WO2010107068A1 - β－グルカンの測定方法及びそれに用いられるβ－グルカン結合性蛋白質 - Google Patents

β－グルカンの測定方法及びそれに用いられるβ－グルカン結合性蛋白質 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for measuring ⁇ -glucan (hereinafter abbreviated as “ ⁇ G”) using a novel ⁇ -glucan binding protein and a novel ⁇ -glucan binding protein used therefor.
  • ⁇ G ⁇ -glucan binding protein
  • Mycosis includes superficial ones that occur in the skin and deep ones that occur in the internal organs, blood system, and lymphatic system. Deep mycosis is a kind of opportunistic infection that affects patients with weak resistance (immunocompromised state), and is a very serious disease state. Representative examples of the causative agents of deep mycosis include Candida and Aspergillus. Since ⁇ G is commonly present in any cell wall, it is useful to measure blood ⁇ G. In clinical diagnosis, measurement of plasma or serum ⁇ -glucan is used for early diagnosis of fungal infection, therapeutic effect and prognosis determination.
  • ⁇ G has a glucose repeating structure with ⁇ - (1 ⁇ 3) bonds as the main chain, and in some cases has a (1 ⁇ 6) bond or a (1 ⁇ 4) bond branch. High molecular weight (however, the distribution is wide).
  • ⁇ G binds to the ⁇ G-binding domain portion of the G factor ⁇ subunit present in the blood cell extract of horseshoe crab (Amebocyte lysate).
  • ⁇ subunit of Tachypleus genus Horseshoe crab G factor has been completed, and the amino acid sequence and base sequence thereof are disclosed in NCBI (National Center for Biotechnology Information) database.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the ⁇ subunit of Tachypleus horseshoe crab factor G has also been successfully expressed by genetic engineering techniques (Patent Document 3).
  • Factor G is a serine protease precursor that is activated by the binding of ⁇ G, and the factor G-based protease cascade begins.
  • the activated factor G activates the clotting enzyme precursor, and finally produces a gel. Therefore, in the fields of medicine, pharmacy, and microbiology, a ⁇ G detection method utilizing this property of horseshoe crab blood cell extract has been developed.
  • ⁇ G detection methods include end-point synthetic substrate, gelation overturning method and turbidimetric time analysis method using gelation reaction that occurs between solution containing horseshoe crab blood cell extract and ⁇ G.
  • Typical examples thereof include a method and a kinetic synthetic substrate method.
  • measurement of ⁇ G by turbidimetric time analysis is performed as follows. That is, a horseshoe crab blood cell extract-containing reagent and a sample containing ⁇ G are mixed, and the mixture is irradiated with light. Next, using a suitable measuring instrument (for example, a spectrophotometer, a microplate reader, etc.), for example, a change in transmittance, a change in absorbance, a variation in the transmitted light ratio Rt, and a logarithmic value of the transmitted light ratio Rt.
  • the time required for the optical change such as fluctuation to reach a predetermined value after the start of light irradiation (gelation time, Tg) is measured.
  • the obtained time is applied to a calibration curve representing the relationship between the gelation time and ⁇ G concentration prepared in advance using a ⁇ G solution having a known concentration, and the ⁇ G concentration in the sample is obtained.
  • the measurement method using the horseshoe crab blood cell extract as described above is a method capable of measuring a very small amount of ⁇ G in blood with high sensitivity.
  • these methods are carried out according to the method (1), so the test results are likely to vary in the measurement results.
  • a protein consisting only of the ⁇ G binding domain of the G factor ⁇ subunit is prepared by genetic engineering, and this is fluorescently labeled using one molecule.
  • the detection sensitivity in this method is up to several ng / mL in terms of Pakiman (a kind of ⁇ G), and is not sufficient for application in the field of clinical examination.
  • Non-patent Document 1 a measurement method using Biacore using a sensor chip
  • Patent Document 2 a ⁇ G-binding protein that specifically binds to ⁇ G and inhibits activation of horseshoe crab G-factor and labeled with a labeling substance
  • Patent Document 2 a method of measuring ⁇ G using an antibody against ⁇ G-binding protein
  • the method using a sensor chip is mainly a method for measuring the affinity between ⁇ G and ⁇ G-binding protein, but it is a qualitative method and complicated in operation, and this method is applied to the field of clinical testing. There is a problem to do.
  • the ⁇ G-binding protein used in the method using an antibody against a ⁇ G-binding protein having the property of inhibiting the activation of horseshoe crab G-factor and a ⁇ G-binding protein labeled with a labeling substance is a natural product, There is a problem that a difference occurs. Further, whether this method can be applied to the field of clinical examination has not yet been examined. Furthermore, this method has a problem in sensitivity.
  • a cysteine residue is substituted with another amino acid, which includes one or more domains derived from the factor G ⁇ subunit Xln Z1 domain and / or Z2 domain of the horseshoe crab and binds to ⁇ -1,3-glucan
  • Patent Document 4 An invention relating to a fungal detection kit containing a possible recombinant protein is also known (Patent Document 4).
  • This method is a method for detecting fungi by bringing one kind of recombinant protein having the above characteristics into contact with a sample containing fungi.
  • ⁇ G measurement methods including the sandwich method using the protein have not been studied.
  • Non-patent Document 2 There is also known a method of measuring ⁇ G by a method such as ELISA using 2 molecules of Dectin 1 (Dectin 1) known as a receptor for ⁇ G (Non-patent Document 2). However, this method also does not reach the sensitivity required by clinical sites.
  • CBD Cellulose binding domein
  • CBD can be used for measuring ⁇ G in the field of clinical examination even if there is a CBD having a xylanase Z-like domain.
  • any of these methods has various problems particularly when used for clinical examination when ⁇ G is specifically measured.
  • the present invention has been made in view of the situation as described above, and has a sensitivity and specificity equivalent to that of a reagent using a conventional protease cascade, and solves the above-mentioned various problems, and a measuring method and a measuring reagent for ⁇ G It is an issue to provide.
  • the present invention has been made for the purpose of solving the above-described problems, and has the following configuration.
  • a ⁇ G measurement method performed by the following method, (I) a sample and an amino acid sequence identical to or substantially identical to the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, or 20, and binding to ⁇ G Protein 1 (hereinafter abbreviated as “ ⁇ G binding protein 1”) and the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 or 20
  • ⁇ G-binding protein 1 and a protein 2 having substantially the same amino acid sequence and having a binding property to ⁇ G hereinafter abbreviated as “ ⁇ G-binding protein 2” are brought into contact with each other.
  • ⁇ G measurement kit comprising the following as a constituent: (i) identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 or 20 Reagent containing protein 1 having the same amino acid sequence and having binding property to ⁇ G (ii) Amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 or 20 And a protein 2 containing the same or substantially the same amino acid sequence and having a binding property to ⁇ G. (4) A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, or 20, and having a binding property to ⁇ G.
  • a nucleic acid molecule that encodes (7) A recombinant in which the nucleic acid molecule according to (5) or (6) is incorporated.
  • the present inventors focused on the ⁇ G binding domain existing in the horseshoe crab G factor ⁇ subunit, and the domain has a dimeric structure. It was thought that ⁇ G could be measured using an ⁇ subunit fragment containing a domain structure. In addition, it is considered that such ⁇ subunit fragment can be obtained as a recombinant product (recombinant) by a genetic method, and as a result of further research, ⁇ G measurement by sandwich method using the ⁇ subunit fragment is performed. A system was established.
  • the present invention provides a ⁇ G measurement method using two molecules of ⁇ G-binding protein having a specific amino acid sequence, a reagent and kit used therefor, a recombinant ⁇ G-binding protein having a specific amino acid sequence, and a method for producing the same It is.
  • ⁇ G can be measured with higher sensitivity and specificity than the conventional method.
  • ⁇ G is measured in a sample containing protease, it is not necessary to perform pretreatment for inactivating the protease in the sample in advance.
  • it since it is highly sensitive, there exists an effect that it can be used also for a clinical test.
  • the measurement method of the present invention is carried out using the recombinant product of the present invention, so there is no lot difference in the reagent used, and ⁇ G is specific with constant and high measurement sensitivity. The effect that it can measure automatically is produced.
  • the measurement method of the present invention can be applied not only to the method used but also to measurement using an automatic analyzer.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit and fragments thereof.
  • the upper diagram of FIG. 1 shows a schematic diagram of the Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of a Limulus genus limulus factor G ⁇ subunits derived fragment, the N-terminal amino acid and C-terminal amino acid of the fragment, the position on the Limulus genus limulus factor G ⁇ subunits, respectively.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit and fragments thereof.
  • the upper figure of FIG. 2 shows a schematic diagram of Tachypleus genus Horseshoe crab G factor ⁇ subunit.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of Tachypleus genus limulus factor G ⁇ subunits derived fragment, the N-terminal amino acid and C-terminal amino acid of the fragment, the position on the Tachypleus genus limulus factor G ⁇ subunits, respectively.
  • the protein expression result of the Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a (233-649aa) obtained in Example 1 is shown.
  • (a) shows the result of Western blotting
  • (b) shows the result of silver staining of the gel after SDS-PAGE.
  • lane (1) shows the results when the protein molecular weight marker is used
  • lane (2) shows the results when the affinity-purified fragment a is used as a sample.
  • 6 is a calibration curve showing the relationship between the lentinan concentration (converted value) in the sample and the absorbance at 450 nm of the sample, obtained in Example 5. Error bars indicate 2SD values. The result of having measured the peroxidase activity in each fragment density
  • Example 7 The result of having measured the peroxidase activity of the fragment
  • the layout of the capillary chip used in Example 6 is shown. 6 is a calibration curve showing the relationship between the lentinan concentration (converted value) in the sample and the time integral value of the fluorescence intensity of the complex obtained in Example 6. Error bars indicate 2SD values.
  • the ⁇ G according to the present invention is not particularly limited as long as it is a polysaccharide containing ⁇ G as its constituent component.
  • various bacteria for example, Alcaligenes genus, Agrobacterium genus, etc.
  • yeasts for example, Saccharomyces genus, Candida genus, Cryptococcus genus, Trichosporon genus, Rhodotorula genus, etc.
  • molds Aspergillus genus, Mucor genus) , Penicillium genus, Trichophyton genus, Sporothrix genus, Phialophora genus etc.
  • actinomycetes genus Actinomyces genus, Nocardia genus etc.
  • mushrooms eg shiitake mushrooms, suhirotake mushrooms, kawaratake etc.
  • curdlan for example, curdlan, pachyman, sclerotane, lentinan, schizophyllan, coriolan, etc., or storable polysaccharides of algae (eg, brown algae, euglena, diatoms, etc.), specifically, laminaran, paramylon, etc.
  • storable polysaccharides of algae eg, brown algae, euglena, diatoms, etc.
  • laminaran paramylon, etc.
  • ⁇ G binding protein 1 and “ ⁇ G binding protein 2” may be collectively referred to as “ ⁇ G binding protein according to the present invention” or simply “ ⁇ G binding protein”.
  • ⁇ G-binding protein 1 and “ ⁇ G-binding protein 2” are derived from the G-factor ⁇ subunit of the horseshoe crab blood cell component.
  • the amino acid sequence of the Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit was revealed by the present inventors. It includes an amino acid sequence consisting of about 649 amino acids represented by SEQ ID NO: 2, encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a ⁇ -1,3-glucanase-like domain on the N-terminal side, There is a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ) that appears to be a ⁇ G-binding domain on the C-terminal side, and a xylanase A-like domain in the middle of the sequence.
  • the xylanase A-like domain has two repeats of the QQWS (Gln-Gln-Trp-Ser) motif, which is a structural motif.
  • the present inventor based on the knowledge regarding the amino acid sequence of Limulus genus G-factor ⁇ subunit obtained by the present inventor, includes four types of xylanase Z-like domains (XlnZ) that are considered to be ⁇ G binding domains.
  • XlnZ xylanase Z-like domains
  • fragment a Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment a
  • fragment b Limulus genus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment b
  • fragment c Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment c
  • fragment d Limulus genus horseshoe crab G-factor ⁇ subunit fragment d
  • FIG. 1 A schematic diagram of the Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit revealed by the present inventor is shown in the upper diagram of FIG.
  • a schematic diagram of fragments derived from the Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit designed by the present inventor, and the positions of the N-terminal amino acid and C-terminal amino acid of each fragment on the Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit are shown in FIG. 1 is also shown in the lower diagram.
  • Fragment a consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 233rd to 649th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of the Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2. It has a xylanase A-like domain (two QQWS motifs are present) and a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment b consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 387th to 649th amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence of Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2. It has a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment c consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, which is encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 7. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 524th to 649th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of the Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2. It has one C-terminal domain of the dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment d consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 9. This corresponds to the amino acid portion of the 233rd to 515th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of the Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2. It has a xylanase A-like domain (two QQWS motifs are present) and one N-terminal domain of the dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • the structure analysis of the ⁇ subunit of Tachypleus spp. G-factor G has been completed, and the amino acid sequence and base sequence thereof are disclosed in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database. It includes a signal peptide consisting of 19 amino acids and an amino acid sequence consisting of 673 represented by SEQ ID NO: 12, which is encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 herein.
  • Patent Document 3 discloses a DNA encoding a polypeptide of the ⁇ subunit of Tachypleus genus G. elegans. The polypeptide consists of 654 amino acids and lacks the signal peptide portion of the amino acid sequence disclosed in the NCBI database.
  • the present inventor designed four fragments of the Tachypleus genus Horseshoe crab G which contains a xylanase Z-like domain (XlnZ) which seems to be a ⁇ G-binding domain in the same manner as the above-mentioned fragments of Limulus genus G factor ⁇ subunit were designed.
  • a fragment of the factor ⁇ subunit was designed.
  • fragment e -Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment e
  • fragment f -Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment f
  • fragment g -Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment h
  • fragment h -Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment h
  • a schematic diagram of the Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit is shown in the upper part of FIG.
  • the fragment e and the fragment h were designed by the present inventors for the first time.
  • Fragments f and g are known.
  • ⁇ G is measured using a substance labeled with a labeling substance. Two fragments of these fragments, or two of these fragments and other fragments are used.
  • ⁇ G is measured by a sandwich method using molecules.
  • Fragment e consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 13. This corresponds to the 268th to 673rd amino acid sequence portion from the N-terminal of the amino acid sequence of Tachypleus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12. It has a xylanase A-like domain (three QQWS motifs are present) and a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment f consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 15. This corresponds to the 410th to 673rd amino acid sequence portion from the N-terminus of the amino acid sequence of the Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12. It has a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment g consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 17. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 548th to 673rd amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence of the Tachypleus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12. Of the dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ), it has one C-terminal domain.
  • Fragment h consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 19. This corresponds to the 268th to 547th amino acid sequence portion from the N-terminus of the amino acid sequence of the Tachypleus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12.
  • Xylanase A-like domain (three QQWS motifs are present) It has one N-terminal domain of the dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Table 1 summarizes the sequence numbers of amino acid sequences and the base sequences encoding the amino acid sequences of Limulus genus G-factor ⁇ subunit and fragments thereof, and Tachypleus genus G-factor ⁇ subunit and fragments thereof. .
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 or 20 used in the measurement method of the present invention is SEQ ID NO: About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95, and the amino acid sequence represented by any of 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 or 20 An amino acid sequence having a homology of at least% and binding to ⁇ G can be mentioned.
  • a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, or 20 includes, for example, SEQ ID NO: 4 , 6, 8, 10, 14, 16, 18, or 20 has a substantially identical amino acid sequence and has a binding property to ⁇ G.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 6, 8, 10, 14, 16, 18, or 20, 1 to 5 (preferably 1 to 3) amino acids are substituted.
  • it is a protein having an amino acid sequence that is deleted or has an amino acid sequence in which 1 to 5 (preferably 1 to 3) amino acids are inserted or added to the amino acid sequence, and has a binding property to ⁇ G.
  • the position for giving substitution, deletion, insertion, addition, etc. to the amino acid sequence constituting the protein is arbitrary as long as it does not affect the affinity of ⁇ G for the protein.
  • substitution, deletion, insertion, and addition may occur at a plurality of positions with respect to one amino acid sequence as long as the affinity for ⁇ G of the protein is not affected.
  • Preferred examples of ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 used in the measurement method of the present invention include fragment a, fragment b, fragment c, fragment d, fragment e, fragment f, fragment g, fragment according to the present invention. h. Considering that a recombinant can be easily obtained, fragment a, fragment b, fragment e and fragment f are particularly preferable.
  • the ⁇ G binding protein used is more preferably as follows. That is, the ⁇ G-binding protein is long enough to separate the site for binding the labeling substance and the ⁇ G-binding site in the ⁇ G-binding protein so that the labeling substance does not interfere with the binding between the ⁇ G-binding protein and ⁇ G ( It is better to have (number of amine acids). Furthermore, when ⁇ G-binding protein is used in the sandwich method, the measurement sensitivity becomes higher when the length is longer (the number of amino acids is larger). Considering the above points, as the ⁇ G-binding protein according to the present invention, fragment a, fragment b, fragment e, and fragment f are preferable, and fragment a or fragment b is particularly preferable.
  • the ⁇ G-binding protein used in the ⁇ G measurement method of the present invention does not have the ⁇ -glucanase-like domain of the horseshoe crab G factor ⁇ subunit. To use this ⁇ G-binding protein in the ⁇ G measurement method, There are the following advantages.
  • the horseshoe crab blood cell extract is a natural product, so even if an attempt is made to use a horseshoe crab blood cell extract or a factor G, G factor ⁇ subunit, etc. separated therefrom for ⁇ G measurement, a lot difference appears. Cheap.
  • it since it is a natural product, there is a possibility that supply will become unstable in the future. Therefore, such a problem can be solved if a recombinant product of a protein having binding ability to ⁇ G is obtained.
  • the inventors of the present application have studied to obtain a recombinant product of a protein having binding ability to ⁇ G.
  • the protein is expressed using E. coli as a host, the cause is not clear.
  • the ⁇ G-binding protein used in the ⁇ G measurement method of the present invention can be expressed even when mammalian cells, insect cells, etc. are used as hosts.
  • yeast is used as a host.
  • yeast cells have ⁇ G, an operation to remove yeast-derived ⁇ G from the expressed protein is required.
  • insect cells are used as a host, there is a problem that the secreted protein may be contaminated by bovine serum albumin contained in a medium for culturing insect cells.
  • E. coli cells do not have ⁇ G, there is no risk that the protein expressed in E. coli is contaminated with ⁇ G. Furthermore, as is well known, E. coli is easier to handle, easier to grow, faster to grow, less expensive to handle, and requires special culture equipment compared to other cells. Therefore, when E. coli is used as a host, there is an advantage that a recombinant protein can be produced quickly, stably and inexpensively.
  • the ⁇ G-binding protein lacking the glucanase-like domain of the horseshoe crab G factor ⁇ subunit according to the present application is excellent in that it can be expressed even when E. coli is used as a host.
  • the method for measuring ⁇ G of the present invention is as follows. (1) reacting a sample with ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 to form a complex of ⁇ G-binding protein 1, ⁇ G and ⁇ G-binding protein 2 in the sample, (2) measuring the amount of the complex; (3) Measure the amount of ⁇ G in the sample based on the amount of the complex obtained. Is achieved.
  • the principle of the measurement method according to the present invention is a so-called sandwich method in which measurement is performed using ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2.
  • EIA enzyme immunoassay method
  • Micro-TAS Micro-Total Analysis Systems: ⁇ -TAS
  • the formed complex can be measured by a heterogeneous method using BF separation using an insoluble carrier or the like, or by a homogeneous method without BF separation.
  • Method 1 using free ⁇ G-binding protein A sample is brought into contact with free ⁇ G-binding protein 1 (not immobilized on an insoluble carrier) and free ⁇ G-binding protein 2 (not immobilized on an insoluble carrier) to form ⁇ G binding A complex of sex protein 1 with ⁇ G in the sample and ⁇ G-binding protein 2; (Ii) measuring the amount of the complex; (Iii) Based on the amount of the complex obtained, the amount of ⁇ G in the sample is measured.
  • I-2 Method 2 using free ⁇ G-binding protein (I) contacting a sample with free ⁇ G-binding protein 1 (not immobilized on an insoluble carrier) to form complex-1 of ⁇ G and ⁇ G-binding protein 1 in the sample; (Ii) The complex-1 is brought into contact with free ⁇ G-binding protein 2 (not immobilized on an insoluble carrier) to form ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G and ⁇ G-binding protein 2 in the sample.
  • Complex-3 and then (iii) measuring the amount of complex-2; (Iv) Based on the amount of the complex-2 obtained, the amount of ⁇ G in the sample is measured.
  • Method 1 using ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier and free unlabeled ⁇ G-binding protein 2 (I) A sample, a ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier, and a free unlabeled ⁇ G-binding protein 2 are brought into contact with each other, and the ⁇ G-binding protein 1 immobilized on the insoluble carrier and the sample To form a complex of ⁇ G of ⁇ G and unlabeled ⁇ G-binding protein 2; (Ii) measuring the amount of the complex; (Iii) Based on the amount of the complex obtained, the amount of ⁇ G in the sample is measured.
  • Method 2 using ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier and free unlabeled ⁇ G-binding protein 2 (I) contacting the sample with ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier to form complex-1 of ⁇ G-binding protein 1 immobilized on the insoluble carrier and ⁇ G in the sample; Next, (ii) the complex-1 and free unlabeled ⁇ G-binding protein 2 are contacted to form complex-2 of complex-1 and unlabeled ⁇ G-binding protein 2, and then (iii) ) Measuring the amount of Complex-2, (Iv) The amount of ⁇ G in the sample is measured based on the complex-2.
  • Method 1 using free ⁇ G-binding protein 1 and free ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance 1 (I) A sample, a free ⁇ G-binding protein 1 and a free ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance are brought into contact with each other, and ⁇ G-binding protein 1, ⁇ G in the sample, and a labeled ⁇ G-binding protein 2 A complex with (Iii) measuring the amount of labeling substance in the complex; (Iv) The amount of ⁇ G in the sample is measured based on the amount of the labeling substance obtained.
  • Method 2 using free ⁇ G-binding protein 1 and free ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance (I) contacting the sample with free ⁇ G-binding protein 1 to form complex-1 of ⁇ G and ⁇ G-binding protein 1 in the sample, and then (ii) the complex-1 and label Contact with the free labeled ⁇ G-binding protein 2 labeled with a substance to form complex-2 of complex-1 and labeled ⁇ G-binding protein 2, and then (iii) in complex-2 Measure the amount of labeling substance, (Iv) The amount of ⁇ G in the sample is measured based on the amount of the labeling substance obtained.
  • Method 1 using ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier and free ⁇ G-binding protein labeled with a labeling substance 1 (I) A ⁇ G-binding protein immobilized on an insoluble carrier by contacting a sample, ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier, and free labeled ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance 1 to form a complex of ⁇ G in the sample and labeled ⁇ G-binding protein 2; (Iii) measuring the amount of labeling substance in the complex; (Iv) The amount of ⁇ G in the sample is measured based on the amount of the labeling substance obtained.
  • Method 2 using ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier and free ⁇ G-binding protein labeled with a labeling substance (I) contacting the sample with ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier to form complex-1 of ⁇ G-binding protein 1 immobilized on the insoluble carrier and ⁇ G in the sample; Next, (ii) the complex-1 and the free labeled ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance are brought into contact with each other to form a complex-2 of the complex-1 and the labeled ⁇ G-binding protein 2. And then (iii) measuring the amount of the labeled substance in the complex-2, (Iv) The amount of ⁇ G in the sample is measured based on the amount of the labeling substance obtained.
  • Method 1 using free ⁇ G-binding protein 1 labeled with a labeling substance and free ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance (I) A sample, a free ⁇ G-binding protein 1 labeled with a labeling substance, and a free ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance are brought into contact with each other to label ⁇ G-binding protein 1 with ⁇ G in the sample forming a complex with ⁇ G-binding protein 2; (Iii) measuring the amount of labeling substance in the complex; (Iv) The amount of ⁇ G in the sample is measured based on the amount of the labeling substance obtained.
  • Method 2 using free ⁇ G-binding protein 1 labeled with a labeling substance and free ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance (I) contacting the sample with free ⁇ G-binding protein 1 labeled with a labeling substance to form complex-1 of ⁇ G in the sample and labeled ⁇ G-binding protein 1, and then (ii) the complex Body-1 and free labeled ⁇ G-binding protein 2 labeled with a labeling substance are contacted to form complex-2 of complex-1 and labeled ⁇ G-binding protein 2, and (iii) Measure the amount of labeling substance in Complex-2, (Iv) The amount of ⁇ G in the sample is measured based on the amount of the labeling substance obtained.
  • Method 1 using ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles and ⁇ G-binding protein 2 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles 1 (I) A sample, ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles, and ⁇ G-binding protein 2 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles are brought into contact with each other.
  • Method 2 using ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles and ⁇ G-binding protein immobilized on an insoluble carrier such as latex particles 2 (I) A complex of ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles and ⁇ G in the sample by bringing the sample and ⁇ G-binding protein 1 immobilized on the insoluble carrier into contact with each other And then (ii) contacting the complex-1 with ⁇ G-binding protein 2 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles to immobilize the complex-1 on an insoluble carrier such as latex particles. Forming complex-2 with ⁇ G-binding protein 2, and then (iii) measuring the amount in the complex-2, (Iv) Based on the amount of the complex obtained, the amount of ⁇ G in the sample is measured.
  • an antibody against ⁇ G-binding protein 1 or ⁇ G-binding protein 2 and ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 are used, and the antibody, ⁇ G-binding protein 1, ⁇ G-binding protein 2, and ⁇ G in the sample And a method of measuring the amount of ⁇ G in a sample by forming a complex with the sample and measuring the amount of the complex.
  • the antibody used in this method may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but does not inhibit the formation of a complex between ⁇ G-binding protein 1, ⁇ G-binding protein 2, and ⁇ G. is there.
  • ⁇ G can be measured using a plurality of the antibodies in one measurement system.
  • ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 may be bound to an insoluble carrier or labeled with a labeling substance.
  • ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 used in the measurement method of the present invention may be different or the same.
  • a combination of each of ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 or a combination of a plurality of types of ⁇ G-binding protein 1 and a plurality of types of ⁇ G-binding protein 2 may be used.
  • the one or plural kinds of ⁇ G-binding proteins 1 and the one or plural kinds of ⁇ G-binding proteins 2 used may be the same or different. More preferable combinations include a combination of ⁇ G-binding protein 1 with fragment a or b and ⁇ G-binding protein 2 with fragments a or b.
  • More preferred combinations include (Fragment a-Fragment a), (Fragment a-Fragment b), (Fragment b-Fragment a) and (Fragment b-Fragment b). Further preferred combinations are (Fragment a- Examples include fragment a) and (fragment b-fragment a). Particularly preferred combinations include (fragment b-fragment a).
  • a separation method when performing measurement using free (labeled) ⁇ G-binding protein 1 and / or free (labeled) ⁇ G-binding protein 2 not immobilized on an insoluble carrier, for example, a chromatography method is used.
  • High performance liquid chromatography, electrophoresis, capillary electrophoresis, capillary chip electrophoresis for example, a method using an automatic immunoanalyzer such as LiBASys (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the specific conditions include the obtained complex-1 or complex-2, free (labeled) ⁇ G-binding protein 1 and / or free (labeled) ⁇ G-binding protein that did not form a complex.
  • LiBASys when used as an automatic immunoanalyzer, for example, it may be carried out according to the method described in Biological Sample Analysis Vol. 22, No. 4, 303-308 (1999).
  • any insoluble carrier can be used as long as it is used, for example, in a usual immunoassay.
  • synthetic polymer compounds such as polystyrene, polypropylene, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyacrylamide, polyglycidyl methacrylate, polyvinyl chloride, polyethylene, polychlorocarbonate, silicone resin, silicone rubber, such as porous glass.
  • examples include inorganic materials such as ground glass, ceramics, alumina, silica gel, activated carbon, and metal oxides.
  • insoluble carriers can be used in a wide variety of forms such as microtiter plates, beads, tubes, a dedicated tray in which a large number of tubes are integrally formed, disk-shaped pieces, fine particles (latex particles), and the like.
  • microplates and beads are particularly preferred from the standpoints of ease of washing and operability when simultaneously processing a large number of samples.
  • the method for immobilizing the ⁇ G-binding protein according to the present invention on a carrier is not particularly limited as long as it can immobilize the ⁇ G-binding protein on an insoluble carrier.
  • Examples of the immobilization methods known per se that are usually used in this field include all chemical bonding methods (methods of immobilization by covalent bonding), physical adsorption methods, and the like.
  • Preferable examples include, for example, a solution containing the ⁇ G-binding protein according to the present invention usually in the range of 0.1 ⁇ g / mL to 20 mg / mL, preferably 1 ⁇ g / mL to 5 mg / mL, and an insoluble carrier, Examples thereof include a method of obtaining an insoluble carrier (solid phase) to which a ⁇ G-binding protein is bound by reacting at a temperature for a predetermined time.
  • the solvent for preparing the ⁇ G-binding protein solution may be any solvent as long as it does not prevent the ⁇ G-binding protein according to the present invention from adsorbing or binding to the insoluble carrier.
  • pH 5.0-10.0 preferably pH ⁇ 6.5-8.5 has a buffering action near neutrality, for example, phosphate buffer, Tris buffer, Good buffer, glycine buffer, borate buffer, MOPS buffer, etc. are preferred .
  • the concentration of the buffer in these buffers is appropriately selected from the range of usually 10 to 500 ⁇ mM, preferably 10 to 300 ⁇ mM.
  • saccharides for example, saccharides, salts such as NaCl, surfactants, preservatives, proteins, etc., as long as they do not prevent the ⁇ G-binding protein according to the present invention from adsorbing or binding to the insoluble carrier. Etc. may be included.
  • the blocking treatment usually performed in this field that is, an insoluble carrier bound with the ⁇ G-binding protein according to the present invention obtained as described above, and a protein unrelated to the ⁇ G-binding protein, for example, Doing soaking in a solution containing milk proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, skim milk, egg white albumin, commercially available blocking agents (eg, Block Ace (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.)) This is desirable from the viewpoint of preventing non-specific reactions during measurement.
  • a solution containing milk proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, skim milk, egg white albumin, commercially available blocking agents (eg, Block Ace (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.)
  • Block Ace manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
  • ⁇ G-binding protein immobilized on an insoluble carrier may be directly immobilized on an insoluble carrier, or may be insoluble via an anti- ⁇ G-binding protein antibody immobilized on an insoluble carrier. It may be immobilized on a carrier.
  • the anti- ⁇ G binding protein antibody used therefor may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Specific examples of the insoluble carrier for immobilizing the anti- ⁇ G binding protein antibody include the same insoluble carriers as those for immobilizing the ⁇ G binding protein described above. Further, in order to immobilize the anti- ⁇ G binding protein antibody on the insoluble carrier, it may be carried out according to the above-described method for immobilizing the ⁇ G binding protein on the insoluble carrier.
  • examples of the labeling substance used for labeling ⁇ G-binding protein include peroxidase, microperoxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphorus used in usual immunoassay methods and the like.
  • Enzymes such as acid dehydrogenase, acetylcholinesterase, malate dehydrogenase, luciferase, such as 99m Tc, 131 I, 125 I, 14 C, 3 H, 32 P used in radioimmunoassay (RIA) radioisotope such as 35 S, for example, fluorescence immunoassay (fluoroimmunoassay, FIA) fluorescein used in, dansyl, fluorescamine, coumarin, naphthylamine fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, rhodamine X isothiocyanate, follow Fluorescent substances such as Min 101, lucifer yellow, acridine, acridine isothiocyanate, riboflavin or derivatives thereof, for example, luminescent substances such as luciferin, isoluminol, luminol, bis (2,4,6-trifluoropheny
  • HiLyte dyes such as HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 488, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 680, HiLyte Fluor 750, etc.
  • a per se known labeling method generally used in a per se known immunoassay (EIA, RIA, FIA) or the like [for example , Laboratory of Medical Chemistry, Volume 8, supervised by Yuichi Yamamura, 1st edition, Nakayama Shoten, 1971; Illustrated fluorescent antibody, Akira Kawaio, 1st edition, Soft Science Inc., 1983; Enzyme immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Muroi, 2nd edition, School of Medicine, 1982, etc .; Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edition, J. Sambrook, E.M. F. Frisch, T .; The method described in Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.) or a conventional method using a reaction between avidin (or streptavidin) and biotin may be used as appropriate.
  • the ⁇ G binding protein may be labeled by a method of binding a labeling substance to the ⁇ G binding protein via one or several amino acids, or one or several amino acids and a linker.
  • a labeling substance In the ⁇ G-binding protein in which a labeling substance is bound via an amino acid or an amino acid and a linker, the ⁇ G-binding site in the ⁇ G-binding protein is further away from the labeling substance. Therefore, the labeling substance is more preferable because it is less likely to prevent the binding between the ⁇ G binding site and ⁇ G in the sample.
  • an amino acid may be bound to the N-terminus of ⁇ G according to the present invention by a conventional method.
  • PCR is performed using an F primer to which a nucleotide sequence encoding the amino acid is added at the N-terminus, and the obtained PCR product is incorporated into an appropriate expression vector DNA, followed by obtaining a transformant by a conventional method,
  • a ⁇ G-binding protein bound with amino acids can also be obtained.
  • kits for binding (labeling) a labeling substance to a protein as described above are commercially available, labeling may be performed using them according to the instruction manual attached to the kit.
  • labeled ⁇ G-binding protein labeled with a labeling substance may be indirectly labeled by binding to an anti- ⁇ G binding protein antibody labeled with a labeling substance.
  • the anti- ⁇ G binding protein antibody used therefor may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Specific examples of the labeling substance for labeling the anti- ⁇ G binding protein antibody and the method for measuring the label are as described in the description of the labeled ⁇ G binding protein.
  • the anti- ⁇ G binding protein antibody can be labeled with the labeling substance in accordance with the method for labeling the ⁇ G binding protein with the labeling substance.
  • nucleic acid chain can be used as a labeling substance.
  • the nucleic acid chain is composed of a nucleotide residue consisting of a purine base or pyrimidine base, a pentose which is a sugar moiety, and a phosphate, and this phosphate is a diester between each nucleotide between the 3 ′ and 5 ′ carbons of the sugar. It is a chain-like polynucleotide that is linked and polymerized by bonding, and examples thereof include RNA whose sugar moiety is ribose and / or DNA whose sugar moiety is deoxyribose.
  • the nucleic acid strand may be a single strand or a double strand or a plurality of nucleic acid strands.
  • the length of the nucleic acid chain used is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved, and is usually 1 bp to 1000 kbp, preferably 5 bp to 100 kbp, more preferably 10 bp to 50 kbp.
  • nucleic acid chain used in the present invention may be appropriately modified with an appropriate one as long as the object of the present invention can be achieved.
  • Examples of the method for binding the nucleic acid chain and the ⁇ G-binding protein according to the present invention include known methods disclosed in, for example, Japanese Patent No. 42147779.
  • the ⁇ G-binding protein and the nucleic acid chain according to the present invention each have a functional group directly or linker [for example, N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), sulfosuccinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) ) Butyrate (Sulfo-SMPB), sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC), etc.].
  • EMCS N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide
  • sulfosuccinimidyl 4- p-maleimidophenyl)
  • Butyrate Sulfo-SMPB
  • Sulfo-SMCC sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • the ⁇ G-binding protein according to the present invention and the reactive functional group-introduced nucleic acid chain may be bound by the method described in Japanese Patent No. 42147779.
  • a method for introducing a reactive functional group into a nucleic acid chain a method known per se can be mentioned.
  • PCR is performed using a PCR primer having a reactive functional group introduced at the 5 ′ end, and the PCR product is reactive at the 5 ′ end.
  • Reactivity to the nucleic acid end by a method to obtain a nucleic acid chain having a functional group introduced (molecular cloning, laboratory manual, second edition, J. Sambrook, EF Frisch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.) Functional groups can be introduced.
  • labeled ⁇ G-binding protein labeled with a labeling substance may be obtained by binding a nucleic acid labeled with a labeling substance.
  • the nucleic acid used in the method and the method for binding the nucleic acid and ⁇ G-binding protein are as described above.
  • Examples of the method for binding the nucleic acid and the labeling substance include the method described in Japanese Patent No. 4214797.
  • labeled ⁇ G-binding protein those usually used as stabilizers in this field, such as sugars, proteins, surfactants, etc. are usually used. It may be contained within the concentration range used in this field.
  • the method for measuring the amount of label in the complex resulting from the measurement method of the present invention varies depending on the type of labeling substance, but depending on the property of the labeling substance that can be detected by some method. Each may be carried out according to a predetermined method.
  • the labeling substance is an enzyme
  • the conventional immunoassay method such as “enzyme immunoassay” (protein-nucleic acid-enzyme-separate volume No. 31; , Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 1987), etc.
  • the labeling substance is a radioactive substance
  • the radioactive substance is released in accordance with, for example, a conventional method performed by RIA.
  • measurement equipment such as an immersion GM counter, liquid scintillation counter, well scintillation counter, HPLC counter, etc. may be selected and used as appropriate (for example, a medicinal chemistry experiment course) , Volume 8, supervised by Yuichi Yamamura, 1st edition, Nakayama Shoten, 1971 etc.).
  • the labeling substance is a fluorescent substance
  • a conventional method performed in FIA using a measuring instrument such as a fluorometer, for example, “Illustrated Fluorescent Antibody, Akira Kawaio, First Edition, Co., Ltd.” Measurement may be performed according to the method described in “Soft Science, 1983” or the like.
  • the labeling substance is a luminescent substance
  • a conventional method using a measuring instrument such as a photocounter for example, “enzyme immunoassay”
  • the measurement may be carried out according to the method described in Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Separate Volume, No. 31, Kitagawa, Tsuneo, Minamihara, Toshio, Tsuji, Ishikawa, Koji, 252-263, Kyoritsu Publishing Co., Ltd., 1987).
  • the measurement may be performed by a conventional method using a measuring instrument such as a spectrophotometer.
  • an electron spin resonance apparatus is used. Common methods used, such as “Enzyme immunoassay” (Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No. 31; Measurements may be performed according to the methods described above.
  • the labeling substance when it is an enzyme, it reacts with a coloring reagent to lead to a coloring reaction, and a method known per se, such as a method for measuring the amount of dye produced as a result with a spectrophotometer or the like Is mentioned.
  • coloring reagent used for such purpose examples include tetramethylbenzidine (TMB), o-phenylenediamine, o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside, 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline) Coloring reagents usually used in this field such as -6-sulfonic acid (ABTS), N-ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidine (ADPS), p-nitrophenyl phosphoric acid and the like can be mentioned. Moreover, what is necessary is just to set these use density
  • an enzyme activity inhibitor such as 1 to 6N sulfuric acid or a reaction stopper attached to the kit is added to the reaction solution. May be used.
  • a method for measuring ⁇ G using an unlabeled ⁇ G-binding protein for example, a method using a property derived from the obtained complex, specifically, a protease possessed by the complex itself
  • a method for measuring enzyme activity such as activity and the degree of fluorescence deflection as absorbance
  • a method such as a homogeneous immunoassay system such as surface plasmon resonance.
  • carriers such as latex particles used in the method of using ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles and ⁇ G-binding protein 2 immobilized on an insoluble carrier such as latex particles include Used in biological measurement methods, for example, molecular aggregates such as liposomes and polymeric micelles, polystyrene, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyacrylamide, polyglycidyl methacrylate, polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polychlorocarbonate, Examples thereof include those prepared using a synthetic polymer compound such as a silicone resin and silicone rubber, an inorganic substance such as porous glass, ground glass, alumina, silica gel, activated carbon, and metal oxide.
  • a synthetic polymer compound such as a silicone resin and silicone rubber, an inorganic substance such as porous glass, ground glass, alumina, silica gel, activated carbon, and metal oxide.
  • latex particles are artificial carriers, and are particularly preferable from the viewpoints that the surface of the carrier is easily chemically treated according to the purpose and that non-specific reactions are unlikely to occur.
  • the material is not particularly limited, for example, styrene latex particles such as polystyrene latex particles, acrylic acid latex particles, and the like are preferable.
  • Examples of the form include beads, fine particles, and latex particles.
  • the particle size is not particularly limited, but those having an average particle size of usually 0.05 to 0.5 ⁇ m, preferably 0.1 to 0.4 ⁇ m are preferable.
  • the method for supporting the ⁇ G-binding protein according to the present invention on the carrier is not particularly limited as long as it is carried out by bringing the ⁇ G-binding protein according to the present invention into contact with the carrier.
  • a known supporting method for example, a so-called physical adsorption method that is usually used in this field is representative.
  • the ⁇ G-binding protein according to the present invention may be carried on the carrier according to the loading method recommended in the instruction manual.
  • the formed insoluble carrier such as latex particles
  • the complex is formed.
  • the amount of ⁇ G in the sample is applied to a calibration curve representing the relationship between the ⁇ G concentration and the change in turbidity and scattered light intensity obtained by performing the same operation using a sample with a known ⁇ G concentration in advance.
  • the ⁇ G concentration in the sample can be obtained.
  • the concentration of ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 according to the present invention at each reaction is determined to what extent the measurement range of ⁇ G is, and depending on the specific measurement method. Different.
  • free ⁇ G-binding protein 1 and free ⁇ G-binding protein 2 used when measuring 0.1 pg to 1 ⁇ g of ⁇ G and performing measurement using two molecules of free ⁇ G-binding protein.
  • the amount of each used is 0.1 ng to 0.1 mg.
  • the amount of ⁇ G-binding protein 1 bound to the insoluble carrier is 0. 1 ng to 0.1 mg and the amount of labeled ⁇ G binding protein 2 used is about 0.1 ng to 0.1 mg.
  • ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 are used for example, when measuring 0.1 pg to 1 ⁇ g of ⁇ G and performing measurement using two molecules of ⁇ G-binding protein bound to an insoluble carrier such as latex particles, ⁇ G-binding protein 1 and The amount of ⁇ G-binding protein 2 used is about 0.1 ng to 0.1 mg, respectively.
  • the dose is 1 to 1000 ⁇ L, preferably 10 to 100 ⁇ L (containing 0.1 pg to 1 ⁇ g of ⁇ G) of the sample containing ⁇ G.
  • the ⁇ G-binding protein according to the invention is usually 1-1000 ⁇ L (containing 0.1 ng-0.1 mg as ⁇ G-binding protein), preferably 2-500 ⁇ L.
  • the reaction temperature is 25 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C.
  • the reaction time is usually 10 seconds to 30 hours, preferably 5 minutes to 20 hours, more preferably 30 minutes to 10 hours. .
  • ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 may be reacted with the sample at the same time or sequentially.
  • peroxidase POD
  • ⁇ G-binding protein 1 immobilized on an insoluble carrier and ⁇ G-binding protein 2 labeled with POD are used.
  • An example of a method for measuring the amount of ⁇ G in the derived sample is as follows.
  • a solution containing ⁇ G-binding protein 2 according to the present invention labeled with POD containing 0.1 ng to 0.1 mg of ⁇ G-binding protein 2
  • POD containing 0.1 ng to 0.1 mg of ⁇ G-binding protein 2
  • complex-2 a complex of immobilized ⁇ G-binding protein 1- ⁇ G-labeled ⁇ G-binding protein
  • the reaction is performed for a certain period of time, and a reaction stop solution such as 1M phosphoric acid is added to stop the reaction. Measure the absorbance at 450 nm.
  • ⁇ G in the sample By fitting the obtained measured value to a calibration curve showing the relationship between the measured value and the amount of ⁇ G obtained by performing the same operation using the same reagent as described above for a ⁇ G solution with a known concentration in advance, ⁇ G in the sample The amount can be determined.
  • ⁇ G When ⁇ G is detected by performing capillary chip electrophoresis, it may be performed by a differential refraction detector, a fluorescence detector, a UV detector, or the like. Among them, a UV detector or a fluorescence detector is preferable, and fluorescence detection is performed. A vessel is more preferred.
  • the ⁇ G measurement method of the present invention When the ⁇ G measurement method of the present invention is separated by, for example, capillary chip electrophoresis and measured with a fluorescence detector, it may be performed as follows.
  • the ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 used may be labeled with a labeling substance.
  • 1 to 50 ⁇ L of ⁇ G sample usually 0.001 to 10 ⁇ M, preferably 0.01 to 1 ⁇ M ⁇ G-binding protein 1 according to the present invention, and usually 0.01 to 10 ⁇ M, preferably 0.01 to 1 ⁇ M ⁇ G-binding protein according to the present invention.
  • 20 to 50 ⁇ L of a test solution containing 2 is mixed and allowed to react at 25 to 40 ° C. for 5 to 30 minutes, preferably 10 seconds to 15 minutes. Thereafter, the obtained solution is separated by an appropriate separation method, for example, capillary chip electrophoresis, and measured by, for example, a fluorescence detector.
  • the ⁇ G concentration in the sample can be obtained by applying the obtained measurement value to a calibration curve representing the relationship between the ⁇ G concentration prepared in advance using a ⁇ G solution having a known concentration and the measurement value. .
  • ⁇ G-binding protein 1 labeled with, for example, Alexa Fluor-488 tetrafluorophenyl ester and ⁇ G-binding protein 2 labeled with, for example, Alexa Fluor-647 succinimidyl ester are used, so-called fluorescence correlation correlation spectroscopy (Fluorescence Correlation Spectroscopy ( ⁇ FCCS) can also be used to measure ⁇ G.
  • fluorescence correlation correlation spectroscopy Fluorescence Correlation Spectroscopy ( ⁇ FCCS) can also be used to measure ⁇ G.
  • sample according to the present invention examples include, but are not limited to, clinical specimens such as blood, serum, plasma, urine, lymph, cerebrospinal fluid, pleural effusion, and ascites, pharmaceuticals, medical devices, foods, and the like.
  • buffer used to dissolve the ⁇ G-binding protein used in the measurement method of the present invention include, for example, Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, Good buffer, etc.
  • buffer used in the measurement method using the antigen-antibody reaction include all, and the pH is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction between the protein of the present invention and ⁇ G. A range is preferred.
  • the present invention is not limited to the method used, but can be sufficiently used for a measurement system using an automatic analyzer, and can perform measurement easily and quickly.
  • the reagent for ⁇ G measurement of the present invention includes “an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, or 20, and A reagent for ⁇ G measurement containing a protein having binding properties.
  • the ⁇ G binding protein may be immobilized on an insoluble carrier.
  • the ⁇ G binding protein may be labeled with a labeling substance.
  • Preferred embodiments of the insoluble carrier and the labeling substance are as described above.
  • the insoluble carrier on which the ⁇ G-binding protein is immobilized is not limited to one type of ⁇ G-binding protein immobilized on the insoluble carrier, but a plurality of types of ⁇ G-binding proteins are used as the insoluble carrier. It may be fixed.
  • the concentration of ⁇ G-binding protein contained in the reagent of the present invention is usually 0.1 ng / mL to 100 mg / mL, preferably 1 ng / mL to 10 mg / mL.
  • the reagent of the present invention may further contain other suitable reagents usually used in this field such as a buffering agent and an alkaline earth metal salt, and these reagents are used in so-called biochemical reactions and the like. What is necessary is just to select suitably from what is used.
  • the buffer include trishydroxylaminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer and the like that are usually used in this field, and the concentration of the buffer in the reagent is Depending on the buffer used, it is usually 5 mM to 500 mM, preferably 20 mM to 200 mM.
  • the ⁇ G-binding protein according to the present invention in the reagent may be a lyophilized product.
  • ⁇ G measurement kit of the present invention (1) Contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 or 20, and has a binding property to ⁇ G A reagent containing protein 1 ( ⁇ G-binding protein 1), and (2) the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 or 20 A reagent containing protein 2 having the same amino acid sequence and having binding ability to ⁇ G ( ⁇ G binding protein 2), Is included as a constituent requirement.
  • the ⁇ G binding protein may be supported on an insoluble carrier. Further, it may be labeled with a labeling substance.
  • ⁇ G-binding protein 1 and ⁇ G-binding protein 2 constituting the above (1) and (2) of the kit may be one kind or plural kinds, respectively. Further, ⁇ G-binding protein 1 constituting (1) and ⁇ G-binding protein 2 constituting (2) may be the same or different.
  • the ⁇ G measurement kit of the present invention can be used as necessary in sugar alcohols such as mannitol and sorbitol, sugars such as sucrose and trehalose, polysaccharides such as dextran, Reagents such as proteins such as serum albumin and stabilizers such as surfactants may be added, and the concentration and the like may be set according to the range usually used in this field.
  • the reagent containing the ⁇ G-binding protein of the present invention may use the buffer, alkaline earth metal salt, etc. described in the section of the reagent of the present invention, and the concentration thereof is in the same range as above. Use it.
  • it is good also as a kit which combined standard (beta) G for calibration curve preparation.
  • the standard ⁇ G may be a commercially available standard of ⁇ G manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., or a standard ⁇ G manufactured according to the method described in Japanese Patent No. 36552738.
  • the reagents in these reagent kits may be lyophilized products.
  • the ⁇ G-binding protein of the present invention is a ⁇ -subunit of factor G having a binding property to ⁇ G in a horseshoe crab blood cell component, and a fragment derived from the ⁇ subunit and having a binding property to ⁇ G.
  • ⁇ -subunit of factor G which is a component of Limulus genus hematopoietic blood cell extract, and a fragment thereof, which has a binding property to ⁇ G
  • G factor ⁇ which is a component of Tachypleus genus Hemocyte extract
  • the subunits and fragments thereof include proteins having binding ability to ⁇ G.
  • Examples of such ⁇ G-binding protein of the present invention include “an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14, or 20. And a protein having a binding property to ⁇ G ”.
  • a protein having an amino acid sequence identical to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14 or 20 and having binding ability to ⁇ G” in the ⁇ G-binding protein of the present invention Corresponds to each fragment of Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit or each fragment of ⁇ subunit of Tachypleus horseshoe crab G factor described in the above “method for measuring ⁇ G”.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14 or 20” of the present invention includes SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14 Or an amino acid sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and further preferably about 95% or more with the amino acid sequence represented by any one of 20 or 20.
  • Examples of the “protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 14 or 20” include, for example, SEQ ID NOs: 4, 6, 8 Examples thereof include a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by any one of 10, 14, and 20, and having binding ability to ⁇ G.
  • 1 to 5 (preferably 1 to 3) amino acids are substituted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 14, or 20.
  • Substitution, deletion, insertion, and addition may occur at a plurality of positions with respect to one amino acid sequence as long as the binding property of the protein to ⁇ G is not lost.
  • the ⁇ G-binding protein of the present invention can be produced by a general chemical method according to its amino acid sequence.
  • the ⁇ G-binding protein of the present invention can be obtained by ordinary chemical synthesis methods such as the fluorenylmethyloxycarbonyl method (Fmoc method) and the t-butyloxycarbonyl method (tBoc method). It can also be chemically synthesized using a commercially available peptide synthesizer.
  • the ⁇ G-binding protein of the present invention is obtained by incorporating a nucleic acid molecule encoding the ⁇ G-binding protein of the present invention into an appropriate expression vector such as a plasmid or phage, and transforming a host cell using the recombinant expression vector ( Alternatively, a well-known method using a genetic recombination technique in which the obtained host cell is amplified and secreted into or out of the cell can also be obtained.
  • the nucleic acid molecule encoding the ⁇ G-binding protein of the present invention has a nucleotide sequence that is the same or substantially the same as the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 13, or 19. Containing nucleic acid molecule. "
  • nucleic acid molecule containing the same base sequence as any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 13 or 19 encoding the ⁇ G-binding protein of the present invention.
  • Nucleic acid molecule consisting of the same base sequence as the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, or 13 and "SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 13”.
  • a nucleic acid molecule containing the entire base sequence identical to the base sequence represented by any one of 19 a nucleic acid molecule containing the entire base sequence identical to the base sequence represented by any one of 19 ”.
  • Nucleic acid molecule containing a base sequence substantially the same as the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 13 or 19 means SEQ ID NOs: 1, 3, 5 , 7, 9, 13 or 19 is a nucleic acid molecule having a base sequence in which one to several bases are partially deleted, added, substituted or inserted. Deletions, additions, substitutions and insertions may occur simultaneously at one or more sites in one nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule encoding the ⁇ G-binding protein of the present invention an amino acid that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 14, or 20
  • a nucleic acid molecule that is a base sequence that encodes a protein containing a sequence and having a binding property to ⁇ G (the ⁇ G-binding protein of the present invention).
  • Specific examples of the “ ⁇ G-binding protein of the present invention” mentioned here are as described in the explanation regarding the “ ⁇ G-binding protein of the present invention”.
  • the nucleic acid molecule may be DNA or RNA.
  • RNA is collected from horseshoe crab blood cells by a conventional method, and purified mRNA is obtained by using, for example, a conventional method of lifting with a poly (A) chain of mRNA. .
  • cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction by a conventional method. This cDNA is used as a template for the following PCR as a cDNA library containing the horseshoe crab G factor ⁇ subunit gene.
  • the base sequence of the DNA fragment incorporated into the recombinant expression vector is analyzed to confirm that the sequence containing the target horseshoe crab G factor ⁇ subunit gene is incorporated.
  • vectors used here include cloning vectors such as TA cloning vectors. It is convenient to use a commercially available cloning vector. For example, pGEM-T Easy (manufactured by Progema Co.) is widely used.
  • the base sequence of the DNA fragment incorporated into the recombinant vector is analyzed to confirm that the sequence containing the gene derived from the horseshoe crab G factor ⁇ subunit is incorporated.
  • an arbitrary position selected from the 3′-terminal region of the base sequence of the cDNA encoding the horseshoe crab G factor ⁇ subunit-derived fragment (SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 19)
  • a cDNA library (cDNA) containing an R primer designed from the above, an F primer designed from any position between the 5′-terminal region of the same sequence and the initiation codon, and a gene of a fragment derived from a horseshoe crab G factor ⁇ subunit as a template
  • the target horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment gene or its gene by a nucleic acid amplification method such as PCR using the above-obtained recombinant vector incorporating a sequence containing the horseshoe crab G factor ⁇ subunit gene)
  • a DNA fragment of a sequence containing the fragment (eg, SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 19) is amplified.
  • the obtained PCR product is incorporated into an appropriate expression vector DNA according to a conventional method to obtain an expression recombinant vector into which a sequence containing a fragment gene derived from the horseshoe crab G factor ⁇ subunit is obtained. If necessary, the base sequence of the DNA fragment incorporated into the recombinant vector for expression is analyzed, and it is confirmed that the sequence containing the target fragment gene of the horseshoe crab G factor ⁇ subunit is incorporated.
  • the base sequence of the DNA fragment incorporated into the recombinant vector for expression is analyzed, and it is confirmed that the target fragment gene derived from the horseshoe crab G factor ⁇ subunit or a sequence containing the fragment is incorporated.
  • the DNA fragment (including horseshoe crab G factor ⁇ subunit or its fragment gene sequence) to be incorporated into the recombinant vector for expression is used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker as desired. be able to.
  • the expression vector used in the above methods 1) to 3) has the function of expressing the ⁇ G-binding protein according to the present invention in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells and producing these proteins. If it has a person, it will not be specifically limited. For example, plasmid vectors, phage vectors and viral vectors are included.
  • pTrcHis2 vector pcDNA3.1 / myc-His vector (Invitrogen), pUC119 (Takara Shuzo), pBR322 (Takara Shuzo), pBluescript II II KS + (Stratagene), Pqe-tri (Qiagen), plasmid vectors such as pET, pGEM-3Z, pGEX, pMAL, bacteriophage vectors such as ⁇ ENBL3 (Stratagene), ⁇ DASHII (Funakoshi), Charomid DNA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) And cosmid vectors such as Lorist6 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Lorist6 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • plasmids derived from E. coli eg, pTrc99A, pKK223, pET3a
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast eg, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses, vaccinia
  • animal viruses such as viruses and baculoviruses, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Neo, p3 ⁇ FLAG-CMV-14, pCAT3, pcDNA3.1, pCMV, etc. .
  • the target ⁇ G-binding protein according to the present invention (a horseshoe crab G factor ⁇ subunit or a fragment thereof) is expressed as a fusion protein with another tag peptide or protein.
  • Tag peptides to be fused include FLAG tag, 3XFLAG tag, His tag (His tag, eg, 6 ⁇ His tag), and proteins include ⁇ -galactosidase ( ⁇ -Gal), green fluorescent protein (GFP), maltose binding protein (MBP) ) And the like.
  • a ⁇ G-binding protein according to the present invention is a fusion protein with these peptides or proteins by inserting a linker for sequences encoding tag peptides or using an expression vector containing sequences encoding tag peptides or proteins in advance. As expressed.
  • pTrcHis 2 vector manufactured by Invitrogen
  • a His tag gene is incorporated as an expression vector and incorporating a sequence containing a ⁇ G-binding protein gene upstream thereof
  • a sequence containing a ⁇ G-binding protein gene upstream thereof by confirming the expression of this His tag, the expression of the ⁇ G binding protein gene in the upstream region will also be confirmed.
  • the recombinant of the present invention is a recombinant into which the nucleic acid molecule of the present invention as described above is incorporated, and includes an expression recombinant vector into which the ⁇ G-binding protein gene according to the present invention is incorporated. Specific examples thereof are as described above.
  • transformant (transductant) of the present invention can be prepared by transforming (transducing) an appropriate host cell using the obtained recombinant vector for expression.
  • host cells used for this purpose include microorganisms [bacteria (eg, Escherichia, Bacillus), yeast (eg, Saccharomyces), animal cells, insect cells, etc.).
  • microorganisms bacteria (eg, Escherichia, Bacillus), yeast (eg, Saccharomyces), animal cells, insect cells, etc.).
  • cell-free expression systems and plant cell systems that are commonly used in this field can also be implemented.
  • Escherichia examples include Escherichia coli .
  • Escherichia coli BL21, BL21 (DE3), K-12, DH1, DH5, DH5 ⁇ , M15, HB101, C600, XL-1 Blue, JM109, JM105, JM127, XL1-Blue, VCS257, TOP10).
  • Bacillus examples include B. subtilis , B. brevis , and B. borstelenis .
  • yeast include Aspergillus filamentous fungi such as S. cerevisiae , Scizo. Pombe , A. nidulans , and Pichia pastoria , and Asperigillus nidulans .
  • animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO, mouse L cells, human HeLa cells, and FL cells.
  • insect cells examples include BmN4 and Sf9, but are not particularly limited thereto.
  • Competent Cell Competent Cell with higher efficiency of introducing plasmid or phage DNA may be used.
  • E. coli DH5 ⁇ Competent Cell E. coli JM109 Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can be mentioned.
  • Transformation of a host cell with an expression vector can be performed using a conventionally known method.
  • the host cell is a bacterium (for example, E. coli ), for example, the method of Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1972) 9,2110), the protoplast method (Mol. Gen. Genet., (1979) 168,111) or competent method (J. Mol. Biol., (1971) 56, 209), M. Morrison method (Method in Enzymology, 68, 326-331, 1979) Can do.
  • transformation transformation may be performed according to the product protocol.
  • a recombinant vector for expression incorporating a fragment containing a gene sequence encoding the target ⁇ G-binding protein for example, a recombinant vector
  • a recombinant vector There is a method of using the drug resistance gene previously possessed by the expression vector used to obtain the drug, examining the drug resistance of the introduced body, and confirming that it is resistant.
  • the pTrcHis2 vector when used as an expression vector, the vector has a gene for ampicillin resistance ( amp r ).
  • the obtained transformant is cultured in a medium supplemented with ampicillin, and the cultured transformant (ampicillin resistant strain) is recombined for expression incorporating a base sequence encoding the target ⁇ G-binding protein.
  • a method for confirming that a transformant has been transformed with a vector is mentioned.
  • the obtained transformant produces the target ⁇ G-binding protein according to the present invention (hereinafter sometimes referred to as “recombinant ⁇ G-binding protein”) ( ⁇ G-binding property).
  • recombinant ⁇ G-binding protein ⁇ G-binding property
  • there are the following methods in addition to hybridization such as Southern hybridization and colony hybridization using a conventional probe.
  • the recombinant ⁇ G binding protein is not secreted into the culture medium of the transformant, such as when expressed as a transmembrane protein, a conventional method for destroying or lysing the cells (for example, sonication, homogenizer)
  • a membrane solubilizer such as a suitable surfactant, etc.
  • a conventional immunoassay method using an antibody against the tag peptide for example, a conventional immunoassay method using an antibody against the tag peptide (dot western blotting method, western blotting method, etc.) is performed, and the culture is performed.
  • a transformant that expresses the target recombinant ⁇ G-binding protein can be obtained.
  • a recombinant horseshoe crab G factor ⁇ subunit-derived fragment is secreted into the culture medium of the transductant, the culture medium (culture supernatant) is subjected to normal immunology as in the case of the lysate. And a transformant expressing the desired recombinant ⁇ G-binding protein may be selected and obtained in the same manner.
  • the ⁇ G-binding protein according to the present invention is obtained by transforming a transformant transformed with an expression plasmid vector incorporating a sequence containing the ⁇ G-binding protein gene obtained as described above into a nutrient medium. It can be obtained by culturing in to produce a recombinant ⁇ G binding protein.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant).
  • the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose.
  • the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, large extract, and the like. Examples include soybean koji and potato extract.
  • other nutrients for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride], vitamins, antibiotics, growth promoting factors and the like may be contained.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Cultivation is performed by methods known in the art.
  • the culture conditions such as temperature, medium pH and fermentation time are selected so as to obtain the highest titer of ⁇ G-binding protein according to the present invention.
  • the culture medium When cultivating a transformant (transductant) whose transformant host is Escherichia coli, the culture medium may be a commonly used medium under the usual conditions for culturing Escherichia coli.
  • a liquid medium is suitable.
  • any medium that is usually used for culturing Escherichia coli may be used.
  • synthetic media such as D-MEM and RPMI, LB media, 2 ⁇ YT media, Terrific Broth, M9 media [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972).
  • Culturing can be performed usually at 14 to 42 ° C., preferably 28 to 39 ° C. for about 3 to 24 hours, with aeration and agitation if necessary.
  • a drug such as isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) or 3 ⁇ -indolylacrylic acid may be added. 4).
  • the ⁇ G-binding protein according to the present invention can be obtained from the culture obtained by the above culture as follows.
  • the culture is subjected to a conventional method such as filtration or centrifugation to collect the cells or cells.
  • a suitable buffer solution for example, disrupting cell walls and / or cell membranes of cells by a method such as surfactant treatment, ultrasonic treatment, lysozyme treatment, freeze-thawing, etc.
  • the present invention is applied by a method such as centrifugation or filtration
  • a crude extract containing the ⁇ G-binding protein according to 1 is obtained.
  • the ⁇ G-binding protein according to the present invention is purified and isolated so as not to be contaminated with ⁇ G according to a conventional method generally used for purifying and isolating natural or synthetic proteins.
  • ⁇ G-binding protein isolation and purification methods include, for example, methods utilizing solubility such as salting-out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, etc. , Methods using charge such as ion exchange chromatography, methods utilizing specific affinity such as affinity chromatography, methods utilizing hydrophobicity differences such as reverse phase high performance liquid chromatography, isoelectric Examples thereof include a method using a difference in isoelectric point such as point electrophoresis.
  • the expressed recombinant ⁇ G-binding protein has a His tag. Therefore, the target recombinant ⁇ G-binding protein is purified by subjecting the solution containing the recombinant ⁇ G-binding protein to affinity chromatography using a column packing containing nickel ions such as Ni-NTA® (nickel-nitrilotriacetic® acid) ®. can do.
  • Ni-NTA® nickel-nitrilotriacetic® acid
  • the solution containing the recombinant ⁇ G-binding protein purified by the above method may be further subjected to affinity chromatography using a filler to which the ⁇ -binding protein according to the present invention is bound.
  • the host used for the expression of the recombinant ⁇ G-binding protein is a eukaryote such as yeast
  • the host product may also contain ⁇ G produced by the host. Therefore, in order to remove this host-derived ⁇ G and obtain the desired recombinant ⁇ G-binding protein, it is preferable to further add this affinity chromatography treatment to the purification treatment.
  • the presence of the ⁇ G-binding protein according to the present invention thus separated and purified can be confirmed by measurement, for example, by ELISA using an anti-His antibody.
  • Example 1 (1) using RNA recovered RNA extraction reagent ISOGEN (manufactured by Nippon Gene), the following products supplied protocol, as described below, were collected and total RNA from Limulus genus Limulus hemocytes.
  • ISOGEN manufactured by Nippon Gene
  • the obtained blood cell homogenate was incubated at room temperature for 5 minutes, then 1.4 mL of chloroform was added, stirred for 15 seconds, and further incubated at room temperature for 3 minutes. Thereafter, the homogenate was centrifuged at 12000 G for 15 minutes at 4 ° C., and then the aqueous phase was transferred to a new tube. After 3.5 mL of isopropanol was added and stirred, the mixture was incubated at room temperature for 10 minutes. The homogenate was then centrifuged at 12000 G for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a precipitate. The resulting precipitate was washed with 7 mL of 70% ethanol and dried to obtain an RNA precipitate.
  • the obtained RNA precipitate was dissolved in 800 ⁇ L of sterile water.
  • the absorbance of the obtained RNA aqueous solution was measured, and the amount of total RNA obtained was measured.
  • Limulus horseshoe crab blood cells 640 mg to 779 ⁇ g of total RNA were obtained.
  • RNA aqueous solution obtained in (1) above 250 ⁇ l was added to 250 ⁇ l of the total RNA aqueous solution obtained in (1) above (about 243 ⁇ g as total RNA), and 500 ⁇ L of the solution was further added.
  • Oligotex TM -dT30 the reaction was incubated at 65 ° C. for 5 minutes. The reaction was placed on ice for 3 minutes. Subsequently, 0.1 ml of 5M NaCl was added to the reaction solution and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the reaction solution was centrifuged at 15000 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was dissolved in 450 ⁇ l TE (Tris-EDTA buffer, pH 8.0).
  • the pellet solution was incubated at 65 ° C. for 5 minutes and then placed on ice for 3 minutes. Thereafter, the pellet solution was centrifuged at 20000 G for 3 minutes, and 400 ⁇ L of the supernatant was recovered. After subjecting the supernatant to normal ethanol precipitation, the resulting precipitate was dissolved in 10 ⁇ L TE to obtain a purified mRNA solution.
  • primer sequence primer F1 5'-gcaatgttggtgttgc-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • primer R1 5'-gaagaaacaacagctgttgacc-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • primer F1 is 3 bases (gca: signal sequence) 5 ′ to the start codon of the gene encoding Tachypleus genus G factor ⁇ subunit disclosed in NCBI (National Center for Biotechnology Information) database. And a 16-base sequence from the start codon to the 13th base on the 3 ′ end side.
  • primer R1 encodes several amino acids on the C-terminal side of the Tachypleus genus G factor ⁇ subunit.
  • PCR uses this primer pair, uses the cDNA obtained in (3) 1) above as a template, heats at 98 ° C. for 2 minutes under the following reaction conditions, then 95 ° C. for 15 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, The process was repeated 30 times at 68 ° C. for 30 minutes, and finally at 68 ° C. for 5 minutes.
  • PCR reaction conditions Sterile water 12 ⁇ l cDNA 2 ⁇ l primer F1 1 ⁇ l primer R1 1 ⁇ l 0.2 mM dNTP (mixture of dATP, dGTP, dCTP, dTTP) (Nippon Gene) 2 ⁇ l 2 ⁇ TOPOTAQ Amplification Buffer with 6 mM MgCl 2 (Wako Pure Chemical Industries) 20 ⁇ l TOPOTAQ DNA Polymerase (Wako Pure Chemical Industries) 2 ⁇ l
  • the obtained PCR product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis containing 1 ⁇ g / mL of ethidium bromide, and a band portion gel near 1.2 Kbp was cut out.
  • the PCR product was purified from the excised gel using QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen).
  • Base sequence homology search The base sequence (BioRad Laboratories Co., Ltd.) is used to decode the base sequence of the obtained sequence reaction product [having the same base sequence as the cDNA obtained in (3) 1) above]. It was performed using.
  • the base sequence encoding the Limulus genus G factor ⁇ subunit obtained by decoding is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded by this base sequence deduced from the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the base sequence of the PCR product inserted into the vector that is, the base sequence of cDNA is different from the known Tachypleus genus G factor ⁇ subunit gene sequence, although showing high homology. That is, the homology between the gene sequence of the known Tachypleus genus G factor ⁇ subunit and the gene sequence corresponding to the Limulus genus G factor ⁇ subunit (excluding the signal peptide and the partial sequence on the N-terminal side and the stop codon) is 85.6. %Met. Moreover, when the amino acid sequences deduced from the respective base sequences were compared, the homology between them was 79.5%.
  • the structure of the Limulus genus G factor ⁇ subunit was analyzed in detail based on the amino acid sequence encoded by this nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) deduced from the nucleotide sequence of the obtained cDNA.
  • the Limulus genus G factor ⁇ subunit has a ⁇ -1,3-glucanase-like domain on the N-terminal side and a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ) that appears to be a ⁇ G-binding domain on the C-terminal side, And it became clear that a xylanase A-like domain (XlnA-like domain) exists in the center.
  • the difference from the amino acid sequence of the known Tachypleus genus G factor ⁇ subunit is that (i) the linker sequence between the ⁇ G binding domains of the dimeric sequence present on the C-terminal side is completely different, (ii) The QQWS motif, which is a structural motif present in the xylanase A-like domain in the center of the sequence, was repeated three times in the Tachypleus genus G factor ⁇ subunit, whereas it was repeated twice in the Limulus genus G factor ⁇ subunit.
  • FIG. 1 the schematic diagram of the structure of Limulus genus G factor ⁇ subunit predicted from the above analysis is shown in FIG. 1, and the schematic diagram of the known Tachypleus genus G factor ⁇ subunit structure is shown in FIG.
  • Primer sequence primer F2 5'-aatacaccttctcctgttgacg-3 '(SEQ ID NO: 23) primer R2 5'-ctggattaagattacaaaggtt-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • the peptide having the amino acid sequence from 233 to 649 of this Limulus genus G factor ⁇ subunit was named “ Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a”. That is, “ Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a” has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. The amino acid sequence of the fragment a is encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragments a, so that it can be compared to the schematic diagram of the Limulus genus G factor ⁇ subunit, shown in the lower portion of FIG. 1. That, Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragment a is xylanase A-like domain of Limulus genus G factor ⁇ subunit (two QQWS motifs are present.) And, in the dimer seems to ⁇ G binding domain It has a xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • PCR was performed at 98 ° C for 2 minutes under the following reaction conditions, followed by repeating 30 times of 95 ° C for 15 seconds, 63 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute, and finally at 68 ° C for 5 minutes. .
  • PCR reaction conditions Sterile water 12 ⁇ l Limulus genus G factor ⁇ / pGEM-T 2 ⁇ l primer F2 1 ⁇ l primer R2 1 ⁇ l 0.2 mM dNTP (mixture of dATP, dGTP, dCTP, dTTP) (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) 2 ⁇ l 2 ⁇ TOPOTAQ Amplification Buffer with 6 mM MgCl 2 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 20 ⁇ l TOPOTAQ DNA Polymerase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2 ⁇ l
  • the obtained PCR product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis containing 1 ⁇ g / mL of ethidium bromide, and a band gel around 1.3 Kbp was excised, and PCR was performed from the excised gel using QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen). The product was purified.
  • pTrcHis2 vector manufactured by Invitrogen
  • 4 ⁇ L of the obtained PCR product were mixed and made up to a total volume of 5 ⁇ L with sterile water.
  • a ligation reaction was performed by incubating at 25 ° C. for 5 minutes to prepare a recombinant vector.
  • an E. coli K strain-derived DH5 ⁇ competent cell line manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • This transformant was cultured at 37 ° C. for 1 day on an LB agar medium containing ampicillin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (100 ⁇ g / ml) to form colonies.
  • a transformant having the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as a reading frame was named “ Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a (233-649 aa) / DH5 ⁇ ”.
  • Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragment a is a transformant expressing selected above (6) (233-649Aa) Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragment a (233-649Aa) / the DH5 ⁇ Pre-cultured overnight.
  • the culture solution (5 mL) was inoculated into 1 L of LB medium containing 100 mg / L ampicillin, and cultured with stirring at 37 ° C. for 4 hours.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the culture solution was centrifuged, and the resulting precipitate (bacteria) was collected.
  • the precipitate was washing the precipitate with distilled water (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), the bacterial cells were crushed with ultrasonic waves and centrifuged (5000 g ⁇ 10 minutes) to obtain a supernatant fraction.
  • the expressed protein has 6 Hiss derived from the pTrcHis2 vector added to the C-terminal side. Therefore, Ni-agarose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used, and affinity purification with Ni-agarose was performed according to the method described in the attached manual, and protein was obtained from the supernatant fraction obtained above. Purified.
  • the PVDF membrane was washed three times with PBS-T (containing 0.05% polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then ECLplus (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used.
  • the X-ray film (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was exposed to light.
  • the gel after SDS-PAGE was stained using a silver staining kit (Wako Pure Chemical Industries) according to the method described in the manual attached to the kit.
  • Results are shown in FIGS. 3 (a) and 3 (b).
  • (a) shows the result of Western blotting
  • (b) shows the result of silver staining of the gel after SDS-PAGE.
  • lane (1) is a protein molecular weight marker Dr. Western (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.), and lane (2) is a result of using affinity purified fragment a as a sample.
  • lane (1) is a result of using protein molecular weight marker Precision Plus Protein Standard (manufactured by BIO-RAD), and lane (2) is a result of using affinity purified fragment a as a sample.
  • the molecular weight of the Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a deduced from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is about 48 kDa.
  • the protein size of the band reacted with the peroxidase-labeled anti-His antibody (FIG. 3 (a)), confirmed by SDS-PAGE is about 48 kDa
  • Limulus genus factor G A band was confirmed at the same position as the molecular weight of the ⁇ subunit-derived fragment a.
  • Example 2 Measurement of ⁇ G by various ⁇ G-binding proteins (1) Preparation of various ⁇ G-binding proteins 1) Fragment of a horseshoe crab (genus Limulus ) G factor ⁇ subunit a The recombinant Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a obtained in Example 1 was used.
  • mRNA was purified from an extract obtained from silkworm larvae blood cells, and cDNA was obtained by reverse transcription reaction.
  • the obtained cDNA was used as a template, 5′-tacgaggcaccaccg-3 ′ (SEQ ID NO: 39) was used as an F primer, and 5′-gttaaagtttttgcaata-3 ′ (SEQ ID NO: 40) was used as an R primer.
  • PCR was performed under conditions.
  • the obtained PCR product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis containing 1 ⁇ g / mL of ethidium bromide, and the gel in the band part near 1.5 kbp was cut out.
  • the PCR product was purified from the excised gel using QIAquick Gel Extraction kit.
  • Example 1 (6) using the same expression vector (pTrcHis2 vector) as used in Example 1 (6), an expression vector was prepared and a DH5 ⁇ competent cell line derived from the Escherichia coli K strain was transformed. Thereafter, the transformant was cultured in the same manner as in Example 1 (7) to express “the silkworm-derived ⁇ G recognition protein (1-479aa)”. After the culture, the protein was purified from the culture broth in the same manner as in Example 1 (7).
  • Fig. 3 of Proc.Natl.Acad.Sci. USA vol.93, p.7888-7893 shows the binding of gram-negative bacteria derived from silkworm.
  • An amino acid sequence of a gram-negative bacteria-binding protein and a base sequence encoding the same are described.
  • the protein is a protein consisting of 467 amino acids and is encoded by a 2257 bp nucleotide sequence.
  • the structure of the protein is described as “includes a glucanase-like domain and is similar to the factor G ⁇ domain”, it was assumed that this protein has a property of binding to ⁇ G.
  • mRNA was purified from an extract obtained from silkworm larvae blood cells, and cDNA was obtained by reverse transcription reaction.
  • the obtained cDNA was used as a template, 5′-atatcgtacgctcaaatgcc-3 ′ (SEQ ID NO: 41) was used as an F primer, and 5′-ctttgtcaaagttatcgcctta-3 ′ (SEQ ID NO: 42) was used as an R primer.
  • PCR was performed under conditions.
  • the obtained PCR product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis containing 1 ⁇ g / mL of ethidium bromide, and the gel in the band part near 1.5 kbp was cut out.
  • the PCR product was purified from the excised gel using QIAquick Gel Extraction kit.
  • Example 1 (6) using the same expression vector (pTrcHis2 vector) as used in Example 1 (6), an expression vector was prepared and a DH5 ⁇ competent cell line derived from the Escherichia coli K strain was transformed. Thereafter, the transformant was cultured in the same manner as in Example 1 (7) to express “the silkworm-derived ⁇ G recognition binding protein (1-454aa)”. After the culture, the protein was purified from the culture broth in the same manner as in Example 1 (7).
  • a protein of the glucanase-like portion of the ⁇ G recognition protein comprising the amino acid sequence of the 181st to 471st amino acids of the C-terminal side of this Noshimemadagai (hereinafter referred to as “Noshimemadaraika-derived ⁇ G recognition protein (181-471aa)”) Is obtained according to the method described in Fabrick JA, et al., Insect Biochem. Mol. Biol., Vol.33, p.579-594, 2003 and the method described in Example 1 above. It was.
  • mRNA was purified from an extract obtained from the hemolymph of Noshime-Madame, and cDNA was obtained by a reverse transcription reaction.
  • cDNA was obtained by a reverse transcription reaction.
  • 5′-gaggtcaagtttcctgaag-3 ′ (SEQ ID NO: 43) was used as an F primer
  • 5′-gtcagagtctatgcgctg-3 ′ SEQ ID NO: 44
  • the obtained PCR product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis containing 1 ⁇ g / mL of ethidium bromide, and the gel in the band part near 1.5 kbp was cut out.
  • the PCR product was purified from the excised gel using QIAquick Gel Extraction kit.
  • Example 1 (6) using the same expression vector (pTrcHis2 vector) as used in Example 1 (6), an expression vector was prepared and a DH5 ⁇ competent cell line derived from the Escherichia coli K strain was transformed. Thereafter, the transformant was cultured in the same manner as in Example 1 (7) to express “Noshimemadaraika-derived ⁇ G recognition protein (181-471aa)”. After the culture, the protein was purified from the culture broth in the same manner as in Example 1 (7).
  • pTrcHis2 vector a DH5 ⁇ competent cell line derived from the Escherichia coli K strain was transformed. Thereafter, the transformant was cultured in the same manner as in Example 1 (7) to express “Noshimemadaraika-derived ⁇ G recognition protein (181-471aa)”. After the culture, the protein was purified from the culture broth in the same manner as in Example 1 (7).
  • Block Ace manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
  • 50 mM phosphate buffered saline pH 7.0
  • the numerical value described in Table 3 is a value obtained by subtracting a blank value from the obtained absorbance at 450 nm and multiplying by 1000.
  • each symbol is a result when the following samples are used.
  • a iv ⁇ G recognition protein
  • Table 4 shows the value S / N ratio obtained by dividing each obtained absorbance measurement value by the blank value.
  • ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 200 or more and S / N is 3.0 or more ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 100 or more and S / N is 1.5 or more ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 50 to 99 or S / N is 1.0 or more ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 0 to 49 or S / N is 1.0 or more
  • the ⁇ G measurement method using the ⁇ G-binding protein according to the present invention is based on the plate (iii) and the horseshoe crab ( Limulus genus) on which the fragment a derived from horseshoe crab ( Limulus genus) G factor ⁇ subunit is immobilized. This is a measurement method using both the factor G ⁇ subunit-derived fragment a (iii).
  • Example 3 Sandwich measurement 1 using fragments derived from Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit (1) Based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the Limulus genus limulus factor G ⁇ subunit obtained in Limulus genus Limulus G design examples of factors ⁇ subunits derived fragment 1 (5), the following four kinds of Limulus A fragment derived from the genus G factor ⁇ subunit was designed. In addition, the schematic diagram of each fragment
  • Fragment a derived from Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit: Fragment a obtained in Example 1. It consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 233rd to 649th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of the Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2. It has a xylanase A-like domain (two QQWS motifs are present) and a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment derived from Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit b consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 387th to 649th amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence of Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2. It has a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Limulus genus Factor G subunit ⁇ fragment c consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 524th to 649th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of the Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2. It has one domain on the C-terminal side of the dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ) possessed by the Limulus genus G factor ⁇ subunit.
  • XlnZ dimeric xylanase Z-like domain
  • Limulus genus G-factor ⁇ subunit-derived fragment d consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9. This corresponds to the amino acid sequence portion from the N-terminal to the 233rd to 515th amino acids of the Limulus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 2.
  • Xylanase A-like domain (having two QQWS motifs) and dimer xylanase Z-like domain (XlnZ) of Limulus genus G factor ⁇ subunit have one N-terminal domain.
  • Tachypleus genus limulus factor G ⁇ disclosed design NCBI (National Center for Biotechnology Information) database subunits derived fragment, based on the gene sequence of Tachypleus genus G factor ⁇ subunit (SEQ ID NO: 11), the following Four Tachypleus genus G factor ⁇ subunit-derived fragments were designed.
  • piece is shown together in FIG. 2 so that it can compare with the schematic diagram of Tachypleus horseshoe crab G factor alpha subunit.
  • Fragment derived from Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit e consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 13. This corresponds to the amino acid sequence of the 299th to 673rd amino acid sequence from the N-terminal of the amino acid sequence of the Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12. It has a xylanase A-like domain (three QQWS motifs are present) and a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment derived from Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit f consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 15. This corresponds to the 410th to 673rd amino acid sequence portion from the N-terminus of the amino acid sequence of the Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12. It has a dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Fragment derived from Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit g consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 17. This corresponds to the amino acid sequence portion of the 548th to 673rd amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence of the Tachypleus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12.
  • SEQ ID NO: 12 the amino acid sequence portion of the 548th to 673rd amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence of the Tachypleus genus G-factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12.
  • XlnZ dimeric xylanase Z-like domains
  • Tachypleus genus G-factor ⁇ subunit-derived fragment h consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19. This corresponds to the 299th to 547th amino acid sequence portion from the N-terminus of the amino acid sequence of the Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit represented by SEQ ID NO: 12. It has a xylanase A-like domain (three QQWS motifs are present) and one of the N-terminal domains of the dimeric xylanase Z-like domain (XlnZ).
  • Table 6 shows the sequence number of the amino acid sequence of each fragment, the sequence number of the base sequence encoding the amino acid, the base sequence of the primer pair used when cloning each base sequence, and the sequence number.
  • Each primer having the base sequence shown in Table 6 was synthesized by Sigma. Then, except for using the primers, in the same manner as in Example 1 (6), a recombinant vector Limulus genus G factor alpha / pGEM-T used as a template to perform PCR. The obtained PCR product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis containing 1 ⁇ g / mL of ethidium bromide, and the gel in the band part near 1.5 kbp was cut out. The PCR product was purified from the excised gel using QIAquick Gel Extraction kit.
  • Example 1 Next, using the same expression vector (pTrcHis2 vector) as used in Example 1 (6), an expression vector was prepared and a DH5 ⁇ competent cell line derived from the Escherichia coli K strain was transformed. Thereafter, the transformant was cultured in the same manner as in Example 1 (7) to express each fragment. Mass production of each fragment was performed by the above method.
  • Table 7 The numerical values described in Table 7 are values obtained by subtracting a blank value from the obtained absorbance at OD 450 nm and multiplying by 1000. Moreover, in Table 7, each symbol is a result when the following horseshoe crab G factor ⁇ subunit-derived fragment is used.
  • Table 8 shows the value S / N ratio obtained by dividing each obtained absorbance measurement value by the blank value.
  • ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 200 or more and S / N is 3.0 or more ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 100 or more and S / N is 1.5 or more ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 50 to 99 or S / N is 1.0 or more ⁇ : OD450nm ( ⁇ 1000) is 0 to 49 or S / N is 1.0 or more NT: not test
  • a more preferable combination of (fragment immobilized on plate-fragment labeled with peroxidase) in the case of measuring ⁇ G by the method of this example is (fragment a-fragment a) (Fragment a-fragment f), (fragment b-fragment a), (fragment b-fragment d), (fragment b-fragment f), (fragment e-fragment f) and (fragment f-fragment f). It was.
  • Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment c Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment d, Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment g and Tachypleus horseshoe crab G factor ⁇ subunit fragment h are all xylanases. It has one Z domain (monomer).
  • fragment immobilized on the plate used for the measurement and peroxidase-labeled fragments fragment immobilized on the plate-peroxidase-labeled fragment
  • Measurement was carried out using any combination of (dimer-2mer), (dimer-1mer), (monomer-2mer), and (monomer-1mer). It can be seen that ⁇ G can also be measured.
  • the ⁇ G binding protein 1 according to the present invention and the ⁇ G according to the present invention labeled with the labeling substance are labeled. It can be seen that ⁇ G can be measured by carrying out a sandwich measurement system using binding protein 2.
  • Example 4 Sandwich measurement 2 using fragments derived from horseshoe crab G factor ⁇ subunit (1) Preparation of horseshoe crab G factor ⁇ subunit-derived fragment 1) Preparation of Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment b and Tachypleus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment g B Except for using strain-derived BL21 (DE3), the same method as in Example 3 (3) was performed to express Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment b and Tachypleus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment g. And purified.
  • Tachypleus genus G factor ⁇ subunit derived fragment g / Cys Preparation Tachypleus genus G factor ⁇ subunit from fragments g (547aa-673aa) Tachypleus genus G factor ⁇ subunit introduce a cysteine 1 residue at the N-terminus of the The derived fragment g / Cys was designed.
  • primer F a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 45 (5′-tgttctaaattaattcaggcag-3 ′) is used as primer F
  • primer R a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 36
  • primer F and primer R are The fragment g / Cys derived from Tachypleus genus G factor ⁇ subunit was expressed and purified by the same method as in Example 3 (3) except for the synthesis except for Sigma.
  • the absorbance at 450 nm was measured using Vmax (manufactured by Molecular Devices) in the same manner as in Example 2 (3) 4). In addition, it measured similarly using the sample of lentinan conversion value 0pg / mL, and was set as the blank value.
  • Table 10 uses the peroxidase labeled product of the Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment b obtained in (1) 1) above or the peroxidase labeled product of the Tachypleus genus G factor ⁇ subunit derived fragment g obtained as (1) 1) above. The result is shown.
  • Table 11 shows the results when the peroxidase-labeled product of Tachypleus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment g / Cys obtained in (1) 2) above was used as the peroxidase-labeled fragment.
  • Example 3 Comparing the results of Table 10 and Table 11 with the results of Table 9 obtained in Example 3, the fragment b derived from the Limulus genus G factor ⁇ subunit obtained in (1) 1) above was used as the peroxidase-labeled fragment.
  • ⁇ G could not be measured (fragment immobilized on plate-peroxidase-labeled fragment) combinations (fragment a-fragment b), (fragment b-fragment b), (fragment Even in the case of c-fragment b), (fragment f-fragment b), and (fragment g-fragment b), ⁇ G could be measured with sufficient sensitivity.
  • Example 3 peroxidase is bound to two Cys residue portions in the ⁇ G binding domain of the factor G ⁇ subunit fragment.
  • the peroxidase bound to the fragment inhibited the binding between the fragment and ⁇ G. Therefore, in this example, a Cys residue was introduced at the N-terminus of the fragment, and peroxidase was bound thereto.
  • peroxidase does not inhibit the binding between the fragment and ⁇ G, and ⁇ G can be measured with sufficient sensitivity.
  • primer F a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 46 (5'-tgtctggattaagattacaaagg-3 ') is used as primer F
  • primer R a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 24 is used as primer R
  • primer F and primer R was synthesized by consigning to Sigma, Inc.
  • Sample preparation “ ⁇ -glucan standard product” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) attached to ⁇ -glucan test Wako, which is a ⁇ G measurement kit, was dissolved in 50 mM PBS (pH 7.5). It was diluted with serum albumin and adjusted to a lentinan conversion value (described in the instruction manual attached to “ ⁇ G standard product”: the indicated value 35 pg corresponds to 1 ng of lentinan) 1000 pg / mL. Further, 0.5% serum albumin dissolved in 50 mM phosphate buffered saline (pH 7) was prepared to lentinane converted values of 0, 20, 50, 100, 250, 400, and 500 pg / mL. This was used as a sample.
  • TMB solution manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • kit reaction stop solution (1M phosphoric acid solution) was added to each well to stop the reaction. Absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using Vmax (Molecular Device).
  • a calibration curve was prepared by plotting the absorbance (OD 450 nm, y axis) at 450 nm against the lentinan concentration (converted value, pg / mL, x axis) in the sample.
  • regression line equation and the correlation coefficient obtained from the measured value by the least square method are as follows.
  • a lentinan concentration of 20 pg / mL corresponds to a blood glucan of 0.7 pg / mL (cut-off value of 11 pg / mL or less) as measured with ⁇ -glucan test Wako, which is a ⁇ G measurement kit used for the measurement. .
  • Example 6 Confirmation of peroxidase-like activity of horseshoe crab G factor ⁇ subunit-derived fragment (1) ⁇ G-binding protein Recombinant Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a obtained in Example 1 and obtained in Example 3 The recombinant Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment b was used.
  • Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragment a has a 233 th to 649 th amino acid sequence from the N-terminus of Limulus genus G factor ⁇ subunit
  • Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragment b Has the amino acid sequence from the 387th to the 649th amino acid from the N-terminus of the Limulus genus G factor ⁇ subunit.
  • the ⁇ G-binding protein of (1) above was prepared to 0, 3, 4, 5, 6, 7 ⁇ g / mL with 50 mM MOPS buffer (pH 7.0), respectively, and ELISA micro assay was performed. 50 ⁇ L was dispensed into each well of the plate. Each ⁇ G-binding protein was immobilized on a microplate by allowing to stand at 10 ° C. for 16 hours.
  • TMB solution manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • reaction stop solution (1M phosphoric acid solution) was added to each well to stop the reaction. Absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using a Vmax® (manufactured by Molecular Devices).
  • the Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment b does not exhibit peroxidase activity within a concentration range of 0, 3, 4, 5, 6, 7 ⁇ g / mL.
  • the peroxidase activity could be confirmed depending on the concentration of the fragment a in the range of 0, 3, 4, 5, 6, 7 ⁇ g / mL.
  • Example 7 Involvement of metal ions in peroxidase activity of Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a
  • a solution 50 mM MOPS buffer (pH 7.0)
  • ethylenediaminetetraacetic acid ⁇ 2Na (EDTA) is mixed to a final concentration of 70 m, or NaN 3 to a final concentration of 0.05%. Incubated.
  • a 10 ⁇ g / mL solution of Limulus genus factor G subunit-derived fragment a not containing these metal chelating agents was prepared.
  • each solution after incubation is prepared with 50 mM MOPS buffer (pH 7.0) so that the Limulus genus factor G subunit-derived fragment a is 5 ⁇ g / mL, and is added to each well of the ELISA microplate.
  • 50 ⁇ L was dispensed and allowed to stand at 10 ° C. for 12 to 20 hours for immobilization.
  • 0.2 ml of 1% Block Ace solution or 0.1% serum albumin dissolved in 50 mM phosphate buffered saline (pH 7.0) was dispensed to each well at room temperature. Left for 1 hour to wash each well.
  • TMB solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well by 50 ⁇ L and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 50 ⁇ L of reaction stop solution (1M phosphoric acid solution) was added to each well, and the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using a Vmax® (manufactured by Molecular Devices).
  • Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragment a is, the presence of EDTA or NaN 3 is a metal chelating agent, that peroxidase activity of Limulus genus G factor ⁇ subunit derived fragment a is lost It could be confirmed. As a result, it is considered that metal ions are involved in Limulus genus G in order to obtain peroxidase activity.
  • Example 8 Sandwich measurement 4 using fragments derived from horseshoe crab G factor ⁇ subunit (1) Limulus genus limulus factor G ⁇ subunits derived fragment a / Cys Limulus genus limulus factor G ⁇ subunits derived fragment introduced a cysteine 1 residue at the N-terminus of the preparation Limulus genus limulus factor G ⁇ subunits derived fragment a of a / Cys was designed.
  • primer F a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 46 (5'-tgtctggattaagattacaaagg-3 ') is used as primer F
  • primer R a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 24 is used as primer R
  • primer F and primer R was synthesized by consigning to Sigma, Inc.
  • PCR was performed using ⁇ DNA (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) as a template to prepare a 250 bp DNA fragment having a C6 amino linker at one end.
  • ⁇ DNA manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • This PCR product was purified by DEAE ion exchange chromatography and isopropanol precipitation to obtain a 250 bp DNA fragment for labeling.
  • a photoresist film was formed on Si formed on a quartz substrate.
  • the photoresist was exposed using a mask having a capillary design (layout) shown in FIG. 7 and developed. After removing the portion of the Si where the photoresist was removed by development, sputtering was performed, and then wet etching was performed using a hydrogen fluoride solution to form capillary channel grooves (capillaries) in the quartz substrate. After removing the photoresist and Si film remaining on the quartz substrate, the quartz substrate and a cover plate having holes for introducing or discharging various reagents into various wells are bonded together to produce a capillary chip. did.
  • L1 and L2 denote leading buffer introduction wells
  • R1 denotes a trailing buffer introduction well
  • S denotes an electrophoresis sample introduction well
  • W1 and W2 denote drain wells.
  • the distance between L1 and R1 is 6.3 cm
  • the distance between L1 and L2 is 2.8 cm.
  • Electrophoresis reagent a) Trailing buffer: 125 mM HEPES containing 75 mM Tris base, 0.5% pDMA 22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSA b) Reading buffer: 75 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 50 mM NaCl, 0.5% pDMA22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSA, 1% Heparin Li
  • the fluorescence intensity is measured over time by 650 nm laser excitation using a fluorescence microscope (BX-50; manufactured by KS Olympus Co., Ltd.) with a capillary part 2 cm from the L2 channel crossing part to L1. Went by.
  • the time integral value of the fluorescence intensity of the complex with respect to the lentinan concentration (converted value, pg / mL, x-axis) in the sample (the fluorescence intensity was monitored over time, and the corresponding peak portion was measured in time.
  • a calibration curve plotting the integrated values (y-axis) was created.
  • the lentinan concentration of 50 pg / mL corresponds to 1.75 pg / mL of blood glucan (cut-off value of 11 pg / mL) as measured by ⁇ G Test Wako, which is a kit for measuring ⁇ G used for the measurement.
  • Example 9 Sandwich measurement using fragments derived from horseshoe crab G factor ⁇ subunit 5 (1) Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit-derived fragment a / Cys The recombinant Limulus horseshoe crab G factor ⁇ subunit-derived fragment a / Cys obtained in Example 8 was used.
  • 0.2 ml of 0.5% serum albumin dissolved in 50 mM phosphate buffered saline (pH 7.0) was dispensed into each well, and 1 was allowed to stand at room temperature. After allowing to stand for a period of time, a treatment for washing each well was performed.
  • a reaction stop solution (1M phosphoric acid solution) was added to each well to stop the reaction. Absorbance at a wavelength of 450 nm was measured using Vmax (Molecular Device). Separately, a ⁇ -glucan standard was measured in the same manner using the sample prepared by the method of Example 5 (3), and a calibration curve was prepared. The amount of ⁇ G in the plasma sample was calculated by applying the absorbance value obtained using the plasma sample to the calibration curve.
  • Comparative Example 1 Plasma sample The pretreated plasma sample used in Example 9 was used.
  • ⁇ G concentration of the plasma sample of (1) above was measured using a commercially available ⁇ -glucan test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a kit for ⁇ G measurement. According to the operation method described, ⁇ G was measured as follows according to a conventional method of turbidimetric time analysis. That is, 200 ⁇ L of the pretreated plasma sample was added to the Limulus reagent of the kit (lyophilized product, containing horseshoe crab blood cell extract (AL)), stirred for several seconds with a vortex mixer, and kept at 37 ° C.
  • a commercially available ⁇ -glucan test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Tg time until the amount of transmitted light of the mixed solution decreased by 5% from the start of measurement was measured.
  • Tg time until the amount of transmitted light of the mixed solution decreased by 5% from the start of measurement was measured.
  • Tg time until the amount of transmitted light of the mixed solution decreased by 5% from the start of measurement was measured.
  • a conventional method for measuring ⁇ G using a horseshoe crab blood cell extract utilizes a proteolytic enzyme cascade, but the cascade is inhibited by a protease contained in a blood sample. Therefore, in order to perform ⁇ G measurement using a conventional horseshoe crab blood cell extract, a pretreatment for heat-treating the blood sample and inactivating the enzyme in the blood sample in advance is essential.
  • Example 9 the ⁇ G content in the pretreated plasma sample and the non-pretreated plasma sample was measured by the sandwich ELISA method of the present invention.
  • the ⁇ G concentration measured using the untreated plasma sample approximated the ⁇ G concentration measured using the pretreated plasma sample.
  • the value was also close to the ⁇ G concentration (Comparative Example 1) obtained by measuring the ⁇ G concentration in the pretreated plasma sample by a conventional measurement method using a horseshoe crab blood cell extract. From this, it can be seen that if the ⁇ G measurement method of the present invention is carried out, ⁇ G can be measured without pretreatment of the sample.
  • the above results suggest that the ⁇ G measurement method of the present invention can be a new detection system for detecting ⁇ G in clinical samples.
  • Example 10 Correlation of plasma ⁇ G value by sandwich assay method of the present invention and conventional assay using horseshoe crab blood cell extract (1)
  • Sandwich assay of the present invention 1) Fragment derived from peroxidase-labeled Limulus genus G factor ⁇ subunit a / Cys The peroxidase-labeled Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a / Cys prepared in Example 9 was used.
  • FIG. 9 shows a correlation diagram with the conventional measurement method.
  • the ⁇ G concentration obtained by the ⁇ G measurement method of the present invention shows a good correlation with the ⁇ G concentration obtained by the conventional measurement method using a horseshoe crab blood cell extract.
  • the above results suggest that the ⁇ G measurement method of the present invention can be a new detection system for detecting ⁇ G in clinical samples.
  • Example 11 Sandwich Measurement Using a Fragment Derived from Limulus Horseshoe Crab G Factor ⁇ Subunit 6 (1) Peroxidase-labeled Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a / Cys The peroxidase-labeled Limulus genus G factor ⁇ subunit-derived fragment a / Cys prepared in Example 9 was used.
  • Results The results are shown in FIG. In FIG. 10, the error bar indicates a value of 1SD. As apparent from FIG. 10, it was confirmed that when ⁇ G was measured by fluorescence measurement using the ⁇ G-binding protein according to the present invention, the lower limit of the lentinan concentration was significantly detectable up to 1 pg / mL.
  • the blood glucan cut-off value when measured with ⁇ G Test Wako which is a commercially available ⁇ G measurement kit, is 11 pg / mL. It is known that 1 pg of lentinan corresponds to 0.035 pg of glucan. In this example, the lower limit of the lentinan concentration that can be detected is 1 pg / mL, and it is possible to measure a concentration lower than the cut-off value of a commercially available kit for ⁇ G measurement, that is, extremely high sensitivity. It was found that ⁇ G can be measured.
  • the ⁇ G measurement method of the present invention can utilize a recombinant ⁇ G-binding protein and does not require the use of natural raw materials. Therefore, there is no lot difference between reagents, and ⁇ G is specifically detected with a constant and high measurement sensitivity. There is an effect that it can be measured.

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Abstract

試料と、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有するβＧ結合性蛋白質１とβＧ結合性蛋白質２とを接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、該複合体の量を測定し、得られた該複合体の量に基づいて試料中のβＧ量を測定する、βＧの測定方法、それに用いられる試薬並びにキット、新規なβＧ結合性蛋白質及びこれをコードする核酸分子、並びに該βＧ結合性蛋白質の製造方法に関する。

Description

β－グルカンの測定方法及びそれに用いられるβ－グルカン結合性蛋白質
　本発明は、新規なβ－グルカン結合性蛋白質を用いた、β－グルカン（以下、「βＧ」と略記する。）の新規な測定方法及びそれに用いられる新規なβ－グルカン結合性蛋白質に関する。
　真菌症には皮膚に生じる表在性のものと、内臓、血液系、リンパ系に生じる深在性のものがある。深在性真菌症は抵抗力の弱った（免疫不全状態）患者が罹る日和見感染症の一種であり、極めて重篤な病態となる。深在性真菌症の起因菌の代表例としては、カンジダ、アスペルギルスが挙げられ、何れの細胞壁にもβＧが共通して存在しているので、血中βＧを測定することは有用である。臨床診断上では血漿あるいは血清中β-グルカンの測定が、真菌感染症の早期診断、治療効果および予後の判定に用いられている。
　βＧはβ-(１→３)結合のグルコース繰り返し構造を主鎖とし、場合によっては（１→６）結合や（１→４）結合の分岐を持つ構造であり、数千～100万程度の高分子量（但し、分布は広い）である。また、βＧは、カブトガニの血球抽出物（アメボサイト ライセート、Amebocyte Lysate）中に存在するＧ因子αサブユニットのβＧ結合ドメイン部分に結合する。
　Tachypleus属カブトガニＧ因子のαサブユニット構造解析は完了しており、そのアミノ酸配列及び塩基配列はＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに開示されている。また、Tachypleus属カブトガニＧ因子のαサブユニットは、遺伝子工学的手法により発現させることにも成功している（特許文献３）。
　Ｇ因子はセリンプロテアーゼ前駆体で、βＧが結合することで活性化され、Ｇ因子系のプロテアーゼカスケードが始まる。そして活性化されたＧ因子により凝固酵素前駆体が活性化され、最終的にゲルを生じる。そこで、医学、薬学、微生物学の分野ではカブトガニ血球抽出物のこの性質を利用したβＧ検出法が開発された。
　現在主に用いられているβＧ検出法としては、カブトガニの血球抽出物を含む溶液とβＧとで生起するゲル化反応を利用したゲル化転倒法や比濁時間分析法の他、エンドポイント合成基質法、カイネティック合成基質法等が、その代表的なものとして挙げられる。
　例えば比濁時間分析法によるβＧの測定は以下の通り行われる。すなわち、カブトガニ血球抽出物含有試薬とβＧを含有する試料とを混合し、該混合液に光を照射する。次いで、適当な測定機器（例えば分光光度計、マイクロプレートリーダー等）を使用して該混合液についての例えば透過率の変化、吸光度の変化、透過光量比Ｒtの変動、透過光量比Ｒtの対数値の変動等の光学的変化が、光照射開始後に所定の値に到達するまでに要する時間（ゲル化時間、Ｔｇ）を測定する。得られた当該時間を、濃度既知のβＧ溶液を使用して予め作成しておいたゲル化時間とβＧ濃度との関係を表す検量線に当てはめ、試料中のβＧ濃度を求める。
　以上のようなカブトガニの血球抽出物を用いる測定方法は、血中の極微量のβＧを高感度に測定できる方法である。しかしこれらの方法は、一方で（１）用手法により実施するので、試験者により測定結果にばらつきが出やすい、（２)血液中のβＧを特異的に測定する為に、血液中のエンドトキシンの不活性化や検査薬のエンドトキシン不感受化を行う必要がある、（３）血液中に含まれるカブトガニカスケード反応に対する妨害因子を不活性化するために、検体の前処理が必要である。（４）測定時間が長い（約９０分）、（５）カブトガニの血球抽出物、すなわち天然原材料（天然品）を使用しているので、資源枯渇が危ぶまれている、（６）カブトガニの血球抽出物、すなわち天然原材料を使用しているので、品質を安定させるのにコストがかかる、等々の問題点がある。
　そこで、上記したプロテアーゼカスケードを用いた測定方法における問題点を解決すべく、さらにいくつかの新たな測定方法が開発されている。
　例えば、天然原材料であるカブトガニの血球抽出物の代わりに、Ｇ因子αサブユニットのβＧ結合ドメインのみからなる蛋白質を遺伝子工学的に調製し、これを蛍光標識したもの１分子を用い、蛍光偏光法によりβＧを測定する方法がある（特許文献１）。しかし、この方法での検出感度はパキマン(βＧの一種）換算で数ｎｇ／ｍＬ程度までであり、臨床検査の分野で応用するのに十分な感度ではない。
　また、センサーチップを利用したBiacoreでの測定方法（非特許文献１）や、βＧに特異的に結合し、カブトガニＧ因子の活性化を阻害する性質のあるβＧ結合性蛋白質と標識物質で標識したβＧ結合性蛋白質に対する抗体を用いてβＧを測定する方法（特許文献２）がある。特許文献２に記載されたβＧ結合性蛋白質は遺伝子工学的にも調製し得る、と記載されている。
　しかし、センサーチップを利用する方法は、主にβＧとβＧ結合性蛋白質との親和性を測定する方法であるが、定性的な手法で且つ操作が煩雑で、この方法を臨床検査の分野に応用するには問題がある。
　また、カブトガニＧ因子の活性化を阻害する性質のあるβＧ結合性蛋白質と標識物質で標識したβＧ結合性蛋白質に対する抗体を用いる方法で使用しているβＧ結合性蛋白質は天然品であるため、ロット差が生じるという問題がある。また、この方法を臨床検査の分野に応用できるかどうかについてはまだ検討がなされていない。更に、この方法は感度に問題がある。
　更にまた、「システイン残基が他のアミノ酸に置換されたカブトガニのファクターG αサブユニットＸｌｎ　Ｚ１ドメインおよび／またはＺ２ドメインに由来するドメインを１ないし複数含み、且つβ－１,３－グルカンに結合可能な組み換え蛋白質を含む、真菌検出用キット」に係る発明も知られている（特許文献４）。
　この方法は、上記のような特徴を持つ組み換え蛋白質の一種類を、真菌を含有する試料と接触させることにより、真菌を検出する方法である。しかし、該蛋白質を用いたβＧの測定法（サンドイッチ法を含む）については検討されていない。
　βＧの受容体として知られるデクチン１（Dectin 1）２分子を用い、ELISA等の方法でβＧを測定する方法も知られている（非特許文献２）。しかし、この方法も、臨床現場が要求する感度には到達していない。
　更に、セルロース分解菌であるFibrobacter succinogenes等の細菌の中に、セルロース結合性蛋白質を持つものがあることが知られている。セルロース結合性蛋白質の、セルロースと結合する領域はセルロース結合ドメイン（Cellulose binding domein、ＣＢＤ）と呼ばれる。ＣＢＤは、更にアミノ酸配列の特徴から複数のファミリー（CBDＩ～Ｘ）に分類される（Advances in Microbial Physiology, vol.37, p.1-81, 1995）。ＣＢＤには、βＧに結合する性質のあるキシラナーゼＺ様ドメインを持つものが存在する。しかし、ＣＢＤのすべてがキシラナーゼＺ様ドメインを持つわけではない。また、ＣＢＤの結合する対象であるセルロースは（１→４）－β－Ｄ－グルカンであるが、臨床検査で測定対象になる血中のβＧは（１→３）－β－Ｄ－グルカンである。そのため、ＣＢＤの中にキシラナーゼＺ様ドメインを持つものが存在しても、ＣＢＤが臨床検査の分野でβＧを測定することに利用できるか、については不明であった。
　上記したとおり、これらのいずれの方法も、βＧを特異的に測定する場合、特に臨床検査に利用するには種々の問題があった。
特開２００３－１５５２９８号公報 特許第３７９３５７３号公報 特許第３７８１７７１号公報 特開２００９－４７５８８号公報
Takaki Y. et al., J. Biol. Chem., 2002, vol.277, p.14281-14287 Graham L. M. et. al., J. Immunol. Methods, 2006, vol.314(1-2), p.164-169
　本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、従来のプロテアーゼカスケードを利用した試薬と同等の感度・特異性を持ち、且つ上記した種々の問題点を解決したβＧの測定法及び測定試薬を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決する目的でなされたもので、以下の構成よりなる。
（１）下記の方法で行う、βＧの測定方法、
　（ｉ）試料と、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質１（以下、「βＧ結合性蛋白質１」と略記する。）と、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質２（以下、「βＧ結合性蛋白質２」と略記する。）とを接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
　（ii）該複合体の量を測定し、
　（iii）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
（２）配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質を含有する、βＧ測定用試薬。
（３）下記を構成成分として含んで成るβＧ測定用キット
　（ｉ）配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質１を含有する試薬
　（ii）配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質２を含有する試薬。
（４）配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質。
（５）配列番号１、３、５、７、９、１３又は１９のいずれかで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する、核酸分子。
（６）配列番号２、４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質、をコードする、核酸分子。
（７）上記(５)又は(６)に記載の核酸分子が組み込まれた組換え体。
（８）上記(７)に記載の組み換え体により形質転換又は形質導入された形質転換体又は形質導入体。
（９）上記(８)に記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られた培養物から蛋白質を分離することを特徴とする、配列番号２、４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質、の製造方法。
　本発明者は、上記した如き課題を解決することを目的として鋭意研究の途上、カブトガニＧ因子αサブユニットに存在するβＧ結合ドメインに注目し、該ドメインが２量体構造であることから、このドメイン構造を含むαサブユニット断片を用いてβＧの測定ができるのではないかと考えた。また、そのようなαサブユニット断片は、遺伝子学的手法によりリコンビナント品（組み換え体）を得ることができると考え、更に研究を行った結果、該αサブユニット断片を用いたサンドイッチ法によるβＧ測定系を確立した。すなわち、特定のアミノ酸配列を有するαサブユニット断片であって、且つβＧ結合ドメインの少なくとも１量体の構造を有する断片の中に、βＧの測定に好適なものがあることを見出し、更にこれらαサブユニット断片２分子を用いたいわゆるサンドイッチ法によるβＧ測定系を確立し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、特定のアミノ酸配列を有するβＧ結合性蛋白質２分子を用いたβＧ測定法及びそれに用いられる試薬及びキット、並びに特定のアミノ酸配列を有するリコンビナントβＧ結合性蛋白質及びその製造方法を提供するものである。本発明のβＧ測定法によれば、従来法よりもβＧの測定を高感度且つ特異的に行うことが出来る。また、プロテアーゼを含有する試料中のβＧの測定を行う場合であっても、試料中のプロテアーゼを予め失活させるための前処理を行う必要がない。また、高感度であるために、臨床検査にも用いることができるという効果を奏する。
　さらに、本発明のリコンビナント品を用いて本発明の測定方法を実施すれば、天然原料を使用する必要がないので、使用する試薬のロット差がなく、一定の、且つ高い測定感度でβＧを特異的に測定することができる、という効果を奏する。
　更にまた、本発明の測定方法は、用手法のみならず、自動分析装置を用いた測定にも適用可能である。
図１は、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット及びその断片の模式図を示す。図１の上図は、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニットの模式図を示す。図１の下図は、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の模式図と、各断片のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸の、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット上の位置をそれぞれ示す。 図２は、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット及びその断片の模式図を示す。また、図２の上図は、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットの模式図を示す。図２の下図は、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の模式図と、各断片のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸の、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット上の位置をそれぞれ示す。 実施例１で得られた、　Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片a（２３３－６４９aa）の蛋白質発現結果を示す。(ａ)はウエスタンブロッティングを行った結果、(ｂ)はSDS-PAGE後のゲルを銀染色した結果をそれぞれ示す。また、図３（ａ）及び（ｂ）において、レーン(１)は蛋白質分子量マーカー、レーン(２)はアフィニティー精製した断片aを試料とした場合の結果を示す。 実施例５で得られた、試料中のレンチナン濃度（換算値）と、試料の４５０ｎｍにおける吸光度との関係を示す検量線である。エラーバーは、２SDの値を示す。 実施例６で得られた、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片a及びLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂの、各断片濃度でのペルオキシダーゼ活性を測定した結果を示す。 実施例７で得られた、金属キレート剤の存在下又は不存在下における、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aのペルオキシダーゼ活性を測定した結果を示す。 実施例６で用いた、キャピラリーチップのレイアウトを示す。 実施例６で得られた、試料中のレンチナン濃度（換算値）と、複合体の蛍光強度の時間積分値との関係を示す検量線である。エラーバーは、２SDの値を示す。 実施例１０で得られた、本発明のサンドイッチ測定法により得られたβＧ濃度と、従来のカブトガニ血球抽出物を用いた測定法により得られたβＧ濃度との相関を示す。 実施例１１で得られた、試料中のレンチナン濃度（換算値）と発光量（cps:count per second）との関係を示す図である。エラーバーは、１SDの値を示す。
　本発明に係るβＧとしては、βＧをその構成成分として含む多糖類であれば特に限定されない。例えばカブトガニ血球抽出物の酵素反応を引き起こす性質のあるものが挙げられる。具体的には、例えば各種細菌類（例えば、Alcaligenes属，Agrobacterium属等）、酵母類（例えば、Saccharomyces属，Candida属，Cryptococcus属，Trichosporon属，Rhodotorula属等）、カビ類（Aspergillus属，Mucor属，Penicillium属，Trichophyton属，Sporothrix属，Phialophora属等）、放線菌類（Actinomyces属，Nocardia属等）、キノコ類（例えば，シイタケ，スエヒロタケ，カワラタケ等）等の細胞壁等から得られる天然の多糖、具体的には例えばカードラン，パキマン，スクレロタン，レンチナン，シゾフィラン，コリオラン等が、或は藻類（例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等）の貯蔵性多糖、具体的には例えばラミナラン、パラミロン等が挙げらる。
　本発明のβＧの測定方法に用いられる「配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質１」（βＧ結合性蛋白質１）と、「配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質２」（βＧ結合性蛋白質２）とは、同じであっても異なっていてもよく、合成蛋白質であってもよい。
　尚、「βＧ結合性蛋白質１」と「βＧ結合性蛋白質２」とをあわせて、以下、「本発明に係るβＧ結合性蛋白質」、又は単に「βＧ結合性蛋白質」と記載する場合がある。
　「βＧ結合性蛋白質１」及び「βＧ結合性蛋白質２」は、カブトガニ血球成分のＧ因子αサブユニットに由来するものである。
　Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列は、本発明者により明らかにされた。それは配列番号１で表される塩基配列でコードされる、配列番号２で表される約６４９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含み、Ｎ末端側にβ-1,3-グルカナ―ゼ様ドメイン、Ｃ末端側にβＧ結合ドメインと思われる２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）、そして配列中央には、キシラナーゼA様ドメインがある。キシラナーゼA様ドメインには、構造モチーフであるQQWS（Gln-Gln-Trp-Ser）モチーフの２回繰り返しがある。
　また本発明者は、本発明者によって得られたLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列に関する知見を元に、βＧ結合ドメインと思われるキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）をその構造に含む４種類のLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットの断片をデザインした。即ち、
　・Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ａ（以下、単に「断片ａ」と記載する場合がある。）、
　・Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｂ（以下、単に「断片ｂ」と記載する場合がある。）、
　・Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｃ（以下、単に「断片ｃ」と記載する場合がある。）、
　・Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｄ（以下、単に「断片ｄ」と記載する場合がある。）
である。
　本発明者が明らかにした、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニットの模式図を図１の上図に示す。また、本発明者が設計した、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の模式図と、各断片のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸の、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット上の位置を、図１の下図に併せて示す。
　各断片の構造等について、以下に説明する。
　断片ａは、配列番号３で表される塩基配列でコードされる、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２３３番目～６４９番目のアミノ酸配列部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（２つのQQWSモチーフが存在している。）と、２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
　断片ｂは、配列番号５で表される塩基配列でコードされる、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から３８７番目～６４９番目のアミノ酸配列部分に相当する。２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
　断片ｃは、配列番号７で表される塩基配列でコードされる、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から５２４番目～６４９番目のアミノ酸配列部分に相当する。２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうちのＣ末端側のドメイン１つを持つ。
　断片ｄは、配列番号９で表される塩基配列でコードされる、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２３３番目～５１５番目のアミノ酸部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（２つのQQWSモチーフが存在している。）と、２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうちのＮ末端側のドメイン１つを持つ。
　一方、Tachypleus属カブトガニＧ因子のαサブユニット構造解析は完了しており、そのアミノ酸配列及び塩基配列はＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに開示されている。それは、アミノ酸１９個からなるシグナルペプチドと、本明細書では配列番号１１で表される塩基配列でコードされる、配列番号１２で表される６７３個からなるアミノ酸配列を含む。Ｎ末端側にβ-1,3-グルカナ―ゼ様ドメイン、Ｃ末端側にβＧ結合ドメインと思われる２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）、そして配列中央にはキシラナーゼA様ドメインがある。キシラナーゼA様ドメインは、構造モチーフであるQQWSモチーフの３回繰り返しがある。また、特許第3781771号（特許文献３）には、Tachypleus属カブトガニＧ因子のαサブユニットのポリペプチドをコードするＤＮＡが開示されている。該ポリペプチドは、６５４個のアミノ酸からなり、ＮＣＢＩデータベースに開示されたアミノ酸配列のシグナルペプチド部分を欠く。
　また、本発明者は、上記でLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットの断片をデザインしたと同様にβＧ結合ドメインと思われるキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）をその構造に含む４種類のTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットの断片をデザインした。即ち、
　・Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｅ（以下、単に「断片ｅ」と記載する場合がある。）、
　・Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｆ（以下、単に「断片ｆ」と記載する場合がある。）、
　・Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｇ（以下、単に「断片ｇ」と記載する場合がある。）、
　・Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｈ（以下、単に「断片ｈ」と記載する場合がある。）
である。
　Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットの模式図を図２の上図に示す。また、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の模式図と、各断片のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸の、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット上の位置を、図２の下図に併せて示す。このうち、断片ｅ及び断片ｈは本発明者が初めてデザインしたものである。また、断片ｆ及びｇは公知であり、例えばこれを標識物質で標識したものを用いてβＧの測定を行った例はあるが、これらの断片二分子、又はこれらの断片と他の断片を二分子用い、サンドイッチ法によるβＧの測定を行った例は知られていない。
　各断片の構造等について、以下に説明する。
　断片ｅは、配列番号１３で表される塩基配列でコードされる、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２６８番目～６７３番目のアミノ酸配列部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（３つのQQWSモチーフが存在している。）、及び２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
　断片ｆは、配列番号１５で表される塩基配列でコードされる、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から４１０番目～６７３番目のアミノ酸配列部分に相当する。２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
　断片ｇは、配列番号１７で表される塩基配列でコードされる、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から５４８番目～６７３番目のアミノ酸配列部分に相当する。２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうち、Ｃ末端側のドメイン一つを持つ。
　断片ｈは、配列番号１９で表される塩基配列でコードされる、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２６８番目～５４７番目のアミノ酸配列部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（３つのQQWSモチーフが存在している。）、２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうちＮ末端側のドメイン一つを持つ。
　Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット及びその断片、並びにTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット及びその断片の、各アミノ酸配列の配列番号とそれをコードする塩基配列の配列番号を下記表１にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の測定方法に用いられる、「配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質」とは、すなわち上記したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットの各断片又は、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットの各断片に相当する。
　また本発明の測定方法に用いられる「配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有し、βＧに対する結合性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　また、「配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」としては、例えば、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、βＧに対する結合性を有する蛋白質が挙げられる。
　より具体的には、例えば、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列において、１～５個（好ましくは１～３個）のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１～５個（好ましくは１～３個）のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質等である。該蛋白質を構成するアミノ酸配列に、置換、欠失、挿入、付加等を与える位置は、該蛋白質のβＧに対する親和性に影響を及ぼすものでない限り、任意である。
　また、置換、欠失、挿入、付加は、該蛋白質のβＧに対する親和性に影響を及ぼすものでない限り、一つのアミノ酸配列に対して、複数の箇所に起きていてもよい。
　本発明の測定方法に用いられるβＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２の好ましい例としては本発明に係る断片ａ、断片ｂ、断片ｃ、断片ｄ、断片ｅ、断片ｆ、断片ｇ、断片ｈが挙げられる。組換え体が得られやすい点を考慮すると、断片ａ、断片ｂ、断片ｅ及び断片ｆが特に好ましい。
　また、本発明に係るβＧ結合性蛋白質を標識物質で標識した標識βＧ結合性蛋白質をβＧの測定に用いる場合、用いられるβＧ結合性蛋白質は、以下のようなものがより好ましい。すなわち、βＧ結合性蛋白質は、標識物質がβＧ結合性蛋白質とβＧとの結合を妨げないように、βＧ結合性蛋白質中の標識物質を結合する部位とβＧ結合部位が十分離れる程度の長さ（アミン酸数）を有していた方が良い。更に、βＧ結合性蛋白質をサンドイッチ法に用いる場合には、やはり長い（アミノ酸数が多い）方が、測定感度が高くなる。以上の点を考慮すると、本発明に係るβＧ結合性蛋白質としては、断片ａ、断片ｂ、断片ｅ、断片ｆが好ましく、断片ａ又は断片ｂが特に好ましい。
　尚、上記した本発明のβＧ測定方法に用いられるβＧ結合性蛋白質は、カブトガニＧ因子αサブユニットのβ－グルカナーゼ様ドメインを持っていないが、このβＧ結合性蛋白質をβＧ測定方法に用いるには、以下のような利点がある。
　すなわち、上記したとおり、カブトガニ血球抽出物は天然品であるため、カブトガニ血球抽出物や、それから更に分離したＧ因子、Ｇ因子αサブユニット等をβＧの測定に用いようとしても、ロット差が出やすい。また、天然品であるが故に、将来供給が不安定になる可能性も否めない。そこで、βＧに対して結合能を有する蛋白質のリコンビナント品が得られれば、このような問題も解決する。
　そこで、本願発明者等はβＧに対する結合能を有する蛋白質のリコンビナント品を得るべく検討を重ねた結果、特にE.coliを宿主として用いて蛋白質の発現を行った場合には、その原因は明らかではないが、カブトガニＧ因子αサブユニットのグルカナーゼ様ドメインを欠くβＧ結合性蛋白質を効果的に発現させることが出来た。
　後記するように、本発明のβＧ測定方法に用いられるβＧ結合性蛋白質は、ほ乳類細胞や昆虫細胞等を宿主とした場合にも発現させることが出来るのは勿論ではあるが、例えば酵母を宿主として使用した場合には、酵母の細胞はβＧを持っているので、発現蛋白質から酵母由来のβＧを除去する操作が必要になる。また、昆虫細胞を宿主として使用した場合には、昆虫細胞を培養する培地中に含まれるウシ血清アルブミンによって分泌発現蛋白質が汚染される可能性があるという問題がある。
　しかし、E.coliの細胞はβＧを持っていないので、E.coliで発現させた蛋白質がβＧで汚染されている危険性はない。更に、良く知られているように、E.coliは他の細胞と比較して、取り扱いが容易で、増殖させやすく、増殖の速度が速い、取り扱いに要する費用が安い、特殊な培養設備が必要ない、という利点を有し、それ故に、E.coliを宿主として用いた場合には、リコンビナント蛋白質を早く、安定にそして安く製造することが出来るという利点がある。
　従って、本願に係るカブトガニＧ因子αサブユニットのグルカナーゼ様ドメインを欠くβＧ結合性蛋白質は、E.coliを宿主とした場合でも発現させることが出来る点でも、優れている。
　本発明のβＧの測定方法は、
（１）試料と、βＧ結合性蛋白質１と、βＧ結合性蛋白質２とを反応させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
（２）該複合体の量を測定し、
（３）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する、
ことにより達成される。
　本発明に係る測定方法の原理は、βＧ結合性蛋白質１とβＧ結合性蛋白質２を用いて測定する、いわゆるサンドイッチ法である。
　例えば通常のイムノクロマト法，ラテックス法，酵素免疫測定法（ＥＩＡ）法において行われるサンドイッチ法であって、抗体又は抗原の代わりにβＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２を用いる方法である。また、Micro-TAS(Micro-Total Analysis Systems:μ-TAS、μ総合分析システム)への応用も可能である。
　形成された複合体は、不溶性担体等を用い、BF分離を行うヘテロジニアスな方法で測定することも、BF分離を行わないホモジニアスな方法で測定することも可能である。
　以下に、本発明の実施態様の例を述べる。尚、各操作の後に必要に応じ不要物質を除去する操作（洗浄等）を行っても良い。
Ｉ－１．遊離のβＧ結合性蛋白質を用いる方法１
（ｉ）試料と、（不溶性担体に固定化されていない）遊離のβＧ結合性蛋白質１と、（不溶性担体に固定化されていない）遊離のβＧ結合性蛋白質２とを接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
（ii）該複合体の量を測定し、
（iii）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
Ｉ－２．遊離のβＧ結合性蛋白質を用いる方法２
（i）試料と、（不溶性担体に固定化されていない）遊離のβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質１との複合体－１を形成させ、次いで
（ii）該複合体－１と（不溶性担体に固定化されていない）遊離のβＧ結合性蛋白質２とを接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質２との複合体－２とを形成させ、次いで
（iii）該複合体－２の量を測定し、　
（iv）得られた該複合体－２の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
II－１．不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と、遊離の非標識βＧ結合性蛋白質２を用いる方法１
（i）試料と、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と、遊離の非標識βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧと非標識βＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
（ii）該複合体の量を測定し、
（iii）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
II－２．不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と、遊離の非標識βＧ結合性蛋白質２を用いる方法２
（i）試料と不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとの複合体－１を形成させ、次いで
（ii）該複合体－１と遊離の非標識βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、複合体－１と非標識βＧ結合性蛋白質２との複合体－２を形成させ、次いで
（iii）該複合体－２の量を測定し、
（iv）該複合体－２の基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
III－１．遊離のβＧ結合性蛋白質１と、標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質２を用いる方法１
（i）試料と、遊離のβＧ結合性蛋白質１と、標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質２とを接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧと標識βＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
（iii）該複合体中の標識物質量を測定し、
（iv）得られた標識物質量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
III－２．遊離のβＧ結合性蛋白質１と標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質２を用いる方法２
（i）試料と遊離のβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質１との複合体－１を形成させ、次いで
（ii）該複合体－１と、標識物質で標識した遊離の標識βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、複合体－１と標識βＧ結合性蛋白質２との複合体－２を形成させ、次いで
（iii）該複合体－２中の標識物質量を測定し、
（iv）得られた標識物質量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
IV－１．不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質を用いる方法１
（i）試料と、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と、標識物質で標識した遊離の標識βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧと標識βＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
（iii）該複合体中の標識物質量を測定し、
（iv）得られた標識物質量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
IV－２．不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質を用いる方法２
（i）試料と不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとの複合体－１を形成させ、次いで
（ii）該複合体－１と標識物質で標識された遊離の標識βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、複合体－１と標識βＧ結合性蛋白質２との複合体－２を形成させ、次いで
（iii）該複合体－２中の標識物質量を測定し、
（iv）得られた標識物質量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
Ｖ－１．標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質１と標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質２を用いる方法１
（i）試料と、標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質１と、標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質２とを接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧと標識βＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
（iii）該複合体中の標識物質量を測定し、
（iv）得られた標識物質量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
V－２．標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質１と標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質２を用いる方法２
（i）試料と標識物質で標識した遊離のβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、試料中のβＧと標識βＧ結合性蛋白質１との複合体－１を形成させ、次いで
（ii）該複合体－１と、標識物質で標識した遊離の標識βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、複合体－１と標識βＧ結合性蛋白質２との複合体－２を形成させ、次いで
（iii）該複合体－２中の標識物質量を測定し、
（iv）得られた標識物質量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
VＩ－１．ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２を用いる方法１
（i）試料と、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２とを接触させて、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
（iii）該複合体の量を測定し、
（iv）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
VＩＩ－２．ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質を用いる方法２
（i）試料と不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとの複合体－１を形成させ、次いで
（ii）該複合体－１とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２とを接触させて、複合体－１とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２との複合体－２を形成させ、次いで
（iii）該複合体－２中の量を測定し、
（iv）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
　更に、βＧ結合性蛋白質１又はβＧ結合性蛋白質２に対する抗体と、βＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２を用い、該抗体とβＧ結合性蛋白質１とβＧ結合性蛋白質２と試料中のβＧとの複合体を形成させ、該複合体の量を測定することによって、試料中のβＧ量を測定する方法も挙げられる。この方法に用いられる抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良いが、βＧ結合性タンパク質１とβＧ結合性蛋白質２とβＧとが、複合体を形成するのを阻害しないものである。また、一つの測定系で、該抗体を複数種用いてβＧの測定を行うことも出来る。更に、上記したとおり、βＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２は、不溶性担体に結合していても、標識物質で標識されていてもよいことはいうまでもない。
　また、本発明の測定方法に用いられるβＧ結合性蛋白質１とβＧ結合性蛋白質２の組合せは、それぞれ別なものであっても、同じものであっても良い。
　すなわち、βＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２それぞれ一種ずつの組合せでも、複数種のβＧ結合性蛋白質１と複数種のβＧ結合性蛋白質２の組合せであっても良い。また、用いられる一種又は複数種のβＧ結合性蛋白質１と一種又は複数種のβＧ結合性蛋白質２とは、同じであっても異なっていてもよい。より好ましい組合せとしては、βＧ結合性蛋白質１は断片ａ又はｂで、βＧ結合性蛋白質２が断片ａ又はｂの組合せが挙げられる。
　また、例えば不溶性担体に結合したβＧ結合性蛋白質１と遊離の（標識）βＧ結合性蛋白質２を用いる場合には、好ましい（不溶性担体に固定化したβＧ結合性蛋白質１－遊離のβＧ結合性蛋白質２）の組合せとしては、（断片ａ－断片ａ）、（断片ａ－断片ｆ）、（断片ｂ－断片ａ）、（断片ｂ－断片ｄ）、（断片ｂ－断片ｆ）、（断片ｅ－断片ｆ）及び（断片ｆ－断片ｆ）が挙げられる。
　より好ましい組合せとしては、（断片ａ－断片ａ）、（断片ａ－断片ｂ）、（断片ｂ－断片ａ）及び（断片ｂ－断片ｂ）が挙げられ、更に好ましい組合せとしては（断片ａ－断片ａ）及び（断片ｂ－断片ａ）挙げられる。特に好ましい組合せとしては、（断片ｂ－断片ａ）が挙げられる。
　次いで、得られた複合体－１又は複合体－２と、複合体を形成しなかったβＧ結合性蛋白質１及び／又はβＧ結合性蛋白質２とを分離する方法としては、自体公知の分離分析法で通常行われている方法が挙げられる。
　例えば、不溶性担体に固定化された本発明に係るβＧ結合性蛋白質を用いた測定を行う場合の分離方法としては、Ｂ／Ｆ分離法により分離する方法が挙げられる。
　また、不溶性担体に固定化されていない遊離の（標識）βＧ結合性蛋白質１及び／又は遊離の(標識)βＧ結合性蛋白質２を用いた測定を行う場合の分離方法としては、例えばクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法、例えばLiBASys（島津製作所（株）製）等の自動免疫分析装置を用いた方法等が挙げられる。その具体的な条件は、得られた複合体－１又は複合体－２と、複合体を形成しなかった遊離の（標識）βＧ結合性蛋白質１及び／又は遊離の(標識)βＧ結合性蛋白質２を分離できるように設定すればよく、その他の条件は、自体公知の方法に準ずればよい。例えばHPLCを用いて分離する場合、Anal.Chem.65,5,613-616(1993)や特開平9-301995号に記載の方法に準じて行えばよく、キャピラリー電気泳動法を用いる場合には、Ｊ.Chromatogr. 593 253－258 （1992）、Anal.Chem. 64 1926－1932 （1992）、WO2007/027495等に記載の方法に準じて行えばよい。また、自動免疫分析装置として例えばLiBASysを用いる場合、生物試料分析22巻4号303-308(1999)に記載されている方法に準じて行えばよい。
　本発明のβＧの測定方法で使用される、本発明に係るβＧ結合性蛋白質を固定化する不溶性担体としては、例えば通常の免疫学的測定法等で用いられるものであれば何れも使用可能であるが、例えばポリスチレン，ポリプロピレン，ポリアクリル酸，ポリメタクリル酸，ポリアクリルアミド，ポリグリシジルメタクリレート，ポリ塩化ビニール，ポリエチレン，ポリクロロカーボネート，シリコーン樹脂，シリコーンラバー等の合成高分子化合物、例えば多孔性ガラス，スリガラス，セラミックス，アルミナ，シリカゲル，活性炭，金属酸化物等の無機物質等が挙げられる。また、これら不溶性担体は、マイクロタイタープレート、ビーズ、チューブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、ディスク状片、微粒子（ラテックス粒子）、等多種多様の形態で使用し得る。なかでもマイクロプレートやビーズは、洗浄の容易さおよび多数の試料を同時処理する際の操作性等の点から特に好ましい。
　本発明に係るβＧ結合性蛋白質を担体に固定化させる方法は、βＧ結合性蛋白質を不溶性担体に固定化し得るものであればよく、特に限定されない。通常この分野で利用される自体公知の固定化方法は全て挙げられ、例えば、化学的結合法（共有結合により固定化する方法）、物理的に吸着させる方法等が挙げられる。
　好ましい例としては、例えば、本発明に係るβＧ結合性蛋白質を通常0.1μg／mL～20mg／mL、好ましくは1μg／mL～5mg／mLの範囲で含む溶液と不溶性担体とを接触させ、適当な温度で所定時間反応させてβＧ結合性蛋白質が結合した不溶性担体（固相）を得る方法が挙げられる。
　βＧ結合性蛋白質の溶液を調製するための溶媒としては、本発明に係るβＧ結合性蛋白質が不溶性担体上に吸着あるいは結合するのを妨げる性質を有するものでなければよいが、例えば精製水、例えばpH 5.0～10.0、好ましくはpH 6.5～8.5の中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等が好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10～500 mM、好ましくは10～300 mMの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、本発明に係るβＧ結合性蛋白質が不溶性担体上に吸着あるいは結合するのを妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。
　尚、通常この分野で行われているブロッキング処理、すなわち、上述のごとくして得られた本発明に係るβＧ結合性蛋白質が結合した不溶性担体を、さらにβＧ結合性蛋白質とは無関係の蛋白質、例えばヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、スキムミルク等の乳蛋白質、卵白アルブミン、市販のブロッキング剤（例えばブロックエース（大日本住友製薬(株)製））等を含有する溶液中に浸漬する処理を行うことは、測定時の非特異的反応を防ぐ点から望ましい。
　また、上記した「不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質」は、直接不溶性担体に固定化されていても良いし、不溶性担体に固定化された抗βＧ結合性蛋白質抗体を介して、不溶性担体に固定化されていてもよい。それに用いられる抗βＧ結合性蛋白質抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗βＧ結合性蛋白質抗体を固定化する不溶性担体の具体例としては、上記したβＧ結合性蛋白質を固定化する不溶性担体と同じものが挙げられる。また、抗βＧ結合性蛋白質抗体を不溶性担体に固定化するには、上記したβＧ結合性蛋白質を不溶性担体に固定化する方法に準じて行えばよい。
　尚、この分野で用いられているアビジン-ビオチン反応のような非常に強固な結合反応を利用してβＧ結合性蛋白質を不溶性担体に固定化することも可能である。
　本発明において、βＧ結合性蛋白質を標識するために用いられる標識物質としては、例えば通常の免疫測定法等において用いられるペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（Radioimmunoassay、ＲＩＡ）で用いられる99mTc，131I，125I，14C，3H、32P，35S等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（Fluoroimmunoassay、FIA）で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミンフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルフォローダミン101、ルシファーイエロー、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、リボフラビンあるいはこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセンあるいはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-（3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン）-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等の標識物質等、通常この分野で用いられている標識物質が全て挙げられる。
　また、上記した標識物質の他、例えばHiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750等のHiLyte系色素〔何れもハイライトバイオサイエンス社（HiLyte Bioscience, Inc.）商品名〕、Alexa Fluor Dye 350、Alexa Fluor Dye 430、Alexa Fluor Dye 488、Alexa Fluor Dye 532、Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye 594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等のAlexa系色素〔何れもモレキュラープローブス社（Molecular Probes）商品名〕、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等のCyDye系色素〔何れもアマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）商品名〕、例えばクーマシーブリリアントブルーR250，メチルオレンジ等の色素等も用いることが出来る。、
　また、上記した如き標識物質をβＧ結合性蛋白質に結合させる（標識する）には、例えば自体公知の免疫測定法（ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ）等において一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971；図説　蛍光抗体、川生明著、第1版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第2版、医学書院、1982等;モレキュラー　クローニング　ア　ラボラトリー　マニュアル　セカンド　エディション、Ｊ．サムブルック，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，Ｔ．マニアティス、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー　プレス等に記載の方法）や、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等を適宜利用して行えばよい。
　さらに、１個又は数個のアミノ酸、又は１個又は数個のアミノ酸とリンカーを介して、βＧ結合性蛋白質に標識物質を結合させる方法で、βＧ結合性蛋白質を標識させてもよい。アミノ酸、又はアミノ酸とリンカーを介して標識物質を結合させたβＧ結合性蛋白質は、βＧ結合性蛋白質中のβＧ結合部位と標識物質との間がより離れる。そのため標識物質が、βＧ結合部位と試料中のβＧとの結合を妨げる可能性が低くなるので、より好ましい。アミノ酸を結合したβＧ結合性蛋白質を得るには、本発明に係るβＧのＮ末端に常法によりアミノ酸を結合させれば良い。また、Ｎ末端に当該アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を付加したＦプライマーを用いたＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を適当な発現用ベクターＤＮＡに組み込み、続いて常法により形質転換体を得、本発明のβＧ結合性蛋白質を発現させることでも、アミノ酸を結合したβＧ結合性蛋白質を得ることができる。
　また、上記した如き標識物質を蛋白質に結合させる（標識する）キットも各種市販されているので、それらを用い、キットに添付の取扱説明書に従って、標識を行ってもよい。
　更に、上記した「標識物質で標識された標識βＧ結合性蛋白質」は、標識物質で標識された抗βＧ結合性蛋白質抗体に結合することによって、間接的に標識されたものであってもよい。それに用いられる抗βＧ結合性蛋白質抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗βＧ結合性蛋白質抗体を標識する標識物質及び該標識の測定方法の具体例は、標識βＧ結合性蛋白質に関する記載で述べたとおりである。更にまた、該標識物質で抗βＧ結合性蛋白質抗体を標識するには、上記したβＧ結合性蛋白質を標識物質で標識する方法に準じて行えばよい。
　また、標識物質として核酸鎖を用いることも出来る。
　核酸鎖は、プリン塩基又はピリミジン塩基、糖部分であるペントース、及びリン酸からなるヌクレオチド残基を基本単位とし、このリン酸が各ヌクレオチド間が糖の３'と５'位炭素の間でジエステル結合によって結ばれ重合した鎖状のポリヌクレオチドであり、例えば糖部分がリボースであるRNA又は／及び糖部分がデオキシリボースであるDNAが挙げられる。また、当該核酸鎖は、１本鎖でも、２本鎖ないしこれ以上の複数の核酸鎖からなるものであってもよい。
　使用される核酸鎖の長さとしては、本発明の目的を達成し得るものであればよく、通常１bp～1000kbp、好ましくは５bp～100kbp、より好ましくは10bp～50kbpである。
　尚、本発明で用いられる核酸鎖は、本発明の目的を達成し得る範囲であれば、適当なもので適宜修飾等されていてもよい。
　核酸鎖と本発明に係るβＧ結合性蛋白質を結合させる方法としては、例えば特許第４２１４７７９号等に開示された公知の方法が挙げられる。
　例えば本発明に係るβＧ結合性蛋白質及び核酸鎖が夫々有する官能基を、直接又はリンカー〔例えばN-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMCS）、スルホサクシニミジル 4-（p-マレイミドフェニル）ブチレイト（Sulfo-SMPB）、スルホサクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレイト（Sulfo-SMCC）等〕等を介して結合させればよい。
　また、核酸鎖に予め反応性官能基を導入した後、特許第４２１４７７９号に記載の方法により本発明に係るβＧ結合性蛋白質と反応性官能基導入核酸鎖を結合させてもよい。核酸鎖へ反応性官能基を導入する方法としては、自体公知の方法が挙げられる。
　また、核酸鎖と本発明に係るβＧ結合性蛋白質を結合させる方法として、例えば、５'末端に反応性官能基を導入したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物として５'末端に反応性官能基が導入された核酸鎖を得る方法（モレキュラー　クローニング　ア　ラボラトリー　マニュアル　セカンド　エディション、Ｊ．サムブルック，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，Ｔ．マニアティス、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー　プレス等）等により核酸末端へ反応性官能基を導入することができる。
　また、上記した「標識物質で標識された標識βＧ結合性蛋白質」は、標識物質で標識された核酸を結合したものであってもよい。それに用いられる核酸、及び核酸とβＧ結合性蛋白質の結合方法は上記した通りである。
　核酸と標識物質の結合方法としては、例えば特許第４２１４７７９号に記載された方法が挙げられる。
　尚、標識されたβＧ結合性蛋白質（標識βＧ結合性蛋白質）を含有する溶液中には、通常この分野で安定化剤として使用されているもの、例えば糖類、蛋白質、界面活性剤等が、通常この分野で使用される濃度範囲内で含有されていても良い。
　また、本発明の測定方法を実施した結果生じる複合体中の標識量を測定する方法としては、標識物質の種類により異なるが、標識物質が有している何らかの方法により検出し得る性質に応じて、それぞれ所定の方法に従い実施すればよい。例えば、標識物質が酵素の場合には免疫測定法の常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51～63,共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合には、例えばＲＩＡで行われている常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応じて液浸型GMカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸型シンチレーションカウンター、HPLC用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971等参照）。また、標識物質が蛍光性物質の場合には、例えば蛍光光度計等の測定機器を用いるＦＩＡで行われている常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、（株）ソフトサイエンス社、1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が発光性物質の場合にはフォトカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252～263、共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。さらに、標識物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有する場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質  核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264～271、共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じてそれぞれ測定を行えばよい。
　より具体的には、例えば標識物質が酵素である場合は、これを発色試薬と反応させて発色反応に導き、その結果生成する色素量を分光光度計等により測定する方法等の自体公知の方法が挙げられる。
　このような目的で用いられる発色試薬としては、例えばテトラメチルベンジジン（TMB）、ｏ-フェニレンジアミン、ｏ-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド、2，2’-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）、N-エチル-N-スルホプロピル-m-アニシジン（ADPS）、p-ニトロフェニルリン酸等、通常この分野で用いられる発色試薬が挙げられる。また、これらの使用濃度は、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜設定すればよい。
　また、発色反応を停止させるために、例えば反応液に1～6Nの硫酸等の酵素活性阻害剤や、キットに添付の反応停止剤を添加する等、通常この分野で行われている反応停止方法を利用してもよい。
　また、標識されていないβＧ結合性蛋白質を用いてβＧを測定する方法としては、例えば得られた複合体に由来する性質を利用して測定する方法、具体的には、複合体自体が有するプロテアーゼ活性等の酵素活性や蛍光偏向度を吸光度として測定する方法、或いは、表面プラズモン共鳴などのホモジニアスイムノアッセイ系等の方法が挙げられる。
　また、ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２を用いる方法に用いられるラテックス粒子等の担体としては、免疫学的測定法で用いられる、例えば、リポソーム、高分子ミセル等の分子会合体、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等を材料として調製されたものが挙げられる。また、中でも、ラテックス粒子は、人工担体であり、目的に応じて担体表面を化学的処理し易いこと、また非特異反応が起こりにくいこと等の点から特に好ましい。その材質は特に限定されないが、例えばポリスチレンラテックス粒子等のスチレン系ラテックス粒子、アクリル酸系ラテックス粒子等が好ましいものとして挙げられる。
　その形態としては、ビーズ、微粒子、ラテックス粒子等の形態のものが挙げられる。
また、その粒径は特に限定されないが、通常０．０５～０．５μm、好ましくは０．１～０．４μmの平均粒径のものが好ましい。
　上記担体に本発明に係るβＧ結合性蛋白質を担持させる方法としては、本発明に係るβＧ結合性蛋白質と担体とを接触させることによってなされればよく、特に限定されない。通常この分野で利用される自体公知の担持方法（例えば、所謂物理的吸着法）が、代表的なものとして挙げられる。
　また、市販の担体を用いる場合には、その取扱説明書で推奨されている担持方法に従って、本発明に係るβＧ結合性蛋白質を担体に担持させればよい。
　ラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２を用いる測定方法に於いて、形成したラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとラテックス粒子等の不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質２との複合体の量を測定する方法としては、例えば該複合体が生じたことに起因する濁度の変化を測定することにより目的成分の測定を行なう所謂濁法や、散乱光強度の変化を測定することにより目的成分の測定を行なう所謂比ろう法、ラテックス凝集法等の常法が挙げられる。
　上記方法で試料中のβＧ量を得るには、予めβＧ濃度既知の試料を用い同様の操作を行って得た、βＧ濃度と濁度や散乱光強度の変化との関係を表す検量線に当てはめることにより、試料中のβＧ濃度を求めることが出来る。
　本発明のβＧ測定方法において、各反応時の本発明に係るβＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２の濃度は、βＧの測定範囲をどの程度にするか、また具体的な測定方法によっても異なる。
　例えば、０．１ｐｇ～１μｇのβＧを測定する場合であって、遊離のβＧ結合性蛋白質２分子を用いた測定を行う場合に用いられる遊離のβＧ結合性蛋白質１及び遊離のβＧ結合性蛋白質２の使用量は、それぞれ０．１ｎｇ～０．１ｍｇである。
　不溶性担体に固定化したβＧ結合性蛋白質１と標識βＧ結合性蛋白質２を用い、化学発光法や発色法で測定する場合には、不溶性担体に結合したβＧ結合性蛋白質１の使用量は０．１ｎｇ～０．１ｍｇ、標識βＧ結合性蛋白質２の使用量は０．１ｎｇ～０．１ｍｇ程度である。
　また、例えば、０．１ｐｇ～１μｇのβＧを測定する場合であって、ラテックス粒子等の不溶性担体に結合したβＧ結合性蛋白質２分子を用いた測定を行う場合に用いられるβＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２の使用量は、それぞれ０．１ｎｇ～０．１ｍｇ程度である。
　その用量は、βＧを含む試料と遊離のβＧ結合性蛋白質を反応させる場合には、βＧを含む試料１～１０００μＬ、好ましくは１０～１００μＬ（βＧを０．１ｐｇ～１μｇ含有）に対して、本発明に係るβＧ結合性蛋白質が通常１～1000μL（βＧ結合性蛋白質として０．１ｎｇ～０．１ｍｇ含有）、好ましくは２～500μLである。
　また、反応時の温度は25～40℃、好ましくは30～37℃であり、反応時間は、通常１０秒～３０時間、好ましくは５分～２０時間、より好ましくは３０分～１０時間である。
　βＧ結合性蛋白質１とβＧ結合性蛋白質２は、同時に試料と反応させても良いし、順次反応させてもよい。
　本発明のβＧ量の測定法の具体例として、標識物としてペルオキシダーゼ（POD）を用い、不溶性担体に固定化したβＧ結合性蛋白質１と、ＰＯＤで標識したβＧ結合性蛋白質２を用いて、生体由来試料中のβＧ量を測定する方法を例にとって説明すると、概略以下の通りである。
　すなわち、βＧを含有する試料５０μＬ（βＧを０．１ｐｇ～１μｇ含有）を、本発明に係るβＧ結合性蛋白質１を不溶性担体に固定化した固相（βＧ結合性蛋白質１を０．１ｎｇ～０．１ｍｇ含有）と接触させ、4～40℃で３分～２０時間反応させて不溶性担体上にβＧとβＧ結合性蛋白質１との複合物（複合体-1とする。）を生成させる。次に、PODで標識した本発明に係るβＧ結合性蛋白質２を含有する溶液５０～１００μＬ（βＧ結合性蛋白質２を０．１ｎｇ～０．１ｍｇ含有）と4～40℃で3分～16時間反応させて、固定化βＧ結合性蛋白質１－βＧ－標識βＧ結合性蛋白質の複合物（複合体-2とする。）を不溶性担体上に生成させる。続いて、例えば適当な濃度のＴＭＢ溶液を添加した後、一定時間反応させ、１Mリン酸等の反応停止液を加えて、反応を停止させる。４５０ｎｍの吸光度を測定する。得られた測定値を、予め濃度既知のβＧ溶液について上記と同じ試薬を用い同様の操作を行って得た、測定値とβＧ量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中のβＧ量を求めることができる。
　キャピラリーチップ電気泳動を行って、βＧの検出を行う場合、示差屈折検出器、蛍光検出器、UV検出器等の機器によりなされればよく、中でも、UV検出器、蛍光検出器が好ましく、蛍光検出器がより好ましい。
　本発明のβＧ測定方法を、例えばキャピラリーチップ電気泳動で分離し、蛍光検出器で測定する場合、以下の如くなされればよい。用いられるβＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２は、標識物質で標識されていても良い。
　即ち、βＧ試料１～50μLと、通常0.001～10μM、好ましくは0.01～1μMの本発明に係るβＧ結合性蛋白質１と、通常0.01～10μM、好ましくは0.01～1μMの本発明に係るβＧ結合性蛋白質２を含有する試液20～50μLとを混合し、25～40℃保温下に5～30分、好ましくは10秒～15分反応させる。その後、得られた溶液を、適当な分離方法、例えばキャピラリーチップ電気泳動により分離し、例えば蛍光検出器等により測定する。得られた測定値を、濃度既知のβＧ溶液を使用して予め作成しておいたβＧ濃度と該測定値との関係を表す検量線に当てはめることにより、試料中のβＧ濃度を求めることができる。
　尚、例えばAlexa Fluor-488 tetrafluorophenyl ester等で標識したβＧ結合性蛋白質１と、例えばAlexa Fluor-647 succinimidyl ester等で標識したβＧ結合性蛋白質２を用い、公知のいわゆる蛍光相互相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCCS)を行って、βＧの測定を行うことも出来る。
　本発明に係る試料としては、例えば血液，血清，血漿，尿，リンパ，髄液，胸水，腹水等の臨床検体、医薬品、医療用具、食品等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の測定法において用いられる、βＧ結合性蛋白質を溶解させる緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常抗原抗体反応を利用した測定法に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHとしては本発明の蛋白質とβＧとの反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常5～9の範囲が好ましい。
　尚、本発明は、用手法に限らず、自動分析装置を用いた測定系にも十分利用可能であり、容易にかつ迅速に測定を行う事が出来る。なお、用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせ等については、特に制約はなく、適用する自動分析装置の環境、機種に合わせて、或いは、他の要因を考慮にいれて最も良いと思われる試薬類等の組み合わせを適宜選択して用いれば良い。
　本発明のβＧ測定用試薬としては、「配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質を含有する、βＧ測定用試薬。」が挙げられる。βＧ結合性蛋白質は不溶性担体に固定化されていてもよい。
　また、βＧ結合性蛋白質は標識物質で標識されていてもよい。不溶性担体及び標識物質の好ましい態様等は上記したとおりである。また、上記したβＧ結合性蛋白質が固定化された不溶性担体としては、一種類のβＧ結合性蛋白質が不溶性担体に固定化されたものであっても、複数種のβＧ結合性蛋白質が不溶性担体に固定化されたものであってもよい。
　本発明の試薬中に含有されるβＧ結合性蛋白質の濃度は通常０．１ｎｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬである。
　また、本発明の試薬には、更に緩衝剤やアルカリ土類金属塩等この分野で通常用いられるその他の適当な試薬類が含まれていてもよく、これら試薬類はいわゆる生化学反応等で使用されるものの中から適宜選択して用いればよい。上記緩衝剤としては、具体的には、通常この分野で用いられるトリスヒドロキシルアミノメタン緩衝液、りん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、Good's緩衝液等が挙げられ、該緩衝剤の試薬中の濃度は、用いられる緩衝剤により多少異なるが、通常5mM～500mMであり、好ましくは20mM～200mMである。尚、試薬中の本発明に係るβＧ結合性蛋白質は凍結乾燥品であっても構わない。
　本発明のβＧ測定用キットとしては、
（１）配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質１（βＧ結合性蛋白質１）を含有する試薬、及び
（２）配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質２（βＧ結合性蛋白質２）を含有する試薬、
を構成要件として含んでなるものが挙げられる。
　βＧ結合性蛋白質は不溶性担体に担持されていてもよい。また、標識物質で標識されていてもよい。
　その構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。
　また、該キットの上記(１)及び(２)を構成するβＧ結合性蛋白質１とβＧ結合性蛋白質２は、それぞれ一種であっても、複数種であっても良い。また、(１)を構成するβＧ結合性蛋白質１と(２)を構成するβＧ結合性蛋白質２は、同じであっても異なっていてもよい。
　また、本発明のβＧ測定用キットは、必要に応じて、通常この分野で用いられる、マンニトールやソルビトールのような糖アルコール類、ショ糖やトレハロースのような糖類、デキストランのような多糖類、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質、界面活性剤等の安定化剤等の試薬を付加してもよく、その濃度等は通常この分野で用いられている範囲に準じて設定されればよい。また、本発明のβＧ結合性蛋白質を含む試薬には、上記本発明の試薬の項で記載した、緩衝剤やアルカリ土類金属塩等を用いてもよく、その濃度等も上記と同じ範囲で用いればよい。更に、検量線作成用の標準βＧを組み合わせたキットとしてもよい。該標準βＧは、和光純薬工業株式会社等によって製造された市販のβＧの標準品を用いても、日本特許第3652738号に記載の方法に従って製造されたものを用いても構わない。また、これら試薬キットにおける試薬類は凍結乾燥品であってもよい。
　本発明のβＧ結合性蛋白質は、カブトガニ血球成分中のβＧに対して結合性を有するＧ因子のαサブユニット、及び該αサブユニット由来断片であって、βＧに対する結合性を有する蛋白質である。
　例えば、Limulus属のカブトガニ血球抽出物の成分であるＧ因子のαサブユニット、及びその断片であって、βＧに対する結合性を有する蛋白質、及びTachypleus属のカブトガニ血球抽出物の成分であるＧ因子αサブユニット及びその断片であって、βＧに対する結合性を有する蛋白質が挙げられる。
　そのような本発明のβＧ結合性蛋白質の例としては、「配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質。」が挙げられる。
　本発明のβＧ結合性蛋白質における「配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質」とは、上記した「βＧの測定方法」において説明した、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニットの各断片又は、Tachypleus属カブトガニＧ因子のαサブユニットの各断片に相当する。
　また本発明の「配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　また、「配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」としては、例えば、配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、βＧに対する結合性を有する蛋白質が挙げられる。
　より具体的には、例えば、配列番号４、６、８、１０、１４又は２０で表されるアミノ酸配列において、１～５個（好ましくは１～３個）のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１～５個（好ましくは１～３個）のアミノ酸が挿入され若しくは付加したされたアミノ酸配列を有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質等である。
　置換、欠失、挿入、付加は、該蛋白質のβＧに対する結合性を失わない限り、一つのアミノ酸配列に対して、複数の箇所に起きていてもよい。
　本発明のβＧ結合性蛋白質は、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学法製法により製造することができる。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル法（Ｆｍｏｃ法）、ｔ－ブチルオキシカルボニル法（ｔＢｏｃ法）等の通常の化学合成法により、本発明のβＧ結合性蛋白質を得ることができる。また、市販のペプチド合成機を用いて化学合成することもできる。
　更に、本発明のβＧ結合性蛋白質は、本発明のβＧ結合性蛋白質をコードする核酸分子を適当なプラスミドやファージなどの発現ベクターに組み込み、宿主細胞を該組換え発現ベクターを用いて形質転換（又は形質導入）させ、得られた宿主細胞を増幅させて、細胞内又は細胞外に分泌させる、という遺伝子組み換え技術を用いた周知の方法でも、得ることができる。
　本発明のβＧ結合性蛋白質をコードする核酸分子は、「配列番号１、３、５、７、９、１３又は１９のいずれかで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する、核酸分子。」である。
　本発明のβＧ結合性蛋白質をコードする「配列番号１、３、５、７、９、１３又は１９のいずれかで表される塩基配列と同一の塩基配列を含有する、核酸分子。」とは、「配列番号１、３、５、７、９又は１３のいずれかで表される塩基配列と同一の塩基配列からなる核酸分子。」及び「配列番号１、３、５、７、９、１３又は１９のいずれかで表される塩基配列と同一の塩基配列の全部を含有する、核酸分子。」を意味する。
　「配列番号１、３、５、７、９、１３又は１９のいずれかで表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸分子。」とは、配列番号１、３、５、７、９、１３又は１９のいずれかで表される塩基配列の１～数個の塩基が一部が欠失、付加、置換、挿入された塩基配列を持つ核酸分子をいう。欠失、付加、置換、挿入は、一つの核酸分子の一箇所又は複数の箇所に同時に起こっていてもよい。
　また、本発明のβＧ結合性蛋白質をコードする核酸分子として、「配列番号２、４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質（本発明のβＧ結合性蛋白質）、をコードする塩基配列である、核酸分子。」も挙げられる。ここでいう「本発明のβＧ結合性蛋白質」の具体例は、上記した「本発明に係るβＧ結合性蛋白質」に関する説明に記載したとおりである。
　核酸分子は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよい。
　遺伝学的方法により本発明に係るβＧ結合性蛋白質（本発明のβＧ結合性蛋白質を含む）を調製する方法の一例を以下に説明する。
１．発現用組換えベクターの調製
（１）ｃＤＮＡの調製
　カブトガニ血球細胞より常法によりtotal ＲＮＡを回収し、例えばｍＲＮＡの持つpoly (A)鎖でつり上げる常法等を利用することにより、精製ｍＲＮＡを得る。得られた精製ｍＲＮＡを鋳型として、常法による逆転写反応によってｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡは、カブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーとして、以下のＰＣＲの際の鋳型として、用いられる。
（２）本発明に係るβＧ結合性蛋白質を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターの調製
１）カブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターの調製
　例えば常法によりカブトガニＧ因子αサブユニットをコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１又は１１）の3'-末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したリバースプライマー（Ｒプライマー）、配列番号１又は１１の5'-末端側領域から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したフォワードプライマー（Ｆプライマー）及び鋳型としてカブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリー（上記したcDNAライブラリー等）を用いたＰＣＲ等の核酸増幅法により、目的とするカブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子を含む配列（例えば配列番号１又は１１）のＤＮＡ断片を増幅させる。得られたＰＣＲ産物を、常法に従い適当な発現用ベクターＤＮＡに組み込み、発現用組み換えベクターを得る。
　必要に応じ、発現用組み換えベクターに組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、目的とするカブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子を含む配列が組み込まれていることを確認する。
２）カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターの調製－１
　まず、例えば常法によりカブトガニＧ因子αサブユニットをコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１又は１１）の3'-末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したＲプライマー、配列番号１又は１１の5'-末端側領域から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したＦプライマー及び鋳型としてカブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリー（cDNA等）を用いたＰＣＲ等の核酸増幅法により、カブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子又を含む配列（例えば配列番号１又は１１）のＤＮＡ断片を増幅させる。得られたＰＣＲ産物を、常法に従い適当なベクターＤＮＡに組み込み、組み換えベクターを得る。
　ここで用いられるベクターとしては、例えばTAクローニングベクター等のクローニングベクターが挙げられる。市販のクローニングベクターを用いると簡便である。例えば、pGEM-T Easy（Progema Co.製）等が汎用されている。
　必要に応じ、組み換えベクターに組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、カブトガニＧ因子αサブユニット由来遺伝子を含む配列が組み込まれていることを確認する。
　次いで、カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３、５、７、９、１３、１５、１７、１９）の3'-末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したＲプライマー、同配列の5'-末端側領域から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したＦプライマー及び鋳型としてカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリー（cDNA、上記で得られた、カブトガニＧ因子αサブユニット遺伝子を含む配列を組み込んだ組換えベクター等）を用いたＰＣＲ等の核酸増幅法により、目的とするカブトガニＧ因子αサブユニット断片遺伝子又はその遺伝子断片を含む配列（例えば配列番号３、５、７、９、１３、１５、１７、１９）のＤＮＡ断片を増幅させる。得られたＰＣＲ産物を、常法に従い適当な発現用ベクターＤＮＡに組み込み、目的のカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターを得る。
　必要に応じ、発現用組み換えベクターに組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、目的とするカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片遺伝子を含む配列が組み込まれていることを確認する。
３）カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターの調製－２
　例えば常法によりカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号３、５、７、９、１３、１５、１７、１９）の3'-末端側領域から選ばれた任意の位置から設計したＲプライマー、同配列の5'-末端側領域から開始コドンまでの間の任意の位置から設計したＦプライマー及び鋳型としてカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリー（cDNA等）を用いたＰＣＲ等の核酸増幅法により、目的とするカブトガニＧ因子αサブユニット由来遺伝子を含む配列（配列番号３、５、７、９、１３、１５、１７、１９）のＤＮＡ断片を増幅させる。得られたＰＣＲ産物を、常法に従い適当な発現用ベクターＤＮＡに組み込み、目的のカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用組み換えベクターを得る。
　必要に応じ、発現用組み換えベクターに組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、目的とするカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片遺伝子又はその断片を含む配列が組み込まれていることを確認する。
　尚、発現用組み換えベクターに組み込むＤＮＡ断片（カブトガニＧ因子αサブユニット又はその断片遺伝子配列を含む）は、目的によりそのまま、又は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。
　上記１）～３）の方法で用いられる発現ベクターとしては、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明に係るβＧ結合性蛋白質を発現し、これら蛋白質を生産する機能を有する者であれば特に制限されない。例えばプラスミドベクター，ファージベクター及びウイルスベクターが包含される。
　具体的には、例えば、pTrcHis2ベクター、pcDNA3.1/myc-Hisベクター（Invitrogen社製）、pUC119（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社製）、pBluescript II KS+（Stratagene社製）、Pqe-tri（Qiagen社製）、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL等のプラスミドベクター、λENBL３（Stratagene社製）、λDASHII（フナコシ社製）等のバクテリオファージベクター、Charomid DNA（和光純薬工業(株)製）、Lorist6（和光純薬工業(株)製）等のコスミドベクター等が挙げられる。
　その他、大腸菌由来のプラスミド(例えばpTrc99A，pKK223，pET3a)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110，pTP5，pC194)、酵母由来プラスミド(例えばpSH19，pSH15)、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルス等の動物ウイルス等の他、pA1－11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等が挙げられる。
　尚、検出や精製を容易にするために、目的とする本発明に係るβＧ結合性蛋白質（カブトガニＧ因子αサブユニット又はその断片）を、他のタグペプチドや蛋白質との融合蛋白として発現させても良い。融合させるタグペプチドとしてはFLAGタグ，3XFLAGタグ，Hisタグ（His tag、例えば６×Hisタグ）等、蛋白質としてはβ－ガラクトシダーゼ（β-Gal），緑色蛍光蛋白質（GFP），マルトース結合蛋白質（MBP）等が挙げられる。
　実際には、オープンリーディングフレームの前後に上記したようなタグペプチドをコードする配列を設計したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ったものを発現ベクターにサブクローニングしたり、当該遺伝子と発現ベクターとの間にタグペプチドをコードする配列のリンカーを挿入したり、予めタグペプチドや蛋白質をコードする配列を含む発現ベクターを用いることにより、本発明に係るβＧ結合性蛋白質は、これらのペプチドや蛋白質との融合蛋白質として発現する。例えば、His tag遺伝子を組み込んだpTrcHis 2ベクター（Invitrogen製）を発現ベクターとして用い、その上流にβＧ結合性蛋白質の遺伝子を含む配列を組み込んでおけば、このHis tagの発現を確認することによって、その上流域のβＧ結合性蛋白質遺伝子の発現も確認されることになる。
　本発明の組換え体とは、上記した如き本発明の核酸分子が組み込まれた組換え体であり、本発明に係るβＧ結合性蛋白質遺伝子が組み込まれた発現用組み換えベクターが挙げられる。その具体例は上記したとおりである。
２．形質転換体の調製
　本発明の形質転換体（形質導入体）は、得られた発現用組み換えベクターを用いて、適当な宿主細胞を形質転換（形質導入）することにより調製することができる。
　そのために用いられる宿主細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリキア（Escherichia）属菌、バチルス属菌）、酵母（例えばサッカロマイセス属など）、動物細胞及び昆虫細胞など〕が挙げられる。その他、この分野で通常行われる無細胞発現系や植物細胞系も実施可能である。
　具体的には、エシェリキア属菌では、大腸菌（Escherichia coli.が挙げられる。例えば BL21, BL21(DE3), K-12, DH1, DH5, DH5α, M15，HB101, C600, XL-1 Blue, JM109, JM105， JM127, XL1-Blue, VCS257, TOP10）などが挙げられる。バチルス属菌では、B. subtilis, B. brevis, B. borstelenisなどが挙げられる。酵母としてはS. cerevisiae, Scizo. pombe, A. nidulans, Pichia pastoriaなど、或いはAsperigillus nidulansなどのAspergillus属糸状菌も挙げられる。動物細胞としては、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスL細胞、ヒトHeLa細胞、FL細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはBmN4，Sf9などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　この他、よりプラスミドやファージＤＮＡの導入効率の高い、Competent Cell（コンピテントセル）を用いても良い。例えば、E. coli DH5α Competent Cell、E. coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
　発現ベクターによる宿主細胞の形質転換（又は形質導入）は、従来公知の方法を用いて行うことが出来る。
　例えば宿主細胞が細菌（例えばE. coliの場合）の場合は、たとえばCohenらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., (1972) 9,2110）プロトプラスト法（Mol.Gen. Genet., (1979) 168,111）またはコンピテント法（J.Mol.Biol., (1971) 56, 209）、M.Morrisonの方法（Method in Enzymology, 68, 326-331,1979）等の常法により行うことができる。また、市販のCompetent Cellを用いる場合には、その製品プロトコールに従って、形質転換（形質導入）を行えばよい。
　ここで、「目的のβＧ結合性蛋白質をコードする遺伝子列を含む断片を組み込んだ発現用組換えベクター」で形質転換した形質転換体が得られたことを確認する方法としては、例えば組換えベクターを得るために用いた発現ベクターが予め持っている薬剤耐性の遺伝子を利用し、導入体の薬剤耐性を調べ、耐性であることを確認する方法が挙げられる。例えば、pTrcHis2ベクターを発現ベクターとして用いた場合、該ベクターはアンピシリン耐性（amp r ）の遺伝子を持っている。そこで、得られた形質転換体をアンピシリンを添加した培地中で培養し、培養された形質転換体（アンピシリン耐性株）を、目的のβＧ結合性蛋白質をコードする塩基配列を組み込んだ発現用組換えベクターで形質転換された形質転換体であると確認する方法が挙げられる。
　得られた形質転換体（形質導入体）が、目的とする本発明に係るβＧ結合性蛋白質（以下「リコンビナントβＧ結合性蛋白質」と記載する場合がある。）を生成している（βＧ結合性蛋白質遺伝子が発現している）ことを確認するためには、例えば、常法であるプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション，コロニーハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーションの他、例えば以下の方法がある。
　リコンビナントβＧ結合性蛋白質が、例えば膜貫通型蛋白として発現した場合等、形質転換体の培養液中に分泌されてこない場合には、細胞を破壊又は溶解する常法（例えば超音波処理する、ホモジナイザー等で処理する、適当な界面活性剤等の膜溶解剤で処理する等）にて、得られた形質転換体を処理し、そのライセート（lysate）を得る。そして、そのライセートについて（必要であれば更に蛋白質を精製した後、）、例えばタグペプチドに対する抗体を用いた通常の免疫学的測定法（ドットウェスタンブロッティング法、ウェスタンブロッティング法等）を行い、その培養上清中にタグペプチドが発現していることを確認された導入体を選択することにより、目的のリコンビナントβＧ結合性蛋白質を発現する形質転換体を取得することが出来る。
　また、組み換えカブトガニＧ因子αサブユニット由来断片が該導入体の培養液中に分泌されてくる場合には、その培養液（培養上清）について、上記ライセートについて行う場合と同様に通常の免疫学的測定法を行い、同様の方法で目的のリコンビナントβＧ結合性蛋白質を発現する形質転換体を選択、取得すればよい。
３．βＧ結合性蛋白質の発現
　本発明に係るβＧ結合性蛋白質は、上記のようにして得られたβＧ結合性蛋白質遺伝子を含む配列を組み込んだ発現用プラスミドベクターで形質転換した形質転換体を、栄養培地中で培養し、リコンビナントβＧ結合性蛋白質を生成させることにより得ることができる。
　栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。また所望により他の栄養素〔例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム〕、ビタミン類、抗生物質、生長促進因子等を含んでいても良い。培地のpHは約5～8が望ましい。
　培養は、当業界に於いて知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH及び発酵時間は本発明に係るβＧ結合性蛋白質最高力価が得られるように選択される。
　形質転換体の宿主が大腸菌である形質転換体（形質導入体）を培養する場合は、大腸菌を培養する常法の条件で、通常用いられる培地で行えばよいが、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。
　形質転換体の宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、大腸菌を培養する際に通常用いられる培地であればよい。例えば、D-MEMやRPMIなどの合成培地、LB培地、2×YT培地、Terrific Broth、M9培地〔ミラー(Miller)，ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)等が挙げられる。培養は、必要により通気、攪拌をしながら、通常14～42℃、好ましくは28～39℃、約3～24時間行うことができる。また必要により例えば、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を加えてもよい。
４．リコンビナントβＧ結合性蛋白質の回収
　本発明に係るβＧ結合性蛋白質は、上記培養により得られる培養物から、以下のようにして取得できる。
　すなわち、本発明に係るβＧ結合性蛋白質が培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体或いは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば界面活性剤処理、超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁及び／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法で本発明に係るβＧ結合性蛋白質を含有する粗抽出液を得る。そして、当該粗抽出液から、天然または合成タンパク質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って本発明に係るβＧ結合性蛋白質をβＧの混入がないように、精製、単離する。
　βＧ結合性蛋白質の単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈殿法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　例えば、pTrcHis2ベクター等の予めHis tag遺伝子タグペプチド等のタグペプチドをコードする配列を含んでいる発現ベクターを用いた場合、発現したリコンビナントβＧ結合性蛋白質はHisタグを持っている。そこで、リコンビナントβＧ結合性蛋白質を含有する溶液を、Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid) などニッケルイオンを含むカラム充填剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーに付すことにより、目的のリコンビナントβＧ結合性蛋白質を精製することができる。
　また、上記方法で精製処理したリコンビナントβＧ結合性蛋白質を含有する溶液を、更に本発明に係るβ結合性蛋白質を結合させた充填剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーに付してもよい。特にリコンビナントβＧ結合性蛋白質の発現に用いた宿主が酵母菌などの真核生物の場合、宿主の生成物中に、宿主の生成したβＧも含有する場合がある。そこで、この宿主由来のβＧを除去して、目的のリコンビナントβＧ結合性蛋白質を得るには、上記精製処理に、更にこのアフィニティークロマトグラフィー処理を加えることが好ましい。
　かくして分離・精製した本発明に係るβＧ結合性蛋白質の存在は、例えば抗His抗体を用いたELISA等により測定して確認することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。
実施例１
（１）ＲＮＡの回収
　ＲＮＡ抽出用試薬ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用い、その製品付属のプロトコルに従って、下記の通り、Limulus属カブトガニ血球細胞よりtotal　ＲＮＡを回収した。
　まず、ISOGEN 7ｍｌを入れたチューブにLimulus属カブトガニ（アメリカ産）血球細胞を640mｇ入れ、ポリトロンホモジナイザー（Kinematica AG社製）を用いて、血球細胞を破砕した。
　得られた血球細胞のホモジネートを、室温で５分間インキュベートした後、１.４ｍＬのクロロホルムを添加し、15秒間攪拌し、更に室温で３分間インキュベートした。その後ホモジネートを、４℃、12000Ｇで１５分間遠心分離した後、水相を新しいチューブに移し、３.５ｍLのイソプロパノールを添加・攪拌後、室温で１０分間インキュベートした。次いで、ホモジネートを４℃、12000Ｇで１０分間遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を７ｍLの７０％エタノールで洗浄し、乾燥して、ＲＮＡ沈殿物を得た。得られたＲＮＡ沈殿物を、８００μLの滅菌水に溶解した。得られたＲＮＡ水溶液の吸光度を測定して、得られたtotal ＲＮＡの量を測定した。Limulus属カブトガニ血球細胞 640ｍｇから779μｇのtotal ＲＮＡが得られた。
（２）ｍＲＮＡの精製
　OligotexTM-dT30<Super>（タカラバイオ社製）を用い、下記の方法で、ｍＲＮＡを精製した。
　まず、上記(１)で得られたtotal ＲＮＡ水溶液 250μｌ（total RNAとして約243μｇ）に、250μｌの緩衝液（10ｍM Tris-HCl, 1mMEDTA,0.1% SDS, pH7.5）を添加し、更に500μLのOligotexTM-dT30を添加した後、６５℃で５分間インキュベートして、反応させた。反応液を氷上に３分間置いた。次いで、反応液に０.１ｍｌの５M　NaClを添加し、37℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液を１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除き、ペレットを４５０μｌ　TE（Tris-EDTA buffer、pH8.0）に溶解させた。ペレットの溶液を６５℃で５分間インキュベートした後、氷上に３分間置いた。その後、ペレットの溶液を20000Gで３分間遠心分離し、400μL分の上清を回収した。上清を通常のエタノール沈殿処理した後、得られた沈殿物を10μL　TEに溶解して、精製ｍＲＮＡの溶液を得た。
（３）ｃＤＮＡの作製及びＰＣＲクローニング
１）ｃＤＮＡ
　上記(２)で得られた精製ｍＲＮＡを鋳型として用い、オリゴ(dT)12-18(和光純薬工業製)とReverscript II（ニッポンジーン製）を用いた通常の逆転写反応を行って、ｃＤＮＡを合成した。
２）ＰＣＲ
　Limulus属Ｇ因子αサブユニットをコードする遺伝子配列は、決定されていなかった。そこで、Tachypleus属G因子αサブユニットをコードする塩基配列から、Tachypleus属Ｇ因子αサブユニットをコードする遺伝子配列を増幅させるＰＣＲプライマーを設計し、このプライマーを用いたＰＣＲを行えば、Limulus属Ｇ因子αサブユニットをコードする塩基配列を増幅できると考え、以下の通り実施した。
　まず、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに開示された、Tachypleus属G因子αサブユニットの遺伝子配列（配列番号１１に示した。）をもとに、下記のプライマー配列を設計し、シグマ社に委託して合成した。
　プライマー配列
　　primer F１　　5'-gcaatgttggtgttgc-3' （配列番号２１）　
　　primer R１　　5'-gaagaaacaacagctgttgacc-3' （配列番号２２）　
　上記プライマーのうち、primer F1は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに開示されたTachypleus属G因子αサブユニットをコードする遺伝子の開始コドンよりも５'側の３つの塩基（gca：シグナル配列をコードすると思われる配列の一部）と、それに続く開始コドンから３'末端側１３番目の塩基までの１６塩基の配列に対応する。また、primer R1は、上記Tachypleus属G因子αサブユニットのＣ末端側の数個のアミノ酸をコードする。
　ＰＣＲは、このプライマー対を用い、上記(３)１)で得られたｃＤＮＡを鋳型として用い、下記の反応条件で、98℃で2分間加熱の後、95℃　15秒、50℃　30秒、68℃2分を３０回繰り返して行い、最後に６８℃　５分の条件で行った。
　　ＰＣＲ反応条件
　　滅菌水　　　　　　１２μｌ
　　ｃDNA　　　　　   　２μｌ
　　primer F1　　　 　　１μｌ
　　primer R1　　　 　　１μｌ
　　0.2mMｄNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）（ニッポンジーン社製）　２μｌ
　　2×TOPOTAQ Amplification Buffer with 6 mM MgCl2 (和光純薬工業製)　 ２０μｌ
　　TOPOTAQ　DNA　Polymerase(和光純薬工業製)　　　　　　　　　　　　  　２μｌ
　得られたＰＣＲ産物を、エチジウムブロミド１μｇ／ｍＬを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけ、1.2Kbp付近のバンド部分のゲルを切り出した。QIAquick Gel Extraction kit（キアゲン製）を用いて、切り出したゲルからＰＣＲ産物を精製した。
（４）組換えベクターの調製と塩基配列の決定
　pGEM－T Easy（Promega Co.製）0.1μgに、上記(３)２)で得られた精製ＰＣＲ産物 約5μg、DNA ligation kit Ver.2 (宝酒造製)Ｉ液5μLを混合後、滅菌蒸留水で総量10μLにした。次いで、１６℃で１時間、ライゲーション反応を行って、組換えベクターを得た。得られた組換えベクターは、上記(３)１)で得られたｃＤＮＡと同じ塩基配列、すなわち、Limulus属Ｇ因子αサブユニットをコードする塩基配列が挿入されている。そこで、得られたこの組換えベクターを、「Limulus属G因子α/ｐＧＥＭ－Ｔ」と命名した。
　得られた組換えベクターLimulus属G因子α/ｐＧＥＭ－Ｔ 200ngを鋳型として用い、上記(３)２）で用いたプライマーの組合せを用いて、DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit ( GE ヘルスケア社製 )を使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、シークエンス反応を行った。
（５）塩基配列の相同性検索
　得られたシークエンス反応物[上記(３)１）で得られたｃＤＮＡと同じ塩基配列を持つ]の塩基配列の解読を、BaseStation（バイオラッドラボラトリーズ(株)）を用いて行った。解読によって得られたLimulus属G因子αサブユニットをコードする塩基配列を配列番号１に、その塩基配列から推定される、この塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。
　次いで、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースを用いて、ベクターに挿入したＰＣＲ産物の塩基配列の相同性検索(BLAST)を行った。その結果、ベクターに挿入したＰＣＲ産物の塩基配列、すなわちｃＤＮＡの塩基配列は、公知のTachypleus属G因子αサブユニットの遺伝子配列と、高い相同性を示すものの、異なることが明らかとなった。即ち、公知のTachypleus属G因子αサブユニットの遺伝子配列と、Limulus属G因子αサブユニット（シグナルペプチドとＮ末端側の一部配列、そしてストップコドン除く）に相当する遺伝子配列の相同性は85.6％であった。また、それぞれの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を比較すると、両者の相同性は、79.5％であった。
　更に、得られたｃＤＮＡの塩基配列から推定される、この塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）を元に、Limulus属G因子αサブユニットの構造を詳しく解析した。その結果、Limulus属G因子αサブユニットは、Ｎ末端側にβ-1,3-グルカナ―ゼ様ドメイン、Ｃ末端側にβＧ結合ドメインと思われる２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）、そして中央にはキシラナーゼA様ドメイン（XlnA様ドメイン）が存在していることが明らかになった。公知のTachypleus属G因子αサブユニットのアミノ酸配列との相違点としては、（ｉ）Ｃ末端側に存在する２量体配列のβＧ結合ドメインの間のリンカー配列が全く異なっている、（ii）配列中央のキシラナーゼA様ドメインに存在する構造モチーフであるQQWSモチーフが、Tachypleus属G因子αサブユニットでは３回繰り返すのに対し、Limulus属G因子αサブユニットのそれでは、２回繰り返していた。
　以上の解析結果をもとに、Limulus属G因子αサブユニットと公知のTachypleus属G因子αサブユニットの塩基配列、アミノ酸配列、蛋白質構造を比較した。結果を下記表２にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、以上の解析から予測されたLimulus属G因子αサブユニットの構造の模式図を図１に、公知のTachypleus属G因子αサブユニット構造の模式図を図２にそれぞれ示す。
（６）発現ベクターの調製
　まず、上記(４)で得られた組換えベクターLimulus属G因子α/ｐＧＥＭ－Ｔを鋳型として用いてＰＣＲ反応を行った。プライマーは、上記(５)で明らかになった塩基配列（配列番号１）から下記のプライマー配列を設計し、シグマ社にて、常法の合成法により合成したものを使用した。このプライマーを用いたＰＣＲにより、上記（５）で明らかとなったLimulus属G因子αサブユニットをコードする配列番号１で表される塩基配列のうちの、５'末端から６９６番目から１９４７番目までの塩基配列、即ち「配列番号２で表されるLimulus属G因子αサブユニットのアミノ酸配列の２３３番目(アスパラギン)～６４９番目（バリン）までのアミノ酸配列」をコードする塩基配列を、増幅することができる。
　プライマー配列
　　primer F２　 5'-aatacaccttctcctgttgacg-3'　（配列番号２３）
　　primer R２ 　5'-ctggattaagattacaaaggtt-3'　（配列番号２４）
　尚、このLimulus属G因子αサブユニットの２３３～６４９番目までのアミノ酸配列を持つペプチドを「Limulus属G因子αサブユニット由来断片ａ」と命名した。すなわち、「Limulus属G因子αサブユニット由来断片ａ」は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を持つ。そして、該断片ａのアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列でコードされる。
　Limulus属G因子αサブユニット由来断片ａの模式図を、Limulus属G因子αサブユニットの模式図と比較できるように、図１の下図に示す。すなわち、Limulus属G因子αサブユニット由来断片ａは、Limulus属G因子αサブユニットのキシラナーゼＡ様ドメイン（２つのQQWSモチーフが存在している。）と、βＧ結合ドメインと思われる２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
　ＰＣＲは、下記の反応条件で、98℃で2分間加熱した後、95℃　15秒、63℃　30秒、68℃　１分を３０回繰り返して行い、最後に６８℃　５分の条件で行った。
　ＰＣＲ反応条件
　　滅菌水　　　　　　１２μｌ
　　Limulus属G因子α/ｐＧＥＭ－Ｔ　　　　　   　２μｌ
　　primer F2　　　　 　１μｌ
　　primer R2　　　　 　１μｌ
　　0.2mMｄNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）（ニッポンジーン(株)製）２μｌ
　　2×TOPOTAQ Amplification Buffer with 6 mM MgCl2 (和光純薬工業(株)製) ２０μｌ
　　TOPOTAQ　DNA　Polymerase (和光純薬工業(株)製)　　　　　             　２μｌ
　得られたＰＣＲ産物を、エチジウムブロミド１μｇ／ｍＬを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけ、1.3Kbp付近のバンド部分のゲルを切り出し、QIAquick Gel Extraction kit（キアゲン製）を用いて、切り出したゲルからＰＣＲ産物を精製した。
　次いで、pTrcHis2ベクター（インビトロジェン(株)製）　１μＬ分と、得られたＰＣＲ産物4μLを混合し、滅菌水で全量5μLにした。次いで、25℃、5分間インキュベートしてライゲーション反応を行い、組換えベクターを調製した。この組換えベクターを用いて大腸菌K株派生のDH5αコンピテント細胞株（ニッポンジーン(株)製）を常法により形質転換した。この形質転換体を、アンピシリン（和光純薬工業(株)製）（100μg/ml）を含む、LB寒天培地上で、３７℃、１日培養してコロニーを形成させた。
　各コロニーの形質転換体から、常法によりＤＮＡをそれぞれ抽出し、BaseStation（バイオラッドラボラトリーズ(株)製）を用いて塩基配列を確認した。そして、配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列をリーディングフレームとして持つ形質転換体を、「Limulus属G因子αサブユニット由来断片a（２３３－６４９aa）/DH5α」と命名した。
（７）Limulus属G因子αサブユニット由来断片a（２３３－６４９aa）の発現
　上記(６)で選択した形質転換体であるLimulus属G因子αサブユニット由来断片a（２３３－６４９aa）/DH5αを一晩前培養した。100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地１ Lに、その培養液（5 mL）を接種し、３７℃で４時間撹拌培養した。菌体のOD600nmが０．８に達した時点で最終濃度１mMのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）（和光純薬工業(株)製）を培地に添加し、更に２０℃、４８時間攪拌培養した。
　培養後、培養液を遠心分離し、得られた沈殿物（菌体）を回収した。沈殿物を蒸留水（大塚製薬製）で洗浄後、菌体を超音波で破砕し、遠心分離（５０００ｇ×１０分）を行って、上清画分を得た。
　発現した蛋白質は、Ｃ末端側に、pTrcHis2ベクター由来の６個のHisが付加している。そこで、Ni－アガロース（和光純薬工業(株)製）を使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、Ni-アガロースによるアフィニティー精製を行って、上記で得られた上清画分から蛋白質を精製した。
（８）Limulus属G因子αサブユニット由来断片a（２３３－６４９aa）の発現の確認
　まず、上記(７)で精製した発現蛋白質（リコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片a）を、ポリアクリルアミドゲル（和光純薬工業(株)製）を用いたSDS－PAGEにかけた後、iBlot(インビトジェン社製)を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜を１％ブロックエースにてブロッキング処理後、ペルオキシダーゼで標識した抗His抗体（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を室温で１時間反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳ－Ｔ（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレート0.05%含有）（和光純薬(株)工業製）で３回洗浄後、ECLplus（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて発光させ、X線フイルム（GEヘルスケア　バイオサイエンス製）に感光させた。
　別に、SDS-PAGE後のゲルを、銀染色キット（和光純薬工業製）を用い、キットに添付のマニュアル記載の方法に準じて、染色した。
　結果を図３(ａ)及び(ｂ)に示す。(ａ)はウエスタンブロッティングを行った結果、(ｂ)はSDS-PAGE後のゲルを銀染色した結果をそれぞれ示す。
　また、図３（ａ）において、レーン(１)は蛋白質分子量マーカー　ドクターウェスタン（オリエンタル酵母工業(株)製）、レーン(２)はアフィニティー精製した断片aを試料として用いた場合の結果である。
　図３（ｂ）において、レーン(１)は蛋白質分子量マーカー　プレシジョンプラス　プロテインスタンダード（BIO-RAD製）、レーン(２)はアフィニティー精製した断片aを試料として用いた場合の結果である。
　図３(ａ)の結果から明らかな如く、発現した蛋白質とペルオキシダーゼ標識抗His抗体が反応したバンド（矢印で示した。）が検出された。
　また、配列番号４で表されるアミノ酸配列から推測されるLimulus属G因子αサブユニット由来断片aの分子量は約48kDaである。図３(ｂ)の結果から明らかな如く、SDS-PAGEで確認された、ペルオキシダーゼ標識抗His抗体と反応したバンド（図３(ａ)）の蛋白質の大きさは約４８kDaで、Limulus属G因子αサブユニット由来断片aの分子量と同じ位置にバンドが確認できた。
　よって、以上の方法によりLimulus属G因子αサブユニット由来の断片a（２３３－６４９aa）を発現させ、リコンビナントなLimulus属G因子αサブユニット由来断片aを得ることができたことが確認された。
実施例２．各種βＧ結合性蛋白質によるβＧの測定
（１）各種βＧ結合性蛋白質の調製
１）カブトガニ（Limulus属）G因子αサブユニット由来断片a
　実施例１で得られた、リコンビナントLimulus属G因子αサブユニット由来断片aを用いた。
２）カイコ由来β認識蛋白質（１－４７９aa）の調製
　Ochiai M. et al., J. Biol. Chem., vol.275, No.7, p.4995-5002 (2000)のFig.3には、カイコ由来のβ-1,3-グルカン認識蛋白質（β-1,3-glucan recognition protein）のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列が記載されている。該蛋白質は、アミノ酸４７９個からなる蛋白質で、1575bpの塩基配列でコードされている。上記文献に記載された方法と上記実施例１に記載の方法に従い、上記文献のFig.3に開示されたカイコ由来のβ-1,3-グルカン認識蛋白質（以下、本明細書では「カイコ由来βＧ認識蛋白質（１－４７９aa）」と記載する。）を得た。
　すなわち、カイコ幼虫の血球から得た抽出物からｍＲＮＡを精製し、逆転写反応でｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｆプライマーとして5'-tacgaggcaccaccg-3'（配列番号３９）を、Ｒプライマーとして5'-gttaaagtttttgcaata-3'（配列番号４０）を用い、該文献に記載された条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をエチジウムブロミド１μｇ／ｍＬを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけ、1.5kbpの付近のバンド部分のゲルを切り出した。QIAquick Gel Extraction kitを用いて、切り出したゲルからＰＣＲ産物を精製した。
　次いで、実施例１(６)で用いたのと同じ発現ベクター（pTrcHis2ベクター）を用いて発現ベクターの調製、及び大腸菌K株派生のDH５αコンピテント細胞株の形質転換を行った。その後、実施例１(７)と同じ方法で、その形質転換体を培養し、「カイコ由来βＧ認識蛋白質（１－４７９aa）」を発現させた。培養後、実施例１(７)と同様の方法で、培養液から蛋白質を精製した。
３）カイコ由来βＧ認識結合蛋白質（１－４５４aa）の調製
　Proc.Natl.Acad.Sci. USA vol.93, p.7888-7893 (1996)のFig. 3には、カイコ由来のグラム陰性菌結合性蛋白質（Gram-negative bacteria-binding protein）のアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列が記載されている。該蛋白質は、アミノ酸４６７個からなる蛋白質で、２２５７bpの塩基配列でコードされている。上記文献に、該蛋白質の構造が「グルカナーゼ様ドメインを含み、G因子αドメインと類似している。」と記載されていることから、この蛋白質はβＧと結合する性質があると推測した。
　そこで、上記文献に記載された方法と上記実施例１に記載の方法に従い、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, vol.93, p.7888-7893 (1996)のFig. 3に開示されたカイコ由来のグラム陰性菌結合性蛋白質（以下、本明細書では「カイコ由来βＧ認識結合蛋白質（１－４５４aa）」と記載する。）を得た。
　すなわち、カイコ幼虫の血球から得た抽出物からｍＲＮＡを精製し、逆転写反応でｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｆプライマーとして5'-atatcgtacgctcaaatgcc-3'（配列番号４１）を、Ｒプライマーとして5'-ctttgtcaaagttatcgcctta-3'（配列番号４２）を用い、該文献に記載された条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をエチジウムブロミド１μｇ／ｍＬを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけ、1.5kbpの付近のバンド部分のゲルを切り出した。QIAquick Gel Extraction kitを用いて、切り出したゲルからＰＣＲ産物を精製した。
　次いで、実施例１(６)で用いたのと同じ発現ベクター（pTrcHis2ベクター）を用いて発現ベクターの調製、及び大腸菌K株派生のDH５αコンピテント細胞株の形質転換を行った。その後、実施例１(７)と同じ方法で、その形質転換体を培養し、「カイコ由来βＧ認識結合蛋白質（１－４５４aa）」を発現させた。培養後、実施例１(７)と同様の方法で、培養液から蛋白質を精製した。
４）ノシメマダラメイガ由来βＧ認識蛋白質（１８１－４７１aa）の調製
　ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）のヘモリンパ（hemolymph）には、βＧ認識蛋白質（β-1,3-glucan recognition protein）が存在する。Fabrick J.A., et al., Insect Biochem. Mol. Biol., vol.33, p.579-594, 2003には、そのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列が記載されている。それは、４７１個のアミノ酸からなり、Ｃ末端側にグルカナーゼ様部分（glucanase-Like domain）を持つ（Fabrick J.A. et al., J. Biol. Chem., vol.279, No.25, p.26605-26611, 2004、Fig.1）。
　そこで、このノシメマダラメイガの、Ｃ末端側１８１番目－４７１番目のアミノ酸配列からなるβＧ認識蛋白質のグルカナーゼ様部分の蛋白質（以下、本明細書では「ノシメマダライカ由来βＧ認識蛋白質（１８１－４７１aa）」と記載する。）を、Fabrick J.A., et al., Insect Biochem. Mol. Biol., vol.33, p.579-594, 2003に記載された方法と上記実施例１に記載の方法に従って得た。
　すなわち、ノシメマダラメイガのヘモリンパから得た抽出物からｍＲＮＡを精製し、逆転写反応でｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｆプライマーとして5'-gaggtcaagtttcctgaag-3'（配列番号４３）を、Ｒプライマーとして5'-gtcagagtctatgcgctg-3'（配列番号４４）を用い、該文献に記載された条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をエチジウムブロミド１μｇ／ｍＬを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけ、1.5kbpの付近のバンド部分のゲルを切り出した。QIAquick Gel Extraction kitを用いて、切り出したゲルからＰＣＲ産物を精製した。
　次いで、実施例１(６)で用いたのと同じ発現ベクター（pTrcHis2ベクター）を用いて発現ベクターの調製、及び大腸菌K株派生のDH５αコンピテント細胞株の形質転換を行った。その後、実施例１(７)と同じ方法で、その形質転換体を培養し、「ノシメマダライカ由来βＧ認識蛋白質（１８１－４７１aa）」を発現させた。培養後、実施例１(７)と同様の方法で、培養液から蛋白質を精製した。
５）その他のβＧ結合性蛋白質の調製
　その他、βＧ結合性蛋白質として、下記のものを用いた。
・マウス由来デクチン－1（R&D SYSTEMS社製）
・マウス由来抗(1,3)βＧ抗体（Biosupplies Australia Pty Ltd製）
（２）βＧ結合性蛋白質のペルオキシダーゼ標識
　Peroxidase Labeling Kit -NH2（(株)同仁化学研究所製）を使用し、キットに添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(１)で調製した各βＧ結合性蛋白をペルオキシダーゼで識標した。
（３）サンドイッチ測定
１）βＧ結合性蛋白質固定化ELISA用マイクロプレートの調製
　上記(１)で調製したβＧ結合性蛋白質を、それぞれ50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)で5μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレート（Nunk社製）の各ウェルに50μL分注し、１０℃で１６時間静置して、該マイクロプレートに各βＧ結合性蛋白質を固定化した（βＧ結合性蛋白質として約250ng/ウェル）。
　次いで、非特異的吸着を減少させるためのブロッキング操作として、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した１％ブロックエース（大日本住友製薬(株)製）溶液を各ウェルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置後、各ウェルを洗浄する処理を行った。
２）ペルオキシダーゼ標識βＧ結合性蛋白質の調製
　上記(２)で得られたペルオキシダーゼ標識βＧ結合性蛋白質を、それぞれ５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した１％ブロックエース溶液で、８０００倍に希釈した。
３）試料の調製
　β－グルカンテストワコー「β－グルカン標準品」（和光純薬工業(株)製）を、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した１％ブロックエース溶液で、レンチナン換算値1000pg/mLに調製した。これを試料として用いた。
４）測定
　上記３）で調製した試料５０μL（レンチナン換算値 50pg）を、上記１)で調製したβＧ結合性蛋白質固定化ELISA用マイクロプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T（和光純薬工業製）で３回洗浄した。上記２）で調製したペルオキシダーゼ標識βＧ結合性蛋白質（２μｇ／ｍＬ）をそれぞれ各ウェルに50μl ずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で１回洗浄し、ＴＭＢ（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）溶液(和光純薬工業(株)製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃、30分間反応させた。その後、反応停止液（１Mりん酸溶液）を各ウェルに50μL ずつ添加して反応を停止させた。４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
　尚、レンチナン換算値 ０pg/mLの試料を用いて同様に測定を行い、ブランク値とした。
（４）結果
　得られた結果を、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　尚、表３に記載された数値は、得られた４５０nmにおける吸光度からブランク値を減算し、１０００倍にした値である。
　また、表３において、それぞれの記号は下記各試料を用いた場合の結果である。
　i：　カイコ由来βＧ認識蛋白質
　ii：　カイコ由来βＧ認識結合蛋白質
　iii：　Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ
　iv：　ノシメマダラメイガ由来βＧ認識蛋白質 
　v：　マウス由来デクチンＩ
　vi：　マウス由来抗(1,3)βＧ抗体
　即ち、例えば上記表３において、「プレートに固定化した蛋白質：iii」且つ「ペルオキシダーゼ標識した蛋白質：iii」で、値が「412」の場合は、『Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａを固定化したELISA用マイクロプレートと、ペルオキシダーゼで標識したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａを用いて上記測定を行い、得られた４５０ｎｍにおける吸光度測定値を１０００倍した値が「412」であった』ということである。
　次に、得られた各吸光度測定値をブランク値で割って得られた値S/N比を、下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　更に、表３と表４の結果をもとに得られた評価結果を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５において、各記号はそれぞれ下記を意味する。
　◎：　OD450nm（×1000）が200以上且つ、S/Nが3.0以上
　○：　OD450nm（×1000）が100以上且つ、S/Nが1.5以上
　△：　OD450nm（×1000）が50～99又は、S/Nが1.0以上
　×：　OD450nm（×1000）が0～49又は、S/Nが1.0以上
　尚、表５において、マウス由来デクチンＩを固定化したプレート（v）と、ペルオキシダーゼ標識マウス由来デクチンＩ（v）の両方を用いた測定法は、非特許文献１等により公知のデクチン２分子を利用したサンドイッチ法による測定法である。
　一方、表５において、本発明にかかるβＧ結合性蛋白質を用いたβＧの測定法は、カブトガニ（Limulus属）Ｇ因子αサブユニット由来断片ａを固定化したプレート（iii）とカブトガニ（Limulus属）Ｇ因子αサブユニット由来断片ａ（iii）の両方を用いた測定法である。
　表５の結果から明らかな如く、表３の値が１００以上且つ、表４のS/N比１．５以の組合せは、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来a断片を固定化したプレート（iii）と、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来a断片（iii）を用いた測定系であった。
　公知のサンドイッチ測定系であるデクチン２分子を用いた方法（デクチンを固定化したプレートと、ペルオキシダーゼ標識したデクチンの両方を用いた方法）では、好ましい結果が得られなかった。
　以上のことから、本発明のβＧ結合性蛋白であるカブトガニ（Limulus属）Ｇ因子αサブユニット由来a断片（iii）を用いたサンドイッチ測定系がβＧ測定に有用であることが示された。
実施例３. Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片を用いたサンドイッチ測定１
（１）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片のデザイン
　実施例１(５)で得られたLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）を基に、下記４種のLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片をデザインした。尚、各断片の模式図を、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニットの模式図と比較できるように、図１に併せて示した。
１）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ：実施例１で得られた断片ａ。配列番号３で表される塩基配列でコードされる、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２３３番目～６４９番目のアミノ酸配列部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（２つのQQWSモチーフが存在している。）と２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
２）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｂ：配列番号５で表される塩基配列でコードされる、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から３８７番目～６４９番目のアミノ酸配列部分に相当する。２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
３）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｃ：配列番号７で表される塩基配列でコードされる、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から５２４番目～６４９番目のアミノ酸配列部分に相当する。Limulus属Ｇ因子αサブユニットの持つ２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうちのＣ末端側のドメインひとつを持つ。
４）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｄ：配列番号９で表される塩基配列でコードされる、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で表されるLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２３３番目～５１５番目のアミノ酸配列部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（２つのQQWSモチーフが存在している。）と、Limulus属Ｇ因子αサブユニットの持つ２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうち、Ｎ末端側のドメインひとつを持つ。
（２）Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片のデザイン
　ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに開示された、Tachypleus属Ｇ因子αサブユニットの遺伝子配列（配列番号１１）をもとに、下記４種のTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片をデザインした。尚、各断片の模式図を、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットの模式図と比較できるように、図２に併せて示した。
１）Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｅ：配列番号１３で表される塩基配列でコードされる、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２９９番目～６７３番目のアミノ酸配列部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（３つのQQWSモチーフが存在している。）、及び２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
２）Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｆ：配列番号１５で表される塩基配列でコードされる、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から４１０番目～６７３番目のアミノ酸配列部分に相当する。２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）を持つ。
３）Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｇ：配列番号１７で表される塩基配列でコードされる、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から５４８番目～６７３番目のアミノ酸配列部分に相当する。Tachypleus属Ｇ因子αサブユニットの持つ２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうち、Ｃ末端側のドメインひとつを持つ。
４）Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｈ：配列番号１９で表される塩基配列でコードされる、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２で表されるTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットのアミノ酸配列の、Ｎ末端から２９９番目～５４７番目のアミノ酸配列部分に相当する。キシラナーゼＡ様ドメイン（３つのQQWSモチーフが存在している。）、及び２量体のキシラナーゼZ様ドメイン（XlnZ）のうちのＮ末端側のドメインひとつを持つ。
（３）カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の発現
　上記(１）及び(２)でデザインした各断片のアミノ酸配列をコードする各塩基配列から、各断片をコードする塩基配列を増幅させるＰＣＲプライマーを設計した。
　各断片のアミノ酸配列の配列番号、そのアミノ酸をコードする塩基配列の配列番号、及び各塩基配列をクローニングする際に用いたプライマー対の塩基配列とその配列番号を、下記表６にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に記載の塩基配列を有する各プライマーを、シグマ社に委託して合成した。次いで、該プライマーを用いる以外は、実施例１(６)と同様の方法で、組換えベクターLimulus属G因子α/ｐＧＥＭ－Ｔを鋳型として用いて、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をエチジウムブロミド１μｇ／ｍＬを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけ、1.5kbpの付近のバンド部分のゲルを切り出した。QIAquick Gel Extraction kitを用いて、切り出したゲルからＰＣＲ産物を精製した。
　次いで、実施例１(６)で用いたのと同じ発現ベクター（pTrcHis2ベクター）を用いて発現ベクターの調製、及び大腸菌K株派生のDH５αコンピテント細胞株の形質転換を行った。その後、実施例１(７)と同じ方法で、その形質転換体を培養し、各断片を発現させた。以上の方法で各断片の大量生産を行った。
（４）カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片のペルオキシダーゼ標識
　Peroxidase Labeling Kit－SH（(株)同仁科学研究所製）を使用し、キットに添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(３)で得られたLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来の各断片、及びTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来の各断片それぞれをペルオキシダーゼで標識した。
（５）サンドイッチ測定
１）カブトガニＧ因子αサブユニット由来各断片固定化ELISA用マイクロプレートの調製
　上記(３)で調製したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来の各断片、及びTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来の各断片をβＧ結合性蛋白質として用いる以外は、実施例２(３)１）と同様の方法で、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来の各断片、又はTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニットの各断片を固定化したELISA用マイクロプレートをそれぞれ調製した。
２）ペルオキシダーゼ標識βＧ結合性蛋白質の調製
　上記(４)で調製したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来の各断片のペルオキシダーゼ標識物、及びTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来の各断片のペルオキシダーゼ標識物を、それぞれ５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した１％ブロックエース溶液で、８０００倍に希釈した。
３）試料の調製
　実施例２(３)３)と同じ試薬を用い、同じ方法で試料を調製した。
４）測定
　上記３）で調製した試料５０μL（レンチナン換算値５０ｐｇ）を上記１)で調製した各マイクロプレートの各ウェルに添加した。以後は、実施例２(３)４)と同様の方法で、４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
　尚、レンチナン換算値０ｐｇ／ｍＬの試料を用いて同様に測定を行い、ブランク値とした。
（６）結果
　得られた結果を、表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に記載された数値は、得られたＯＤ４５０nmにおける吸光度からブランク値を減算し、１０００倍にした値である。
　また、表７において、それぞれの記号は下記カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片を用いた場合の結果である。
　ａ：Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ａ
　ｂ：Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｂ
　ｃ：Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｃ
　ｄ：Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｄ
　ｅ：Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｅ
　ｆ：Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｆ
　ｇ：Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｇ
　ｈ：Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｈ
　表７のデータの読み方は、表３の場合と同様である。
　次に、得られた各吸光度測定値をブランク値で割って得られた値S/N比を、下記表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　更に、表７と表８の結果をもとに得られた評価結果を、下記表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　尚、表９における記号は下記を意味する。
　◎：　OD450nm（×1000）が200以上且つ、S/Nが3.0以上
　○：　OD450nm（×1000）が100以上且つ、S/Nが1.5以上
　△：　OD450nm（×1000）が50～99又は、S/Nが1.0以上
　×：　OD450nm（×1000）が0～49又は、S/Nが1.0以上
　NT：　not test
　表９の結果から明らかな如く、プレートに固定化した断片とペルオキシダーゼ標識した断片の組合せ（プレートに固定化した断片－ペルオキシダーゼ標識した断片）を、当該断片の由来カブトガニで分類した場合、（Limulus属－Limulus属）、（Limulus属－Tachypleus属）、（Tachypleus属－Limulus属）及び（Tachypleus属－Tachypleus属）の、いずれの組合せを用いて測定を行った場合でも、βＧの測定が行えることが判る。
　また、表９の結果から明らかな如く、本実施例の方法でβＧを測定する場合の、より好ましい（プレートに固定化した断片－ペルオキシダーゼ標識した断片）の組合せは、（断片ａ－断片ａ）、（断片ａ－断片ｆ）、（断片ｂ－断片ａ）、（断片ｂ－断片ｄ）、（断片ｂ－断片ｆ）、（断片ｅ－断片ｆ）及び（断片ｆ－断片ｆ）であった。
　また、測定に使用した断片のうち、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ａ、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｂ、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｅ及びTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｆは、いずれもキシラナーゼＺ用ドメインの繰り返し配列２つ（２量体）を持つ。
　一方、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｃ、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｄ、Tachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｇ及びTachypleus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ｈは、いずれもキシラナーゼＺ用ドメインを１つ（１量体）持つ。
　そこで、測定に使用したプレートに固定化した断片とペルオキシダーゼ標識した断片の組合せ（プレートに固定化した断片－ペルオキシダーゼ標識した断片）を、当該断片に含まれるキシラナーゼＺ用ドメインの構造で分類した場合、（２量体－２量体）、（２量体－１量体）、（１量体－２量体）、（１量体－１量体）の、いずれの組合せを用いて測定を行った場合でも、βＧの測定が行えることが判る。
　また、これらの結果から、今回の測定条件ではそれほど良好な結果の得られていない一部の組合せについても、条件を整えれば測定が可能となることも示唆される。
　以上のことから、測定に使用する断片の、由来カブトガニおよびキシラナーゼＺ用ドメインの構造に関係なく、本発明に係るβＧ結合性蛋白質１を固定化したプレートと標識物質で標識した本発明に係るβＧ結合性蛋白質２を用いたサンドイッチ測定系を実施すれば、βＧの測定が行えることが判る。
実施例４.カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片を用いたサンドイッチ測定２
（１）カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片の調製
１）Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂ及びTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇの調製
　形質転換用の大腸菌株としてプロテアーゼ欠損株でB株派生のBL21（DE3）を用いる以外は、実施例３(３)と同様の方法を実施して、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂ及びTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇを発現させ、精製した。
２）Tachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇ/Cysの調製
　Tachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇの（547aa-673aa）のＮ末端にシステイン１残基を導入したTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇ/Cysを設計した。次いで、プライマーＦとして配列番号４５に記載の塩基配列（5'-tgttctaaattaattcaggcag-3'）を持つプライマー、プライマーＲとして配列番号３６に記載の塩基配列を持つプライマーを用いる（プライマーＦ及びプライマーＲは、シグマ社に委託して合成した。）以外は、実施例３(３)と同様の方法を実施して、Tachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇ/Cysを発現させ、精製した。
（２）サンドイッチ測定
１）βＧ結合性蛋白質固定化ＥＬＩＳＡ様マイクロプレート
　実施例３(５)１）で調製したのと同じものを用いた。
２）ペルオキシダーゼ標識発現断片の調製
　Peroxidase Labeling Kit－SHを使用し、キットに添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(１)で得られた各断片をペルオキシダーゼで標識した。
３）試料：実施例２(３)３)と同じ試薬を用い、同じ方法で試料を調製した。
４）測定
　上記３）で調製した試料５０μL（レンチナン換算値５０ｐｇ）を上記(２)１)で調製した各マイクロプレートの各ウェルに添加した。以後は、実施例２(３)４)と同様の方法で、４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
　尚、レンチナン換算値０ｐｇ／ｍＬの試料を用いて同様に測定を行い、ブランク値とした。
（３）結果
　得られた結果を、下記の表１０及び表１１に示す。
　表１０は、ペルオキシダーゼ標識断片として、上記(１)１)で得られたLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂのペルオキシダーゼ標識物又はTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇのペルオキシダーゼ標識物を用いた場合の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　また、表１１は、ペルオキシダーゼ標識断片として、上記(１)２)で得られたTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇ/Cysのペルオキシダーゼ標識物を用いた場合の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１０及び表１１の結果を実施例３で得られた表９の結果と比較すると、ペルオキシダーゼ標識断片として上記(１)１)で得られたLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂを用いた場合、実施例３の場合にはβＧの測定ができなかった（プレートに固定化した断片－ペルオキシダーゼ標識した断片）の組合せが（断片ａ－断片ｂ）、（断片ｂ－断片ｂ）、（断片ｃ－断片ｂ）、（断片ｆ－断片ｂ）、（断片ｇ－断片ｂ）の場合でも、十分な感度でβＧの測定ができた。
　また、ペルオキシダーゼ標識断片として上記(１)１)で得られたTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇを用いた場合、実施例３の場合には感度が不十分だった（断片ｇ－断片ｇ）場合でも、十分な感度でβＧの測定ができた。
　更に、実施例３の場合には（プレートに固定化した断片－ペルオキシダーゼ標識した断片）の組合せの（断片ｃ－断片ｇ）の組合せではβＧの測定ができず、また（断片ｂ－断片ｇ）の組合せでは、十分な感度でβＧの測定ができなかった。しかし、ペルオキシダーゼ標識断片として上記(１)２)で得られたTachypleus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｇ/Cysを用いた場合には、（断片ｃ－断片ｇ/Cys）及び（断片ｂ－断片ｇ/Cys）の組合せで、十分な感度でβＧの測定ができた。
　その理由としては、以下のことが考えられる。すなわち、実施例３ではＧ因子αサブユニット断片のβＧ結合ドメイン中の２箇所のCys残基部分にペルオキシダーゼを結合させる。しかし、βＧ測定で標識断片と試料を反応させた際、断片に結合したペルオキシダーゼが、断片とβＧとの結合を阻害していたと考えられる。そこで、本実施例では断片のＮ末端にCys残基を導入し、そこにペルオキシダーゼを結合させた。これにより、ペルオキシダーゼが断片とβＧとの結合を阻害しなくなり、十分な感度でβＧの測定ができたのだと考えられる。
　以上の通り、本実施例で用いた３種のペルオキシダーゼ標識断片は、実施例３で反応しなかった組合せでも反応することがわかった。
実施例５.カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片を用いたサンドイッチ測定３
（１）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cysの調製
　Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａのＮ末端にシステイン１残基を導入したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ/Cysを設計した。次いで、プライマーＦとして配列番号４６に記載の塩基配列（5'-tgtctggattaagattacaaagg-3'）を持つプライマー、プライマーＲとして配列番号２４に記載の塩基配列を持つプライマーを用いる以外は（プライマーＦ及びプライマーＲは、シグマ社に委託して合成した。）、実施例１(６)～(８)と同様の方法を実施して、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ/Cysを発現させ、精製した。
（２）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cysのペルオキシダーゼ標識
　Peroxidase Labeling Kit－SHを使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(１)で得られたリコンビナントLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ／Cysをベルオキシダーゼで標識した。　
　これを、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.5）に溶解したカゼイン含有の１％ブロックエース溶液で８０００倍に希釈したものを、測定に用いた。
（３）試料の調製
　βＧ測定用キットであるβ－グルカンテストワコーに添付の「β－グルカン標準品」（和光純薬工業製）を、５０ｍM　ＰＢＳ（ｐＨ７.５）に溶解した０.５％血清アルブミンで希釈し、レンチナン換算値（「βＧ標準品」に添付の現品説明書に記載：表示値３５ｐｇはレンチナン１ｎｇに相当）１０００ｐｇ／ｍＬに調製した。そして、更に５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７）に溶解した０.５％血清アルブミンでレンチナン換算値０、２０、５０、１００、２５０、４００、５００pg/mLに調製した。これを試料として用いた。
（４) Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｂ固定化ELISA用マイクロプレートの調製
　実施例３で得られたリコンビナントLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂを、50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)で5μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレートの各ウェルに50μLずつ分注し、１０℃で１６時間静置して、該マイクロプレートにLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｂを固定化した。
　次いで、非特異的吸着を減少させるためのブロッキング操作として、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した０.５％血清アルブミンを各ウェルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置後、各ウェルを洗浄する処理を行った。
（５）サンドイッチ測定
　上記（４）で調製したマイクロプレートの各ウェルに、上記（３)で調製した各レンチナン濃度の試料をそれぞれ５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T（和光純薬工業製）で３回洗浄した。上記（２)で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片aを各ウェルに50μl ずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で１回洗浄した。次いでTMB溶液(和光純薬工業製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃で30分間反応させた。その後、キットの反応停止液（１Mりん酸溶液）を各ウェルに50μL ずつ添加し、反応を停止させた。波長４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
　得られた測定値をもとに、試料中のレンチナン濃度（換算値、pg/mL、ｘ軸）に対する４５０ｎｍにおける吸光度（OD450nm、ｙ軸)をプロットした検量線を作成した。
（６）結果
　得られた検量線を図４に示す。図４において、エラーバーは２SDの値を示す。
　また、測定値から最小２乗法で求めた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。
　ｙ＝０．００１３ｘ＋０．１３４２
　Ｒ２＝０.９９８９
　図４から明らかな如く本発明に係るβＧ結合性蛋白質を用いてβＧの測定を行った場合、試料中のβＧ濃度（レンチナン濃度換算値で０～５００pg/mL）に比例した、良好な検量線が得られ、βＧの定量に用いることが出来ることがわかる。特に、レンチナン濃度の下限が２０pg/mLまで有意に検出可能であることが確認できた。尚、レンチナン濃度２０pg/mLは、測定に使用したβＧ測定用キットであるβ－グルカンテストワコーで測定した場合の、血中グルカン０．７pg/mL(カットオフ値１１pg/mL以下)に相当する。
実施例６.カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片のペルオキシダーゼ様活性の確認
（１）βＧ結合性蛋白質
　実施例１で得られたリコンビナントLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片a、及び実施例３で得られたリコンビナントLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂを用いた。
　尚、上記した如く、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aは、Limulus属Ｇ因子αサブユニットのＮ末端から２３３番目～６４９番目のアミノ酸配列を持ち、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂは、Limulus属Ｇ因子αサブユニットのＮ末端から３８７番目～６４９番目のアミノ酸配列を持つ。即ち、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂは、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ａと比較して、Limulus属Ｇ因子αサブユニットのＮ末端から２３３番目～３８６番目のアミノ酸配列を欠くものである。
（２）ペルオキシダーゼ活性の測定
　上記(１)のβＧ結合性蛋白質を、それぞれ50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)にて０、３、４、５、６、７μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレートの各ウェルに50μL分注した。１０℃で１６時間静置して、マイクロプレートに各βＧ結合性蛋白質を固定化した。
　次いで、非特異的吸着を減少させるブロッキング操作として、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した１％ブロックエース溶液または０．１％血清アルブミンを各ウェルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置し、各ウェルを洗浄した。
　次いで、TMB溶液(和光純薬工業製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃、30分間反応させた。その後、反応停止液（１Mりん酸溶液）を各ウェルに50μL ずつ添加して反応を停止させた。波長 ４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
　尚、βＧ結合性蛋白質の代わりに０．１％血清アルブミンのみの試料を用いて、同様に測定を行い、ブランク値とした。
（３）結果
　得られた結果を、図５に示す。図５において、各バーはそれぞれ下記のβＧ結合性蛋白質を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　図５から明らかな如く、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ｂは、その濃度が０、３、４、５、６、７μg/mLの範囲内ではペルオキシダーゼ活性を示さない。一方、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aは、その濃度が０、３、４、５、６、７μg/mLの範囲内で断片ａの濃度依存的にペルオキシダーゼ活性が確認できた。
　以上の結果よりLimulus属Ｇ因子αサブユニット断片のＮ末端から２３３番目～３８６番目のアミノ酸配列がペルオキシダーゼ活性を持つのに必須であると考えられる。
実施例７Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aのペルオキシダーゼ活性に対する金属イオンの関与
（１）ペルオキシダーゼ活性の測定
　実施例１で得られたリコンビナントLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aの１０μg/mL溶液（50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)）中に、エチレンジアミン四酢酸・2Na（EDTA)を終濃度７０ｍ、又はNaN3を終濃度０．０５％となるように混合し、25℃、１時間インキュベートした。対照としてこれら金属キレート剤を含有しないLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aの１０μg/mL溶液を調製した。
　次いで、インキュベート後のそれぞれの溶液を、50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)にてLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aが５μg/mLになるように調製し、ELISA用マイクロプレートの各ウェルに50μL分注し、 １０℃で１２時間～２０時間静置して固定化した。非特異的吸着を減少させるブロッキング操作として、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した１％ブロックエース溶液または０．１％血清アルブミンを各ウェルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置し、各ウェルを洗浄した。
　TMB溶液(和光純薬工業製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃、30分間反応させた。その後、反応停止液（１Mりん酸溶液）を各ウェルに50μL ずつ添加し、波長 ４５０nmにおける吸光度をVmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
（２）結果
　得られた結果を、図６に示す。
　図６から明らかな如く、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aは、金属キレート剤であるEDTA又はNaN3が存在すると、Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片aのペルオキシダーゼ活性が失われることが確認できた。この結果、Limulus属Gがペルオキシダーゼ活性を得るためには金属イオンが関与していることが考えられる。
実施例８.カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片を用いたサンドイッチ測定４
（１）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cysの調製
　Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａのＮ末端にシステイン１残基を導入したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ/Cysを設計した。次いで、プライマーＦとして配列番号４６に記載の塩基配列（5'-tgtctggattaagattacaaagg-3'）を持つプライマー、プライマーＲとして配列番号２４に記載の塩基配列を持つプライマーを用いる以外は（プライマーＦ及びプライマーＲは、シグマ社に委託して合成した。）、実施例１(６)～(８)と同様の方法を実施して、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ/Cysを発現させ、精製した。
（２）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片aのＤＮＡ標識
（ｉ）標識用の２５０ｂｐＤＮＡ断片の調製
プライマー１（5'-gcctagcaaactcggaagatt-3'、配列番号４７）と、あらかじめ５‘末端にＣ６アミノリンカー（シグマ社製）が導入されたプライマー２（塩基配列は5'-atctatgactgtacgccaatgtccctag-3'、配列番号４８）をシグマ社に委託して合成した。このプライマーペアを用い、λＤＮＡ（株式会社日本ジーン製）を鋳型として用いてＰＣＲを行ない、一方の末端にＣ６アミノリンカーを持つ２５０ｂｐＤＮＡ断片を調製した。このＰＣＲ産物をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーおよびイソプロパノール沈殿により精製し、標識用２５０ｂｐＤＮＡ断片を得た。
（ii）２５０ｂｐＤＮＡ断片とLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片aの結合
　ＤＮＡ断片に導入されたＣ６アミノリンカーのＮＨ２基と、Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）リンカー（サーモフィシャー社製）とをＥＭＣＳ添付説明書記載の方法により反応させた後、ゲル濾過処理を行い、未反応ＥＭＣＳリンカーを除去してＥＭＣＳリンカーが結合したＤＮＡ断片を得た。このＥＭＣＳリンカー結合ＤＮＡ断片と上記（１）の断片aとをＥＭＣＳ添付説明書記載の方法で反応させた。得られた反応物をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片aのＤＮＡ標識体を得た。
（３）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a／Cysの蛍光標識
　ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　Ｃ２　ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．製）を使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(１)で得られた断片a／CysをＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ　６４７で蛍光識標した。
（４）βＧ試料の調製
　βＧ測定用キットであるβ－グルカンテストワコーに添付の「β－グルカン標準品」（和光純薬工業製）を、キット添付のβ－グルカン標準溶解液で溶解し標準液（原液）を調製した。更にキット添付のβ－グルカン標準溶解液で希釈しレンチナン換算濃度で０、２５、５０、１００、２００、４００、８００ｐｇ／ｍＬに調製した。これを試料として用いた。
（５）キャピラリー電気泳動法によるサンドイッチ測定
１）キャピラリーチップ
　図７に示すレイアウトを有するキャピラリーチップを、「マイクロ科学チップの技術と応用」１８５～２１７頁［北森武彦ほか　２００４年出版（丸善株式会社）］に記載の方法に従い、以下のように作製した。
　即ち、石英基板上に成膜したＳｉ上にフォトレジスト膜を成膜した。このフォトレジストに図７に示すキャピラリデザイン（レイアウト）を有するマスクを用いて露光し、現像を行った。現像によりフォトレジストが除かれた部分のＳｉをスパッタによって除去した後、フッ化水素溶液を用いてウエットエッチングを行って石英基板にキャピラリチャンネル溝（細管）を作製した。石英基板上に残るフォトレジスト及びＳｉ膜を除去した後、当該石英基板と、各種ウェルへの各種試薬類の導入又は排出用の穴を有するカバープレートとをHF接合法によって張り合わせてキャピラリーチップを作製した。
　尚、図７中、Ｌ１及びＬ２はリーディングバッファー導入用ウェルを、Ｒ１はトレーリングバッファー導入用ウェルを、Ｓは泳動用試料導入用ウェルを、Ｗ１及びＷ２は、ドレイン用ウェルをそれぞれ示す。また、図中のＬ１－Ｒ１間は６．３ｃｍ、Ｌ１－Ｌ２間は２．８ｃｍである。
２）泳動用試料
　上記（２）で得られたLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a／CysのＤＮＡ標識体、および上記（３）で得られたLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a／Cysの蛍光標識体を用いて、以下の組成の反応用試液を調製した。
　　２５ｎＭ　Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/CysのＤＮＡ標識体
　　６ｎＭ　Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cysの蛍光標識体
　　１５０ｍＭ　ＢｉｓＴｒｉｓ
　　１００ｍＭ　塩化マグネシウム
　　０．５６％　ｐＤＭＡ２２（ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド））
　　３．３３％　グリセロール
　　０．０５６％　Ｔｗｅｅｎ２０
　　０．０１％　ＢＳＡ
　　１％　ヘパリンリチウム
　　ｐＨを７．０に調製
　この反応用試液４５μＬと上記（４）で調製したβＧ試料５μＬを室温で１分間混合し、試料中のβＧとLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/CysのＤＮＡ標識体、およびLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cysの蛍光標識体を反応させたものを泳動用試料とした。
３）泳動用試液
a) トレーリングバッファー：75mM Tris base, 0.5% pDMA 22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSAを含む125mM HEPES
b) リーディングバッファー：50mM NaCl, 0.5% pDMA22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSA, 1% Heparin Liを含む75mM Tris-HCl （pH8.0）
４） 泳動用試料及び試液の導入
　図７のＳウェル（泳動用試料導入用ウェル）に前記２）で得られた泳動用試料１０μＬを、Ｒ１ウェル（試液導入用ウェル）にトレーリングバッファー１０μＬを、Ｌ１ウェル及びＬ２ウェルにリーディングバッファー１０μＬをそれぞれを滴下し、Ｗ１（ドレイン用ウェル）－Ｗ２（ドレイン用ウェル）間に１００秒間、－５ｐｓｉの圧力を印加して、泳動用試料及びリーディングバッファーをチャンネルに導入した。
５） 濃縮・分離・検出
　図７のＲ１ウェル－Ｌ１ウェル間に２５００Ｖの電圧を印加して、３０℃で、Ｒ１→Ｌ１方向に泳動用試料を濃縮させながら電気泳動を行なった。Ｌ１ウェル－Ｌ２ウェル間の電圧をモニターすることで、Ｌ２チャンネルとメインチャンネルとのクロス部分の通過を確認し、通過したところでＬ２ウェル－Ｌ１ウェル間に１５００Ｖの電圧を１２０秒間印加して、Ｌ２→Ｌ１方向に泳動して当該試料中の未反応のLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a／Cysの蛍光標識体と、試料中のβＧとLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a／CysのＤＮＡ標識体およびLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a／Cysの蛍光標識体の複合体とを分離し、該複合体量の検出を行った。
　尚、検出は、Ｌ２チャンネルクロス部分からＬ１よりに２ｃｍのキャピラリー部分で、蛍光顕微鏡（ＢＸ－５０；ＫＳオリンパス（株）製）を使用して６５０ｎｍレーザー励起により蛍光強度を経時的に測定することによって行った。
　その結果を基に、試料中のレンチナン濃度（換算値、pg/mL、ｘ軸）に対する該複合体の蛍光強度の時間積分値（蛍光強度を経時的にモニターし該当するピークの部分を時間で積分した値、ｙ軸）をプロットした検量線を作成した。
（６）結果
　得られた検量線を図８に示す。図８において、エラーバーは２ＳＤを示す。
　また、測定値から最小２乗法で求めた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。
　ｙ＝０．０３７０ｘ＋５．１
　Ｒ２＝０．９９９９
　図８から明らかな如く本発明に係るβＧ結合性蛋白質を用いてβＧの測定を行った場合、試料中のβＧ濃度（レンチナン濃度換算値で０～８００ｐｇ／ｍＬ）に比例した、良好な検量線が得られ、βＧの定量に用いることが出来ることがわかる。特に、レンチナン濃度濃度の下限が５０ｐｇ／ｍＬまで有意に検出可能であることが確認できた。尚、レンチナン濃度５０ｐｇ／ｍＬは、測定に使用したβＧ測定用キットであるβＧテストワコーで測定した場合の、血中グルカン１．７５ｐｇ／ｍＬ(カットオフ値１１ｐｇ／ｍＬ)に相当する。
実施例９．カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片を用いたサンドイッチ測定５
（１）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cys
　実施例８で得られたリコンビナントLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cysを用いた。
（２）Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片a/Cysのペルオキシダーゼ標識
　Peroxidase Labeling Kit－SHを使用し、添付のマニュアル記載の方法に準じて、上記(１)のリコンビナントLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ／Cysをベルオキシダーゼで標識した。　
　これを、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.5）に溶解したカゼイン含有の１％ブロックエース溶液で８０００倍に希釈したものを、測定に用いた。
（３）血漿試料の調製
　ヒト血漿を、50mM PBS (pH7.5, 0.5%血清アルブミン含有）で10倍希釈し、その半量を70℃で10分間温浴中で加熱処理（前処理）した。
　前処理した血漿と、前処理しなかった血漿を夫々血漿試料として用いた。
（４) Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ固定化ELISA用マイクロプレートの調製
　実施例１で得られたリコンビナントLimulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片ａを、50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)で5μg/mLに調製し、ELISA用マイクロプレートの各ウェルに50μLずつ分注し、１０℃で１６時間静置して、該マイクロプレートにLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａを固定化した。
　次いで、非特異的吸着を減少させるためのブロッキング操作として、５０ｍMリン酸緩衝生理食塩水（ｐH7.0）に溶解した０.５％血清アルブミンを各ウェルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置後、各ウェルを洗浄する処理を行った。
（５）サンドイッチ測定
　上記（４）で調製したマイクロプレートの各ウェルに、上記（３)で調製した血漿試料をそれぞれ５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T（和光純薬工業製）で３回洗浄した。上記（１)で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット断片ａを各ウェルに50μl ずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で１回洗浄した。次いでTMB溶液(和光純薬工業製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃で30分間反応させた。その後、反応停止液（１Mりん酸溶液）を各ウェルに50μL ずつ添加し、反応を停止させた。波長４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定した。
　別にβ－グルカン標準品を、実施例５(３)の方法で調製した試料を用いて同様に測定を行い、検量線を作成した。
　血漿試料を用いて得られた吸光度値を、該検量線に当てはめることによって、血漿試料中のβＧ量を算出した。
　尚、本発明の測定方法の性能を確認するために、常法による添加回収試験を行った。すなわち、適当量のβＧをβＧ陰性のヒト血漿に加えた血漿試料を用いて、本実施例の方法によるβＧの測定を行った。その結果、添加回収率は72.8～93.9％で、良好な回収率を示した。
　また本実施例の方法によるβＧ測定法は、血漿中に含まれるヘパリンの影響を受けないことを確認している。
（６）結果
　得られた結果を表１２に示す。
比較例１．
（１）血漿試料
　実施例９で用いた、前処理した血漿試料を用いた。
（２）βＧ濃度の測定
　上記(１)の血漿試料のβＧ濃度を、βＧ測定用キットである市販のβ－グルカン テストワコー（和光純薬工業(株)製）を用い、当該キットのパンフレットに記載の操作法に従い、比濁時間分析法の常法に従って以下のようにβＧの測定を行った。
　すなわち、前処理した血漿試料２００μLを、キットのリムルス試薬（凍結乾燥品。カブトガニ血球抽出物(ＡＬ)を含有する。）に添加し、ボルテックスミキサーにより数秒間攪拌した後、３７℃保温下に、トキシノメーターＭＴ－５５００（和光純薬工業(株)製）を用いて、上記混合液の透過光量が、測定開始から５％減少するまでの時間（以下、Ｔｇと略記する。）を測定した。別に、蒸留水と濃度既知のβＧ溶液を用いて同様の測定を行い、βＧ濃度とＴｇとの関係を表す検量線を作成した。この検量線に基づいて、試料中のβＧの濃度を算出した。
（３）結果
　得られた結果を表１２に併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　従来のカブトガニ血球抽出物を用いたβＧの測定方法は、蛋白質分解酵素カスケードを利用するものであるが、血液試料中に含有するプロテアーゼにより該カスケードが阻害されてしまう。そこで従来のカブトガニ血球抽出物を用いたβＧの測定を実施するためには、血液試料を加熱処理して、予め血液試料中の酵素を失活させる前処理が必須である。
　実施例９で、前処理した血漿試料と前処理しない血漿試料中のβＧ含量を、本発明のサンドイッチELISA法で測定した。その結果、表１２から明らかな如く、前処理しない血漿試料を用いて測定したβＧ濃度は、前処理した血漿試料を用いて測定したβＧ濃度と近似していた。しかもその値は、前処理した血漿試料中のβＧ濃度を従来のカブトガニ血球抽出物を用いた測定法によって測定して得られたβＧ濃度（比較例１）とも近似していた。
　このことから、本発明のβＧ測定法を実施すれば、試料の前処理を行わずにβＧの測定を行えることが判る。また、以上の結果は、本発明のβＧの測定法は、臨床試料中のβＧを検出するための新しい検出系になり得ることを示唆するものである。
実施例１０．本発明のサンドイッチ測定法と従来のカブトガニ血球抽出物を用いた測定法による血漿βＧ値の相関
（１）本発明のサンドイッチ測定
１）ペルオキシダーゼ標識Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片a／Cys
　実施例９で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片a／Cysを用いた。
２) Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ固定化ELISA用マイクロプレート
　実施例９で調製したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ａ固定化ELISA用マイクロプレートを用いた。
３）血漿試料の調製
　市販のβ－グルカンテストワコー（和光純薬工業(株)）を用いた測定で、βＧ濃度がカットオフ辞意かであることを確認したヒト血漿（Ｎ＝５０）を、実施例９と同じ方法で前処理したものを血漿試料として用いた。
４）サンドイッチ測定
　実施例９と同じ機器を用い、同様の測定条件で測定を行い、血漿試料中のβＧ量を算出した。
（２）カブトガニ血球抽出物を用いた測定（比濁時間分析法）
　血漿試料として、上記（１）３）と同じものを用いる以外は比較例１と同様の方法で、血漿試料中のβＧ量を算出した。
（３）結果
　本発明のサンドイッチ測定法により得られたβＧ濃度（本発明のβＧ測定法）と、市販のキットを用いた従来のカブトガニ血球抽出物を用いた測定法により得られたβＧ濃度（従来の測定法）との相関図を図９に示す。
　図９の結果の回帰分析を行って得られた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。
　ｙ＝０．５０６ｘ＋６．２４８
　Ｒ＝０．９３３
　以上の結果から明らかな通り、本発明βＧ測定法により得られたβＧ濃度は、従来のカブトガニ血球抽出物を用いた測定法により得られたβＧ濃度と良好な相関関係を示すことが判る。以上の結果は、本発明のβＧの測定法は、臨床試料中のβＧを検出するための新しい検出系になり得ることを示唆するものである。
実施例１１. Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片を用いたサンドイッチ測定６
（１）ペルオキシダーゼ標識Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片a／Cys
　実施例９で調製したペルオキシダーゼ標識Limulus属Ｇ因子αサブユニット由来断片a／Cysを用いた。
（２) Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｂ固定化ELISA用マイクロプレート
　実施例５（４）で調製したLimulus属カブトガニＧ因子αサブユニット由来断片ｂ固定化ELISA用マイクロプレートを用いた。
（３）βＧ試料の調製
　βＧ測定用キットであるβ－グルカンテストワコーに添付の「β－グルカン標準品」（和光純薬工業製）を、キット添付のβ－グルカン標準溶解液で溶解し標準液（原液）を調製した。更にキット添付のβ－グルカン標準溶解液で希釈しレンチナン換算濃度で０、１、５、１０，１７，５０，１００ｐｇ／ｍＬに調製した。これを試料として用いた。
（４）サンドイッチ測定
　上記(２)のマイクロプレートの各ウェルに、上記(３)で調製した試料をそれぞれ５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。次いで各ウェルをPBS-T（和光純薬工業製）で３回洗浄した。上記(１)のペルオキシダーゼ標識Limulus属カブトガニＧ因子αサブユニットａ／Cysを各ウェルに50μl ずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄後、蒸留水で１回洗浄した。次いでSuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate（Thermo scientific製）を加え、キットに添付の取扱説明書に従って、反応させた。
　Ultra Evolution(TECAN Group Ltd.製)を用いて、発光量（cps, count per second）を測定した。
（５）結果
　結果を図１０に示す。図１０において、エラーバーは１ＳＤの値を示す。
　図１０から明らかな如く本発明に係るβＧ結合性蛋白質を用いて、蛍光測定でβＧの測定を行った場合、レンチナン濃度の下限が１ｐｇ／ｍＬまで有意に検出可能であることが確認できた。
　また、市販のβＧ測定用キットであるβＧテストワコーで測定する場合の血中グルカンカットオフ値は１１pg/mＬである。レンチナン１ｐｇはグルカン０．０３５ｐｇに相当することが知られている。本実施例に於いて、検出できるレンチナン濃度の下限が１ｐｇ／ｍＬであり、試料希釈倍率を考慮しても市販のβＧ測定用キットのカットオフ値よりも低い濃度を測定できること、すなわち極めて高感度にβＧを測定できることが判った。
　これは、実施例４の場合と同様、Cysを導入した断片ａをペルオキシダーゼ標識したことにより、断片ａに結合したベルオキシダーゼと、断片ａ中のβＧ結合部位との間に距離が生じることで、ペルオキシダーゼが断片とβＧとの結合を阻害しなくなり、十分な感度でβＧの測定が出来たのだと考えられる。
　本発明のβＧ測定法は、リコンビナントβＧ結合性蛋白質を利用することができ、天然原料を使用する必要がないので、試薬によるロット差がなく、一定の、しかも高い測定感度でβＧを特異的に測定することができる、という効果を奏する。
Ｌ１、Ｌ２　リーディングバッファー導入用ウェル
Ｒ１　トレーリングバッファー導入用ウェル
Ｓ　泳動用試料導入用ウェル
Ｗ１、Ｗ２　ドレイン用ウェル

Claims (21)

  1. 下記の方法で行う、β－グルカン（以下、「βＧ」と略記する。）の測定方法、
    （１）試料と、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質１（以下、「βＧ結合性蛋白質１」と略記する。）と、配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質２（以下、「βＧ結合性蛋白質２」と略記する。）とを接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質２との複合体を形成させ、
    （２）該複合体の量を測定し、
    （３）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のβ－グルカン量を測定する。
  2. βＧ結合性蛋白質１が不溶性担体に固定化されている、請求項１に記載の測定方法。
  3. βＧ結合性蛋白質２が標識物質で標識されている、請求項１に記載の測定法。
  4. 下記の方法で行う、請求項１に記載の測定方法、
    （１）試料と、βＧ結合性蛋白質１とを接触させて、試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質１との複合体－１を形成させ、次いで
    （２）該複合体－１と、βＧ結合性蛋白質２と接触させて、βＧ結合性蛋白質１と試料中のβＧとβＧ結合性蛋白質２との複合体－２とを形成させ、次いで
    （３）該複合体－２の量を測定し、
    （４）得られた該複合体－２の量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
  5. 下記の方法で行う、請求項１に記載の測定方法、
    （１）試料と、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、試料中のβＧと不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１との複合体－１を形成させ、次いで
    （２）該複合体－１と、βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、複合体－１とβＧ結合性蛋白質２との複合体－２を形成させ、次いで
    （３）該複合体－２の量を測定し、
    （４）得られた該複合体－２の量に基づいて、試料中のβ－グルカン量を測定する。
  6. 下記の方法で行う、請求項１に記載の測定方法、
    （１）試料と、不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１とを接触させて、試料中のβＧと不溶性担体に固定化されたβＧ結合性蛋白質１との複合体－１を形成させ、次いで
    （２）該複合体－１と、標識物質で標識された標識βＧ結合性蛋白質２とを接触させて、複合体－１と標識βＧ結合性蛋白質２との複合体－２を形成させ、次いで
    （３）該複合体－２中の標識物質量を測定し、
    （４）得られた標識物質量に基づいて、試料中のβＧ量を測定する。
  7. βＧ結合性蛋白質１及びβＧ結合性蛋白質２を、不溶性担体に固定化することなく用いる、請求項１に記載の測定法。
  8. 複合体を形成させた後、該複合体と、遊離のβＧ結合性蛋白質１及び遊離のβＧ結合性蛋白質２を、キャピラリー電気泳動で分離する、請求項７に記載の測定法。
  9. 配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質を含有する、βＧ測定用試薬。
  10. βＧ結合性蛋白質が不溶性担体に固定化されている、請求項９に記載の試薬。
  11. βＧ結合性蛋白質が標識物質で標識されている、請求項９に記載の試薬。
  12. 下記を構成成分として含んで成るβ－グルカン測定用キット
    （１）配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質１を含有する試薬
    （２）配列番号４、６、８、１０、１４、１６、１８又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質２を含有する試薬。
  13. βＧ結合性蛋白質１が不溶性担体に固定化されている、請求項１２に記載のキット。
  14. βＧ結合性蛋白質２が標識物質で標識されている、請求項１２に記載のキット。
  15. 配列番号４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質。
  16. 配列番号１、３、５、７、９、１３又は１９のいずれかで表される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含有する、核酸分子。
  17. 配列番号２、４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質、をコードする、核酸分子。
  18. 核酸分子がＤＮＡである、請求項１６又は１７に記載の核酸分子。
  19. 請求項１６又は１７に記載の核酸分子が組み込まれた組換え体。
  20. 請求項１９に記載の組み換え体により形質転換又は形質導入された形質転換体又は形質導入体。
  21. 請求項２０に記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られた培養物から蛋白質を分離することを特徴とする、配列番号２、４、６、８、１０、１４又は２０のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つβＧに対する結合性を有する蛋白質、の製造方法。
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