JP7358509B2 - カブトガニ由来組換えＦａｃｔｏｒＧ及びこれを用いたβ－グルカンの測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、カブトガニ由来の新規なFactorG αサブユニットとFactorG βサブユニットからなるヘテロダイマー、これを用いるβ-グルカン（以下、「BG」と略記する。）の測定方法、及び該ヘテロダイマーを含むキットに関する。

内臓、血液系、及びリンパ系に生じる深在性真菌症は、抵抗力の弱った状態、例えば免疫不全状態の患者が罹る日和見感染症の一種であり、患者はしばしば極めて重篤な病態となる。深在性真菌症の起因菌の代表例としては、カンジダ、アスペルギルスが挙げられ、何れの細胞壁にもBGが共通して存在している。それ故、血中BGを検出し、測定することは有用である。臨床診断の分野では、血漿あるいは血清中BGの濃度が、深在性真菌感染症の早期診断、治療効果および予後の判定の指標として用いられている。

BGは、β(１→３)結合のグルコース繰り返し構造を主鎖とする多糖であり、数千～100万程度の高分子量の物質である。（１→６）結合や（１→４）結合の分岐を持つ場合もある。カブトガニの血球抽出物（アメボサイト ライセート、Amebocyte Lysate、以下、「ライセート」と略記する。）中には、FactorG αサブユニットとFactorG βサブユニットから構成されるヘテロダイマーであるFactorGが存在する。BGは、FactorG αサブユニットのBG結合ドメイン部分に結合する性質を持つ。

BGを測定する方法としては、例えば上記したライセート中のFactorGを介した反応経路を利用し、合成ペプチド基質を用いた下記のような合成基質法が知られている。

BGがFactorG αサブユニットのBG結合ドメイン部分に結合すると、FacotrGはプロテアーゼ活性を持つ活性型FactorGとなる。活性型FactorGは、そのプロテアーゼ活性により、ライセート中に存在するプロクロッティングエンザイム（Proclotting enzyme）をクロッティングエンザイム（Clotting enzyme）に変換させる（非特許文献１）。クロッティングエンザイムは合成ペプチド基質（例えばBoc-DEL-pNA）の合成基質をアミド加水分解してpNAを遊離する。そこで、生成した発色物質(pNA)の吸光度を測定することにより、BGを定量することができる。

タキプレウス属カブトガニ（Tachypleus tridentatus）由来のFactorG αサブユニット及びβサブユニットは既にクローニングされている（非特許文献２、特許文献1）。
特許文献2では、非特許文献２及び特許文献1に記載のFactor Gを用い、BG無添加でプロテアーゼ活性を測定している。

特許第4832134号公報 国際公開第WO2008/004674号パンフレット

T. Morita et al., FEBS Lett., 1981, vol.129, p.318-321 N. Seki et al.,J. Biol. Chem., 1994, vol.269, No.2, p.1370-1374

特許文献1、特許文献2等に記載された技術は、非特許文献２で決定した遺伝子配列を用いて行っているが、昆虫細胞培養培地を使用している。しかしながら、昆虫細胞培養培地には、酵母抽出液からのBG汚染があることが知られている。また、特許文献１では、BG無添加でプロテアーゼ活性を測定している試験は無い。そのため、特許文献１で作製したタキプレウス属カブトガニ由来のFactorGが、BG特異的に活性化されたのか否かは不明である。

実際に、BGを検出限界以下にした培地を用いて本発明者等が行った検証によれば、後記する実施例１の結果から明らかなように、非特許文献２及び特許文献２に記載の方法で作製した組換えタキプレウス属カブトガニ由来FactorGは、BGが存在していてもプロテアーゼ活性を確認することはできなかった。すなわち、これら文献記載のDNA配列を用いて、BGの存在下でプロテアーゼ活性を有する活性型FactorGに変換するFactorG（前駆体）を作製することは困難であった。

更に、特許文献３では、数ngオーダーの検出感度でBGを測定したと記載されている。しかしながら、臨床診断上では血漿或いは血清中BGの測定では数pgのオーダーでの測定が求められているため、数ngオーダーの検出感度では、臨床診断に用いるための十分な性能を有していない。

上記状況を鑑みて、本発明は、BG依存的に活性化されるカブトガニ由来FactorGを提供すること、及びそれを用いた高感度なBGの測定方法を提供することを課題とする。

本発明は、上記課題を解決する目的でなされたもので、以下の構成よりなる。
[1] 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー。
[2] 下記から選択される、前記[1]に記載のヘテロダイマー：
(i) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
(ii) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
(iii) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
(iv) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
(v) 配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
(vi) 配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットのヘテロダイマー。
[3] (i)、(ii)、又は(v)から選択される、前記[2]に記載のヘテロダイマー。
[4] 試料と、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマーを用いた、β－グルカンの測定方法。
[5] 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニット。
[6] 配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニット。
[7] 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマーを含む、β―グルカン測定用キット。

また、本発明は以下の構成を含んでいてもよい。
[8] 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子を組み込んだベクター。
[9] 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、及び配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子の両方を組み込んだベクター。
[10] 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子を組み込んだ形質転換体。
[11] 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、及び配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子の両方を組み込んだ形質転換体。
[12] BGを含有する試料を、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと接触させて処理する、試料からBGを除去する方法。
[13] 前記FactorG αサブユニットが不溶性担体に担持されている、前記[13]に記載のBGを除去する方法。
[14] 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットを含む、β―グルカン除去用キット。

本発明者等は上記問題を解決するべく鋭意研究の結果、BG存在下でプロテアーゼ活性を有するFactorGを開発し、これを用いれば高感度なBGの測定を行えることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明のヘテロダイマーは、BG存在下でプロテアーゼ活性を発揮するBG依存性のプロテアーゼ活性を有する。また、本発明のヘテロダイマーを用いてBG濃度の測定を行えば、従来のBG測定法と比較して、高感度なBGの測定が行える。更に、本発明のヘテロダイマーは、リコンビナント品であるためロット差がなく、安価に、且つ大量に製造できるという効果を奏する。

実施例１で得られた、PSM-J1培地、又は及び本発明のFactorG αサブユニットBを用いて処理したPSM-J1培地中のBGの濃度を測定した結果を示す。 実施例１で得られた、試料中のレンチナン濃度と吸光度との関係を示す検量線である。 実施例３において、本発明のFactorG αサブユニットAとFactorG βサブユニットβi2のヘテロダイマーを用いて得られた、試料中のレンチナン濃度と吸光度との関係を示す検量線である。 実施例３において、本発明のFactorG αサブユニットBとFacorG βサブユニットβ2のヘテロダイマーを用いて得られた、試料中のレンチナン濃度と吸光度との関係を示す検量線である。 実施例４で得られた本発明のFactorG αサブユニットAとFacorG βサブユニットβi2のヘテロダイマーを用い、試料中のレンチナン濃度を測定して得られた、試料中のBG濃度を測定した結果を示す。

１．本発明に係るBG
本発明に係るBGとしては、BGをその構成成分として含む多糖類であって、カブトガニ血球抽出物の酵素反応を引き起こす性質のあるものが挙げられる。具体的には、例えば各種細菌類（例えば、Alcaligenes属，Agrobacterium属等）、酵母類（例えば、Saccharomyces属，Candida属，Cryptococcus属，Trichosporon属，Rhodotorula属等）、カビ類（Aspergillus属，Mucor属，Penicillium属，Trichophyton属，Sporothrix属，Phialophora属等）、放線菌類（Actinomyces属，Nocardia属等）、キノコ類（例えば，シイタケ，スエヒロタケ，カワラタケ等）等の細胞壁等から得られる天然の多糖、具体的には例えばカードラン，パキマン，スクレロタン，レンチナン，シゾフィラン，コリオラン等が、或は藻類（例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等）の貯蔵性多糖、具体的には例えばラミナラン、パラミロン等が挙げられる。

２．本発明のFactorG αサブユニット
本発明のFactorG αサブユニットは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
本発明のFactorG αサブユニットは、BGに結合する性質を有する。
本発明のFactorG αサブユニットの由来としては、Limulus polyphemus由来のものが好ましい。

配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有し、BGに結合する性質を有する蛋白質の、アミノ酸配列が挙げられる。

また、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つのアミノ酸配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列に置換、欠失、挿入、付加等を与える位置及び数は、該アミノ酸配列を有する蛋白質が上記したFactorG αサブユニットの性質を有するものである限り、任意である。

本発明のFactorG αサブユニットの好ましい具体例としては、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニット蛋白質が挙げられる。

配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニット蛋白質がより好ましい。

本発明のFactorG αサブユニットは、そのN末端又はC末端にHisタグ、FLAGタグ、Hatタグ、SUMOタグ等の公知のタグペプチドや、所謂スペーサーが連結していてもよい。また、そのN末端にアミノ酸１～数個、例えば１～３個程度の、シグナルペプチドの断片を有していてもよい。

配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質を、以下「FactorG αサブユニットA」、又は単に「αサブユニットA」と略記する場合がある。
配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質を、以下「FactorG αサブユニットB」又は単に「αサブユニットB」と略記する場合がある。

単に「FactorG αサブユニット」と記載した場合には、「FactorG αサブユニットA」と「FactorG αサブユニットB」の両方を含む本発明のFactorG αサブユニットの総称を意味する。
また、単に「FactorG αサブユニットのアミノ酸配列」と記載した場合は、上記した「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列」の総称を意味する。

３．本発明のFactorG βサブユニット
本発明のFactorG βサブユニットは、配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
本発明のFactorG βサブユニットは、セリンプロテアーゼのドメインを持つが、酵素活性はなく、前記した本発明のFactorG αサブユニットとのヘテロダイマーを形成した場合にプロテアーゼ活性を発揮する。
本発明のFactorG βサブユニットの由来としては、Limulus polyphemus由来のものが好ましい。

配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有し、上記したFactorG βサブユニットの性質を有する蛋白質の、アミノ酸配列が挙げられる。

また、配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つのアミノ酸配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列に置換、欠失、挿入、付加等を与える位置及び数は、該アミノ酸配列を有する蛋白質が上記したFactorG βサブユニットの性質を有するものである限り、任意である。

本発明のFactorG βサブユニットの好ましい具体例としては、配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニット蛋白質が挙げられる。

配列番号６、８、又は１０のいずれか一つで表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニット蛋白質がより好ましい。

配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニット蛋白質が更に好ましい。

本発明のFactorG βサブユニットは、そのN末端又はC末端にHisタグ、FLAGタグ、Hatタグ、SUMOタグ等の公知のタグペプチドや、所謂スペーサーが連結していてもよい。また、そのN末端にアミノ酸１～数個、例えば１～３個程度の、シグナルペプチドの断片を有していてもよい。

本発明の配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質を、それぞれ下記のように命名する。

・配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のFactorG βサブユニット：FactorG βサブユニットβi2、
・配列番号８で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のFactorG βサブユニット：FactorG βサブユニットβi3、
・配列番号１０で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のFactorG βサブユニット：FactorG βサブユニットβ2、
・配列番号１２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のFactorG βサブユニット：FactorG βサブユニットβ5、
・配列番号１４で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のFactorG βサブユニット：FactorG βサブユニットβC1、
・配列番号１６で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のFactorG βサブユニット：FactorG βサブユニットβC2。

「FactorG βサブユニットβi2」を「βサブユニットβi2」、「FactorG βサブユニットβi3」を「βサブユニットβi3」、「FactorG βサブユニットβ2」を「βサブユニットβ2」、「FactorG βサブユニットβ5」を「βサブユニットβ5」、「FactorG βサブユニットβC1」を「βサブユニットβC1」、「FactorG βサブユニットβC2」を「βサブユニットβC2」と、それぞれ略記する場合がある。

また、単に「FactorG βサブユニットのアミノ酸配列」と記載した場合は、上記した「配列番号６、８、１０、１２、１４、及び１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列」の総称を意味する。

４．本発明のヘテロダイマー
本発明のヘテロダイマーは、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組み合わせのヘテロダイマー」である。

言い換えれば、本発明のヘテロダイマーは、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットからなるヘテロダイマー」である。

「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニット」、及び「配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニット」の具体例は、上記した「２．本発明のFactorG αサブユニット」の項、及び「３．本発明のFactorG βサブユニット」の項で説明した通りである。

本発明のヘテロダイマーは、BGの存在下でプロテアーゼ活性を有する。

本発明のヘテロダイマーを構成するFactorG αサブユニットとFactorG βサブユニットの組合せの具体例を下記表１に示す。

本発明のヘテロダイマーの好ましいFactorG αサブユニットとFactorG βサブユニットの組合せとしては、上記表１の組合せ番号１、２、３、４、５、６、８、９、又は１２の組合せが挙げられる。

上記表１の組合せ番号１、２、４、５、９、又は１２の組合せが、より好ましい。

上記表１の組合せ番号１、２、又は９の組合せが、更に好ましい。

上記表１の組合せ番号１又は２の組合せが、特に好ましい。

本発明のヘテロダイマーを構成するFactorG αサブユニット及びFactorG βサブユニットは、そのN末端又はC末端にHisタグ、FLAGタグ、Hatタグ、SUMOタグ等の公知のタグペプチドや、所謂スペーサーが結合していてもよい。また、ヘテロダイマーを構成するFactorG αサブユニット及びFactorG βサブユニットは、そのN末端にアミノ酸１～数個、例えば１～３個程度の、シグナルペプチドの断片を有していてもよい。

５．本発明に係る核酸分子
（１）本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子
本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子としては、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列」の具体例は、上記した「２．本発明のFactorG αサブユニット」の項で説明した通りである。

本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子の具体例としては、例えば下記(i)及び(ii)が挙げられる。

(i) 配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子
配列番号１で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。
配列番号３で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。

「配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子のうち、配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましく、配列番号１で表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。

配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、所謂シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加していてもよい。以後の本明細書に記載されるシグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列は、特に限定されない。

「シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加した本発明のFactorG αサブユニット」をコードする核酸分子の具体例としては、例えば配列番号１７又は配列番号１９で表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

「配列番号１７又は配列番号１９で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号１７又は配列番号１９で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号１７又は配列番号１９で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号１７又は配列番号１９で表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子のうち、配列番号１７又は配列番号１９で表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましく、配列番号１７で表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。

(ii) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子であって、且つ配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質を遺伝子工学的手法で発現させる場合において、この核酸分子を発現させる宿主細胞の種類に合わせて最適化された塩基配列を含有する、核酸分子
。

上記核酸分子のうち、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子であって、且つ配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を遺伝子工学的手法で発現させる場合において、この核酸分子を発現させる宿主細胞の種類に合わせて最適化された塩基配列を含有する、核酸分子がより好ましい。

配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子であって、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を遺伝子工学的手法で発現させる場合において、この核酸分子を発現させる宿主細胞の種類に合わせて最適化された塩基配列を含有する、核酸分子がさらに好ましい。

例えば、昆虫細胞を宿主として用い、この配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子を発現させるために最適化された塩基配列としては、例えば配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

「配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子のうち、配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましく、配列番号３３で表される塩基配列を含有する核酸分子が特に好ましい。

配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、所謂シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加していてもよい。そのような核酸分子の具体例としては、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

「配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子のうち、配列番号４１又は配列番号４２で表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましい。配列番号４１で表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。

本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子は、cDNA等のDNA、又はRNAであってもよい。
また、本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子は一本鎖でも二本鎖であってもよい。二本鎖の場合には、例えば配列番号１、３、１７、１８、３３、３４、４１、又は４２で表される塩基配列とその相補鎖からなるもの等である。

また、本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子は、その5'末端又は3'末端にHisタグ、FLAGタグ、Hatタグ、SUMOタグ等の公知のタグペプチドや所謂スペーサーをコードする塩基配列が連結していてもよい。またその5’末端にシグナルペプチドをコードする塩基配列が連結していてもよい。

本発明に係る「本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子」の好ましい具体例としては、配列番号１、３、１７、１９、３３、３４、４１、又は４２のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

上記核酸分子のうち、配列番号１、１７、３３、又は４１のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましい。

上記した本発明のFactorG αサブユニットをコードする核酸分子をまとめて、以下「核酸分子α」と略記する場合がある。

（２）本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子
本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子としては、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。「配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列」の具体例は、上記した「３．本発明のFactorG βサブユニット」の項で説明した通りである。

本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子の具体例としては、例えば下記(i)及び(ii)が挙げられる。

(i)配列番号５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれか一つで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子

配列番号５で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。FactorG βサブユニットβi2のアミノ酸配列をコードする。
配列番号７で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号８で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。FactorG βサブユニットβi3のアミノ酸配列をコードする。
配列番号９で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。FactorG βサブユニットβ2のアミノ酸配列をコードする。
配列番号１１で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸分子である。FactorG βサブユニットβ5のアミノ酸配列をコードする。
配列番号１３で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。FactorG βサブユニットβC1のアミノ酸配列をコードする。
配列番号１５で表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、配列番号１６で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。FactorG βサブユニットβC2のアミノ酸配列をコードする。

「配列番号５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれか一つで表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれか一つで表されるで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれか一つで表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子の中でも、配列番号５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましく、配列番号５、７、又は９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましく、配列番号５又は７で表される塩基配列を含有する核酸分子が更に好ましい。

配列番号５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれか一つで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、所謂シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加していてもよい。「シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加した本発明のFactorG βサブユニット」をコードする核酸分子の具体例としては、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、又は３１のいずれか一つで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

「配列番号２１、２３、２５、２７、２９、又は３１のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、又は３１のいずれか一つで表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号２１、２３、２５、２７、２９、又は３１のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、又は３１のいずれか一つで表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子の中でも、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、又は３１のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましく、配列番号２１、２３、又は２５のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましく、配列番号２１又は２３で表される塩基配列を含有する核酸分子が更に好ましい。

(ii)配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子であって、且つ配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質を遺伝子工学的手法で発現させる場合において、この核酸分子を発現させる細胞の種類に合わせて最適化された塩基配列を有する、核酸分子

上記核酸分子のうち、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子であって、且つ配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を遺伝子工学的手法で発現させる場合において、この核酸分子を発現させる細胞の種類に合わせて最適化された塩基配列を有する、核酸分子が好ましい。

配列番号６、８、又は１０のいずれか一つで表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子であって、且つ配列番号６、８、又は１０のいずれか一つで表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を遺伝子工学的手法で発現させる場合において、この核酸分子を発現させる細胞の種類に合わせて最適化された塩基配列を有する、核酸分子がより好ましい。

配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子であって、且つ配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質を遺伝子工学的手法で発現させる場合において、この核酸分子を発現させる細胞の種類に合わせて最適化された塩基配列を有する、核酸分子が更に好ましい。

例えば、昆虫細胞を宿主として用い、この６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸分子を発現させるために最適化された塩基配列としては、配列番号３５～４０、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

「配列番号３５～４０、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号３５～４０、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号３５～４０、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号３５～４０、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子のうち、配列番号３５～４０、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましく、配列番号３５、３６、３７、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましく、配列番号３５、３６、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が更に好ましい。

配列番号３５～４０のいずれか一つで表される塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子は、所謂シグナルペプチドをコードする塩基配列を付加していてもよい。そのような核酸分子の例としては、配列番号４３～４８のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。また、後記するシグナルペプチドとタグ配列を有する配列番号６８で現れる塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

「配列番号４３～４８、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号４３～４８、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列が挙げられる。

また、「配列番号４３～４８、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子」の塩基配列としては、配列番号４３～４８、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列において、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、更に好ましくは１個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加された塩基配列が挙げられる。置換、欠失、挿入、若しくは付加は、一つの塩基配列の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。

上記核酸分子のうち、配列番号４３～４８、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましく、配列番号４３、４４、４５、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましく、配列番号４３又は４４で表される塩基配列を含有する核酸分子が更に好ましい。

本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子は、cDNA等のDNA、又はRNAであってもよい。
また、本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子は一本鎖でも二本鎖であってもよい。二本鎖の場合には、例えば配列番号５、７、９、１１、１３、１５、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５～４０、４３～４８、６８、又は６９で表される塩基配列とその相補鎖からなるもの等である。

また、本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子は、その5'末端側又は3'末端にHisタグ、FLAGタグ、Hatタグ、SUMOタグ等の公知のタグペプチドや所謂スペーサーをコードする塩基配列が連結していてもよい。またその5’末端にシグナルペプチドをコードする塩基配列が連結していてもよい。

本発明に係る「本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子」の好ましい具体例としては、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５～４０、４３～４８、６８、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。

配列番号５、７、９、２１、２３、２５、３５、３６、３７、４３、４４、４５、６８、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が好ましい。

配列番号５、７、２１、２３、３５、３６、４３、４４、６８、又は６９いずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。

上記した本発明のFactorG βサブユニットをコードする核酸分子をまとめて、以下「核酸分子β」と略記する場合がある。

（３）本発明に係る核酸分子
更に、上記「核酸分子α」及び「核酸分子β」をまとめて「本発明に係る核酸分子」と略記する場合がある。

また、前記した通り、本発明に係る核酸分子は、その5'末端又は3'末端にHisタグ、FLAGタグ、Hatタグ、SUMOタグ等の公知のタグペプチドや所謂スペーサーをコードする塩基配列が連結していてもよい。
例えば、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７，１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１のいずれか一つで表される塩基配列にタグをコードする塩基配列を連結した塩基配列を、発現させる細胞の種類に合わせて最適化した核酸分子が挙げられる。
例えば、5'末端側からシグナル配列、Hatタグ、SUMOタグ、FactorG βサブユニットi2(アミノ酸配列：配列番号６)の順に配したアミノ酸配列（配列番号６７）を設計し、このアミノ酸配列をコードし、且つ昆虫細胞用に最適化した配列番号６８で表される塩基配列を有する核酸分子が挙げられる。配列番号６８で表される塩基配列において、FactorG βサブユニットi2をコードする塩基配列は、配列番号６９で表される塩基配列である。

本発明に係る核酸分子は、cDNA等のDNA、又はRNAであってもよい。

本発明のヘテロダーマ―を構成する本発明のFactorG αサブユニットとFactorG βサブユニットの組合せをコードする、核酸分子αと核酸分子βの組合せとしては、例えば下記表２に記載のものが挙げられる。

好ましい（核酸分子α―核酸分子β）の配列番号の組合せとしては、上記表２の組合せ番号１、２、３、４、５、６、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４８、又は４９の組合せが挙げられる。

上記表２の組合せ番号１、２、４、５、９、１２、１３、１４、１６、１７、２１、２４、２５、２６、２８、２９、３３、３６、３７、３８、４０、４１、４５、４８、又は４９の組合せがより好ましい。

上記表２の組合せ番号１、２、９、１３、１４、２１、２５、２６、３３、３７、３８、４５、又は４９の組合せが更に好ましい。

上記表２の組合せ番号１、２、１３、１４、２５、２６、３７、３８、又は４９の組合せが特に好ましい。

６．本発明のヘテロダイマーの取得方法
本発明のヘテロダイマーの取得方法としては、例えば下記の３通りの方法が挙げられる。
（１）共発現による取得方法
（２）αサブユニットとβサブユニットをそれぞれ取得してから結合させることにより取得する方法
（３）化学合成による取得方法
中でも、ヘテロダイマーの収率等を考慮すると、「（１）共発現による取得方法」が好ましい。

（１）共発現による取得方法
本発明のヘテロダイマーは、「本発明に係る核酸分子（核酸分子α、及び核酸分子β）を、適当なウイルスやプラスミド等の発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞を該組み換え発現ベクターを用いた常法により形質転換（又は形質導入）させる。得られた形質転換体（形質導入体）を培養し、本発明のFactorGαサブユニットと本発明のFactorG βサブユニットを共発現させ、本発明のヘテロダイマーを、細胞外又は細胞内に分泌させる。」という遺伝子組み換え技術を用いた周知の方法で、得ることができる。

上記方法としては、一般的な昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母菌等の真核細胞を用いた発現系、又は大腸菌の様な原核生物を用いた発現系を利用する方法が挙げられる

以下に、共発現による本発明のヘテロダイマーを得る方法の一例として、バキュロウイルス―昆虫細胞の発現系を利用した方法を例に挙げて説明する。

１）本発明に係る核酸分子を組み込んだ本発明に係る組換え体の調製
バキュロウイルス―昆虫細胞の発現系を利用した本発明に係る組換え体の調製は、通常本発明に係る核酸分子（核酸分子α又は核酸分子β）を一旦トランスファーベクターに組み込んだのち、バキュロウイルスゲノムDNAとともに、宿主となる昆虫細胞にコトランスフェクションすることによりなされる。
本法に用いられる核酸分子α、及び核酸分子βの具体例は、上記した「５．本発明に係る核酸分子」の項に記載した通りである。

本法に用いられる核酸分子αの好ましい例としては、配列番号１、３、１７、１９、３３、３４、４１、又は４２のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。配列番号３３、３４、４１、又は４２のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。配列番号４１、又は４２で表される塩基配列を含有する核酸分子が特に好ましい。核酸分子の種類としては、cDNAがより好ましい。

本法に用いられる核酸分子βの好ましい例としては、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５～４０、４３～４８、６８、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。配列番号３５～４０、４３～４８、６８、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。配列番号４３～４８、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が特に好ましい。核酸分子の種類としては、cDNAがより好ましい。

本発明に係る核酸分子（核酸分子α、及び核酸分子β）を得る方法としては、特に限定されないが、自体公知の化学合成法により調製する方法や、DNAの合成に通常行われている、DNAシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてオリゴヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製する方法で、目的とする本発明に係る核酸分子を得ることができる。

バキュロウイルス－昆虫細胞を用いた発現系に用いられるバキュロウイルスとしては、核多角病ウイルス（Nuclear Polyhedrosis Virus、NIV）が好ましい。例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus、AcNPV）等が挙げられる。

宿主となる昆虫細胞としては、S. frugiperda由来のexpresSF+^TM（Protein Science社製）、Spodoptera Frugiperda由来のSf9、Sf21等、Trichoplusia ni由来のHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等が挙げられる。

トランスファーベクターとしては、pIEx/Bac-1、pIEx/Bac-3（Novagen社）、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（以上、インビトロジェン社製）、pBacPAK9等の、昆虫細胞用ベクターが挙げられる。

本発明に係る核酸分子を組み込んだトランスファーベクターは、例えば、本発明に係る核酸分子（核酸分子α又は／及び核酸分子β）としてcDNAを用い、該cDNAを上記の如きトランスファーベクターに組み込むことにより得られる。当該トランスファーベクターの取得は、常法により行えばよい。

尚、トランスファーベクターに組み込む核酸分子α又は核酸分子βであるcDNAは、目的により、そのまま制限酵素で消化した後、又はcDNAをトランスファーベクターに組み込むためのリンカーを付加した後に使用してもよい。

また、本発明のヘテロダイマーの検出や精製を容易にするために、目的とする本発明のヘテロダイマーを、他のタグペプチドや蛋白質等の公知のマーカーとの、融合蛋白として発現させてもよい。融合させるタグペプチドとしてはFLAGタグ，3XFLAGタグ，Hisタグ（His tag、例えば６×Hisタグ）Hatタグ、SUMOタグ等、蛋白質としてはβ－ガラクトシダーゼ（β-Gal），緑色蛍光蛋白質（GFP），マルトース結合蛋白質（MBP）等が挙げられる。

この場合、例えば、核酸分子α又は／及び核酸分子βの塩基配列の5’末端側又は3'末端側にHisタグ遺伝子の塩基配列を連結させた配列を有するcDNAを用いて、本発明のヘテロダイマーを発現させればよい。具体的には、例えば、トランスファーベクターに、そのような配列を有するcDNAを組み込んでおけばよい。そうすると、本発明のヘテロダイマーは、Hisタグ蛋白質との融合蛋白質として発現する。そこで、このHisタグの発現を確認することによって、本発明のヘテロダイマーの発現を容易に確認することができる。

本発明に係る組換え体の調製において、核酸分子を組み込んだトランスファーベクターとバキュロウイルスゲノムDNAを一緒に、宿主である昆虫細胞にコトランスフェクションさせる場合、通常は、ScreenFect^TMA plus（富士フイルム和光純薬(株)製）等のトランスフェクション試薬を用いてコトランスフェクションを行えばよい。例えばヒートショック法、リン酸カルシウム法（特開平2-227075号公報）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413, 1987）等の常法によりコトランスフェクションを行ってもよい。

コトランスフェクションから３～１０日後に培養上清を回収し、限界希釈法、プラーク法等の常法により組換えバキュロウイルスを選択し純化する。

以上の方法で、目的とする核酸分子αの塩基配列が組み込まれた組換えバキュロウイルス、又は核酸分子βの塩基配列が組み込まれた組換えバキュロウイルス（本発明に係る組換え体）が得られる。

２）宿主細胞のトランスフェクションによる本発明に係る形質転換体の調製
上記で得られた組換えバキュロウイルス（本発明に係る組換え体）を、以下の方法で宿主となる昆虫細胞にトランスフェクションさせる。
すなわち、核酸分子αが組み込まれた組換えバキュロウイルスと核酸分子βが組み込まれた組換えバキュロウイルスを、宿主細胞の培地に加える。核酸分子αが組み込まれた組換えバキュロウイルスを、volume of infection (以下、VOIと略記する。)=1/400～1/200、核酸分子βが組み込まれた組換えバキュロウイルスを、VOI=1/200～1/100の割合で加え、FactorG βサブユニットの発現量に対してFactorG αサブユニットの発現量を抑えることが好ましい。この場合、多重感染度（Multiphcity of Infection、以下MOIと略記する）で換算すると、概ねFactorG αサブユニット：FactorG βサブユニット＝0.4～0.8：0.9～1.8の比率になる。

以上の方法で、本発明に係る組換え体である組換えバキュロウイルスでトランスフェクションさせた、本発明に係る形質転換体である宿主細胞が得られる。

また、バキュロウイルスを用いない下記の方法でも、本発明に係る形質転換体を得ることが出来る。

まず、本発明に係る核酸分子α又は核酸分子βを、例えば常法に従いベクターDNAに組み込む。所謂発現ベクターが有用である。

発現ベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主細胞中で複製保持または自己増殖できるものであって、且つ本発明のポリヌクレオチドを発現し、生産する機能を有するものであれば特に制限されない。プラスミドベクター，ファージベクター等が包含される。

かかるベクターとして、具体的には、昆虫細胞発現系で用いられるプラスミドとして例えばpIZT/V5-His, pIB/V5-His (Termo Fisher Scientific社)、pIEx及びpIEx Bacシリーズ（例えばpIEx-Bac-1、Merck Millipore社）、大腸菌（Escherichia coli.）由来のプラスミドとして例えばpUC119（宝酒造社製）、pQE-TRIプラスミド (Qiagen社製)、pBluescript II KS+（Stratagene社製）、pBR322（宝酒造社製）、pGEM、pGEX、pUC、pBS、pET、pGEM-3ZpMALなどが、酵母由来プラスミドとして例えばpB42AD、pESP、pESCなどが、枯草菌由来プラスミドとして例えばpHT926、pTB51、pHY481などが挙げられる。ほ乳動物細胞由来プラスミドとしてはpCAT3、pcDNA3.1、pCMV、pCAG等が挙げられる。

また、ファージとしては、λENBL３（Stratagene社製），λDASHII（フナコシ社製）、λgt10、λgt11（いずれも東洋紡績(株)製）等のλファージなどのバクテリオファージが、Charomid DNA（和光純薬工業(株)製）、Lorist6（和光純薬工業(株)製）等のコスミドベクター等が挙げられる。

本発明に係る核酸分子を組み込んだ組換え発現ベクターは、上記したベクター等に、本発明に係る核酸分子を常法により組み込むことにより調製することができる。そのようなベクターとしては、核酸分子α、核酸分子β、又は核酸分子αと核酸分子βを組み込んだベクターが挙げられる。

本発明に係る形質転換体は、上述の組換え発現ベクター等を宿主細胞に導入することにより調製することが出来る。そのような形質転換体としては、核酸分子α、核酸分子β、又は核酸分子αと核酸分子βを組み込んだ形質転換体が挙げられる。

３）宿主細胞の培養
本発明のヘテロダイマーは、上記の方法で得られたトランスフェクションされた宿主細胞（本発明に係る形質転換体）を、その宿主細胞に応じた適切な培地中で培養し、培養物中に本発明のFactorG αサブユニットと本発明のFactorG βサブユニットを共発現させ、得られた本発明のヘテロダイマーを該培養物から分離・精製することによって製造することが出来る。

トランスフェクションされた宿主細胞の培養は当分野に於いて知られている方法により行えばよい。培養条件、例えば温度、培地のpH及び発酵時間は、本発明のヘテロダイマーの最高力価が得られるように適宜設定すればよい。

宿主が昆虫細胞の場合、培地としては、例えばPSFM-J1培地（富士フイルム和光純薬(株)製）、TNM-FH培地、Grace's InsectMedium培地〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., (1985) 82,8404〕、Sf-100 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製）等が挙げられる。そのpHは5～8であることが望ましい。

なお、血清に含まれるBGの混入を防ぐため、培地にはウシ胎児血清（FCS）等を添加しない無血清培地を用いることが好ましい。

また、後記する本発明のFactorG αサブユニットを用いるBGの除去方法で、混在するBGを除去した培地を用いてもよい。

トランスフェクションさせた宿主細胞の培養は、通常20～40℃、好ましくは25～30℃、約12時間～10日間行う。必要により通気、攪拌、旋回培養を行ってもよい。

ここで、目的の核酸分子α及び核酸分子βを組み込んだ形質転換体が得られたことは、例えばマーカーとしてHisタグ配列を連結させている場合には、抗His抗体を用いたELISA等により確認することができる。

４）本発明のヘテロダイマーの調製

本発明のヘテロダイマーは、上記培養により得られる培養物から、以下のようにして取得できる。

すなわち、本発明のヘテロダイマーが形質転換体の細胞質外に分泌される場合は、上記「３）宿主細胞の培養」で得られた本発明に係る形質転換体の培養物を、濾過または遠心分離等の常法によって細胞を除き、培養濾液または培養上清を得る。次いで当該培養濾液または培養上清から、天然または合成蛋白質を分離及び精製するために一般に用いられる常法に従って本発明のヘテロダイマーを分離し精製する。

また、本発明のヘテロダイマーが、形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、上記３)で得られた本発明に係る形質転換体の培養物を、濾過又は遠心分離などの常法に付して菌体或いは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば界面活性剤処理、超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁及び／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法で本発明のヘテロダイマーを含有する粗抽出液を得る。そして、当該粗抽出液から、天然または合成蛋白質を分離及び精製するために一般に用いられる常法に従って本発明のヘテロダイマーを分離し精製する。

また、上記したようなHis tag遺伝子タグペプチド等のマーカーをコードする配列を本発明の核酸分子と連結させたcDNAを用いた場合には、そのマーカーに応じた公知の方法で、発現した蛋白質を分離し、上記した方法で精製することが出来る。

本発明のヘテロダイマーの分離・精製方法としては、公知の塩析、溶媒沈殿法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

（２）αサブユニットとβサブユニットをそれぞれ取得してから結合させることにより取得する方法
本発明のヘテロダイマーの別の取得方法としては、「本発明のFactorG αサブユニット、及び本発明のFactorG βサブユニットをそれぞれ得る。次いで、得られた本発明のFactorG αサブユニットと本発明のFactorG βサブユニットを結合させる。」方法が挙げられる。

１）本発明のFactorG αサブユニット（本発明のFactorG αサブユニットA、本発明のFactorG αサブユニットB）の取得
本発明のFactorG αサブユニットは、例えば以下のような方法で取得することが出来る。
本発明に係る核酸分子αを用い、上記「６．（１）共発現による取得方法」の「１）本発明に係る核酸分子を組み込んだ本発明に係る組換え体の調製」に記載された方法で、核酸分子α（シグナルペプチドやHisタグ配列等のマーカーをコードする塩基配列を含んでいてもよい）を組み込んだ組換えバキュロウイルスを得る。
次いで、この組換えバキュロウイルスを宿主となる昆虫細胞にトランスフェクションさせる。トランスフェクションさせた宿主細胞を培養し、培養液を遠心等処理して上清を回収する。昆虫細胞のトランスフェクション及び培養方法の詳細は、上記した「６．２）～３）」に記載した通りである。

回収した上清から、常法により蛋白質を分離及び精製し、本発明のFactorG αサブユニットを得る。例えば、本発明に係る核酸分子αの塩基配列にHisタグ配列等のマーカーをコードする塩基配列を連結している場合、発現した蛋白質はHisタグ配列が連結している。そこで、抗His-Tag抗体を用いる常法でアフィニティー精製を行って、培養上清から蛋白質（FactorG αサブユニット）を精製することができる。

本法に用いられる核酸分子αの好ましい例としては、配列番号１、３、１７、１９、３３、３４、４１、又は４２のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。配列番号３３、３４、４１、又は４２のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。配列番号４１、又は４２で表される塩基配列を含有する核酸分子が特に好ましい。核酸分子の種類としては、cDNAがより好ましい。

２）本発明のFactorG βサブユニット（βi2、βi3、β2、β5、βC1、又はβC2）の取得
本発明のFactorG βサブユニットは、例えば以下のような方法で取得することが出来る。
本発明に係る核酸分子βを用い、上記「６．（１）共発現による取得方法」の「１）本発明に係る核酸分子を組み込んだ本発明に係る組換え体の調製」に記載された方法で、核酸分子β（（シグナルペプチドやHisタグ配列等のマーカーをコードする塩基配列を含んでいてもよい））を組み込んだ組換えバキュロウイルスを得る。
次いで、この組換えバキュロウイルスを宿主となる昆虫細胞にトランスフェクションさせる。トランスフェクションさせた宿主細胞を培養し、培養液を遠心等処理して上清を回収する。昆虫細胞のトランスフェクション及び培養方法の詳細は、上記した「６．２）～３）」に記載した通りである。

回収した上清から、常法により蛋白質を分離及び精製し、本発明のFactorG βサブユニットを得る。例えば、本発明に係る核酸分子βの塩基配列にHisタグ配列等のマーカーをコードする塩基配列を連結している場合、発現した蛋白質はHisタグ配列が連結している。そこで、抗His-Tag抗体を用いる常法で取得し、アフィニティー精製を行って、培養上清から蛋白質（FactorG βサブユニット）を精製することができる。

本法に用いられる核酸分子βの好ましい例としては、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５～４０、４３～４８、６８、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が挙げられる。配列番号３５～４０、４３～４８、６８、又は６９のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子がより好ましい。配列番号４３～４８、又は６８のいずれか一つで表される塩基配列を含有する核酸分子が特に好ましい。核酸分子の種類としては、cDNAがより好ましい。

３）ヘテロダイマーの取得
次いで、精製したFactorG αサブユニットAとFactorG βi2サブユニットを、それぞれBGフリーの10 mM MOPS緩衝液に溶解させた後、それぞれ等モルとなるように混合し、撹拌下に数時間～一昼夜反応させることにより、本発明のヘテロダイマーを得ることが出来る。
上記方法に用いられるFactorG αサブユニット及びFactorG βサブユニットを溶解させる溶媒としては、注射用蒸留水等の水、例えばpH 5.0～10.0、好ましくはpH 6.0～8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、MOPS緩衝液等が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10～500 mM、好ましくは10～300 mMの範囲から適宜選択される。

（３）化学合成による取得方法
また、本発明のヘテロダイマーは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。例えば、ルオレニルメチルオキシカルボニル法（Fmoc法）、t-ブチルオキシカルボニル法（tBoc法）等の通常の化学合成法により、本発明のヘテロダイマーを得ることができる。また、市販のペプチド合成機を用いて化学合成することもできる。

７．BGの測定方法
本発明のヘテロダイマーを用いてBGを測定する方法としては、いわゆる合成基質法が挙げられる。

合成基質法では、まず、BGを含有する試料と、本発明のヘテロダイマーと、合成ペプチド基質とを反応させる。BGが本発明のヘテロダイマーを活性化させ、活性化したヘテロダイマーが、そのプロテアーゼ活性によりプロクロッティングエンザイム（Proclotting enzyme）をクロッティングエンザイム（Clotting enzyme）に活性化させる。クロッティングエンザイムはその酵素活性により合成ペプチド基質を加水分解し、合成ペプチド基質から発色基が遊離して、発色を生じる。生じた発色を比色定量することにより、試料中のBG量を算出する。

本発明に係るBGの測定方法に用いられる本発明のヘテロダイマーの具体例、取得方法、及びその好ましい例は、上記「１．」～「６．」に記載した通りである。

本発明に係るBGの測定方法に用いられる合成ペプチド基質としては、例えばC末端にp-ニトロアニリン(pNA)のような発色基を結合させた合成ペプチド基質であって、クロッティングエンザイムの酵素作用により切断させて発色を生じるものが挙げられる。合成ペプチド基質は化学合成してもよいが、各種市販されているので、それを用いればよい。

具体的には、例えば、Boc-Leu-Gly-Arg-pNA、Boc-Glu-Gly-Arg-pNA、Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA、Boc-Thr-Gly-Arg-pNA等が挙げられる。

合成基質法の測定装置としては、例えばマイクロプレートリーダーや分光光度計が用いられる。

本発明に係るBGの測定方法の具体例は、以下の通りである。
すなわち、BGを含有する試料10～50μL（BGを0.1 pg～1 μg含有）を、本発明のヘテロダイマーを含有する溶液20～100μL（本発明のヘテロダイマーを0.1 ng～0.1 mg含有）、プロクロッティングエンザイム、及びBoc-Thr-Gly-Arg-pNA等の合成ペプチド基質 1μM～10 mMと4～40℃で3分～300分間反応させる。その後、反応液の例えば405 nm（測定波長）と492 nm（副波長）における吸光度を測定する。得られた測定値を、予め濃度既知のBG溶液について上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、測定値とBG量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中のBG量を求めることができる。

本発明に係るBGの測定方法に用いられる試料としては、例えば血液，血清，血漿，尿，リンパ，髄液，胸水，腹水等の臨床検体、医薬品、医療用具、食品等が挙げられるがこれらに限定されない。

尚、本発明に係るBGの測定は、用手法又は自動分析装置を用いた測定系で実施することが出来る。用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせ等については、特に制約はなく、適用する自動分析装置の環境、機種に合わせて、或いは、他の要因を考慮にいれて最も良いと思われる試薬類等の組み合わせを適宜選択して用いれば良い。

８．本発明のβ―グルカン測定用キット
本発明のβ―グルカン測定用キットとしては、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６、８、１０、１２、１４、又は１６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマーを含むものが挙げられる。

当該キット中の本発明のヘテロダイマーは、水や緩衝液に溶解させた溶液であっても、凍結乾燥品であっても構わない。本発明のヘテロダイマーを溶解させる溶媒としては、注射用蒸留水、例えばpH 5.0～10.0、好ましくはpH 6.5～8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、MOPS緩衝液等が好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10～500 mM、好ましくは10～300 mMの範囲から適宜選択される。

また、本発明のβ―グルカン測定用キットには、プロクロッティングエンザイム、及び／又は上記した合成ペプチド基質を構成試薬として含んでいてもよい。その具体例は上記した通りである。

また、本発明のβ―グルカン測定用キットの構成試薬には、更に緩衝剤やアルカリ土類金属塩等この分野で通常用いられるその他の適当な試薬類が含まれていてもよく、これら試薬類はいわゆる生化学反応等で使用されるものの中から適宜選択して用いればよい。

また、本発明のβ―グルカン測定用キットは、検量線作成用の標準BGを組み合わせたキットとしてもよい。該標準BGは、富士フイルム和光純薬(株)等によって製造された市販のBGの標準品を用いても、特開平08-075751号に記載の方法に従って製造されたものを用いても構わない。また、これら試薬キットにおける試薬類は凍結乾燥品であってもよい。

９．BGの除去方法
BGを含有する試料を、本発明のFactorG αサブユニット（αサブユニットA、又はαサブユニットB）と接触させて処理することで、試料からBGを除去することが出来る。
本法に用いられる本発明のFactorG αサブユニットの具体例は、上記「２．本発明のFactorG αサブユニット」の項で説明した通りである。
FactorG αサブユニットBがより好ましい。

具体的な処理方法としては、BGを含有する試料と本発明のFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体とを混合する方法、本発明のFactorG αサブユニットを担持した充填剤を充填したカラムに、BGを含有する試料を通液する方法等が挙げられる。また、カラム法としては、一般の液体クロマトグラフィー法に準じて行われる方法が挙げられる。
BGを含有する試料として細胞や細菌等の培養用培地を用いる場合には、「BGを含有する試料と本発明のFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体とを混合する方法」が好ましい。

「BGを含有する試料と本発明のFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体とを混合する方法」を例にとり、以下により具体的に説明する。
先ず、試料を本発明のFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体と混合し、好ましくは振とうする。又は、試料を、本発明のFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体を懸濁させた溶媒と、好ましくは撹拌させながら混合する。その後、試料と本発明のFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体を分離すれば、試料からBGを除去することが出来る。

当該処理を行う場合のFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体の量は、多いほど試料中の夾雑物を十分に除くことができるが、あまり多くても無駄であり、経済的でない。そのため、経済的な量を考慮すると、例えば、FactorG αサブユニットを担持した不溶性担体と試料との使用量比は、1:1000～1:3、好ましくは1:10～1:3程度であればよい。尚、該比率は、重量比（W/W）、容量比（V/V）、容量／重量比（V/W）のいずれでも良い。

また、試料とFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体とを接触させる時間は、試料中のBGがFactorG αサブユニットと結合するのに十分な時間であれば良く、例えば５分～１日、好ましくは１～８時間である。

試料とFactorG αサブユニットを担持した不溶性担体とを分離するには、例えばろ過、デカント等の適当な方法を用いればよい。

上記の方法に用いられる、本発明のFactorG αサブユニットを固定化する不溶性担体としては、セファロース，ポリスチレン，ポリプロピレン，ポリアクリル酸，ポリメタクリル酸，ポリアクリルアミド，ポリグリシジルメタクリレート，ポリ塩化ビニール，ポリエチレン，ポリクロロカーボネート，シリコーン樹脂，シリコーンラバー等の合成高分子化合物、例えば多孔性ガラス，スリガラス，セラミックス，アルミナ，シリカゲル，活性炭，金属酸化物等の無機物質等が挙げられる。セファロース等が好ましい。

また、不溶性担体の形態としては、ビーズ、微粒子、ラテックス粒子等の形態のものが挙げられるが、ビーズ状のものが使いやすいので好ましい。また、その粒径は特に限定されない。

市販のセファロースビーズとしては、例えば、CNBr-activated Sepharose 4B (GEヘルスケア社製）等が挙げられる。

不溶性担体にFactorG αサブユニットを固定化させる方法としては、FactorG αサブユニットと不溶性担体とを接触させることによってなされればよく、特に限定されない。
また、市販の不溶性担体を用いる場合には、その取扱説明書で推奨されている固定化方法に従って、FactorG αサブユニットを不溶性担体に固定化させればよい。

FactorG αサブユニットを不溶性担体に担持する方法は、具体的には例えば、本発明のFactorG αサブユニットを通常0.1μg／mL～20mg／mL、好ましくは1μg／mL～5mg／mLの範囲で含む溶液と、前処理したCNBr-activated Sepharose 4B (GEヘルスケア社製） 0.05～2gを含有する溶液とを接触させ、適当な温度で所定時間、好ましくは転倒混和しながら反応さることによりなされる。未反応活性基を不活化するために、更に新しい溶媒に再懸濁させてインキュベーションする処理を行ってもよい。

昆虫細胞用培地には通常酵母抽出液が含まれているため、BG汚染されている。また、通常の組換え蛋白質発現用の動物細胞用培地、例えば、FreeStyle^TM 293 Expression MediumやFreeStyle^TM CHO Expression Mediumも、BGで汚染されていることが知られている。本発明に係るBGの除去方法によればこれらの培地からBGを除去し、BGの汚染を除去することが出来る。
また、本発明に係るBGの除去方法によれば、培地中に共存する、FactorGを用いたBGの測定の阻害因子を除去することが出来る。

更に本発明に係るBGの除去方法は、培地のBG汚染を除去できるのみならず、以下の用途でも応用することが出来る。
即ち、例えば培養細胞等を用いた実験に於て、培養細胞がBGの影響を受け易い性質のものであるとき、使用試薬のBGの汚染を排除するために用いることができる。

本発明のBG除去用キットとしては、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットを含むものが挙げられ、上記除去方法に用いることができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。

実施例１．本発明のヘテロダイマーの取得－１
＜1. 次世代シークエンサーを用いたカブトガニ由来FactorG RNAの解析＞
以下、「次世代シークエンサー、Next Generation Sequencer」を「NGS」と略記する。
尚、ここで言うNGSは、次世代シークエンサー機器そのものだけではなく、次世代シークエンサーを用いて行われる、サンプル調製から数百万ものシーケンシング反応が並行して実行されることにより配列決定の処理量が増大したシーケンシング手法、その後のPC上で行われる配列解析を含むシステム全般をも示す。

1-1. Total RNAの回収
RNA抽出用試薬ISOGEN（富士フイルム和光純薬(株)製）を用い、その製品付属のプロトコルに従って、下記の通りの方法で、Limulus属カブトガニ血球細胞よりtotal RNAを回収した。

まず、すり鉢内でLimulus属カブトガニ（Limulus polyphemus、アメリカ産）血球細胞を液体窒素で凍結後、すり潰し、破砕した。そこにISOGEN (富士フイルム和光純薬(株)製)を加えて、破砕物を懸濁させ、RNAを抽出させた。

得られた抽出液をチューブに移し、室温で5分間インキュベートした後、40%(v/v)になるようにクロロホルムを添加した。次いで15秒間攪拌し、更に室温で3分間インキュベートした。その後、抽出液を、4℃、12000 x gで15分間遠心分離した後、水相を新しいチューブに移した。次に、3.5 mLのイソプロパノールを添加・攪拌後、室温で10分間インキュベートした。次いて、抽出液を4℃、12000 x gで10分間遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を7 mLの70％エタノールで洗浄し、乾燥して、RNA沈殿物を得た。得られたRNA沈殿物を、70 μL滅菌水に溶解した。得られたRNA水溶液の吸光度を測定して、得られたtotal RNAの濃度を測定した。total RNAの濃度は919.8 ng/μLであり、Limulus属カブトガニ血球細胞 から64 μgのtotal RNAが得られた。

1-2. NGSによるFactorG サブユニットをコードするDNA配列の確認
上記1-1で得られたLimulus属カブトガニの血球細胞由来Total RNAを用い、TruSeq Stranded mRNA sample Prep kit(イルミナ(株)製)を用いて、Kitに記載の説明書に従って、シーケンスライブラリーを作製した。作製したシーケンスライブラリーを、次世代シーケンサーであるHiSeq 2500を用いた分析に付した。

HiSeq 2500を用いた分析により得られたシーケンスデータからアダプター配列とクオリティ値の低い塩基をトリム処理した後、Trinityソフトウェアを用いた常法によりアッセンブルを行った。その後、アッセンブル処理で得られたコンティグ配列のORFの予測を行い、ライブラリーのシーケンスがコードするアミノ酸配列を決定した。
次いで、上記アッセンブルで得られたアミノ酸配列と、Tachypleus属 FactorG αサブユニットのアミノ酸配列（Accession No.BAA04044.1(Protein ID)、配列番号５２、DNA配列：配列番号５１）もしくはTachypleus属 FactorG βサブユニットのアミノ酸配列（Accession No. BAA04045.1(Protein ID)）との相同検索(blastp)を行った。

Tachypleus属 FactorG αサブユニットをコードするアミノ酸配列との相同検索の結果、Tachypreus属FactorG αサブユニットをコードするアミノ酸配列と相同性がある２種類のアミノ酸配列(id: TR44185 c2_g1_i1、id: TR44185 c2_g1_i2）と、それをコードする２種類のDNA配列(配列番号５３、配列番号５４)が確認された。
取得した配列番号５３及び配列番号５４のDNA配列は終止コドンを含まないため、Limulus属FactorG αサブユニットの全アミノ酸配列ではなく、そのN末端側の部分配列をコードしていると推定された。

また、Tachypleus属 FactorG βサブユニットをコードするアミノ酸配列との相同検索の結果、Tachypreus属FactorG βサブユニットのアミノ酸配列と相同性がある２種類のアミノ酸配列とDNA配列、すなわちid: TR39550_c0_g1_i2（アミノ酸配列：配列番号２２、DNA配列：配列番号２１）、及びid: TR39550_c0_g1_i3(アミノ酸配列：配列番号２４、DNA配列：配列番号２３）が確認され、２種類ともLimulus属FactorG βサブユニットのアミノ酸配列をコードしているDNA配列であると推定された。

公知のTachypleus属FactorG αサブユニットとTachypleus属FactorG βサブユニットのホモログの存在については報告が無い。しかし以上の結果から、NGSの解析結果から、Tachypleus属FactorG αサブユニットとTachypleus属FactorG βサブユニットに対して、少なくともそれぞれ2種以上のホモログが存在することが判明した。

＜2. FactorG αサブユニット 全長塩基配列の取得＞

上記＜1.＞で確認されたリムルス属FactorG αサブユニット由来の２種類のアミノ酸配列及びDNA配列を有するFactorG αサブユニットについて、以下の方法で全DNA配列を特定した。

まず、上記1-2で得られた２種類のアミノ酸配列をコードするDNA配列（配列番号５３、配列番号５４）の、N末端側をコードするDNA配列部分（開始コドン配列を含む）の配列をもとに、Forwardプライマーとして、下記のプライマーF1を設計し、合成した。

プライマー F1 5'-GATTACGCCAAGCTTgccagaatgtcgattccatc-3'(配列番号５５)
大文字：ベクターへのin-fusion反応時に用いる付加配列
小文字：配列番号５３及び配列番号５４由来の配列

2-1. 3’RACE法によるPCRフラグメントの取得。
SMARTer^TM RACE 5'/3' Kit （タカラバイオ(株)製）を用い、上記1-1で得られたLimulus属カブトガニの血球細胞由来Total RNAを1st strand cDNAに逆転写し、cDNAライブラリーを作製した。
本kit付属のUPM short primer mix、上記で得られたプライマー F1、及びPrimeSTAR^TM Max DNA Polymerase （タカラバイオ(株)製）を用いて、PCRを行った。PCR溶液の組成を下記表３に、PCR条件を下記表４に、それぞれ示す。

アガロースSをTAE bufferに1.0(w/v)%になるように溶解して固めたゲルに、上記PCRで得られたPCR反応液をアプライし、100V、50分間、TAE buffer中でアガロース電気泳動を行った。泳動終了後、5000倍希釈したSAFELOOK^TM プレグリーン核酸染色液（富士フイルム和光純薬(株)製）で30分染色後、LEDトランスイルミネーターゲルみえーるでバンドの位置を観察した。

約2.2 kbpサイズのバンドを切り取り、NucleoSpin^TM Gel and PCR Clean-up （タカラバイオ(株)製）を用いて、PCRフラグメントを取得し、精製した。

2-2. FactorG αサブユニットの3’側フラグメント入りベクターの作製。
上記2-1で得られたPCRフラグメントとLinearized pRACEベクター（タカラバイオ(株)製）と5×In-Fusion HD Enzyme Premix（タカラバイオ(株)製）とを混合し、50℃で15分反応させ、in-fusion反応溶液を得た。得られたin-fusion反応溶液2.5 μLを、50 μL ECOS^TM Competent E. coli DH5 α（富士フイルム和光純薬(株)製）に添加し、氷上で5分インキュベートした。42℃で45秒ヒートショック処理した後、100 μg/mLアンピシリン入りLB寒天培地に塗布した。37℃で一晩インキュベートし、コロニーを形成させた。

形成したコロニーを約3 mLの100 μg/mLアンピシリン入りLB培地にピックアップし植菌し、37℃で一晩、振とう培養（200 rpm）を行った。培養液が懸濁していることを確認し、10000 x g, 1分で培養液を遠心し、上澄みを除去し、菌体（培養液約3 mL分相当）を取得した。得られた菌体から、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen社)を用い、キットに添付の説明書に従って、プラスミドを抽出した。

2-3. FactorG αサブユニットの3’側フラグメントのサンガーシーケンス解析
上記2-2で得られたプラスミドを、M13-20及びM13-P5（ユニバーサルプライマー、タカラバイオ(株)製）と混合して、サンガーシーケンス解析を行った。

M13-20 Forwardプライマー：5'-gtaaaacgacggccagt-3'（配列番号５６）
M13-P5 Reverse プライマー：5'-caggaaacagctatgac-3'（配列番号５７）

得られたシーケンスデータをトリミングした結果、配列番号５８で表される塩基配列が確認された。この配列番号５８で表される塩基配列を解析した結果、終始コドン及びポリAシグナルとポリAサイトの配列が確認された。このことより、配列番号５８で表される塩基配列は、上記＜1.＞で確認された２種類のアミノ酸配列の一方をコードするDNA配列の3’末端側の配列であると判断された。さらに、この配列番号５８の塩基配列を、上記＜1.＞で確認された２種類のDNA配列である配列番号５３の塩基配列及び配列番号５４の塩基配列とコンティグを実行した。その結果、配列番号５８の塩基配列は、配列番号５４の塩基配列と100%重なる部位が確認されたため、PC上で全長を構築することが可能であることがわかった。そこで、配列番号５８の塩基配列のトリミングとコンティグを、Vector NTIソフトウェア(Invitrogen社)によって行った。
以上の結果、上記＜1.＞で確認された２種類のアミノ酸配列のうち１種類のFactorG αサブユニットの全長アミノ酸配列をコードしている全長DNA配列が確認された。

しかし、上記＜1.＞におけるNGSの解析結果では2クローン存在することが想定されたが、ここでは１クローンしか塩基配列が取得できなかった。
そこで、上記＜1.＞で確認された２種類のDNA配列である配列番号５３及び配列番号５４の塩基配列をもとに、開始コドンを含むプライマーF2を設計し、配列番号５８の3’末端側の塩基配列をもとに終始コドンを含むプライマーR2を設計し、合成した。

プライマーF2 5'-TATTTACAATCCATGGCAatgtttctgtgttatgttg-3' (配列番号５９)
大文字：ベクターへのin-fusion反応時に用いる付加配列
小文字：配列番号５３及び配列番号５４由来の配列
プライマーR2 5'-GGAGCTCCTGCGGCCGCctaaacctttgtaatcttaatc-3' (配列番号６０)
大文字：ベクターへのin-fusion反応時に用いる付加配列
小文字：配列番号５８由来の配列

次いで、以下の方法で改めてcDNA全長を取得する試験を行った。
上記2-2で得られたプラスミドを鋳型とし、プライマーF2とプライマーR2を用い、KOD DNA polymerase（東洋紡(株)製）を用いてPCRを行った。PCR溶液の組成を表５に、PCR条件を表６にそれぞれ示す。

PCR反応終了後、PCR反応溶液をアガロース電気泳動し、常法によりバンドの位置を確認した。約2.2 kbpサイズのバンドを切り取り、NucleoSpin^TMGel and PCR Clean-up （タカラバイオ(株)製）を用いて、PCRフラグメントを取得し、精製した。アガロース電気泳動、染色、及びバンドの観察は、上記「2-1. 3’RACE法によるPCRフラグメントの取得」の項に記載の方法と同様の方法で行った。

上記で得られたPCRフラグメントと、制限酵素NcoIとNotIで処理したLinearized pIEx/Bac^TM-1ベクター（Novagen社）と、5×In-Fusion HD Enzyme Premix（タカラバイオ(株)製）を混合し、50℃で15分反応させ、in-fusion反応溶液を得た。得られたin-fusion反応溶液2.5 μLを50 μL ECOS^TM Competent E. coli DH5 α（富士フイルム和光純薬(株)製）に添加し、氷上で5分インキュベートし、42℃で45秒ヒートショック処理した後、100 μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地に塗布した。37℃で一晩インキュベートし、コロニーを形成させた。
コロニー細胞からのプラスミドの取得は、上記「2-2.FactorG αサブユニットの3’側フラグメント入りベクターの作製」の項に記載の方法と同様の方法で行った。

下記の、pIEx/Bac-1ベクター側のForwardプライマー、及びReverseプライマーを設計した。このForwardプライマーとReverseプライマーを、上記で得られたプラスミドと混合して、サンガーシーケンス解析を行った。

pIEx/Bac-1ベクター側のForwardプライマー: cgcgttggttttagagggca （配列番号６１）
pIEx/Bac-1ベクター側のReverseプライマー: acgtcgccaactcccattgt （配列番号６２）

得られたシーケンスデータをトリミングし、コンティグを行った。トリミングとコンティグはVector NTIソフトウェア(Invitrogen社)によって行った。その結果、上記＜1.＞で確認された２種類のLimulus属FactorG αサブユニットの全長アミノ酸配列をコードする全長DNAの塩基配列を取得した。取得された塩基配列は、配列番号１７で表される塩基配列、及び配列番号１９で表される塩基配列である。

＜3. FactorG βサブユニット の配列確認＞
上記の「1-2.本発明のFactorGサブユニットのアミノ酸配列及び塩基配列等の取得」の工程で、FactorG βサブユニットβi2及びFactorG βサブユニットβi3の全長cDNAの塩基配列、すなわち配列番号２１及び配列番号２３で表される塩基配列を取得した。確認のため、この塩基配列の5’末端側と3’末端側の塩基配列をもとに、下記のプライマーを設計した。

プライマーF3 5'-AACCAAGTGACCatgaaaaccactctatggacttt-3' (配列番号６３）
プライマーR3 5'-GATGGTGGTGCTCGAGTtaaaatactggcacaacttc-3' ） (配列番号６４）

3-1. FactorG βサブユニット配列の全長DNA配列の取得
上記1-1で得られたLimulus属カブトガニの血球細胞由来のTotal RNAとSuperScript^TM VILO^TM Master Mix（Invitrogen社）を用い、常法によりcDNA ライブラリーを作製した。
そのcDNAライブラリーを鋳型として用い、プライマーF3及びプライマーR3を用いて、PCRを行った。PCR溶液の組成を下記表７に、PCR条件を下記表８に、それぞれ示す。

3-2. FactorG βサブユニットの全長cDNA入りトランスファーベクターの作製
上記3-1で得られたPCRフラグメントと、制限酵素NcoIとXhoIで処理したLinearized pIEx^TM-4ベクター（Novagen社）と、5×In-Fusion HD Enzyme Premix（タカラバイオ(株)）を混合し、50℃で15分反応させ、in-fusion反応溶液を得た。得られたin-fusion反応溶液 2.5 μLを50 μL ECOS^TM Competent E. coli DH5 α（富士フイルム和光純薬(株)製）に添加し、氷上で5分インキュベートし、42℃で45秒ヒートショック処理した後、100 μg/mLアンピシリン入りLB寒天培地に塗布した。37℃で一晩インキュベートし、コロニーを形成させた。コロニー細胞からのプラスミドの取得は、上記「2-2.FactorG αサブユニットの3’側フラグメント入りベクターの作製」の項に記載の方法と同様の方法で行った。

3-3. FactorG βサブユニットの全長cDNA配列のサンガーシーケンス解析
上記3-2で得られたシークエンスデータの取得は、pIEx/Bac-1ベクター側のForwardプライマー（配列番号６１）及びpIEx/Bac-1ベクター側のReverseプライマー（配列番号６２）を用い、上記「2-3. FactorG αサブユニットの3’側フラグメントのサンガーシーケンス解析」に記載の方法と同様の方法で行った。
得られたシーケンスデータを、Vector NTIソフトウェア(Invitrogen社)を用いてトリミングし、コンティグを行った。
その結果、Limulus属FactorG βサブユニットをコードする６種類のDNA配列、すなわち配列番号２１、２３、２５、２７、２９、及び３１で表される塩基配列を取得した。

＜4. 組換えバキュロウイルスベクターの作製＞
4-1.トランスファーベクターの構築
前項＜２．＞及び＜３．＞で確認された塩基配列である配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１を、それぞれアミノ酸配列へ翻訳した。

得られたアミノ酸配列を解析した結果、これらのアミノ酸配列のＮ末端側にシグナルペプチド配列の領域があることが確認された。

翻訳した、シグナルペプチドを含むFactorG αサブユニットのアミノ酸配列に、PAタグ配列(配列番号６５：GVAMPGAEDDVV)及び6×Hisタグ配列をC末端側に連結したアミノ酸配列とそれらのタグを連結しないアミノ酸配列を設計した。設計したアミノ酸配列の蛋白質を昆虫細胞で発現させるために、遺伝子配列のコドンを最適化した。

また、翻訳したFactorG βサブユニットのアミノ酸配列に、PAタグ配列及び6×Hisタグ配列をC末端側に連結したアミノ酸配列を設計した。設計したアミノ酸配列の蛋白質を昆虫細胞で発現させるために、遺伝子配列のコドンを最適化した。

下記表９に、以上の操作により得られた、下記の情報をまとめて示す。但し、表９に記載された各アミノ酸配列及び塩基配列は、タグ配列を含まない。
尚、下記表９における各項目は、それぞれ以下の意味である。
・サブユニット名：FactorGサブユニット蛋白質の名称、
・アミノ酸配列番号：FactorGサブユニット蛋白質アミノ酸配列の配列番号（シグナルペプチド配列を除く）、
・塩基配列番号：FactorGサブユニット蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列の配列番号（シグナルペプチド配列をコードする塩基配列を除く）、
・アミノ酸配列番号(シグナル配列含む)：FactorGサブユニット蛋白質アミノ酸配列の配列番号（シグナルペプチド配列を含む）、
・塩基配列番号(シグナル配列含む)：FactorGサブユニット蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列の配列番号（シグナルペプチド配列をコードする塩基配列を含む）、
・最適化した塩基配列番号：FactorGサブユニット蛋白質を昆虫細胞で発現させるために最適化した塩基配列の配列番号（シグナルペプチド配列をコードする塩基配列を除く）、
・塩基配列番号(シグナル配列含む)：FactorGサブユニット蛋白質を昆虫細胞で発現させるために最適化した塩基配列の配列番号（シグナルペプチド配列をコードする塩基配列を含む）。

GENEWIZ社に委託して、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、又は４８で表される塩基配列を有するcDNAを合成し、そのcDNAをpIEx/Bac-1ベクター(Novagen社)のNcoI-NotIサイトへ挿入し、トランスファーベクターを取得した。

4-2. コトランスフェクション
25 cm²フラスコに播いた1.0 x 10⁶ 個のSf9細胞（invitorgen社）に、上記4-1で得られたトランスファーベクター各種 2 μg、Linear AcNPV DNA 90 ng及びScreenFect^TM A plus（富士フイルム和光純薬(株)製）3 μLを含む無血清PSFM-J1培地（富士フイルム和光純薬(株)製）100 μLを添加した。28℃で7日間静置培養後に培養上清を回収し、組換えバキュロウイルスベクター溶液とした。
得られた組換えバキュロウイルスベクターは、FactorG αサブユニット A、FactorG αサブユニット B、FactorG βサブユニットβC1、FactorG βサブユニットβi2、FactorG βサブユニットβi3、FactorG βサブユニットβ2、FactorG βサブユニットβ5、又はFactorG βサブユニットβC2のいずれか一つのアミノ酸配列をコードするcDNAを保持している。
得られた組換えバキュロウイルスベクターを含有する溶液を「コトランスフェクション溶液」として用いた。

＜5. BG除去済み無血清PSFM-J1培地の作製＞
ここで、以下の方法で、本発明のFactorG αサブユニット Bを担持したビーズを用い、昆虫細胞用培地を処理し、培地性能を維持した状態でBGを除去した細胞培養用培地を作製した。

5-1. FactorG αサブユニットBの作製
上記4-1及び上記4-2に記載の方法で得られた、PAタグ配列(配列番号６５：GVAMPGAEDDVV)及び6×Hisタグ配列をC末端側に連結したFactorG αサブユニットBをコードするcDNA（配列番号６６）を有する組換えバキュロウイルスベクター溶液（コトランスフェクション溶液）を用い、以下の操作を行った。

昆虫細胞 expresSF+^TM（プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）を、1.5 x 10⁶ 個/mlとなるように無血清培地PSFM-J1（pH5.5～6.2、富士フイルム和光純薬(株)製）で希釈し、2000 ml 三角フラスコに800 ml用意した。これに上記で得コトランスフェクション溶液を4 ml加え、130 rpm、27℃で3日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、4℃で60分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、FactorG αサブユニットB発現培養上清とした。

5-2. FactorG αサブユニット Bの精製
上記5-1で発現した蛋白質は、Ｃ末端側に、6×Hisタグ配列が連結している。そこで、cOmplete^TM His-Tag Purification Resin(Sigma-Aldrich社)を使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じてアフィニティー精製を行って、上記5-1で得られたFactorG αサブユニットB発現培養上清からFactorG αサブユニットB蛋白質を精製した。

5-3. FactorG αサブユニットBのビーズ固定
CNBr-activated Sepharose 4B（GE社）1gを1 mM HClで懸濁し、200 mL で洗浄した。洗浄済みCNBr-activated Sepharose 4B 4 ml netを、カップリングバッファー（200 mM NaHCO₃, 500 mM NaCl, pH 8.3）に溶解した、上記5-2で得られたFactorG αサブユニットB 16 mgと混合して、4℃、一晩、転倒混和しながらインキュベートした。未反応活性基を不活化するためにビーズを回収し、Tris-HCl buffer, pH 8.0で再懸濁し、2時間、4℃でインキュベーションした。以上の方法で、FactorG αサブユニットB固定化ビーズの懸濁液を得た。

5-4. 無血清PSFM-J1培地からのBG除去
1000 mL 無血清PSFM-J1培地に、上記5-3で得られたFactorG αサブユニットB固定化ビーズの懸濁液0.5 mL netを加え、撹拌振とう機で、室温で4時間撹拌した。その後、0.22μMのPESフィルターに通して、ビーズの除去と滅菌処理を行った。

5-5. BG除去の確認
１）BG除去の確認１－BGの除去
5-4で得られたFactorG αサブユニットB固定化ビーズ処理培地、又は未処理培地を用い、下記表１０に記載の組成の反応溶液を調製し、反応用プレートに順次添加した。次いで、37℃で200分反応を行い、反応終了後、0.04％亜硝酸ナトリウム（1.0M塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸アンモニウム、0.07％Ｎ-1-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（14% Ｎ-1-メチル-2-ピロリドン溶液）を各々0.05mL順次添加してジアゾカップリングし、マイクロプレートリーダー(機器名：Spark(Tecan社製))により540nm（対照波長：630nm）で吸光度を測定した。
尚、ここで用いているカブトガニ由来 天然FactorG含有溶液は、特許第2564632号に記載の方法に従い、粗LALより分画したフラクションを用いた。

結果を図１に示す。
図１から明らかな通り、無血清PSFN-J1培地には350 pg/mL以上のBGが含まれていたが、FactorG αサブユニットBで処理すると、BG濃度は数pg/mL以下となり、検出限界付近の値となった。
以上のことから、本発明のFactorG αサブユニットBで培地を処理することにより、BGを検出限界まで除去できることがわかった。

２）BG除去の確認２―阻害因子の除去
レンチナン（以下LNT）を注射用水で0、5、10、30、60 pg/mLになるように溶解し、「検量線用溶液」とした。すなわち、「検量線用溶液」は培地を含まない。

また、上記5-4の方法でFactorG αサブユニットB固定化ビーズ処理した無血清PSFM-J1培地又は未処理無血清PSFM-J1培地に、LNTを0 、10、30 pg/mLになるように添加した溶液を調製した。0 pg/mLには注射用水を用いた。調製したこの溶液を「調製済み測定対象培地」とした。尚、LNTはレンチナン静注用1 mg「味の素」を1 N NaOHで溶解して調製したものを用いた。

次に、下記表１１に記載の組成の反応溶液を調製し、反応用プレートに順次添加した。次いで、37℃で200分反応を行い、反応終了後、0.04％亜硝酸ナトリウム（1.0M塩酸溶液）、0.3％スルファミン酸アンモニウム、0.07％Ｎ-1-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（14% Ｎ-1-メチル-2-ピロリドン溶液）を各々0.05mL順次添加してジアゾカップリングし、マイクロプレートリーダー(機器名：Spark(Tecan社製))により540nm（対照波長：630nm）で吸光度を測定した。
表１１で用いているカブトガニ由来 天然FactorG含有溶液は、特許第2564632号に記載の方法に従い、粗LALより分画したフラクションを用いた。

結果を図２にまとめて示す。
図２において、--◇--は検量線用溶液を用いて得られた結果を、―▲―は本発明のFactorG αサブユニットBを用いてBG除去処理したPSM-J1培地を用いて得られた結果を、―◆―は未処理のPSM-J1培地を用いて得られた結果を、それぞれ示す。

図２より、未処理の無血清PSFM-J1培地培地を用いて得た検量線（◆、y=0.004X+0.1266）の傾き（0.004）の方が、検量線用溶液を用いて得た検量線（◇、y=0.0071X+0.032）の傾き（0.007）より低値になった。この結果より、無血清PSFM-J1培地中にFactorGの阻害因子が存在していることが示唆された。
一方、本発明のFactorG αサブユニットBビーズを用いてBG除去処理を行った無血清PSFM-J1培地を用いて得た検量線（▲、y=0.0065X+0.0048）の傾きは0.065となり、検量線用溶液を用いて得た検量線の傾き（0.007）に近似した値となった。この結果より、本BG除去処理方法によってFactorGを用いたBG測定に影響を及ぼす阻害因子も取り除かれていることが示唆された。

なお、データは示していないが、昆虫細胞用培地からBG除去を行うためにBG活性を除去する方法として従来より行われている技術である、オートクレーブ処理(121℃, 20分)、ポジダインフィルターを用いた処理（ポール社製）、Zeta Plus^TM 吸着デプスフィルターを用いた処理を行ったが培地性能を維持しながらBGを除去することはできなかった。
以上のことから、本発明のGactorG αサブユニットBを用いて培地中のBGを除去する方法は、培地性能を維持しながら、従来よりも簡便な方法でBGを除去することが出来る方法として、極めて優れた方法であることがわかった。

＜6. 組換えFactorG αサブユニットとβサブユニットの組み合わせ確認試験＞
6-1. 発現試験用組換えバキュロウイルス溶液の作製
昆虫細胞 expresSF+^TM（プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）を、1.5 x 10⁶ cells/mlとなるようにBG除去済み無血清培地PSFM-J1（pH5.5～6.2）で希釈し、125 ml 三角フラスコに50 ml用意した。
これに上記4-2で得られた各コトランスフェクション溶液を0.250 ml加え、130 rpm、27℃で3日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、4℃で30分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、「発現試験用の組換えバキュロウイルス溶液」とした。
尚、上記で用いた「BG除去済み無血清培地PSFM-J1」は、上記「5. BG除去済み無血清PSFM-J1培地の作製」の方法で得た。

6-2. 発現試験用組換えバキュロウイルス溶液のタイター測定
上記6-1で作製した発現試験用の組換えバキュロウイルス溶液の力価を組換えFactorG αサブユニットAとβサブユニットβi2を代表とし、以下の方法で測定した。

2.0 x 10⁶ cellsのSf9細胞（Invtrogen社）を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で1時間静置して細胞を底面に接着させた。
上記6-1で得られた「FactorG αサブユニットA（PAタグ配列及び6×Hisタグ配列をC末端側に連結していないもの）をコードするcDNA」を有する発現試験用の組換えバキュロウイルスの溶液、又は「FactorG βサブユニットβi2をコードするcDNA」を有する発現試験用の組換えバキュロウイルスの溶液を、それぞれ無血清PSFM-J1培地で10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ1 mlずつSf9細胞に添加し、室温で1時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有する無血清PSFM-J1培地4 ml を流し込んで、28℃で7日間静置培養した。7日間後のプレートに0.03%ニュートラルレッド溶液を添加し3時間静置し、染色した。プラーク（透明になっている箇所）数をカウントして、タイター値を算出した。

得られた結果は以下の通りである。
FactorG αサブユニットAをコードするcDNAを有する組換えバキュロウイルス：2.1×10⁸ pfu/mL
FactorG βサブユニットβi2をコードするcDNAを有する組換えバキュロウイルスi2： 1.4×10⁸ pfu/mL

6-3. 組換えFactorG αサブユニットとβサブユニットの共発現
昆虫細胞 expresSF+^TM（プロテイン・サイエンス（Protein Science社製）を、1.5 x 10⁶ cells/mlとなるようにBG除去済み無血清培地PSFM-J1（pH5.5～6.2）で希釈し、125 ml 三角フラスコ12本に50 mlずつ用意した。

これらに、上記6-1で調製した発現試験用組換えバキュロウイルス溶液から、FactorG αサブユニット発現用のバキュロウイルスの一種類をVOI=1/400の割合で、及びFactorG βサブユニット発現用のバキュロウイルスの一種類をVOI=1/100の割合で加え、旋回培養130 rpm、27℃で2日間振盪培養した。培養後、培養液を、3,000 x g、4℃で30分間遠心し、上清と沈殿に分画した。上清は凍結させ保存した（VOI＝volume of infection）。
上記で用いた「BG除去済み無血清培地PSFM-J1」は、上記「5. BG除去済み無血清PSFM-J1培地の作製」の方法で得た。
尚、ここで使用したFactorG αサブユニット発現用のバキュロウイルスが有するDNAは、PAタグ配列及び6×Hisタグ配列をC末端側に連結していないものである。

上記のVOIで感染させた場合、多重感染度（multiplicity of infection、以下MOIとする。）で換算すると、FactorG αサブユニットをコードするcDNAを有する発現用のバキュロウイルス：FactorG βサブユニットをコードするcDNAを有する発現用のバキュロウイルス=0.4:0.9の比率に概ねなる。

ここで使用したFactorG αサブユニットをコードするcDNAを有する発現用のバキュロウイルスは、FactorG αサブユニットA又はBをコードするcDNA（配列番号４１又は配列番号４２）を有する。
また、FactorG βサブユニットをコードするcDNAを有する発現用のバキュロウイルスは、FactorG βサブユニットβi2、βi3、β2、β5、βC1、又はβC2をコードするcDNA（配列番号４３、４４、４５、４６、４７、又は４８）を有する。

＜7. 組換えFactorG αサブユニットとβサブユニットの発現確認（ウェスタンブロッティング）＞
上記6-2で得られた発現試験用の組換えバキュロウイルス溶液（FactorG αサブユニットA発現試験用の組換えバキュロウイルス溶液、又はFactorG βサブユニットβi2発現試験用の組換えバキュロウイルス溶液） 90 μLと試料用緩衝液(3-メルカプト-1,2-プロパンジオール含有)(×4)（富士フイルム和光純薬(株)製）30 μLを混合して、5分間熱処理した。熱処理した試料をイージーセパレーターにセットしたスーパーセップ^TMエース、10-20%ゲル（富士フイルム和光純薬(株)製）に15 μLアプライした。

イージーセパレーター（富士フイルム和光純薬(株)製）をSDS-PAGE バッファー, pH8.5（富士フイルム和光純薬(株)製）で満たし、250CV、60分通電させた。泳動後、SDS-PAGEしたゲルをメタノールで親水化したクリアトランス^TM SP PVDFメンブレン, 疎水性, 0.2 μm（富士フイルム和光純薬(株)製）の上に載せて、アクアブロット^TM 1×高効率転写バッファーで浸したろ紙で上下から挟んだ。1 mA/cm² CA、60分通電させた。

通電後、FactorG αサブユニットA発現試験用の組換えバキュロウイルス溶液を用いた場合は、3%スキムミルク（60分）（富士フイルム和光純薬(株)製）、抗FactorG αサブユニット抗体（60分）、抗マウスIgG抗体（HRP結合）（60分）（富士フイルム和光純薬(株)製）で順に振とうさせた。反応後は、イムノスター^TM ゼータで発光させてAI-600QCにて検出を行った。

また、FactorG βサブユニットβi2発現試験用の組換えバキュロウイルス溶液を用いた場合は、通電後、3%スキムミルク（60分）（富士フイルム和光純薬(株)製）、抗6xHisタグ抗体（HRP結合）（富士フイルム和光純薬(株)製）を順に振とうさせた。反応後は、イムノスター^TM ゼータで発光させてAI-600QCにて検出を行った。
その結果、rFactorG αサブユニットは約75 kDa、rFacotrG βサブユニットは約40 kDa付近の位置にバンドが確認された。

以上のことから、FactorG αサブユニット及び本発明のFactorG βサブユニットが発現したことが確認された。

実施例２．本発明のヘテロダイマーのグルカン依存性プロテアーゼ活性確認試験
実施例１の6-3で得られた、本発明のFactorG αサブユニットとFactorG βサブユニットの共発現物が含まれる上清を試料として用い、得られた共発現物のグルカン依存性プロテアーゼ活性の評価を、以下の方法で行った。

すなわち、下記表１２に記載の組成の反応溶液を調製し、反応用チューブに順次添加した。次いで、37℃で200分反応を行い、ELx808(BioTek製）を用いて、405 nm(測定波長)と492 nm（副波長）における吸光度を測定した。LNT添加と無添加（ブランク）における吸光度の差を、表１３に示す。

また、比較として、Limulus polyphemus由来のFactorG αサブユニットのアミノ酸配列（BAJ10550.1(protein_id)、配列番号５０）をコードするGenbank Accession No. AB547712の塩基配列（配列番号４９）を有するcDNAを調製し、このcDNAを用いる以外は実施例１と同様の方法で、Limulus polyphemus由来のFactorG αサブユニットと本発明のFactorG βサブユニットとを共発現させ、Limulus polyphemuＴａｇs由来のFactorG αサブユニット(AB547712)と本発明のFactorG βサブユニットとのヘテロダイマーを得た。このヘテロダイマーを用いる以外は、同様にグルカン依存性プロテアーゼ活性確認試験を行った。結果を表１３に併せて示す。

更に、特許文献２に記載の方法でTachypleus polyphemus由来のFactorG αサブユニットとFactorG βサブユニットを共発現させて得られたヘテロダイマーを得た。このヘテロダイマーを用いる以外は、同様にグルカン依存性プロテアーゼ活性確認試験を行った。結果を表１４に示す。

尚、ここで用いているLNTはレンチナン静注用1 mg「味の素」を1 N NaOHで溶解して調製たものを用いた。

LNT添加とLNT無添加の場合の吸光度のｄ差を「ブランク差」とする。
表１３において、
◎は、 ブランク差＞0.1の場合を、
〇は、0.1≧ブランク差＞0.01の場合を、
△は、0.01≧ブランク差＞0の場合を、
×は、ブランク差= 0の場合を、それぞれ示す。

表１３から明らかな通り、本発明のヘテロダイマーは、BG存在下でプロテアーゼ活性を有することが確認された。

一方、表１３から明らかな通り、公知の配列であるAB547712と本発明のFactorG βサブユニットのヘテロダイマーは、プロテアーゼ活性を測定することが出来なかった。以上のことから、公知の配列であるAB547712については、BG依存性を保有したFactorGの作製が困難であることが確認された。

また、表１４から明らかな通り、本発明のヘテロダイマーの代わりにTachypleus属由来FactorG αβを用いて同様の測定を行ったところ、プロテアーゼ活性を測定することが出来なかった。

以上のことから、本発明のFactorG αサブユニットと本発明のFactorG βサブユニットとのヘテロダイマーが、BGの定量測定や真菌症の診断に用いることができることが示唆された。

実施例３．本発明のヘテロダイマーを用いたBGの測定
実施例１の6-3で得られた、本発明のFactorG αサブユニットAとFactorG βサブユニットβi2の共発現物が含まれる上清、又は本発明のFactorG αサブユニットBとFacorG βサブユニットβ2の共発現物が含まれる上清を試料として用い、既知のBG量を以下の方法で測定した。

すなわち、下記表１５に記載の組成の反応溶液を調製し、反応用チューブに順次添加した。表１５において、レンチナン静注用1 mg（味の素(株)製）を、1 N NaOHで
LNT濃度が0.35 pg/mL、3.5 pg/mL、及び35 pg/mLになるように溶解したものをLNT溶液として用いた。また、注射用蒸留水を、LNT無添加のブランクとして用いた。

次いで、37℃で200分反応を行い、ELx808(BioTek製）を用いて、405 nm(測定波長)と492 nm（副波長）における吸光度を測定した。LNT添加と無添加（ブランク）における吸光度の差を各LTN濃度における吸光度とした。

次いで、試料中のレンチナン濃度（換算値、pg/mL、ｘ軸）に対する吸光度をプロットした検量線を作成した。

本発明のFactorG αサブユニットAとFactorG βサブユニットβi2の共発現物が含まれる上清を用いた測定で得られた検量線を、図３に示す。
また、測定値から最小２乗法で求めた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。

ｙ=0.2819x^0.296
R²=1

本発明のFactorG αサブユニットBとFactorG βサブユニットβ2の共発現物が含まれる上清を用いた測定で得られた検量線を、図４に示す。
また、測定値から最小２乗法で求めた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。

ｙ=0.1601x^0.2356
R²=0.9938

図３及び図４から明らかな如く本発明のヘテロダイマーを用いてBGの測定を行った場合、試料中のBG濃度（レンチナン濃度換算値で0～350pg/mL）に比例した、良好な検量線が得られた。このことから、本発明のヘテロダイマーをBGの定量に用いることが出来ることがわかる。特に、レンチナン濃度の下限が0.35pg/mLまで有意に検出可能であることが確認できた。尚、臨床検査の分野でBGを測定した場合のBGのカットオフは値11pg/mL以下である。

実施例４．本発明のヘテロダイマーの取得―２
（１）発現ベクターの構築
１）FactorG αサブユニットA発現ベクター発現ベクターの構築
配列番号４１（表９に記載の昆虫細胞用に最適化した塩基配列、シグナル配列含む）で表される塩基配列を有するcDNAをプラスミドベクター pIEx-Bac-1ベクター（Novagen社）のNcoI-NotIサイトへ挿入し、FactorG αサブユニットA発現ベクター（α(TYPE A)/pIEx-Bac-1）を構築した。

２）FactorG βサブユニットi2発現ベクターの構築
5'末端側からシグナル配列、Hatタグ、SUMOタグ、FactorG βサブユニットβi2(アミノ酸配列：配列番号６)の順に配したアミノ酸配列（配列番号６７）を設計し、このアミノ酸配列をコードし、且つ昆虫細胞用に最適化した塩基配列（配列番号６８）を設計した。この塩基配列のFactorG βサブユニットβi2をコードする塩基配列は、配列番号６９で表されるものである。

GENEWIZ社に委託してこの塩基配列を有するcDNAを合成した。このcDNAを、プラスミドベクター pIEx-Bac-1ベクター（Novagen社）のNcoI-NotIサイトへ挿入し、FactorG βサブユニットβi2発現ベクター（βi2/ pIEx-Bac-1）を構築した。

（２）発現ベクターを用いた共発現
昆虫細胞 expresSF+（登録商標；プロテイン・サイエンス（Protein Science社製）を、1.0 x 10⁶ cellsとなるようにBG除去済み無血清培地PSFM-J1（pH5.5～6.2）が入った6well plateに播種した。
上記で構築した発現ベクター α(TYPE A)/pIEx-Bac-1及びβi2/ pIEx-Bac-1(それぞれ１μg分)、及びトランスフェクション試薬 ScreenFectA plus（富士フイルム和光純薬(株)製） 2 μLを、PSFM-J1培地（富士フイルム和光純薬(株)製）100μLを混合し、室温で20分インキュベーションした後、溶液をexpresSF+を播種した6well plateに添加した。
その後、27℃で3日間培養した。培養後、培養液を、12,000 x g、4℃で2分間遠心し、上清と沈殿に分画した。上清を凍結させ保存した。

（３）グルカン依存性プロテアーゼ活性確認試験
得られた上清（本発明のFactorG αサブユニットAとFactorG βサブユニットβi2の共発現物を含有する）を試料として用いる以外は、実施例２と同様の方法で、得られた共発現物のグルカン依存性プロテアーゼ活性の評価を行った。尚、35pg/mL LNT溶液は、測定時の濃度が35 pg/mL、3.5 pg/mL、又は0.35 pg/mLとなるように加えた。

結果を図５に示す。
図５から明らかな通り、本発明のヘテロダイマーを用いてBGの測定を行った場合、試料中のBG濃度が、レンチナン濃度換算値で0.35pg/mLでも十分検出可能であることが確認できた。

Claims (9)

1. 下記から選択される、ヘテロダイマー：
   (１)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (２)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (３)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (４)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (５)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (６)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットのヘテロダイマー、
   (７)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (８)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (９)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットのヘテロダイマー。
2. （１）～（６）から選択される、請求項１に記載のヘテロダイマー。
3. （１）、（２）、又は（５）から選択される、請求項１に記載のヘテロダイマー。
4. 下記から選択されるヘテロダイマーを用いた、β－グルカンの測定方法：
   (１)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (２)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (３)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (４)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (５)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (６)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットのヘテロダイマー、
   (７)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (８)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (９)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットのヘテロダイマー。
5. 前記ヘテロダイマーが（１）～（６）から選択される、請求項４に記載のβ－グルカンの測定方法。
6. 前記ヘテロダイマーが（１）、（２）、又は（５）から選択される、請求項４に記載のβ－グルカンの測定方法。
7. 下記から選択されるヘテロダイマーを含む、β－グルカン測定用キット：
   (１)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (２)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (３)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (４)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (５)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (６)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットのヘテロダイマー、
   (７)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (８)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットとの組合せのヘテロダイマー、
   (９)配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG αサブユニットと、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有するFactorG βサブユニットのヘテロダイマー。
8. 前記ヘテロダイマーが（１）～（６）から選択される、請求項７に記載のβ―グルカン測定用キット。
9. 前記ヘテロダイマーが（１）、（２）、又は（５）から選択される、請求項７に記載のβ―グルカン測定用キット。

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