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管或氨基酸。

优选的，当在孔施加一种力(如电压)，目标多核苷酸通过孔的速率被F8813解旋酶或构建体所控制，从而获得一种可识别的稳定的电流水平，用于确定目标多核苷酸的特征。

优选的，所述的目标多核苷酸为单链、双链或至少一部分是双链的。

进一步优选的，所述的目标多核苷酸可以通过标签、间隔物、甲基化、氧化或损伤的方式进行修饰。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的目标多核苷酸为至少一部分是双链的。其中所述的双链部分构成Y衔体结构，所述的Y衔体结构包含优先螺入所述孔的前导序列。

进一步优选的，所述的目标多核苷酸的长度可以为10-100000个或更多个。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的目标多核苷酸的长度可以为至少10个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少5000个、至少10000个、至少50000个或至少100000个等等。

优选的，所述的解旋酶结合到单链多核苷酸的内部核苷酸中。

优选的，所述的目标多核苷酸为DNA或RNA。即可以为以核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸为单元组成的DNA、RNA、DNA与RNA的连接序列、DNA与RNA杂交序列等。

优选的，当所述的目标多核苷酸为RNA时，为提高要被测序的RNA穿过孔的能力和效率，将RNA修饰为包含非RNA多核苷酸。

优选的，RNA修饰的步骤包含将DNA前导区与待测RNA的3’末端连接。还包括将待测RNA反转录的步骤

优选的，所述的一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。进一步优选的，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行。

进一步优选的，通过电测量和/或光测量产生电信号和/或光信号，而每种核苷酸对应一种信号水平，继而将电信号和/或光信号转化为核苷酸的特征。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的电测量包括但不限于电流测量、阻抗测量、隧道测量、风洞测量或场效应晶体管(FET)测量等等。

本发明所述的电信号选自电流、电压、隧穿、电阻、电位、电导率或横向电测量的测量值。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的电信号为穿过所述孔的电流。

优选的，所述的表征还包括应用改进型维特比算法。

本发明的第十一方面，提供了一种表征目标多核苷酸的产品，所述的产品包含一个或多个本发明所述的F8813解旋酶、一个或多个本发明所述的构建体、一个或多个本发明所述的核酸、一个或多个本发明所述的表达载体或一个或多个本发明所述的宿主细胞，和一个或多个孔。

优选的，所述的孔与F8813解旋酶或构建体之间形成络合物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的产品包含多个F8813解旋酶或多个构建体，和多个孔。

优选的，所述的产品选自试剂盒、装置或传感器。

进一步优选的，所述的试剂盒中还包括包含脂质双层的芯片。所述的孔横跨脂质双层。

本发明所述的试剂盒包含一个或多个脂质双层，每个脂质双层包含一个或多个所述的孔。

本发明所述的试剂盒还包括实施表征目标多核苷酸的试剂或装置。优选的，所述的试剂包括缓冲剂、PCR扩增所需的工具。

本发明的第十二方面，提供了本发明所述的F8813解旋酶、所述的构建体、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主细胞或所述的产品在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用。

本发明的第十三方面，提供了一种表征目标多核苷酸的试剂盒，所述的试剂盒包含本发明所述的F8813解旋酶、所述的构建体、所述的核酸、所述的表达载体或所述的宿主细胞，和孔。

本发明的第十四方面，提供了一种表征目标多核苷酸的装置，所述的装置包含本发明所述的F8813解旋酶、所述的构建体、所述的核酸、所述的表达载体或所述的宿主细胞，和孔。

优选的，所述的装置包括支撑所述多个孔并可传输孔与多核苷酸相互作用的信号的传感器，和至少一个用于存储目标多核苷酸的存储器，和实施表征过程中所需的溶液。

优选的，所述的装置包括多个F8813解旋酶和/或多个构建体，和多个孔。

本发明的第十五方面，提供了一种表征目标多核苷酸的传感器，所述的传感器包含在所述孔和本发明所述F8813解旋酶或所述的构建体之间形成复合物。

优选的，在所述目标多核苷酸存在下使所述孔和解旋酶或构建体接触，并跨所述孔施加电势。所述的电势选自电压电势或化学电势。

本发明的第十六方面，提供了一种形成表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在所述孔和本发明所述F8813解旋酶或所述的构建体之间形成复合物，从而形成表征目标多核苷酸的传感器。

本发明的第十七方面，提供了一种与多核苷酸连接的两个或多个解旋酶，其中，所述的两个或多个解旋酶中至少一个为本发明所述的F8813解旋酶。

本发明的第十八方面，提供了一种F8813解旋酶寡聚体，所述的F8813解旋酶寡聚体包含一个或多个的本发明所述的F8813解旋酶。

优选的，所述的F8813解旋酶寡聚体还可以包含野生型F8813解旋酶或其他类型的解旋酶。其中，所述的其他类型的解旋酶可以为Hel308解旋酶、XPD解旋酶、Dda解旋酶、TraI解旋酶或者TrwC解旋酶等等。

优选的，所述的F8813解旋酶与野生型F8813解旋酶之间、F8813解旋酶与F8813解旋酶之间、野生型F8813解旋酶与野生型F8813解旋酶、F8813解旋酶与其他类型解旋酶之间或者野生型F8813解旋酶与其他类型解旋酶之间，可以通过头对头、尾对尾或者头对尾的方式连接或排列。

优选的，所述的F8813解旋酶寡聚体包含两个以上的本发明所述的F8813解旋酶，其中，所述的F8813解旋酶可以是不同的或者相同的。

本发明所述的“F8813解旋酶”、“构建体”或“孔”，均可以被修饰以助于鉴定或纯化，例如通过添加组氨酸残基(His标签)，天冬氨酸残基(asp标签)，链霉亲和素标签，Flag标签，SUMO标签，GST标签或MBP标签，或通过添加信号序列以促进它们从细胞中分泌，该细胞中的多肽不天然地含有该信号序列。引入遗传标签的替换方式是通过化学反应将标签连到F8813解旋酶、孔或构建体上的天然或人工位点。

本发明所述的“核苷酸”包括但不局限于：腺苷单磷酸(AMP)、鸟苷单磷酸(GMP)、胸苷单磷酸(TMP)、尿苷单磷酸(UMP)、胞嘧啶核苷单磷酸(CMP)、环状腺苷单磷酸(cAMP)、环状鸟苷单磷酸(cGMP)脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和脱氧胞苷单磷酸(dCMP)。优选的，所述核苷酸选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。

本发明所述的“两个以上”包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个等等。

本发明所述的“多个”包括但不限于两个以上、三个以上、四个以上、五个以上、六个以上、七个以上、八个以上或更多个等等。

本发明所述的“至少一个”包括但不限于一个以上、两个以上、三个以上、四个以上、五个以上、六个以上、七个以上、八个以上或更多个等等。

本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。

本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性(例如其控制多核苷酸移动的能力等等)。

本发明所述的“开口”为野生型F8813解旋酶本身带有的多核苷酸结合结构域的开口，也可以指与F8813解旋酶结合的多核苷酸结合部分的开口，所述的开口为使得多核苷酸与F8813解旋酶解离的开口，并且该开口可以不是一直存在的，但是至少在一种构象状态下包含至少一个开口。本发明所述的“经修饰的F8813解旋酶”或者包含经修饰的F8813解旋酶的构建体包含一个或多个与多核苷酸结合的区域，包括一个或多个本身带有的多核苷酸结合结构域或者一个或多个多核苷酸结合部分。所述的“经修饰的F8813解旋酶”或者包含经修饰的F8813解旋酶的构建体含有一个或多个开口。经过修饰F8813解旋酶，使得解旋酶的同一单体上有两个或多个部分连接以减小开口的大小。

本发明所述的F8813解旋酶来源于Methanosarcinathermophila。

本发明所述的经修饰的F8813解旋酶，是相比于相应的野生型解旋酶或天然解旋酶是修饰的。本发明的解旋酶是人工的或非天然的。

本发明所述的F8813解旋酶是一种在链测序过程中控制目标多核苷酸移动的有用工具，当提供了促进移动的常规必要组分时，F8813解旋酶沿着DNA或RNA以3’至5’端的方向移动，但DNA或RNA在孔中的定向(取决于DNA或RNA的哪个末端被捕获)意味着F8813解旋酶可以用于逆着所施加的场的方向或顺着施加的场的方向将DNA或RNA移进孔。而且，通过在野生型F8813解旋酶中引入半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸，可以有效减少F8813解旋酶或构建体上多核苷酸结合结构域或多核苷酸结合部分开口的大小或开闭，以及目标多核苷酸被解开的开口的大小或开闭，从而显着降低 F8813解旋酶从目标多核苷酸上解脱的能力，提高控制目标多核苷酸通过孔的能力。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：显示了经纯化后的F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，M是Marker(KDa)，1道为F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A解旋酶的电泳结果图。

图2：实施例中使用的DNA构建体A的图，其中SEQ ID NO：3(标记为A)其5’末端连接到4个iSpC3间隔区(标记为B)，该间隔区(标记为B)连接到SEQ ID NO：4(标记为C)的3’末端，该SEQ ID NO：4(标记为C)的5’末端连接到SEQ ID NO：5(标记为D)，该构建体的SEQ ID NO：6(标记为E)区域与SEQ ID NO：7(标记为F，其具有3’胆固醇系链)杂交。

图3：显示了F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3反应混合物(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A通过双马来酰亚胺PEG3链接器连接)和F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG4反应混合物(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A通过双马来酰亚胺PEG4链接器连接)的考马斯染色的4-20％SDS-PAGE凝胶。M道显示了一个适当的蛋白质阶梯(质量单位标记显示在凝胶的右侧)。通道1含有5μL约6μM的F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A单体(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1)。通道2含有5μL的约6μM F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A，通过双马来酰亚胺PEG3连接器连接)。通道3含有5μL的约6μM F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG4(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A，通过双马来酰亚胺PEG4连接器连接)。从凝胶中可以清楚地看出，双马来酰亚胺PEG3或PEG4连接剂连接的反应几乎达到100％的产率。箭头1对应于F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A单体(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1)，箭头2对应于F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG3连接)。箭头3对应于F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG4(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG4连接)。

图4：显示了当解旋酶(F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A通过双马来酰亚胺PEG3链接器连接))控制DNA构建体A(穿过纳米孔8MspA(SEQ ID NO：8)移位时的示例电流轨迹(y轴坐标＝电流(pA，0到240)，x轴坐标＝时间(h:m:s，14h:01m:09.3s到14h:01m:33.3s))。

图5：显示了图4的电流轨迹图中所示的解旋酶控制的DNA移动的区域的放大图(y轴坐标＝电流(pA，0到100)，x轴坐标＝时间(h:m:s，14h:01m:12.4s到14h:01m:21.9s)。

图6：检测F8813解旋酶酶活性的荧光分析示意图。其中，荧光底物链具有3’端ssDNA突出部分，以及50个碱基的杂交的dsDNA部分。a)所示，包括主链上部(B)在5’端具有羧基荧光素(C)，并且所述杂交的互补链(D)在3’端具黑洞淬灭剂(BHQ-1)碱基(E)。还包括，与较短链(D)互补的0.5μM的捕获链(F)。如b)和c)所示，在ATP(5mM)和MgCl2(5mM)存在下，添加到所述底物中的解旋酶(100nM)(A)连接到所述荧光底物的3’端部分，沿着所述主链移动，并解开所述互补链后，过量的捕获链优先与互补链DNA退火以防止初始底物与丢失荧光重新退火。如d)所示，加入过量与主链完全互补的捕获链(G)后，部分未被解旋的dsDNA由于过量G的存在而产生链解旋效果，最终所有dsDNA被解旋，荧光值达到最高。

图7：是含有400mM NaCl的缓冲液中的时间依赖型dsDNA被置换比例的变化图。

图8：实施例中使用的DNA-RNA构建体B的图，其中SEQ ID NO：13(标记为G) 其3’末端连接到20个iSpC3间隔区(标记为A)其5’末端连接到4个iSpC3间隔区(标记为B)，该间隔区(标记为B)连接到SEQ ID NO：14(标记为C)的3’末端，该SEQ ID NO：14(标记为C)的5’末端连接到RNA单链SEQ ID NO：15(标记为D)，该构建体的SEQ ID NO：16(标记为E)区域与SEQ ID NO：7(标记为F，其具有3’胆固醇系链)杂交。

图9：当F8813解旋酶(F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG3连接))控制DNA-RNA构建体B穿过纳米孔8MspA(SEQ ID NO：8)移位时的示例电流轨迹(y轴坐标＝电流(pA，-10到200)，x轴坐标＝时间(h:m:s，16h:32m:51.6s到16h:33m:03.6s)。

图10：图9电流轨迹图中所示的F8813解旋酶控制的RNA移动的区域放大图(y轴坐标＝电流(pA，-10到200)，x轴坐标＝时间(h:m:s，16h:33m:01.3s到16h:33m:03.3s)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

实施例1 F8813解旋酶的制备

1、序列获得

在SEQ ID NO:1的第284位和第589位引入半胱氨酸，并且将第172、217和594位的半胱氨酸取代，获得SEQ ID NO：1的变体，即C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1。

获得C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO:1的编码序列，并优化获得SEQ ID NO：2。

2、材料和方法

将含有F8813解旋酶序列(SEQ ID NO：2)的重组质粒通过热击转化到BL21(DE3)感受态细胞，复苏菌液涂布氨苄抗性固体LB平板后在37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，接种至100ml含有氨苄抗性的液体LB培养基中37℃培养。按1％的接种量转接至氨苄抗性的LB液体培养基中进行扩大培养，37℃、200rpm条件下培养，并连续不断的测量其OD ₆₀₀值。当OD ₆₀₀＝0.6-0.8时，将LB培养基中的培养液冷却至18℃，并添加异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)诱导表达，使得终浓度达到1mM。12-16h后，18℃收集细菌。高压破碎细菌，通过FPLC方法进行纯化，收集样品。

3、结果

图1显示了经纯化后的F8813解旋酶(SEQ ID NO:1的变体)SDS-PAGE凝胶电泳图。

实施例2 使用荧光分析检测酶活性来阐述F8813解旋酶的解开杂交dsDNA的能力

1、材料和方法

如图6中的a)所示，荧光底物链(终浓度100nM)具有3’端ssDNA突出部分，以及50个碱基的杂交的dsDNA部分。包括主链上部在5’端具有羧基荧光素(5’FAM-SEQ ID NO:9)，并且所述杂交的互补链在3’端具有黑洞淬灭剂(BHQ-1)碱基(SEQ ID NO:10--BHQ-3’)。当杂交的来自荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭时，底物基本上是无荧光的。还包括与较短链互补的0.5μM的捕获链(SEQ ID NO:11)。如b)和c)所示，在ATP(5mM)和MgCl ₂(5mM)存在下，添加到底物中的F8813解旋酶(100nM)连接到所述荧光底物的3’端部分，沿着所述主链移动，并解开所述互补链后，过量的捕获链优先与互补链DNA退火以防止初始底物与丢失荧光重新退火。同时，体系内仍存在一定量的杂交dsDNA未被F8813解旋酶解旋。如d)所示，加入过量与主链完全互补的捕获链G(SEQ ID NO:12)后，部分未被解旋的dsDNA由于过量G的存在而产生链解旋效果，最终所有dsDNA被解旋，荧光值达到最高。

2、结果

图7显示了含有400mMNaCl的缓冲液中的时间依赖型dsDNA被解旋比例的变化图 (10mM Hepes pH8.0，5mM ATP，5mM MgCl ₂，100nM荧光底物DNA，0.5μM捕获DNA)。NC-Buffer为未添加F8813解旋酶的阴性对照。

实施例3

本实例描述了合成F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3解旋酶(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG3连接)和F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG4解旋酶(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG4连接)的方法。在这种情况下，通过与双马来酰亚胺PEG3或双马来酰亚胺PEG4连接体反应，在F8813的一级序列中的284和589位半胱氨酸之间形成共价连接。

1、材料和方法

将5μl 1M DTT添加到1mlF8813(C172V/C217A/D284C/S589C/C594A)(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A，储存在50mM Tris HCl pH 8.0、100mM NaCl、50％甘油、1mM DTT、1mM EDTA)中，并在室温下以20rpm旋转30分钟。通过PD-10脱盐柱缓冲交换至PBS缓冲液(pH7.2)，得到1.25mL样品。添加20μL双马来酰亚胺PEG3或双马来酰亚胺PEG4后，将混合物在室温下在20rpm转速旋转60分钟培育。为了停止反应，添加5μl 1M DTT以淬灭任何剩余的马来酰亚胺。采用4-20％聚丙烯酰胺凝胶对结果进行分析。

2、结果

图3显示了F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3反应混合物(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A通过双马来酰亚胺PEG3链接器连接)和F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG4反应混合物(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A通过双马来酰亚胺PEG4链接器连接)的考马斯染色的4-20％SDS-PAGE凝胶。M道显示了一个适当的蛋白质阶梯(质量单位标记显示在凝胶的右侧)。通道1含有5μL约6μM的 F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A单体(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1)。通道2含有5μL的约6μM F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A，通过双马来酰亚胺PEG3连接器连接)。通道3含有5μL的约6μM F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG4(SEQ ID NO：1，突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A，通过双马来酰亚胺PEG4连接器连接)。从凝胶中可以清楚地看出，将双马来酰亚胺PEG3或PEG4连接剂连接的反应几乎达到100％的产率。然后将F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG3连接)和F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG4(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG4连接)缓冲交换至20mM HEPES、50mM NaCl、1mM DTT、50％甘油，0.1mM EDTA、pH 8.0。

实施例4

本实施例显示F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3解旋酶(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG3连接)如何控制整个DNA链移动穿过单个MspA纳米孔(SEQ ID NO：8)。

1、材料和方法

制备如图2所示的DNA构建体A：SEQ ID NO：3其5’末端连接到4个iSpC3间隔区，该间隔区连接到SEQ ID NO：4的3’末端，该SEQ ID NO：4的5’末端连接到SEQ ID NO：5，该构建体的SEQ ID NO：6区域与SEQ ID NO：7(其具有3’胆固醇系链)杂交。

将制备的DNA构建体和F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3在25℃的缓冲液(10mM HEPES，pH 8.0，100mM NaCl，5％甘油，2mM DTT)中一起预孵育30分钟。

由嵌入1,2-二乙醇酰基-甘油-3-胆碱磷酸脂质双分子层的MspA纳米孔获得电测量。通过Montal-Mueller技术，在PTFE膜上的～25μm直径孔穴形成双分子层，隔开两个约100μL的缓冲溶液。所有实验在所述缓冲液中进行。使用装配有数字转换器的放大器测定单通道电流。将Ag/AgCl电极连接到所述缓冲液中使得顺式隔间连接到放大器的接地端，并且反式隔间连接到活性电极。

在所述双分子层实现单孔之后，将DNA多核苷酸和F8813解旋酶添加到电生理学室的顺式隔间的70μL缓冲液中以引发解旋酶-DNA复合体在所述纳米孔的捕获。根据需要通过向所述顺式隔间添加二价金属(5mM MgCl ₂)和NTP(2.86μM ATP)激活解旋酶ATP酶活性。实验在+180mV的恒定电势下实施。

2、结果和讨论

结果显示DNA构建体被F8813解旋酶控制的DNA移动，F8813解旋酶控制的DNA移动的结果见图4。F8813解旋酶控制的DNA移动为24秒长并对应于接近200bp的DNA构建体穿过所述纳米孔的移位。其中，图5显示了F8813解旋酶控制的DNA移动的部分区域的放大图。

实施例5

本实施例显示包含DNA的前导区如何连接到RNA以促进加载DNA解旋酶，即F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(具有突变C172V/C217A/D284C/S589C/C594A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺-PEG3连接)，并随后观察解旋酶控制RNA穿过纳米孔的移动。使用体外转录的方式获得0.28kb RNA。该包含DNA的前导区与该RNA的3’末端连接。然后将F8813解旋酶加载到前导区中的DNA连接位点，通过纳米孔分析底物。

1、材料和方法

制备如图8所示的DNA-RNA构建体B：SEQ ID NO：13其3’末端连接到20个iSpC3间隔区其5’末端连接到4个iSpC3间隔区，该间隔区连接到SEQ ID NO：14的3’末端，该SEQ ID NO：14的5’末端通过退火连接到RNA单链SEQ ID NO：15，该构建体的SEQ ID NO：16区域与SEQ ID NO：7(其具有3’胆固醇系链)杂交。

然后使用VAHTS RNA Clean Beads珠以每μL样品1.8μL珠的比例纯化构建体B。将纯化后的构建体B使用超级脚本III试剂盒(SuperScript III kit)将该样品反转录。

然后使用VAHTS RNA Clean Beads珠以每μL样品1μL珠的比例纯化该混合物。

将在缓冲液(在50mM NaCl中，10mM Tris pH7.5)中的DNA-RNA构建体B与在缓冲液(50mM KCl，10mMHEPES，pH 8.0)中的F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3在室温下预孵育30分钟。然后向所述预混合物中添加缓冲液(10mMHEPES，600mM KCl，pH 8.0，3mM MgCl ₂)和ATP。

在室温下由嵌入到在缓冲液(10mM HEPES，400mM KCl，pH 8.0)中的嵌段共聚物中的单个MspA纳米孔获得电测量值。在实现单个孔插入到嵌段共聚物中后，将F8813解旋酶(F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3(1nM终浓度))，DNA(0.3nM终浓度)，燃料(ATP 3mM终浓度)的预混合物添加到单个纳米孔实验系统中。每个实验在保持电势180mV下进行2小时，并监控F8813解旋酶控制的RNA移动。

2、结果

对DNA-RNA构建体B，观察F8813解旋酶控制的RNA移动，其F8813_C172V/C217A/D284C/S589C/C594A-双马来酰亚胺PEG3控制的RNA移动的结果参见图9-10。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

一种经修饰的F8813解旋酶，其特征在于，所述的F8813解旋酶包含多核苷酸结合结构域，所述的F8813解旋酶包括SEQ ID NO：1的变体，所述SEQ ID NO：1的变体包括在SEQ ID NO：1的2A结构域、Ratchet结构域和/或HLH结构域中引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸，以减小多核苷酸结合结构域的开口大小，其中所述F8813解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
根据权利要求1所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述SEQ ID NO：1的变体包括在SEQ ID NO：1的2A结构域的第E250至H310位，和/或Ratchet结构域的第L580至G600位，和/或HLH结构域的第D680至I700位中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
根据权利要求1或2所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述SEQ ID NO：1的变体包括在SEQ ID NO：1的D284和/或S589位置上引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
根据权利要求1-3任一所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述SEQ ID NO：1的变体还包括在SEQ ID NO：1的S272、A273、E274、E281、D284、E285、L287、E288、N289、S290、E291、D293、T294、A300、R303、T314、T315、P316、L317、R318、L320、E322、R326、G328、S589、K691、D694、R695或K698中的任一种或两种以上的位置上引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
根据权利要求1-4任一所述的F8813解旋酶，所述F8813解旋酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或其变体，或者与SEQ ID NO：1或其变体所示氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的同源性，并具有控制多核苷酸移动的能力。
根据权利要求1-5任一所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述引入的半胱氨酸与半胱氨酸之间相互连接，引入的非天然氨基酸与非天然氨基酸之间相互连接，引入的半胱氨酸与非天然氨基酸之间相互连接，引入的半胱氨酸与天然氨基酸之间相互连接，或者引入的非天然氨基酸与天然氨基酸之间相互连接。
根据权利要求1-6任一所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述SEQ ID NO：1的变体还包括SEQ ID NO：1的至少一个或多个半胱氨酸被取代；优选为用丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸取代半胱氨酸。
根据权利要求7所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述的被取代的一个或多个半胱氨酸为C172、C217、C246、C256、C301、C469、C527或C594中的一个或两个以上的组合。
根据权利要求1-8任一所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述的F8813解旋酶包括去除F8813解旋酶的C端HLH结构域，优选去除C端HLH结构域的A644至Y729位氨基酸序列。
根据权利要求1-9任一所述的F8813解旋酶，其特征在于，所述的非天然氨基酸选自4-叠氮基-L-苯丙氨酸(Faz)，4-乙酰基-L-苯丙氨酸，3-乙酰基-L-苯丙氨酸，4-乙酰乙酰基-L苯丙氨酸，O-烯丙基-L-酪氨酸，3-(苯基硒烷基)-L-丙氨酸，O-2-丙炔-1-基-L-酪氨酸，4(二羟基硼基)-L-苯丙氨酸，4-[(乙基硫烷基)羰基]-L-苯丙氨酸，(2S)-2-氨基-3-{4-[(丙烷-2-基硫烷基)羰基]苯基}丙酸，(2S)-2-氨基-3-{4-[(2-氨基-3-硫烷基丙酰基)氨基]苯基}丙酸，O-甲基-L-酪氨酸，4-氨基-L-苯丙氨酸，4-氰基-L-苯丙氨酸，3-氰基-L-苯丙氨酸，4-氟-L-苯丙氨酸，4-碘-L-苯丙氨酸，4-溴-L-苯丙氨酸，O-(三氟甲基)酪氨酸，4-硝基L-苯丙氨酸，3-羟基-L-酪氨酸，3-氨基-L-酪氨酸，3-碘-L-酪氨酸，4-异丙基-L-苯丙氨酸，3-(2-萘基)-L-丙氨酸，4-苯基-L-苯丙氨酸，(2S)-2-氨基-3-(萘-2-基氨基)丙酸，6-(甲基硫烷基)正亮氨酸，6-氧-L-赖氨酸，D-酪氨酸，(2R)-2-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸，(2R)-2氨基辛酸酯3-(2，2′-二吡啶-5-基)-D-丙氨酸，2-氨基-3-(8-羟基-3-喹啉基)丙酸，4-苯甲酰-L-苯丙氨酸，S-(2-硝基苄基)半胱氨酸，(2R)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)硫烷基]丙酸，(2S)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)氧基]丙酸，O-(4，5-二甲氧基-2-硝基苄基)-L-丝氨酸，(2S)-2-氨基-6-({[(2-硝基苄基)氧基]羰基}氨基)己酸，O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸，2-硝基苯丙氨酸，4-[(E)-苯基二氮烯基]-L-苯丙氨酸，4-[3-(三氟甲基)-3H-二吖丙啶基-3基]-D-苯丙氨酸，2-氨基-3-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基氨基]丙酸，(2S)-2-氨基4-(7-羟基-2-氧-2H-色烯-4-基)丁酸，(2S)-3-[(6-乙酰基萘-2-基)氨基]-2-氨基丙酸，4(羧基甲基)苯丙氨酸，3-硝基-L-酪氨酸，O-硫基-L-酪氨酸，(2R)-6-乙酰氨基-2-氨基己酸酯，1-甲基组氨酸，2-氨基壬酸，2-氨基癸酸，L-同质半胱氨酸，5-硫烷基正缬氨酸，6-硫烷基-L-正亮氨酸，5-(甲基硫烷基)-L-正缬氨酸，N6-{[(2R，3R)-3-甲基-3，4-二氢-2H-吡咯2-基]羰基}-L-赖氨酸，N6-[(苄基氧基)羰基]赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-[(环戊基羰基)氨基]己酸，N6-[(环戊基氧基)羰基]-L-赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-{[(2R)-四氢呋喃-2-基羰基]氨基}己酸，(2S)-2-氨基-8-[(2R，3S)-3-乙炔基四氢呋喃-2-基]-8-氧基辛酸，N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸，(2S)-2-羟基-6-({[(2-甲基-2-丙烷基)氧基]羰基}氨基)己酸， N6-[(烯丙氧基)羰基]赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-({[(2-叠氮苄基)氧基]羰基}氨基)己酸，N6L-脯氨酰基-L-赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}己酸或N6-[(2叠氮乙氧基)羰基]-L-赖氨酸。
一种构建体，其特征在于，所述的构建体包含至少一个权利要求1-10任一所述的F8813解旋酶。
根据权利要求11所述的构建体，其特征在于，所述的构建体还包含多核苷酸结合部分。
一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1-10任一所述的F8813解旋酶或权利要求11-12任一所述的构建体。
一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含权利要求13所述的核酸。
一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求13所述的核酸或权利要求14所述的表达载体。
一种权利要求1-10任一所述F8813解旋酶的制备方法，其特征在于，提供SEQ ID NO：1，在SEQ ID NO：1中引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸获得SEQ ID NO：1的变体，以减小F8813解旋酶的多核苷酸结合结构域的开口大小，其中所述F8813解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
一种权利要求1-10任一所述F8813解旋酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求15所述的宿主细胞并进行诱导表达，纯化获得F8813解旋酶。
一种调节解旋酶的多核苷酸结合结构域开口大小的方法，其特征在于，所述的方法包括将权利要求1-10任一所述的F8813解旋酶或权利要求11-12任一所述的构建体与多核苷酸接触，优选为减小多核苷酸结合结构域开口的大小。
一种控制多核苷酸移动的方法，其特征在于，所述的方法包括将权利要求1-10任一所述的F8813解旋酶或权利要求11-12任一所述的构建体与多核苷酸接触。
一种表征目标多核苷酸的方法，其特征在于，所述的方法包括：

I)将权利要求1-10任一所述的F8813解旋酶或权利要求11-12任一所述的构建体，与目标多核苷酸以及孔接触，使得F8813解旋酶或构建体控制目标多核苷酸穿过孔的移动；

并II)获取目标多核苷酸中的核苷酸与所述孔相互作用时的一个或多个特征，以表征所述目标多核苷酸。
根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括横跨与所述解旋酶或构建体，和目标多核苷酸接触的孔施加势差的步骤；优选的，所述的孔选自生物孔、固态孔或生物与固态杂交的孔。
根据权利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述的目标多核苷酸为单链、双链或至少一部分是双链的，所述的目标多核苷酸为DNA或RNA。
根据权利要求20-22任一所述的方法，其特征在于，所述的一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰；优选的，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行。
一种表征目标多核苷酸的产品，其特征在于，所述的产品包含权利要求1-10任一所述的F8813解旋酶、权利要求11-12任一所述的构建体、权利要求13所述的核酸、权利要求14所述的表达载体或权利要求15所述的宿主细胞。
根据权利要求24所述的产品，其特征在于，所述的产品选自试剂盒、装置或传感器。
权利要求1-10任一所述的F8813解旋酶、权利要求11-12任一所述的构建体、权利要求13所述的核酸、权利要求14所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞或权利要求24-25任一所述的产品在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用。