JP6966756B2 - β−グルカン結合タンパク質、β−グルカン検出キット、人工ＤＮＡおよび細菌 - Google Patents
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Description
本発明は、β−グルカン結合タンパク質、β−グルカン検出キット、人工ＤＮＡおよび細菌に関する。
β-グルカンは真菌細胞壁を構成する主要な構成多糖であり、グルコースがβ-(１→３)結合で連結した多糖であるβ-１,３-グルカンや、β-(１→６)結合で構成されるβ-１,６-グルカンなどが知られている。
そして、例えば、深在性真菌症は、治療開始の遅れにより致命的ともなり得る感染症であり、適切な抗菌薬の選択に向けた早期診断のために、β-グルカンを分子マーカーとした真菌の検出が行われている。
具体的には、例えば、カブトガニに由来するβ-１,３-グルカン応答タンパク質であるリムルスＧ因子は、ヒト血中β-１,３-グルカンを検出する体外診断用医薬品として利用されている。また、カブトガニ血球成分のＧ因子αサブユニットに由来するβ-グルカン結合タンパク質とこれを利用したβ-グルカン測定方法として、特許文献１の技術が知られている。
また、β-グルカンは、免疫調節性天然物として古くから注目されており、近年では、β-グルカンを含む機能性食材などの開発も期待されているため、このような分野においてもβ-グルカンを検出、測定するための技術の確立が望まれている。
そして、β-グルカン結合タンパク質としては、各種の昆虫由来の天然のタンパク質が知られており、そのアミノ酸配列が明らかになっているが（非特許文献１）、例えば、pHやNaCl濃度などの条件によっては、その結合安定性が低下する場合があり、各種の用途に対する実用性が十分ではなかった。
このような状況にあって、本発明者らのグループは、鋭意研究によって、β-グルカンと結合する新たな人工β−グルカン結合タンパク質を創作し、その結合安定性などについて報告している（非特許文献２、３）。
M. Kanagawa, T. Satoh, A. Ikeda, Y. Adachi, N. Ohno, Y. YamaguchiStructural insights into recognition of triple-helical beta-glucans by an insect fungal receptor J. Biol. Chem., 286 (2011), 29158-29165
第６０回日本医真菌学会 Ｐ−０５４ポスター
Abstract of 137th Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan
しかしながら、非特許文献２、３では、人工β−グルカン結合タンパク質の特性について検討されているものの、具体的な人工β−グルカン結合タンパク質のアミノ酸配列などについてはこれまで一切明らかにされてこなかった。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、β-グルカンとの結合安定性に優れたβ−グルカン結合タンパク質、β−グルカン検出キット、人工ＤＮＡおよび細菌を提供することを課題としている。
上記の課題を解決するため、本発明のβ−グルカン結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴としている。
本発明のβ−グルカン検出キットは、上記のβ−グルカン結合タンパク質を含むことを特徴としている。
本発明の人工ＤＮＡは、上記のβ−グルカン結合タンパク質をコードしていることを特徴としている。
本発明の細菌は、上記の人工ＤＮＡが導入されていることを特徴としている。
本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、天然型であるBm BGRPやTc BGRPなどよりも高いβ−グルカン結合活性を有しているとともに、pHや熱に対する安定性に優れている。
本発明のβ−グルカン検出キットによれば、pHや温度による影響を受けにくく、安定にβ−グルカンを検出、定量することができる。
本発明の人工ＤＮＡは、例えば大腸菌などに導入することで、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を高い収率で産生する形質転換体を得ることができる。
本発明の細菌によれば、天然型であるBm BGRPやTc BGRPなどよりも高い収率で本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を得ることができる。
以下、本発明のβ−グルカン結合タンパク質、β−グルカン検出キット、人工ＤＮＡおよび細菌の一実施形態について説明する。
＜β−グルカン結合タンパク質＞
本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、以下の配列番号１のアミノ酸配列を含んでいる。このアミノ酸配列は、従来知られているカイコなどの各種昆虫由来のβ−グルカン結合タンパク質（BGRP）のアミノ酸配列と、本発明者らのこれまでの知見に基づいて、約36残基（カイコに対しては23残基）のアミノ酸変異を導入することで人工的に作製したβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）である。
（配列番号１）
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His Met Glu Leu Gly
Thr Tyr Glu Val Pro Asp Ala Lys Leu Glu Ala Ile Tyr Pro Lys Gly Leu Arg Val Ser
Ile Pro Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ala Phe His Gly Lys Leu Asn Glu Glu Met Glu
Gly Leu Glu Ala Gly Thr Trp Ser Arg Asp Ile Thr Lys Ala Lys Asn Gly Arg Trp Thr
Phe Arg Asp Arg Asn Ala Glu Leu Lys Ile Gly Asp Lys Ile Tyr Phe Trp Thr Tyr Val
Ile Lys Asp Gly Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asn Gly Glu Trp Thr Val Thr Gly Tyr Val
Asp Glu Asp Gly Asn Pro Val Asp Thr Asp Gly Pro Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Glu
Phe Lys Leu Val Asp Leu Gln Ser Arg
本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、以下の配列番号１のアミノ酸配列を含んでいる。このアミノ酸配列は、従来知られているカイコなどの各種昆虫由来のβ−グルカン結合タンパク質（BGRP）のアミノ酸配列と、本発明者らのこれまでの知見に基づいて、約36残基（カイコに対しては23残基）のアミノ酸変異を導入することで人工的に作製したβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）である。
（配列番号１）
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His Met Glu Leu Gly
Thr Tyr Glu Val Pro Asp Ala Lys Leu Glu Ala Ile Tyr Pro Lys Gly Leu Arg Val Ser
Ile Pro Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ala Phe His Gly Lys Leu Asn Glu Glu Met Glu
Gly Leu Glu Ala Gly Thr Trp Ser Arg Asp Ile Thr Lys Ala Lys Asn Gly Arg Trp Thr
Phe Arg Asp Arg Asn Ala Glu Leu Lys Ile Gly Asp Lys Ile Tyr Phe Trp Thr Tyr Val
Ile Lys Asp Gly Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asn Gly Glu Trp Thr Val Thr Gly Tyr Val
Asp Glu Asp Gly Asn Pro Val Asp Thr Asp Gly Pro Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Glu
Phe Lys Leu Val Asp Leu Gln Ser Arg
本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、公知の化学的または遺伝子工学的手法によって取得することができるが、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）をコードする人工ＤＮＡが導入された組換え大腸菌によって発現させることで取得する方法を好ましく例示することができる。大腸菌によって本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を発現させることで、昆虫由来の天然型BGRPと比較して、高い収率で本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を取得することができる。
また、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、特に、β−１,３グルカンまたはβ−１,３−１,６グルカンに対して強い結合性を有している。本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）が結合するβ−グルカンとしては、例えば、Paramylon、Curdlan、Pachyman、Paramylon、CSBG(Candida-solubilizedβ-glucan)、APBG（Aureobasidium β-glucan）、SPG、Laminarin、Barley BG（大麦β-グルカン）、酵母β-グルカンなどを例示することができる。
さらに、β-グルカンの三重螺旋構造はアルカリにより、その水素結合が解離し、一部一重螺旋構造を有することが知られているが、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、三重螺旋構造を有するβ−グルカンに対して強い結合性を有している。
本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、天然型であるBm BGRPやTc BGRPなどと比較して高いβ−グルカン結合活性を有しているとともに、pHや熱に対する安定性に優れている。
このように、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）は、大腸菌での発現のしやすさ、収量、β−グルカン結合におけるpHや熱安定性などの点から、例えば、β−グルカンの検出、定量を目的としたタンパク質プローブとして有用である。
また、配列番号１のアミノ酸配列において、標識物や担体への修飾などの効率性を高めるために、例えば、10〜30残基の親水性アミノ酸のペプチドリンカーを任意の位置に挿入することもできる。
＜β−グルカン検出キット＞
本発明のβ−グルカン検出キットは、上述した本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を含み、これ以外にも、β−グルカン検出、測定のための各種の材料を含むことができる。
本発明のβ−グルカン検出キットは、上述した本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を含み、これ以外にも、β−グルカン検出、測定のための各種の材料を含むことができる。
具体的には、本発明のβ−グルカン検出キットを用いたβ−グルカンの検出、測定は、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）と被検試料とを接触させ、β−グルカン結合タンパク質と被検試料中のβ−グルカンとの複合体を形成させ、この複合体の存在を検出するか、あるいは複合体量を定量することで行うことができる。このような検出、測定は、例えば従来知られている方法（例えば特許文献１など）として、ELISA法における直接吸着法、サンドイッチ法、競合法などに準じて行うことができる。また、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を担体に固相化したクロマトグラフィーを作製することで、溶液試料中のβ-グルカンを分離精製することができる。
したがって、本発明のβ−グルカン検出キットは、これらの検出、測定方法に従って、各種のマーカー（標識物質）や担体などを含むことができる。
本発明のβ−グルカン検出キットの一実施形態では、担体として、プラスチック、ガラス、ゲル、セルロイド、紙、磁性樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロース、ラテックス、およびポリスチレンからなる材料を例示することができる。具体的には、担体は、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、マイクロタイタープレート、ラジオイムノアッセイプレート、ビーズ、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、免疫ブロット膜、および免疫ブロット紙を含むことができる。
本発明のβ−グルカン検出キットの一実施形態では、マーカーとして、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、発色団標識、リガンド、フルオレセイン、放射性同位体、ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ビオチン、ビオチン関連、アビジン、アビジン関連化合物などを含むことができる。
＜人工ＤＮＡ＞
本発明の人工ＤＮＡは、上述した本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）をコードしている。具体的には、本発明の人工ＤＮＡとしては、以下の配列番号２の塩基配列を含む人工ＤＮＡを例示することができる。この人工ＤＮＡは、例えば、公知のＤＮＡ自動合成機などを使用して作製することができる。
（配列番号２）
atgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcatatcgaaggtaggcatatggagctcggt
acctatgaagtgcctgatgcgaaactcgaagccatttaccccaaagggttacgcgttagc
attccggatgatggcttttcgctgtttgccttccatgggaaactgaacgaggagatggaa
ggtctggaagctggaacttggagtcgggacatcacgaaagcgaagaacggtcgttggacc
tttcgtgaccgcaatgcagagctgaaaattggcgacaagatctacttctggacctacgtc
atcaaagatggcttgggttatcgccaggataacggagaatggaccgtaacgggctatgtg
gacgaagatggcaatccggttgataccgatggtccgactacgacaccaaccggatccgaa
ttcaagcttgtcgacctgcagtctagatag
本発明の人工ＤＮＡは、上述した本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）をコードしている。具体的には、本発明の人工ＤＮＡとしては、以下の配列番号２の塩基配列を含む人工ＤＮＡを例示することができる。この人工ＤＮＡは、例えば、公知のＤＮＡ自動合成機などを使用して作製することができる。
（配列番号２）
atgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcatatcgaaggtaggcatatggagctcggt
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＜細菌＞
本発明の細菌は、上述した本発明の人工ＤＮＡが導入されることで形質転換されている。細菌の種類は、例えば、大腸菌、P seudomonas、Bacillus subtilis、Bacillus stearothermophilus、酵母その他の菌類などを例示することができるが、大腸菌であることが好ましい。
本発明の細菌は、上述した本発明の人工ＤＮＡが導入されることで形質転換されている。細菌の種類は、例えば、大腸菌、P seudomonas、Bacillus subtilis、Bacillus stearothermophilus、酵母その他の菌類などを例示することができるが、大腸菌であることが好ましい。
例えば、プラスミドベクターなどで本発明の人工ＤＮＡを大腸菌などの細菌に導入して形質転換させ、本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を発現する細菌を得ることができる。本発明の細菌によってタンパク質を発現させることで、昆虫由来の天然型BGRPと比較して、高い収率で本発明のβ−グルカン結合タンパク質（Sup BGRP）を取得することができる。
本発明のβ−グルカン結合タンパク質、β−グルカン検出キット、人工ＤＮＡおよび細菌は、以上の実施形態に限定されるものではなく、適宜設計することができる。
以下、実施例とともに、本発明のβ−グルカン結合タンパク質等について詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
上述したように、本発明のβ−グルカン結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するものである（図１）。以下では、配列番号１のアミノ酸配列からなるβ−グルカン結合タンパク質を「Sup BGRP」または「Sup」と記載する場合がある。
また、天然型のβ−グルカン結合タンパク質として、カイコ Bombyx mori 由来のものを「Bm BGRP」または「Bm」と記載する場合がある（図２）。さらに、天然型のβ−グルカン結合タンパク質として、コクヌストモドキ Tribolium castaneum由来のものを「Tc BGRP」または「Tc」と記載する場合がある。
＜実施例１＞SDS-PAGE
His‐Tagアフィニティ−クロマトグラフィーで精製した各BGRP試料（Sup BGRP、Bm BGRP、Tc BGRP）に2×SDS-Sample Bufferを1:1になるように混合し、ボルテックス後3分煮沸し、サンプルを作成した。 15%アクリルアミドゲル濃度でLaemmli法を用いてサンプル試薬の分離を行った。分子量マーカーにはDynaMarker Protein MultiColor Stable (BioDynamics Laboratory Inc.) を使用した。
His‐Tagアフィニティ−クロマトグラフィーで精製した各BGRP試料（Sup BGRP、Bm BGRP、Tc BGRP）に2×SDS-Sample Bufferを1:1になるように混合し、ボルテックス後3分煮沸し、サンプルを作成した。 15%アクリルアミドゲル濃度でLaemmli法を用いてサンプル試薬の分離を行った。分子量マーカーにはDynaMarker Protein MultiColor Stable (BioDynamics Laboratory Inc.) を使用した。
染色にはRapid CBB KANTO (関東化学株式会社)を用い、そのプロトコールに準じて染色を行った。
図４に示したように、Sup BGRP、Bm BGRP、及びTc BGRPは17から18ｋDa前後 の分子量を示し、いずれも単一分子であることが確認された。
＜実施例２＞大腸菌によるBGRPの発現
Sup BGRPをコードするDNA配列（配列番号２）およびBm BGRPおよびTc BGRPをコードする公知のDNA配列に基づいて作成したプラスミドを、ヒートショック法を用いて大腸菌BL21株に遺伝子導入を行った。
Sup BGRPをコードするDNA配列（配列番号２）およびBm BGRPおよびTc BGRPをコードする公知のDNA配列に基づいて作成したプラスミドを、ヒートショック法を用いて大腸菌BL21株に遺伝子導入を行った。
その後、LB培地に0.01% Ampicillinの濃度になるように調整し加えた培地 10mLで37℃一晩振盪培養を行った。培養後に培地を200mLにメスアップし、OD630で0.4〜0.6の範囲まで37℃で振盪培養を行った。培養後、15℃30分振盪培養を行い、その後IPTGを100 μg/mLの濃度になるように培地に加え、15℃24時間振盪培養を行った。
培養後、5000回転10分遠心を行い、沈殿をTALON Bufferに懸濁し超音波により細胞壁を破砕し、タンパク質を回収した。タンパク質の回収法はTALON Metal Affinity Resin (TaKaRa)のプロトコールに準じて回収した。回収後、PBSにて透析を行い、透析後0.04% Proclinの濃度になるように加えたPBS溶液で冷蔵保存した。
大腸菌によるBGRP（Sup BGRP、Bm BGRP、Tc BGRP）の収量を表１に示す。
表１に示したように、大腸菌にて作製した組換え型Sup BGRPは、天然型BGRP (Bｍ、Tc) よりも高い収率を示すことが確認された。
＜実施例３＞BGRP結合反応性試験
＜１＞BGRP結合反応性試験では、以下の表２に示したβ-グルカンを使用した。
＜１＞BGRP結合反応性試験では、以下の表２に示したβ-グルカンを使用した。
＜２＞まず、サンドイッチELISAでの固相化BGRP量とβ−グルカンの反応性について、Candida BG ( CSBG ) を用いて検討した。具体的には、以下の手法でBGRP固相化量の検討を行った。
（１）Biotin化BGRPの作成
BGRPを10mM Bicine buffer (pH8.0)にて透析し、回収後Biotin-(AC5)2-Sulfo-OSu (DOJINDO)をタンパク質溶液に添加した。よく混和したあと，室温で2時間インキュベートした。その後PBSで透析を行い、透析後0.04％Proclinになるように加え冷蔵保存した。
BGRPを10mM Bicine buffer (pH8.0)にて透析し、回収後Biotin-(AC5)2-Sulfo-OSu (DOJINDO)をタンパク質溶液に添加した。よく混和したあと，室温で2時間インキュベートした。その後PBSで透析を行い、透析後0.04％Proclinになるように加え冷蔵保存した。
（２）Biotin化効率の評価
HABAを3.5mgはかりとりDMSO 125μLに溶解した(HABA-DMSO溶液)。Avidin を2.5mgはかりとりPBSに溶解した。そこに、HABA-DMSO溶液を50μL加えPBSで5mLにメスアップした(HABA-Avidin溶液)。384well plateに(+)Biotinをスタンダードにし、HABA-Avidin溶液と混ぜ合わせ50μL/well入れた。サンプルもスタンダードと同様にHABA-Avidin溶液と混ぜ合わせ50μL/well入れた。その後、測定波長500nmで吸光度を測定した。付属の検量線ソフトにより、試料溶液中のbiotin濃度を算出した。同じ試料溶液中のタンパク濃度をBCA法により求め、Biotin: Proteinの分子比（B/P比）を算出した。
HABAを3.5mgはかりとりDMSO 125μLに溶解した(HABA-DMSO溶液)。Avidin を2.5mgはかりとりPBSに溶解した。そこに、HABA-DMSO溶液を50μL加えPBSで5mLにメスアップした(HABA-Avidin溶液)。384well plateに(+)Biotinをスタンダードにし、HABA-Avidin溶液と混ぜ合わせ50μL/well入れた。サンプルもスタンダードと同様にHABA-Avidin溶液と混ぜ合わせ50μL/well入れた。その後、測定波長500nmで吸光度を測定した。付属の検量線ソフトにより、試料溶液中のbiotin濃度を算出した。同じ試料溶液中のタンパク濃度をBCA法により求め、Biotin: Proteinの分子比（B/P比）を算出した。
（３）Sandwich ELISAを用いたBGRP固相化量の検討
各BGRPを0.1M phosphate buffer (pH6.8)で20、5、1.25、0.31、0.08、0 μg/mLの濃度に希釈し、96well NUNC ELISA plateに50 μL/well入れ、37℃で2時間又は4℃で一晩置いた。その後、PBSTで3回洗浄し、BPBSで室温1時間置いた。CSBGを100 ng/mLにBPBSで希釈し50 μL/well入れ、37℃ 1時間培養した。PBSTで3回洗浄後、各Bio-BGRPをBPBSで0.5μg/mLの濃度に希釈し50μL/well加え、37℃ 1時間培養した。PBSTで3回洗浄後、Streptavidin-HRP (BioLegend)を0.2 μg/mLの濃度にBPBSで希釈し、50μL/well入れ37℃ 1時間培養した。PBSTで5回洗浄後、TMBを50μL/well入れ、Stop solutionを50 μL/well入れ反応を停止させ、測定波長450 nm、参照波長630nmの吸光度で測定を行った。
各BGRPを0.1M phosphate buffer (pH6.8)で20、5、1.25、0.31、0.08、0 μg/mLの濃度に希釈し、96well NUNC ELISA plateに50 μL/well入れ、37℃で2時間又は4℃で一晩置いた。その後、PBSTで3回洗浄し、BPBSで室温1時間置いた。CSBGを100 ng/mLにBPBSで希釈し50 μL/well入れ、37℃ 1時間培養した。PBSTで3回洗浄後、各Bio-BGRPをBPBSで0.5μg/mLの濃度に希釈し50μL/well加え、37℃ 1時間培養した。PBSTで3回洗浄後、Streptavidin-HRP (BioLegend)を0.2 μg/mLの濃度にBPBSで希釈し、50μL/well入れ37℃ 1時間培養した。PBSTで5回洗浄後、TMBを50μL/well入れ、Stop solutionを50 μL/well入れ反応を停止させ、測定波長450 nm、参照波長630nmの吸光度で測定を行った。
＜３＞結果を図５に示す。Bm BGRPとSup BGRPとの比較では、Sup BGRPの方が高い反応性を示すことが確認された。Tc BGRPとSup BGRPの比較ではほぼ同等の反応性を示すことが確認された。3種類のBGRPにおいて、BGRP濃度が5μg/mL以下になると反応性の低下がみられたため、以降の実験では、固相化タンパク濃度を5μg/mLとした。
＜４＞次に、Sandwich ELISA法によって各種β−グルカン及び他の多糖におけるBGRPの反応性結合性の検討を行った。
各BGRPを0.1M phosphate buffer (pH6.8)で5μg/mLの濃度に希釈し、96well NUNC ELISA plateに50 μL/well入れ、37℃で2時間又は4℃で一晩置いた。その後、PBSTで3回洗浄し、BPBSで室温1時間置いた。表２に示した各β−グルカンを2倍連続希釈でプレートに入れ37℃ 1時間培養した。PBSTで3回洗浄後、各Bio-BGRPをBPBSで0.5 μg/mLの濃度に希釈し50 μL/well加え、37℃ 1時間培養した。PBSTで洗浄後、Streptavidin HRP (BioLegend)を0.2μg/mLの濃度にBPBSで希釈し、50μL/well入れ37℃ 1時間培養した。PBSTで5回洗浄後、TMBを50μL/well入れ、Stop solutionを50μL/well入れ反応を停止させ、測定波長450 nm、参照波長630 nmの吸光度で測定を行った。なお、以下の実施例におけるELISAも同様の方法で行った。
結果を図６および図７に示す。
Sup BGRPとBm BGRPの比較では、Candida BG(CSBG)、Pachyman、ParamylonでSup BGRPはBm BGRPと比較して有意に高い結合性を示した。SPG、黒酵母BG(APBG)では、Sup BGRPはBm BGRPと比較して有意に高い結合性を示した。一方、CSBG、Pachyman、Paramylonと同濃度範囲(最大濃度100ng/mL)では反応がほとんど見られなかったため、この3種のBGより反応性は低いと考えられる。
Sup BGRPとTc BGRPの比較では、Candida BG (CSBG)、Pachyman、Paramylonにおいて、Tc BGRPがSup BGRPと比較して有意に高い結合性を示した。Paramylonでは、全ての濃度においてTc BGRPの結合性が有意であったのに対し、Candida BG、Pachymanでは中間の濃度でTc BGRPに有意な結合性がみられた。Pachyman、Paramylon、Curdlanはアルカリを用いて溶解しているため、β−グルカンの高次構造が変化しており、螺旋構造の開裂しているβ−グルカンに結合しやすいTc BGRPの結合性が高いと考えられる。SPG、黒酵母BG(APBG)では、Sup BGRPはTc BGRPと比較して有意に高い結合性を示した。このことからも、Sup BGRP は、Tc BGRPと結合特異性が異なると考えられる。
また、全てのBGRPにおいてBarley glucanには他のβ−グルカンと比較しほとんど結合性を示さなかった。Barley glucanはβ-(1,3)結合とβ-(1,4)結合を有することが知られており、β-(1,4)結合が存在する場合には、BGRPの反応性が低下することが示唆された。
＜実施例４＞BGRP結合性におけるβ-グルカンの高次構造特異性の検討
β-グルカンの三重螺旋構造はアルカリにより、その水素結合が解離し、一部一重螺旋構造を有することが知られている。トリプルヘリックス構造を保持したものと部分的にヘリックス構造が開裂したもので結合性がどのように変化するのかLaminarinとSPGを用いて、実施例３と同様に検討した。
β-グルカンの三重螺旋構造はアルカリにより、その水素結合が解離し、一部一重螺旋構造を有することが知られている。トリプルヘリックス構造を保持したものと部分的にヘリックス構造が開裂したもので結合性がどのように変化するのかLaminarinとSPGを用いて、実施例３と同様に検討した。
結果を図８、図９に示す。Sup BGRP、Bm BGRPはともにアルカリ未処理のβ-グルカンに比較的高い反応を示したが、アルカリ処理を行うと反応が低下した。Tc BGRPは未処理にほとんど反応せずアルカリ処理のβ-グルカンに反応を示した。
したがって、Tc BGRPは一重螺旋のβ-グルカンに反応しやすく、Sup BGRPは三重螺旋のβ-グルカンに良く反応することが示唆された。
＜実施例５＞BGRPのpH反応性の検討
BGRPの酸アルカリ等の液性による結合性への影響を調べるため広域緩衝液のBritton-Robinson buffer (pH3-12) (BR-buffer) と、図１０に示した緩衝液(T2buffer) ならびにPBSのNaCl濃度のみを変化させた水溶液を用いてELISAで検討した。
BGRPの酸アルカリ等の液性による結合性への影響を調べるため広域緩衝液のBritton-Robinson buffer (pH3-12) (BR-buffer) と、図１０に示した緩衝液(T2buffer) ならびにPBSのNaCl濃度のみを変化させた水溶液を用いてELISAで検討した。
結果を図１１および図１２に示す。Sup BGRPはBm BGRP、Tc BGRPおよびdectin-1と比較して、広いpH域でβ−グルカン（Laminarin）結合性を保持しており、この性質は別種の緩衝液を使用しても同じ傾向であることが確認された。
＜実施例６＞BGRPのβ−グルカン結合性に対するNaCl濃度の影響の検討
BGRPの結合性に対するNaCl濃度の影響を調べるため、リン酸緩衝液中のNaCl濃度を変えた反応液でBGRPとβ−グルカン（Laminarin）との反応性をELISAで検討した。
BGRPの結合性に対するNaCl濃度の影響を調べるため、リン酸緩衝液中のNaCl濃度を変えた反応液でBGRPとβ−グルカン（Laminarin）との反応性をELISAで検討した。
結果を図１３に示す。NaCl濃度上昇に伴いTc BGRPやDectin-1はβ−グルカン結合性が低下したが、Sup BGRPやBm BGRPは高塩濃度溶液中でも高いβ−グルカン結合性を示すことが確認された。
＜実施例７＞BGRPの熱処理によるβ−グルカン結合性の変化の検討
＜１＞BGRPの熱安定性を検討するために、BGRP（Sup BGRP、Bm BGRP、Tc BGRP、Dectin‐1）のPBS溶液をThermal cyclerを用いて40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃で30分処理あるいは−20℃の冷凍庫にて30分処理した。
＜１＞BGRPの熱安定性を検討するために、BGRP（Sup BGRP、Bm BGRP、Tc BGRP、Dectin‐1）のPBS溶液をThermal cyclerを用いて40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃で30分処理あるいは−20℃の冷凍庫にて30分処理した。
各温度処理後のBGRPについてSDS-PAGEならびにBlue native PAGE (BN-PAGE)8)で比較した。
β−グルカンはLaminarinあるいはCSBG (BGRP:BG=1:3)を用い、複合体と単量体の泳動度の違いから結合性の変化を比較した。
具体的には、SDS-PAGEは、実施例１と同様の方法で行い、BN-PAGEは、以下の材料と方法によって行った。
（ストック溶液）
A溶液：1Mトリシン／NaOH（pH7.0）：1.79gのトリシンを5mLのDIWで溶解し、5M NaOHでpH7.0に調整した。 最後にそれをDIWで希釈して10mlの溶液を作った。
B溶液：1M Bis-Tris/HCl (pH7.0)：DIW 40mLで10.46g Bis-Trisを可溶化した。pHを6MのHClで7.0に調整し、次いでそれをDIWで希釈して50mLの溶液を作った。
アクリルアミド溶液（48％Acrylamide 1.5% Bis-acrylamide aqueous solution）：19.2ｇのアクリルアミドおよび600mg Bis-acrylamideを40mLのDIWで溶解した。
５×試料緩衝液：50mg CBB G-250(TCI)および6.5mg 6-amino-n-caproic acid(Wako)をチューブ内で秤量した。次に100μLのB溶液を加えた。その後、17.4μgのPMSF（Sigma）をEtOHに溶解したものを溶液に加えた。 その後、DIWで合計1mLに溶解した。 最後に、この緩衝液とグリセロールを１：１で混合した。
A溶液：1Mトリシン／NaOH（pH7.0）：1.79gのトリシンを5mLのDIWで溶解し、5M NaOHでpH7.0に調整した。 最後にそれをDIWで希釈して10mlの溶液を作った。
B溶液：1M Bis-Tris/HCl (pH7.0)：DIW 40mLで10.46g Bis-Trisを可溶化した。pHを6MのHClで7.0に調整し、次いでそれをDIWで希釈して50mLの溶液を作った。
アクリルアミド溶液（48％Acrylamide 1.5% Bis-acrylamide aqueous solution）：19.2ｇのアクリルアミドおよび600mg Bis-acrylamideを40mLのDIWで溶解した。
５×試料緩衝液：50mg CBB G-250(TCI)および6.5mg 6-amino-n-caproic acid(Wako)をチューブ内で秤量した。次に100μLのB溶液を加えた。その後、17.4μgのPMSF（Sigma）をEtOHに溶解したものを溶液に加えた。 その後、DIWで合計1mLに溶解した。 最後に、この緩衝液とグリセロールを１：１で混合した。
（緩衝液）
バッファ陰極緩衝液：ガラスビン中に20mgのCBB G‐250を計量し、5mLのA溶液、1.5mLのB溶液および93.5mLのDIWを加えた。
アノード緩衝液：25mLのB溶液をDIWで500mLに希釈した。
ゲル緩衝液：1.97gの6-amino-n-caproic acidをチューブ内で秤量した。次に1.5mLのB溶液をチューブに注いだ。最後にDIWで15mLに希釈した。調製した溶液はすべて4℃で保存した。ゲル作製および電気泳動は、SE260マイティスモールIIデラックスミニ垂直電気泳動ユニット（Hoefer）を用いて行った。
バッファ陰極緩衝液：ガラスビン中に20mgのCBB G‐250を計量し、5mLのA溶液、1.5mLのB溶液および93.5mLのDIWを加えた。
アノード緩衝液：25mLのB溶液をDIWで500mLに希釈した。
ゲル緩衝液：1.97gの6-amino-n-caproic acidをチューブ内で秤量した。次に1.5mLのB溶液をチューブに注いだ。最後にDIWで15mLに希釈した。調製した溶液はすべて4℃で保存した。ゲル作製および電気泳動は、SE260マイティスモールIIデラックスミニ垂直電気泳動ユニット（Hoefer）を用いて行った。
（ゲル）
ゲル10％分離ゲル：4 mLのゲルバッファー、1.6 mLのアクリルアミド溶液、1 mLのグリセロール、1.4 mLのDIW、および32 μLの10％APS水溶液をチューブ内で穏やかに混合した。ゲルを作製する直前に3.2μLTEMEDを加えた。
上部ゲル：1mLのゲル緩衝液、0.16mLのアクリルアミド溶液、0.84mLのDIWおよび16μLの10％APS水溶液をチューブ内で穏やかに混合した。ゲルを作製する直前に1.6μLのTEMEDを加えた。
ゲル10％分離ゲル：4 mLのゲルバッファー、1.6 mLのアクリルアミド溶液、1 mLのグリセロール、1.4 mLのDIW、および32 μLの10％APS水溶液をチューブ内で穏やかに混合した。ゲルを作製する直前に3.2μLTEMEDを加えた。
上部ゲル：1mLのゲル緩衝液、0.16mLのアクリルアミド溶液、0.84mLのDIWおよび16μLの10％APS水溶液をチューブ内で穏やかに混合した。ゲルを作製する直前に1.6μLのTEMEDを加えた。
（電気泳動）
電気泳動タンパク質およびβ−グルカンの混合物試料を流す前に、電気泳動ユニットを氷水(1L/hour)で循環させることによって低温に保った。2μgのBGRPまたはDectin-1-Fcおよび2μgのBG（Laminarin、CSBG）を混合し（Sup BGRP:Laminarin, Bm BGRP:Laminarin, Dectin-1：Laminarin, Tc BGRP：CSBG）、室温でインキュベートした。1時間 次に５×試料緩衝液を添加し、そして氷上で5分間インキュベートした。最初の1時間、100Vで電気泳動を行った。その後、電気泳動が終了するまで出力を150Vに変更した。電気泳動後、ゲルを固定し、10％メタノールおよび15％酢酸を含有する水溶液で1時間漂白した。 その後、ゲルをDIWで3回洗浄した。最後に、ゲルをスキャンして画像を得た。
電気泳動タンパク質およびβ−グルカンの混合物試料を流す前に、電気泳動ユニットを氷水(1L/hour)で循環させることによって低温に保った。2μgのBGRPまたはDectin-1-Fcおよび2μgのBG（Laminarin、CSBG）を混合し（Sup BGRP:Laminarin, Bm BGRP:Laminarin, Dectin-1：Laminarin, Tc BGRP：CSBG）、室温でインキュベートした。1時間 次に５×試料緩衝液を添加し、そして氷上で5分間インキュベートした。最初の1時間、100Vで電気泳動を行った。その後、電気泳動が終了するまで出力を150Vに変更した。電気泳動後、ゲルを固定し、10％メタノールおよび15％酢酸を含有する水溶液で1時間漂白した。 その後、ゲルをDIWで3回洗浄した。最後に、ゲルをスキャンして画像を得た。
＜２＞結果を図１４に示す。いずれのBGRPも熱処理によるSDS-PAGEでの泳動度変化は見られなかったが、Dectin-1-Fcは60℃で凝集しはじめ、 結合活性が失われたのに対し、3種のBGRPはどれも高温での凝集はあまり起こさず、また結合性を失うこともなかった。Bm BGRP(B)やTc BGRP(T)は60℃以上で凝集が起こり始めたが、Sup BGRPでは凝集は認められなかった。また、β−グルカン結合能は90℃処理でも失われなかった。
Claims (7)
- β−グルカンとの結合性を有するβ−グルカン結合タンパク質であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とするβ−グルカン結合タンパク質。
- 前記β−グルカンは、β−１,３グルカンまたはβ−１,３−１,６グルカンであることを特徴とする請求項１のβ−グルカン結合タンパク質。
- 前記β−グルカンは、三重螺旋構造を有することを特徴とする請求項１のβ−グルカン結合タンパク質。
- 請求項１から３のいずれかのβ−グルカン結合タンパク質を含むβ−グルカン検出キット。
- 請求項１のβ−グルカン結合タンパク質をコードする人工ＤＮＡ。
- 配列番号２の塩基配列を含む、請求項５の人工ＤＮＡ。
- 請求項５または６の人工ＤＮＡが導入された細菌。
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