KR20230065830A - DNA 및 RNA 동시 검출을 위한 Cas 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SpyTag/SpyCatcher 시스템의 공유결합을 이용해 Cas12a와 Cas13a를 결합시킨 복합체에 대한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 Cas12a 및 Cas13a 복합체는 단일 반응으로 상호 방해작용없이 동시에 DNA 및 RNA를 검출할 수 있음을 확인한 바, 이를 이용하여 DNA 및 RNA를 동시에 검출할 수 있는, 정확도를 더욱 증가시킨 CRISPR/Cas 진단 시스템을 제공할 수 있다.

Description

DNA 및 RNA 동시 검출을 위한 Cas 복합체 및 이의 용도{Cas complex for simultaneous detection of DNA and RNA and uses thereof}

본 발명은 DNA 및 RNA를 동시 검출할 수 있는 Cas 복합체에 대한 것으로, 이를 포함하는 DNA 및 RNA 동시 검출용 조성물, 키트 및 DNA 및 RNA 동시 검출 방법에 관한 것이다.

천연 상태 그대로 검출하기 어려운 핵산을 표지하여 검출하는 방법은 분자생물학이나 세포생물학의 다양한 분야에 응용되어 왔다. 특이적인 혼성화 반응 (specific hybridization reaction)을 이용하는 서던 블로팅(Southern blotting), 노던 블로팅 (Northern blotting), 인시츄 혼성화 (in situ hybridization), 핵산 마이크로어레이 (microarray)에서 신호를 검출하기 위해 표지 물질이 부착된 핵산이 널리 사용되어 왔다. 중합효소연쇄반응 (polymerasechain reaction, PCR)에서 표지된 단량체 (표지된 dNTP) 또는 표지된 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭함과 동시에 DNA를 표지하는 방법이 알려져 있다. 이렇게 표지된 DNA를 마이크로어레이로 검출할 수 있다.

PCR과 동시에 핵산을 표지하는 방법은 표지를 위한 별도의 단계가 필요하지 않은 장점이 있는 반면, 형광 염료 등으로 표지된 단량체를 사용하는 경우 표지되지 않은 단량체를 사용하는 경우보다 PCR의 효율이 떨어지는 단점이 있다. 또한, RNA는 PCR 방법으로 증폭할 수 없기 때문에 PCR로 표지하는 방법으로 RNA를 검출하려면 역전사(reverse transcription)를 통해 cDNA를 제조하는 단계가 필요하고, 특히 마이크로 RNA (microRNA, miRNA)와 같이 길이가 짧은 경우 cDNA 제조가 번거로운 문제가 있다. 이에, 보다 향상된 민감도와 특이도를 갖는 핵산 검출 기술의 개발이 절실한 실정이다.

앞서 설명된 방법들의 경우, 많은 양의 검출 핵산을 보유한 경우에 타겟이 되는 핵산을 검출하기에 용이한 방법들이다, 현재도 많이 사용하고 있음에도 불구하고, 적은 양의 타겟 핵산이 존재할 시에는 이를 검출하기가 매우 어려운 실정이며(민감도가 낮음), 다른 저해제들로 인해서 특정 타겟만을 검출하지 못하고, 비특정 타겟을 잘못 검출하는 경우(특이도가 낮음)가 빈번하다.

또한, 병원균이나 바이러스 등의 감염으로 인한 질병에 초기 대처 및 질병의 진행, 확산을 막기 위해서는 병원균 및 바이러스 등의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다. 감염 후 증상이 나타나기 전인 잠복기 때 이를 진단할 수 있다면 전염병의 확산을 효과적으로 예방하여 큰 피해를 막을 수 있다. 즉, 바이러스의 감염으로 인한 질병의 확산을 초기에 대처하고, 단일 염기서열의 변형으로 인한 약물 내성 바이러스 감염에 대하여 적절한 치료를 진행하기 위하여서는, 해당 바이러스에 대한 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다.

한편, CRISPR/Cas 시스템은 박테리아의 면역체계로써, 외부에서 유입된 DNA 또는 RNA를 인지, 절단함으로써 외부로부터의 감염을 막는 역할을 한다. 특히, CRISPR/Cas 시스템이 염기서열 특이적인 인지와 절단이 가능하다는 것이 밝혀진 이후, 새로운 유전자 편집 기술로 주목받고 있는 동시에, 표적 유전자를 검출, 진단하는 기술에까지 다양하게 응용되고 있다.

상기 CRISPR/Cas 시스템에 있어서, 현재까지 이중가닥 DNA(double strand DNA, dsDNA)를 타겟하는 Cas9, DNA를 타겟하는 Cas12, 단일가닥 RNA(single strand RNA, ssRNA)를 타겟하는 Cas13 또는 DNA를 타겟하는 Cas14 등의 Cas 단백질이 확인되어 다양한 진단 및 치료 기술에 활용되고 있다.

하지만 상기 Cas 단백질은 각각 타겟하는 바가 상이한 바, 단일 대상체에서 DNA 및 RNA를 동시에 검출할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템에 대해서는 보고된 바 없다.

본 발명자들은 단일 대상체에서 DNA 및 RNA를 동시에 검출할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템에 대하여 연구하던 중, Cas12a 및 Cas13a 복합체를 완성하고 이의 DNA 및 RNA 동시 검출 능력을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 DNA 및 RNA 동시 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DNA 및 RNA 동시 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 DNA 및 RNA 동시 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DNA-표적화 이펙터 단백질(effector protein) 및 RNA-표적화 이펙터 단백질이 공유결합으로 연결된 복합체를 유효성분으로 포함하는, DNA 및 RNA 동시 검출용 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DNA-표적화 이펙터 단백질 및 RNA-표적화 이펙터 단백질이 공유결합으로 연결된 복합체를 유효성분으로 포함하는, DNA 및 RNA 동시 검출용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 본 발명에 따른 키트를 노출시키는 단계; 및 표적 서열의 절단으로부터의 신호를 검출하여 시료 내 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 DNA 및 RNA 동시 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 SpyTag/SpyCatcher 시스템의 공유결합을 이용해 Cas12a와 Cas13a를 결합시킨 복합체 및 이의 DNA 및 RNA 동시 검출 능력을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 Cas12a 및 Cas13a 복합체는 단일 대상체에서 단일 반응으로 동시에 DNA 및 RNA를 정확하게 검출할 수 있음을 확인한 바, 이를 포함한 DNA 및 RNA 동시 검출용 조성물, 검출용 키트 또는 DNA 및 RNA 동시 검출 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 Cas12a 및 Cas13a 복합체에 있어서, SpyTag와 융합된 Cas13a의 발현(A) 및 SpyCatcher와 융합된 Cas12a의 발현(B)을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 Cas12a 및 Cas13a 복합체에 있어서, 이의 모식도(A), 시간에 따른 Cas12a 및 Cas13a의 결합(B) 및 정제된 단백질 확인 결과(C)이다.
도 3은 SpyCatcher와 융합된 Cas12a의 DNA 검출 능력을 확인한 결과이다.
도 4는 SpyTag와 융합된 Cas13a의 RNA 검출 능력을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 Cas12a 및 Cas13a 복합체에 있어서, 단일 반응시 DNA(A) 및 RNA(B) 동시 검출 능력을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 Cas12a 및 Cas13a 복합체에 있어서, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 이용한 DNA 및 RNA 동반 검출 능력을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 DNA-표적화 이펙터 단백질(effector protein) 및 RNA-표적화 이펙터 단백질이 공유결합으로 연결된 복합체를 유효성분으로 포함하는, DNA 및 RNA 동시 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 공유결합은 SpyTag/SpyCatcher 시스템에 의한 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 “SpyCatcher”는 114개의 아미노산으로 구성된 단백질을 의미하며, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 SpyCatcher는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “SpyTag”는 그람양성균 (Streptococcus pyogenes, Spy) 유래 피브로넥틴 결합 단백질(fibronectin binding protein Fbab-B(FbaB))의 CnaB2 도메인을 둘로 나누어 13개의 아미노산으로 구성된 단백질을 의미하며, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. SpyTag 또한 앞서 설명한 바와 같이, 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함할 수 있다.

상기 SpyTag의 Asp와 SpyCatcher의 리신(Lysine, Lys) 사이에 공유결합의, 이소펩티드(isopeptide) 결합이 형성되며, 이를 통해 각기 다른 물질을 결합시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "DNA 표적화 이펙터 단백질"은 Cas12a일 수 있다. 상기 Cas12a는 Cas 이펙터 단백질 중 Cas12에 속하며, 이중 가닥 DNA(double strand)를 표적으로 한다. Cas12는 Cas9 다음으로 유전자 편집에 많이 활용되며, 프로토스페이서(protospacer)의 인식에 따른 표적 유전자 절단 외에도 표적이 아닌 주변의 단일가닥 DNA(single stranded, ssDNA)의 부수적 절단을 유발한다.

본 발명에 있어서, 상기 DNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 2로 표시되는 Cas12a의 C-말단에 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 SpyCatcher가 융합된 형태이며, 상기 Cas12a 및 SpyCatcher는 링커(Linker)로 연결될 수도 있다. 보다 바람직하게는 상기 DNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 “RNA 표적화 이펙터 단백질”은 Cas13a일 수 있다. Cas13 그룹은 표적 유전자를 인식할 수 있는 28-30 bp(base pair)의스페이서로 이루어진 gRNA와 리보핵단백질을 형성한다 Cas13 단백질은 DNA 분해 효소가 아닌 RNA 분해 효소로 작용을 하며, Cas13은 DNA를 부수적으로 절단하는 Cas12와는 달리 RNA를 부수적으로 절단한다.

Cas13a는 C2C2로 알려졌으며, 가장 먼저 핵산 검출에 활용되었다. Cas13a는 crRNA에 맞는 프로토스페이서를 가진 단일 가닥 RNA 표적을 분해시킨다. 단일 가닥 RNA에 한 번 결합을 하면, Cas13a 단백질은 비특이적 RNA 분해효소로 작용을 하여 주변에 있는 RNA가 표적 RNA가 아니더라도 분해를 시킨다. 한 번의 표적 인식으로 최소 104회의 부수적 절단을 일으키는 것으로 보고되어 있다. Cas13는 상보적인 프로토스페이서를 절단하는 것이 아니고, 그 주변을 절단하여 프로토스페이서가 온전히 유지되기 때문에 절단을 여러차례 할 수도 있어 증폭 효과를 나타내므로 민감한 검출에 활용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 Cas13a의 N-말단에 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 SpyTag가 융합된 형태이다. 더불어 상기 Cas13a 및 SpyTag는 링커로 연결될 수도 있다. 보다 바람직하게는 상기 RNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함할 수 있다.

즉, 본 발명은 C-말단에 SpyCatcher가 융합된 DNA-표적화 이펙터 단백질과 N-말단에 SpyTag가 융합된 RNA-표적화 이펙터 단백질이 상기 SpyTag/SpyCatcher 시스템의 공유결합에 의해 결합된 복합체에 대한 것이다.

또한 본 발명은 DNA-표적화 이펙터 단백질 및 RNA-표적화 이펙터 단백질이 공유결합으로 연결된 복합체를 유효성분으로 포함하는, DNA 및 RNA 동시 검출용 키트를 제공한다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 키트에 있어서, DNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas12a이고, RNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas13a일 수 있으며, 상기 공유결합은 SpyTag/SpyCatcher 시스템에 의한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 복합체 외에 검출하고자 하는 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(gudie RNA) 및 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 키트에 있어서, 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “가이드 RNA(gudie RNA)”는 표적 RNA에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하는 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 본 발명의 복합체 중 Cas12a 및/또는 Cas13a 단백질과 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 및 RNA 동시 검출용 키트는 단일 대상체로부터 DNA 및 RNA를 동시에 검출할 수 있어, 표적 대상체에 대하여 우수한 민감도와 정확도를 보이므로, 보다 더 신속하고 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 시료에 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 본 발명에 따른 키트를 노출시키는 단계; 및 표적 서열의 절단으로부터의 신호를 검출하여 시료 내 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 DNA 및 RNA 동시 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 검출할 수 있는 한, 검출 목적 대상의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 바이러스, 병원균 등의 검출에 이용될 수 있다.

예를 들어, 빠른 진단을 필요하는 바이러스로 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 또는 레트로바이러스가 있을 수 있다. 예를 들어 코로나바이러스과 바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 보르나바이러스과, 필로바이러스과, 파라믹소바이러스과, 뉴모바이러스과, 랩도바이러스과, 아레나바이러스과, 부니아바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과, 또는 델타바이러스 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 “시료”는 임의의 RNA 및/또는 표적 RNA를 포함하는 임의의 시료이며, 생물학적 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 대상으로부터 수득한 임의의 조직 또는 체액일 수 있다. 보다 구체적으로 대상의 가래, 혈액, 혈청, 혈장, 혈구(예를 들어, 백혈구), 조직, 생검 샘플, 도말 샘플, 세척 샘플, 면봉 샘플, 세포 함유 체액, 유동 핵산, 소변, 복막액 및 흉수, 뇌 척수액, 대변, 누액 또는 이로부터의 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료는 조직학적 목적 하에 취해진 조직 절편, 즉 동결 또는 고정 절편 또는 그의 미세해부 세포 또는 세포외 부분을 또한 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 대상에게 위해를 끼치지 않는 방법으로 얻어질 수 있다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Cas12a 및 Cas13a 복합체 제조

1-1. SpyTag-Cas13a 융합 단백질 제조

먼저 시판중인 플라스미드를 이용하여 Lwcas13a 단백질(pET-His6-SUMO-Lwcas13a plasmid addgene #V10159)의 N-말단(term)에 SpyTag을 융합하여, SpyTag-LwCas13a를 제조하였다.

더불어 상기 융합 단백질의 발현을 위해 형질전환체 E.coli BL21(DE3)에 형질전환 시키고 이를 배양하였다. SpyTag-LwCas13a 생산능을 가지는 E.coli BL21(DE3)세포를 암피실린(ampicilline, 100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 TB 배지에 넣고 37℃에서 배양하여 단일콜로니(single colony)를 선별하였으며, 선별된 콜로니를 OD₆₀₀ 값이 0.6 내지 0.7이 되도록 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. OD₆₀₀ 값이 0.6이 되면, 500μM IPTG(isopropyl-βD-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 18℃, 200rpm으로 16시간 동안 배양하였다. IPTG에 의해 인덕션(induction)된 세포를 4000rpm에서 15분 동안 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 남아있는 pellet을 lysis 버퍼(0.2M Tris-HCl, PH8.0; 500mM NaCl, 5% glycerol, 1mM PMSF)로 현탁(suspention)시켰으며, 현탁된 세포를 59% 1sec on/2sec off 조건으로 초음파처리(sonication)를 진행한 다음, 12000 ×ｇ에서 1시간 동안 원심분리(hanil. supra 22k)하였다. 상층액을 Ni-NTA 컬럼으로 정제 후 HisTrap FF 컬럼(column)과 HiTrap 헤파린 컬럼(Heparin column)을 이용하여 상기 형질전환체로부터 SpyTag-Lwcas13a를 분리하였다.

상기와 같이 정제된 단백질을 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)를 이용한 전기영동을 통하여 확인하였다.

그 결과 도 1 중 (A)와 같이 SpyTag과 Cas13a이 융합된 단백질(SpyTag-LwCas13a)의 밴드가 약 150KDa로 확인된 바, SpyTag과 Cas13a이 제대로 융합되었음을 확인하였다.

1-2. SpyCatcher-Cas12a 융합 단백질 제조

상기 실시예 1과 유사하게 시판 중인 플라스미드를 이용하여 Lwcas12a(pMBP-Lbcas12a addgene plasmid #113431)의 C-말단(term)에 SpyCatcher를 융합하여, LbCas12a-SpyCatcher를 제조하였다.

더불어 상기 융합 단백질의 발현을 위해 형질전환체 E.coli BL21(DE3)에 형질전환 시키고 이를 배양하였다. SpyCatcher-LwCas12a 생산능을 가지는 E.coli BL21(DE3)세포를 암피실린(ampicilline, 100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 TB 배지에 넣고 37℃에서 배양하여 단일콜로니(single colony)를 선별하였으며, 선별된 콜로니를 OD₆₀₀ 값이 0.6 내지 0.7이 되도록 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. OD₆₀₀ 값이 0.6이 되면, 375μM IPTG (isopropyl-βD-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 18℃, 200rpm으로 16시간 동안 배양함. IPTG에 의해 인덕션(induction)된 세포를 4000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 그 후 상등액을 버리고 남아있는 pellet을 lysis 버퍼(20mM Tris-HCl, PH7.5; 500mM NaCl, 5% glycerol, 1mM TCEP, 0.5mM PMSF and 0.25mg/ml lysozyme)로 현탁(suspention)시켰으며, 현탁된 세포를 59% 1sec on/2sec off 조건으로 sonication을 진행한 후, 12000 ×ｇ에서 1시간 동안 원심분리(hanil. supra 22k)하였다. 상층액을 Ni-NTA 컬럼으로 정제 후 HisTrap FF 컬럼(column)과 HiTrap 헤파린 컬럼(Heparin column)을 이용하여 상기 형질전환체로부터 SpyCatcher-Cas12a를 분리하였다.

상기와 같이 정제된 단백질을 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)를 이용한 전기영동을 통하여 확인하였다.

그 결과 도 1 중 (B)와 같이 SpyCatcher와 Cas12a이 융합된 단백질(Lbcas12a-SpyCatcher)의 밴드가 약 190KDa로 확인된 바, SpyCatcher와 Cas12a이 제대로 융합되었음을 확인하였다.

1-3. SpyTag-Cas13a 융합 단백질 및 SpyCatcher-Cas12a 융합 단백질 결합

상기 실시예 1-1 및 1-2를 통해 수득한 SpyTag-Cas13a 융합 단백질(SpyTag-Lwcas13a) 및 SpyCatcher-Cas12a 융합 단백질(LbCas12a-SpyCatcher)을 혼합해 도 2 중 (A)와 같이 SpyTag/SpyCatcher 결찰 시스템을 이용하여 결합시켰다(LbCas12:LwCas13).

더불어 시간에 따른 상기 Cas12a 및 Cas13a 복합체의 결합을 확인하였다. 이를 위해 LbCas12a-SpyCatcher와 SpyTag-LwCas13a를 분자비(molar ratio)로 1: 1.5 비율로 혼합하고, 시간별(0 분 내지 2시간) 결합을 SDS-PAGE로 확인하였다.

그 결과 도 2 중 (B)와 같이 시간이 증가함에 따라 LbCas12a-SpyCatcher와 SpyTag-LwCas13a의 발현이 각각 감소하였으며, Cas12a 및 Cas13a의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 더불어 Gel 여과 컬럼(filteration column)을 이용하여 SpyTag-LwCas13a, LbCas12a-SpyCatcher 및 이를 결합한 LbCas12:LwCas13를 정제하고 이를 확인하였다(도 2 중 (C)).

그 결과 본 발명에 따른 복합체인 LbCas12:LwCas13는 Cas12a 및 Cas12a가 결합되어 약 340KDa의 밴드를 보임을 확인하였다.

실시예 2. SpyCatcher-Cas12a 및 SpyTag-Cas13a 융합 단백질 각각의 검출 능력 확인

제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 virus, COVID-19)의 스파이크(Spike, S) 유전자를 이용하여 상기 실시예 1-2를 통해 제조한 SpyCatcher-Cas12a 융합 단백질의 DNA 검출 능력을 확인하였다(DNaseAlert 기질(substrate), 여기(Excitation): 525nm, 방출(Emission): 556nm). 이를 위하여, 공지된 서열을 참고하여 COVID-19 바이러스의 스파이크(SPIKE) 유전자 부분만 합성하여 타겟 코로나 바이러스의 합성(synthetic) DNA를 준비하였다.

50nM SpyCatcher-Cas12a와 100nM crRNA 복합체(Complex)를 만든 후, 상기 코로나 바이러스의 합성 DNA와 60nM DNaseAlert 기질(substrate)을 넣고 37℃, 2시간동안 키네틱(kinetic) 형광신호를 측정하였다.

그 결과 도 3과 같이, 타겟 DNA가 존재하는 경우에만 ssDNA 프로브(probe)의 형광 신호가 증가됨을 확인하였다.

더불어 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 Orf1ab 유전자를 이용하여 상기 실시예 1-3을 통해 제조한 SpyTag-Cas13a 융합 단백질의 RNA 검출 능력을 확인하였다(RNaseAlert 기질(substrate), 여기(Excitation): 490nm, 방출(Emission): 520nm). 이를 위하여, 공지된 서열을 참고하여 COVID-19 바이러스의 Orf1ab 유전자 부분만 합성하여 타겟 코로나 바이러스의 합성(synthetic) DNA를 준비하였고, 상기와 동일한 방법으로 형광신호를 측정하였다. 이때 50nM SpyTag-Cas13a, 50 nM crRNA, 200nM RNaseAlert를 넣어 수행하였다.

그 결과 도 4와 같이, 타겟 RNA가 존재하는 경우에만 ssRNA 프로브의 형광 신호가 증가함을 확인하였다.

실시예 3. 본 발명에 따른 Cas12a 및 Cas13a 복합체의 DNA 및 RNA 동시 검출 능력 확인

최종적으로 타겟물질(Cas12a의 타겟 DNA : COVID-19 바이러스의 Spike 유전자 부분을 합성한 sytnthetic DNA(COVID-19, Spike), Cas13a의 타겟 RNA : COVID-19 바이러스의 Orf1ab 유전자 부분을 합성한 sytnthetic RNA(COVID-19, Orf1ab))을 이용하여, 상기 실시예 1-3에서 제조한 Cas12a 및 Cas13a 복합체(LbCas12:LwCas13)를 이용하여 단일 반응으로 DNA 및 RNA를 검출할 수 있는지 확인하였다.

Cas12a와 Cas13a 반응에 필요한 모든 구성 요소를 한꺼번에 넣고 10 또는 20nm DNA, 10 또는 20nM RNA 각각 또는 이를 혼합한 후, 이에 대한 DNaseAlert와 RNaseAlert 기질의 형광 신호를 관찰하였다.

본 발명에 따른 50nM SpyCatcher-Cas12a와 SpyTag-Cas13a 복합체에 100nM의 Cas12a crRNA와 50nM의 Cas13a crRNA를 모두 넣어 복합체를 만든 후 타겟 synthetic DNA(COVID-19 splike)와 타겟 synthetic RNA(COVID-19 Orf1ab), 그리고 60nM DNaseAlert 기질, 60nM RNaseAlert 기질을 모두 넣고 37℃, 2시간동안 키네틱 형광신호를 측정하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, ssDNA 타겟 DNA가 존재할때는 DNaseAlert(도 5 중 (A)), 타겟 RNA가 존재할때는 RNaseAlert substrate(도 5 중 (B))의 형광 신호가 증가하는 것을 확인한 바, 각각의 기질은 상호 방해작용이 없는 것을 확인하였다.

더불어 10 또는 20nm DNA, 10 또는 20nM RNA 각각 또는 이를 혼합한 후, 이에 대한 DNA 및 RNA 동반 검출 능력을 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 이용하여 확인하였다.

먼저 Cas12a와 Cas13a 반응에 필요한 모든 구성요소를 한꺼번에 넣고 37℃로 2시간동안 반응시킨 후 RNaseAlert 기질(Donor)을 490 nm 파장으로 여기시킨 후 방출 스펙트럼을 측정하여 FRET 현상을 관찰하였다. 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, DNA와 RNA가 동시에 존재하는 경우 FRET 현상에 의해 RNaseAlert 520 nm 밴드와 DNaseAlert 546 nm 밴드가 모두 관찰되었다. 따라서 관찰되는 여기 파장의 band를 분석하면 DNA와 RNA의 동반 검출이 가능한 것을 확인하였다.

종합적으로 본 발명은 SpyTag/SpyCatcher 시스템을 이용해 Cas12a와 Cas13a를 결합시킨 복합체에 대한 것으로, 상기 복합체를 이용할 시 단일 반응으로 상호 방해작용없이 동시에 DNA 및 RNA를 검출할 수 있음을 확인한 바, 이를 이용해 DNA 및 RNA 모두를 한번에 검출할 있는, 정확도를 더욱 증가시킨 CRISPR/Cas 기반 진단 시스템을 제공할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Cas complex for simultaneous detection of DNA and RNA and uses thereof <130> 1-112P <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher <400> 1 Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly 1 5 10 15 Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys 20 25 30 Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg 35 40 45 Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Cys Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val 50 55 60 Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala 65 70 75 80 Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn 85 90 95 Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala 100 105 110 His Ile <210> 2 <211> 1228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas12a <400> 2 Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu 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Ile Ser His Lys Lys 145 150 155 160 Tyr Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg 165 170 175 Thr Ser Glu Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr 180 185 190 Ile Lys Asn Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg 195 200 205 Glu Asn Leu Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp 210 215 220 Ser Val Leu Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp 225 230 235 240 Lys Asn Tyr Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys 245 250 255 Asn Ser Phe Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn 260 265 270 Ser Glu Glu Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn 275 280 285 Lys Ile Asn Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr 290 295 300 Gln Lys Ile Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys 305 310 315 320 Arg Asn Ile Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp 325 330 335 Tyr Ile Asn Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu 340 345 350 Asp Ile Glu Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu 355 360 365 Lys Tyr Lys Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn 370 375 380 Asp Lys Glu Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val 385 390 395 400 Asn Asn Ile Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu 405 410 415 Lys Lys Ser Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu 420 425 430 Asn Asp Lys Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu 435 440 445 Met Ser Gln Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile 450 455 460 Ser Asn Asp Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys 465 470 475 480 Leu Ile Glu Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn 485 490 495 Cys Gly Lys Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser 500 505 510 Asp Phe Ile Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu 530 535 540 Thr Glu Asn Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val 545 550 555 560 Lys Asn Asn Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser 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Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn 1185 1190 1195 1200 Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn Leu 1205 1210 1215 Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile Met Lys 1220 1225 1230 Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala Thr Phe Lys 1235 1240 1245 Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu Glu Ser Glu Lys 1250 1255 1260 Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg 1265 1270 1275 1280 Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys Val Met Phe Glu Tyr Lys 1285 1290 1295 Ala Leu Glu

Claims (12)

1. DNA-표적화 이펙터 단백질(effector protein) 및 RNA-표적화 이펙터 단백질이 공유결합으로 연결된 복합체를 유효성분으로 포함하는, DNA 및 RNA 동시 검출용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 공유결합은 SpyTag/SpyCatcher 시스템에 의한 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 DNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas12a인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 DNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 SpyCatcher와 융합된 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제 4항에 있어서,
   상기 DNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 RNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas13a인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 RNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 SpyTag와 융합된 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 RNA-표적화 이펙터 단백질은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
9. DNA-표적화 이펙터 단백질 및 RNA-표적화 이펙터 단백질이 공유결합으로 연결된 복합체를 유효성분으로 포함하는, DNA 및 RNA 동시 검출용 키트.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 DNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas12a이고, RNA-표적화 이펙터 단백질은 Cas13a인 것을 특징으로 하는, 키트.
    
11. 제 9항에 있어서,
    상기 공유결합은 SpyTag/SpyCatcher 시스템에 의한 것을 특징으로 하는, 키트.
    
12. 시료에 제 1항에 따른 검출용 조성물 또는 제 9항에 따른 키트를 노출시키는 단계; 및
    표적 서열의 절단으로부터의 신호를 검출하여 시료 내 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 DNA 및 RNA 동시 검출 방법.

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