CN117721101A - 一种经修饰的CaPif1解旋酶及其应用 - Google Patents
一种经修饰的CaPif1解旋酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117721101A CN117721101A CN202211132258.8A CN202211132258A CN117721101A CN 117721101 A CN117721101 A CN 117721101A CN 202211132258 A CN202211132258 A CN 202211132258A CN 117721101 A CN117721101 A CN 117721101A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- helicase
- polynucleotide
- capif1
- nanopore
- target polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 229920003192 poly(bis maleimide) Polymers 0.000 claims description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 14
- XQUPVDVFXZDTLT-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]methyl]phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C=C1)=CC=C1CC1=CC=C(N2C(C=CC2=O)=O)C=C1 XQUPVDVFXZDTLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims description 10
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000203069 Archaea Species 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 101000693243 Homo sapiens Paternally-expressed gene 3 protein Proteins 0.000 description 6
- 102100025757 Paternally-expressed gene 3 protein Human genes 0.000 description 6
- KXSKAZFMTGADIV-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(2-hydroxyethoxy)propoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCCOCCO KXSKAZFMTGADIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150113153 PIF1 gene Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- -1 DPhPC phospholipid Chemical class 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- YNAGLKOBLOKHEO-VGRMVHKJSA-N (4r,5s,6s,7r)-4,5,6,7,8-pentahydroxy-2-methyloctane-3-thione Chemical compound CC(C)C(=S)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO YNAGLKOBLOKHEO-VGRMVHKJSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- RVRLFABOQXZUJX-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C)N1C(=O)C=CC1=O RVRLFABOQXZUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程和遗传工程领域，公开了一种修饰的CaPif1解旋酶，包含该解旋酶的复合体，包含该解旋酶的构建体，以及采用该解旋酶或复合体或构建体表征目标多核苷酸的方法及应用。本发明提供的经修饰的CaPif1解旋酶及其复合体和构建体均能够控制多核苷酸穿过生物纳米孔的移动，尤其当多核苷酸链长度增加时，其依然可以稳定控制多核苷酸移动而不会从多核苷酸上发生脱落。本发明还提供了特异的CaPif1解旋酶突变体，提高了其控制多核苷酸穿过纳米孔移位的能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种经修饰的CaPif1解旋酶，特别是涉及一种能够控制目标多核苷酸穿过生物纳米孔移动的解旋酶，并且特别有助于对多核苷酸进行测序，属于基因工程和遗传工程领域。
背景技术
近些年发展起来的纳米孔测序技术是一种新型的单分子测序技术，其利用电场力驱动单链多核苷酸穿过嵌在绝缘磷脂膜上的纳米级生物孔道蛋白，由于不同的碱基大小，每个核苷酸分子在通过生物纳米孔时会产生特征性的阻碍电流，记录下的这些特征电流信号对应于目标核酸的序列。
在“链测序”方法中，单个多核苷酸链通过所述生物纳米孔从而实现核苷酸序列的鉴定。相比于其他测序技术，这种测序技术的优势在于成本低，无需PCR扩增，快速实时便捷，测序读长长(超过150kb)，以及RNA及表观遗传修饰直接测序的能力。其被认为是测序领域的革命性技术，具有不可估量的应用价值。
但是，纳米孔测序技术也存在严重的限制。在电场作用下，单链多核苷酸穿过纳米孔的速度非常快以至于难以从系统噪音中分辨出单个核苷酸的电流阻碍信号。因此，为了实现对核苷酸的鉴定，链测序使用多核苷酸结合的分子马达来控制多核苷酸穿过所述生物纳米孔的移动。然而，分子马达和多核苷酸的结合并非一成不变，在其控制多核苷酸移动时，尤其是面对很长的核苷酸序列时，分子马达会出现从多核苷酸上发生脱落的问题。此外，在链测序这种单分子水平的测序技术中，分子马达存在许多出乎意料的单分子动态行为，比如某些马达蛋白由于活性差，会出现停滞的现象，从而引起孔道的阻塞，降低了测序的通量。其次，马达蛋白在多核苷酸上的移位会出现向前滑动、倒退以及步长不均一的情况，这些不规则的单分子行为导致马达蛋白无法完美地控制单链多核苷酸以棘轮的方式穿过纳米孔，从而降低碱基识别的准确度。因此，目前亟需一种能够稳定、高效地控制多核苷酸穿过生物纳米孔的技术。
发明内容
针对上述技术问题，本发明克服了现有技术中多核苷酸穿过纳米孔移位速度过快的问题，提供了一种DNA依赖的ATPase(CaPif1)解旋酶，其在链测序过程中对于控制多核苷酸穿孔运动是非常有用的。
CaPif1解旋酶核心共包含五个结构域：1A(RecA式(RecA-like)马达)域、2A(RecA式(RecA-like)马达)域、1B(wedge domain)域、2B(SH3式(SH3-like))域和2C域(酵母特有的额外结构)。相应的CaPif1(PDB:7OTJ)蛋白的结构信息可以从蛋白质数据库(PDB)中获得。
其中，1A和2A域主要参与ATP的结合和水解。1B域由一个短的螺旋和一段延伸的环结构构成，被称为“楔形区域”。2B域采取SH-3样的折叠方式，其上的轨道样β发卡结构靠近1B域。2C域在晶体结构中尚未解析出来。
由此，本发明在通过修饰连接缩小开口尺寸时，重点放在1B和2B这两个结构域上，倾向于通过共价连接来缩小或者关闭开口。
连接方式有两种，一种是通过其自身的天然存在的氨基酸，通过替换插入新的氨基酸，比如半胱氨酸和非天然氨基酸等，来实现连接。另一种是通过连接分子(linkermolecules)，倾向于半胱氨酸之间的连接，连接分子包括：BMOE、Bis(PEG)2以及Bis(PEG)3等。
本发明分别在1B和2B两个结构域上引入半胱氨酸，上述的连接分子通常含有两个功能末端，会与半胱氨酸发生共价连接从而实现1B和2B两部分的连接，使得结合的多核苷酸不会从解旋酶上解离。
为此，本发明一方面提供了一种修饰的CaPif1解旋酶，其对野生型CaPif1(368-883)氨基酸序列中的五个天然的半胱氨酸进行修饰，所述五个天然的半胱氨酸分别是C426，C507，C584，C592和C662。
在本发明优选的实施方案中，用丙氨酸(A)或者丝氨酸(S)取代所述五个天然的半胱氨酸。
本发明另一方面提供了一种修饰的CaPif1解旋酶，其引入新的用于实现连接的半胱氨酸，引入位点包括Q443、N448、K452、R455、I633、L634、P635、Q638、Q641、V642、D795、E796、D797和T799。
在本发明优选的实施方案中，优选的突变组合包括R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述的解旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明优选的实施方案中，优选的突变组合包括Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述的解旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明优选的实施方案中，所述的解旋酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
本发明另一方面提供了一种编码本发明的解旋酶的核苷酸序列。
在本发明优选的实施方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
本发明另一方面提供了一种本发明所述的解旋酶与双马来酰亚胺基乙烷或双马来酰亚胺PEG3形成的复合体。
本发明另一方面提供了一种构建体，其包含本发明所述的解旋酶和用于结合多核苷酸的结合部分。
在本发明优选的实施方案中，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白会或双链结合蛋白。
本发明另一方面提供了本发明所述的解旋酶或编码该解旋酶的核苷酸序列或包含该解旋酶的复合体或包含所述解旋酶的构建体在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔中的应用。
本发明另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的解旋酶或编码该解旋酶的核苷酸序列或包含该解旋酶的复合体或包含所述解旋酶的构建体。
本发明另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的装置，所述装置包含本发明所述的解旋酶或编码该解旋酶的核苷酸序列或包含该解旋酶的复合体或包含所述解旋酶的构建体。
本发明另一方面提供了一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的方法，包括以下步骤：
1、将目标多核苷酸与纳米孔，和本发明所述的解旋酶或包含该解旋酶的复合体或包含该解旋酶的构建体接触，使得所述解旋酶、复合体或构建体控制所述目标多核苷酸穿过所述纳米孔；和
2、获取目标多核苷酸中的核苷酸与所述纳米孔相互作用的一个或多个特征，以表征所述目标多核苷酸，所述构建体包含解旋酶和用于结合多核苷酸的结合部分。
在本发明优选的实施方案中，所述一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
在本发明优选的实施方案中，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光测量进行。
在本发明优选的实施方案中，所述的目标多核苷酸为单链、双链、或至少一部分是双链的。
在本发明优选的实施方案中，所述的纳米孔为跨膜孔，所述的跨膜孔为生物孔、固态孔或生物与固态交杂的孔。
本发明另一方面提供了一种包含本发明所述解旋酶的核苷酸序列的载体。
本发明再一方面提供了一种包含本发明所述解旋酶的核苷酸序列或包含该核苷酸序列的载体的宿主细胞。
有益效果
本发明已证明经修饰的CaPif1解旋酶能够控制多核苷酸穿过生物纳米孔进行移动，特别在有电场力的作用下。所述解旋酶能够使得目标多核苷酸以可控和逐步地方式穿过纳米孔进行移动。
本发明提供的特异的CaPif1解旋酶突变体，其在控制多核苷酸穿过纳米孔移位的能力上得到了提高，这些突变体通常会在1B或者2B结构域上存在一个或者多个修饰。因此，本发明所提供的经修饰的CaPif1解旋酶，其至少有1个半胱氨酸或者非天然氨基酸的插入，而且仍然保持其控制多核苷酸移动的能力。
本发明还提供了通过连接分子将1B和2B结构域共价连接起来的经修饰的CaPif1解旋酶，提高了本发明所述CaPif1解旋酶与多核苷酸结合的稳定性，尤其当多核苷酸链长度增加时，本发明所述解旋酶依然可以稳定控制多核苷酸移动而不会从多核苷酸上发生脱落。
附图说明
图1是SDS-PAGE凝胶电泳纯化本发明的CaPif1解旋酶的结果图；
M：Marker；
1：CaPif1解旋酶的电泳结果图。
图2是检测解旋酶酶活性的荧光分析示意图。
图3是CaPif1解旋酶随时间的解旋荧光底物所产生荧光值的变化结果图。
图4是本发明中使用的DNA构建体X的示意图。
A：50个T；
B：本发明使用的解旋酶；
C：1个iSpC18 spacer；
D：SEQ ID NO：11；
E：2个iSpC18 spacers；
F：SEQ ID NO：12；
G：SEQ ID NO：13；
H：3’端带有胆固醇标记的SEQ ID NO：14。
图5是本发明中使用的DNA构建体Y的示意图。
A：50个T；
B：本发明使用的解旋酶；
C：1个iSpC18 spacer；
D：SEQ ID NO：11；
E：2个iSpC18 spacers；
F：SEQ ID NO：12；
K：SEQ ID NO：15；
I：30个T；
J：SEQ ID NO：16。
图6是CaPif1解旋酶控制DNA构建体X穿过纳米孔移位时的电流轨迹示意图。
X轴：时间(s)；
Y轴：电流(nA)。
图7是显示图6所示解旋酶控制DNA构建体X过孔移动的区域放大图。
X轴：时间(s)；
Y轴：电流(nA)。
具体实施方式
为了更好的说明本方法的目的和优点，结合附图及具体实施例对本发明具体实施内容做进一步详细说明。
实施例1：CaPif1解旋酶蛋白的制备
根据野生型CaPif1蛋白的氨基酸序列(PDB ID：7OTJ，相关网址：RCSB PDB-7OTJ:Crystal structure of Pif1 helicase from Candida albicans)，通过体外基因合成的方法获得其核酸序列，再以大肠杆菌为宿主进行相关密码子的优化，更换为大肠杆菌常用的密码子，获得优化的CaPif1蛋白的核酸序列，其序列如SEQ ID NO.5所示。然后通过NdeⅠ和XhoⅠ两个限制性酶切位点将其连接插入到pET28表达载体中，经测序验证序列正确后，最终获得CaPif1解旋酶的重组表达质粒。
将重组质粒通过热激法转化到BL21(DE3)的大肠杆菌表达宿主中。在诱导表达过程中，首先用加有卡纳抗性的LB培养基在37℃过夜培养含有该表达质粒的宿主菌，然后按照1：100的比例在37℃进行放大培养，待其OD(600)值达到0.4-0.6时停止培养并放在4℃进行1小时的降温处理，随后加入终浓度0.5mM的异丙基硫代半乳糖(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)在16℃诱导表达12-16h。然后，4℃，15000rpm离心收集细菌，通过高压破碎仪在4℃对菌体进行高压破碎，随后4℃离心收集上清液，然后通过镍柱、肝素柱、Q柱以及分子筛等一步一步实现目的蛋白的分离纯化，最终获得大量的高纯度的野生型解旋酶蛋白。
附图1显示了经纯化后的CaPif1解旋酶的SDS-PAGE凝胶电泳图。
实施例2：荧光实验分析CaPif1解旋酶的解旋活性
附图2为检测解旋酶酶活性的荧光分析示意图。
如附图2中(1)所示，荧光底物链(终浓度100nM，d，SEQ ID NO：6)具有5’端20个碱基的单链DNA部分和18个碱基杂交的双链DNA部分，而且其3’端具有荧光基团(Cy3，f)。与其互补配对的上方短链(c，SEQ ID NO：7)在5’端具有荧光淬灭基团(BHQ-1，e)。当两条链发生互补配对时，Cy3(f)的荧光会被BHQ-1(e)淬灭掉，此时底物基本上是无荧光的。
在实验过程中，如附图2中(2)所示，CaPif1解旋酶会结合到荧光底物的5’端单链DNA部分，在加入ATP(2mM)和MgCl2(2mM)后沿着5’-3’方向进行移位，并解旋所述的双链部分。
随后，如附图2中(3)所示，过量的捕获链(b，SEQ ID NO：8)优先与短链(c)发生互补配对以防止初始底物之间重新退火，释放出来的底物主链(d)发出荧光。
附图3显示了在300mM NaCl的缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，2mM ATP，2mMMgCl2，300mM NaCl)中CaPif1解旋酶随时间的解旋荧光底物所产生荧光值的变化结果。结果显示，底物由基本上无荧光到发出荧光。
实施例3：CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A突变组合以及CaPif1-Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A突变组合的制备
其中，CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A为具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A、和662A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺基乙烷连接；
CaPif1-Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A为具有突变组合Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：3与双马来酰亚胺PEG3连接。
在如此情况下，通过与双马来酰亚胺基乙烷或者双马来酰亚胺PEG3连接分子反应，在CaPif1初始序列中的455和796或者443和634位半胱氨酸之间形成共价连接。
根据野生型CaPif1蛋白的氨基酸序列(PDB ID：7OTJ，相关网址：RCSB PDB-7OTJ:Crystal structure of Pif1 helicase from Candida albicans)，通过体外基因合成的方法获得其核酸序列，再以大肠杆菌为宿主进行相关密码子的优化，更换为大肠杆菌常用的密码子，获得优化的CaPif1蛋白的核酸序列，其序列如SEQ ID NO.5所示。然后通过NdeⅠ和XhoⅠ两个限制性酶切位点将其连接插入到pET28表达载体中，经测序验证序列正确后，最终获得CaPif1解旋酶的重组表达质粒。然后，通过重叠PCR的方法进行定点突变来分别获得编码突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A、和662A的核酸序列(SEQ IDNO.2)，以及编码突变组合Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的核酸序列(SEQ ID NO.4)。
将突变后的重组质粒通过热激法转化到BL21(DE3)的大肠杆菌表达宿主中。在诱导表达过程中，首先用加有卡纳抗性的LB培养基在37℃过夜培养含有该表达质粒的宿主菌，然后按照1：100的比例在37℃进行放大培养，待其OD(600)值达到0.4-0.6时停止培养并放在4℃进行1小时的降温处理，随后加入终浓度0.5mM的异丙基硫代半乳糖(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)在16℃诱导表达12-16h。然后，4℃，15000rpm离心收集细菌，通过高压破碎仪在4℃对菌体进行高压破碎，随后4℃离心收集上清液，然后通过镍柱、肝素柱、Q柱以及分子筛等一步一步实现目的蛋白的分离纯化，最终获得大量的高纯度的解旋酶突变体蛋白，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3。
将1μL 1M DTT分别加入到100μl CaPif1-R455C、E796C、R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A(具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：1，储存在25mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，10％甘油，2mM EDTA)和CaPif1-Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A(具有突变组合Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A、C662A的SEQ ID NO：3，储存在25mM Tris-HCl pH 7.5，500mMNaCl，10％甘油，2mM EDTA)中，在室温中孵育30分钟。
通过0.5ml Zeba脱盐柱(7k MWCO)将缓冲液置换成PBS缓冲液(pH7.5)，得到100μl样品。分别加入0.5μl，10mM的双马来酰亚胺基乙烷和双马来酰亚胺PEG3，室温下20rpm旋转孵育1个小时，之后，加入1μl，1M DTT来终止反应。用4-10％聚丙烯酰胺凝胶对交联结果进行分析。
结果显示，两种CaPif1突变体与连接分子的反应几乎达到了100％的产率。
实施例4：采用凝胶迁移实验来测量经修饰的CaPif1解旋酶结合DNA的能力
通过退火制备用于凝胶迁移实验所需的DNA底物(SEQ ID NO：9与含5’端Cy3标记的SEQ ID NO：10进行杂交)，然后将其按照1：1的摩尔比分别与野生型CaPif1(PDB ID：7OTJ，相关网址：RCSB PDB-7OTJ:Crystal structure of Pif1 helicase from Candidaalbicans)，CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A(具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：1)和CaPif1-Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A(具有突变组合Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：3)在缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，300mM NaCl)中室温孵育一个小时，得到最终反应液中CaPif1解旋酶的终浓度为250nM，DNA的终浓度为25nM，总反应体积为20μL。
分别加入双马来酰亚胺基乙烷和双马来酰亚胺PEG3到相应的解旋酶突变体样品中至终浓度5μM，室温下孵育1小时。随后，用4％-10％的TBE凝胶进行检测，160V跑胶1.5小时，随后在550nM激发光下观察DNA条带。
结果显示出CaPif1解旋酶在修饰前后对DNA结合能力的影响，即修饰后的CaPif1与多核苷酸的结合能力明显增强。
实施例5：CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷和CaPif1-Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺PEG3具有控制完整DNA构建体X穿过纳米孔移动的能力
其中，CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷为具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺基乙烷连接；CaPif1-Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺PEG3为具有突变Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：3与双马来酰亚胺PEG3连接。
制备如附图4所示的DNA构建体X。
首先设计引物，该引物包含A、C、D、E和F序列，然后用其扩增λDNA上1000个碱基长度的序列(G)，获得的PCR产物经纯化后与序列H按照1：1.1摩尔比进行退火杂交，从而得到最终的DNA构建体X。
将制备好的DNA构建体X(终浓度0.1nM)分别与CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷和CaPif1-Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺PEG3(终浓度10nM)在室温的缓冲液(10mM Hepes，pH8.0，100Mm KCl，10％甘油)中预孵育30分钟。
在缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0)中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的Csgg纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0)流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品、ATP(终浓度2mM)和MgCl2(终浓度10mM)一起流入到单个纳米孔实验系统(总体积100μL)，在+180mV的恒定电压下测量信号6h(包括潜在的2s的-180mV电压反转)。
结果显示上述两种突变体均能够控制完整DNA构建体X穿过纳米孔的移动。
实施例6：CaPif1解旋酶控制整个DNA构建体X穿过单个Csgg纳米孔的移动
本实施例以CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A(具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：1)为例，验证CaPif1解旋酶如何控制整个DNA构建体X穿过单个Csgg纳米孔的移动。
制备如附图4所示的DNA构建体X。
首先设计引物，该引物包含A、C、D、E和F序列，然后用其扩增λDNA上1000个碱基长度的序列(G)，获得的PCR产物经纯化后与序列H按照1：1.1摩尔比进行退火杂交，从而得到最终的DNA构建体X。
将制备好的DNA构建体X(终浓度0.1nM)和CaPif1解旋酶(终浓度10nM)在室温的缓冲液(10mMHepes，pH 8.0，100mM KCl，10％甘油，5mM DTT)中预孵育30分钟。
在缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0)中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的Csgg纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0)流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品、ATP(终浓度2mM)和MgCl2(终浓度10mM)一起流入到单个纳米孔实验系统(总体积100μL)，在+180mV的恒定电压下测量信号6h(包括潜在的2s的-180mV电压反转)。
如附图6所示，观察到CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A(具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：1)解旋酶能够控制DNA构建体X穿过纳米孔进行移动。解旋酶控制的DNA移动时长为14秒对应于接近1000bp的DNA构建体穿过Csgg纳米孔的移动。
其中，附图7显示了CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A(具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：1)解旋酶控制的DNA移动的部分区域的放大图。
实施例7：野生型CaPif1和CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷控制完整DNA构建体Y穿过纳米孔移动的能力
其中，CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷为具有突变组合R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A的SEQ ID NO：1与双马来酰亚胺基乙烷连接。
制备如附图5所示的DNA构建体Y。
首先设计上游引物和下游引物，其中上游引物包含有A、C、D、E和J序列，其中J序列如SEQ ID NO:16所示，下游引物如SEQ ID NO:17所示。然后用他们扩增λDNA上4115个碱基长度的序列(K)，这样使得K序列(如SEQ ID NO:15所示)的3’末端添加上了一段多聚T序列(I)，获得的PCR产物经纯化后与序列H按照1：1.1摩尔比进行退火杂交，从而得到最终的DNA构建体Y。
将制备好的DNA构建体Y(终浓度0.1nM)分别与野生型CaPif1(PDB ID：7OTJ，相关网址：RCSB PDB-7OTJ:Crystal structure of Pif1 helicase from Candida albicans)和CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷(终浓度10nM)在室温的缓冲液(10mM Hepes，pH 8.0，100mM KCl，10％甘油)中预孵育30分钟。
在缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0)中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的Csgg纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH8.0)流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品、ATP(终浓度2mM)和MgCl2(终浓度10mM)一起流入到单个纳米孔实验系统(总体积100μL)，在+180mV的恒定电压下测量信号6h(包括潜在的2s的-180mV电压反转)。
结果显示，添加CaPif1解旋酶和DNA构建体形成的复合物到Csgg纳米孔系统中可以产生典型的核酸过孔电流信号。野生型的CaPif1解旋酶单体和CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷均能够控制DNA构建体Y进行穿孔运动。
统计比较相同数量的所述解旋酶控制的DNA过孔轨迹发现，对于野生型的CaPif1解旋酶单体来说，只有较少比例的电信号轨迹观察到了典型的多聚T(I区域)过孔电流信号。
然而对于CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷来说，绝大多数的电信号轨迹均观察到了多聚T(I区域)的典型过孔信号。这意味着解旋酶到达了DNA构建体Y的3’末端。
上述结果表明，CaPif1-R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A-双马来酰亚胺基乙烷相比于野生型CaPif1具有更好的控制DNA穿孔运动的能力。
以上实施例仅仅是本发明的较佳实施例而已，本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (23)
1.一种修饰的CaPif1解旋酶，其特征在于，对野生型CaPif1(368-883)氨基酸序列中的五个天然的半胱氨酸进行修饰，所述五个天然的半胱氨酸分别是C426，C507，C584，C592和C662。
2.根据权利要求1所述的解旋酶，其中用丙氨酸(A)或者丝氨酸(S)取代所述五个天然的半胱氨酸。
3.一种修饰的CaPif1解旋酶，其特征在于，引入新的用于实现连接的半胱氨酸，引入位点包括Q443、N448、K452、R455、I633、L634、P635、Q638、Q641、V642、D795、E796、D797和T799。
4.根据权利要求3所述的解旋酶，其中突变组合包括R455C、E796C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A。
5.根据权利要求4所述的解旋酶，所述的解旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求3所述的解旋酶，其中突变组合包括Q443C、L634C、C426A、C507A、C584A、C592A和C662A。
7.根据权利要求6所述的解旋酶，所述的解旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的解旋酶，其特征在于，所述的解旋酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
9.编码权利要求1-8中任一项所述的解旋酶的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
11.权利要求1-8中任一项所述的解旋酶与双马来酰亚胺基乙烷或双马来酰亚胺PEG3形成的复合体。
12.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含权利要求1-8中任一项所述的解旋酶或权利要求11所述的复合体和用于结合多核苷酸的结合部分。
13.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白会或双链结合蛋白。
14.权利要求1-8中任一项所述的解旋酶或权利要求9或10所述的核苷酸序列或权利要求11所述的复合体或权利要求12或13所述的构建体在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔中的应用。
15.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-8中任一项所述的解旋酶或权利要求9或10所述的核苷酸序列或权利要求11所述的复合体或权利要求12或13所述的构建体。
16.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的装置，其特征在于，所述装置包含权利要求1-8中任一项所述的解旋酶或权利要求9或10所述的核苷酸序列或权利要求11所述的复合体或权利要求12或13所述的构建体。
17.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将目标多核苷酸与纳米孔，和权利要求1-8中任一项所述的解旋酶或权利要求11所述的复合体或权利要求12或13所述的构建体接触，使得所述解旋酶、复合体或构建体控制所述目标多核苷酸穿过所述纳米孔；和
(2)获取目标多核苷酸中的核苷酸与所述纳米孔相互作用的一个或多个特征，以表征所述目标多核苷酸，所述构建体包含解旋酶和用于结合多核苷酸的结合部分。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光测量进行。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述的目标多核苷酸为单链、双链、或至少一部分是双链的。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述的纳米孔为跨膜孔，所述的跨膜孔为生物孔、固态孔或生物与固态交杂的孔。
22.一种包含权利要求9或10所述的核苷酸序列的载体。
23.一种包含权利要求9或10所述的核苷酸序列或包含权利要求22所述的载体的宿主细胞。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211132258.8A CN117721101A (zh) | 2022-09-16 | 2022-09-16 | 一种经修饰的CaPif1解旋酶及其应用 |
| PCT/CN2023/118905 WO2024056038A1 (zh) | 2022-09-16 | 2023-09-14 | 一种经修饰的CaPif1解旋酶及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211132258.8A CN117721101A (zh) | 2022-09-16 | 2022-09-16 | 一种经修饰的CaPif1解旋酶及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117721101A true CN117721101A (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=90207474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211132258.8A Pending CN117721101A (zh) | 2022-09-16 | 2022-09-16 | 一种经修饰的CaPif1解旋酶及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117721101A (zh) |
| WO (1) | WO2024056038A1 (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1680438A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-10-12 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种人Pif1基因、其编码蛋白及其应用 |
| CN113930406A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-01-14 | 北京齐碳科技有限公司 | 一种Pif1-like解旋酶及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2875128B8 (en) * | 2012-07-19 | 2020-06-24 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Modified helicases |
| CN117947149A (zh) * | 2013-10-18 | 2024-04-30 | 牛津纳米孔科技公开有限公司 | 经修饰的酶 |
| GB201417712D0 (en) * | 2014-10-07 | 2014-11-19 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
| JP2023515597A (ja) * | 2020-06-19 | 2023-04-13 | チタン テクノロジー リミテッド， ベイジン | Ｐｉｆ１様ヘリカーゼ及びその使用 |
| WO2022126304A1 (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-23 | 北京齐碳科技有限公司 | 一种经修饰的解旋酶及其应用 |
-
2022
- 2022-09-16 CN CN202211132258.8A patent/CN117721101A/zh active Pending
-
2023
- 2023-09-14 WO PCT/CN2023/118905 patent/WO2024056038A1/zh unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1680438A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-10-12 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种人Pif1基因、其编码蛋白及其应用 |
| CN113930406A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-01-14 | 北京齐碳科技有限公司 | 一种Pif1-like解旋酶及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KE-YU LU: "Structural study of the function of Candida Albicans Pif1", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 190 - 194 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024056038A1 (zh) | 2024-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11034999B2 (en) | Polymerase-template complexes | |
| EP3619224B1 (en) | Transmembrane pore consisting of two csgg pores | |
| JP6408494B2 (ja) | 酵素停止法 | |
| EP2836506B1 (en) | Mutant lysenin pores | |
| JP7027334B2 (ja) | アルファ溶血素バリアントおよびその使用 | |
| JP6959931B2 (ja) | エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ | |
| JP6429773B2 (ja) | 酵素構築物 | |
| KR100816419B1 (ko) | 핵산의 등온증폭 방법 및 핵산과 신호 프로브의 동시등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법 | |
| CN111733216A (zh) | 一种提高目标核酸检测效率的方法 | |
| CN112805393A (zh) | 一种解旋酶及其应用 | |
| US11034996B2 (en) | Nucleic acid sequence and capture by formation of an abasic site-derived cross-link | |
| CN117721101A (zh) | 一种经修饰的CaPif1解旋酶及其应用 | |
| Shuai et al. | A rapid nucleic acid detection platform based on phosphorothioate-DNA and sulfur binding domain | |
| CN117384878A (zh) | 一种经修饰的CtPif1解旋酶及其应用 | |
| CN118126983A (zh) | 一种修饰的mpk2解旋酶及其应用 | |
| CN113234795B (zh) | 利用Cas蛋白进行核酸检测的方法 | |
| CN118086286A (zh) | 一种DNA -肽偶联物、ARCFU-like解旋酶及其在检测肽段的应用 | |
| WO2024100270A1 (en) | Novel pore monomers and pores | |
| WO2024033422A1 (en) | Novel pore monomers and pores | |
| CN117384867A (zh) | 一种经修饰的Cas3移位酶及其应用 | |
| WO2024033421A2 (en) | Novel pore monomers and pores | |
| JP2000184887A (ja) | 標識されたｄｎａの調製方法 | |
| CN116411049A (zh) | 用于核酸恒温扩增反应的酶组合产品及其应用 | |
| KR20230065830A (ko) | DNA 및 RNA 동시 검출을 위한 Cas 복합체 및 이의 용도 | |
| CN116083395A (zh) | 一种分子马达、构建体、核酸、载体、宿主细胞及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |