WO2022050316A1 - β－１，６－分岐β－１，３－グルカンまたはβ－１，３－グルカンの検出・定量方法および検出・定量キット - Google Patents

β－１，６－分岐β－１，３－グルカンまたはβ－１，３－グルカンの検出・定量方法および検出・定量キット Download PDF

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protein
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reporter
split
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大輔 山中
禎之 安達
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東栄新薬株式会社
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    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting / quantifying ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan and a detection / quantification kit.
  • ⁇ -Glucan is abundantly contained in the cell walls and cells of yeast, algae, mushrooms, molds, lactic acid bacteria, bacteria, lichens, and other microorganisms, and is secreted outside the cells as a soluble molecule. Sometimes. ⁇ -Glucan has a strong immunopotentiating effect and is being applied to foods, cosmetics, and feeds. In particular, soluble ⁇ -glucan derived from basidiomycetes has been used as a pharmaceutical product in Japan.
  • ⁇ -1,6 having a ⁇ -1,3-glucosidic bond in the main chain and a ⁇ -1,6-glucoside bond in the side chain.
  • -Branch ⁇ -1,3-glucan is known to exhibit particularly characteristic physiological activity.
  • Analytical methods such as NMR (nuclear magnetic resonance), HPLC (High Performance Liquid Chromatography), and GC (Gas Chromatograph) are suitable for analyzing and evaluating the structure of these ⁇ -glucans, but they are complicated steps. Advanced purification methods including the above are required. In addition, such an analysis method requires purification of soluble ⁇ -glucan, which is not suitable for analysis of crudely purified samples.
  • a method for quantifying ⁇ -1,3-glucan a limulus method or an enzyme method using a beetle crab body fluid, a beetle-derived ⁇ -glucan binding protein, an antibody, and a mammalian ⁇ -glucan receptor Dectin-1
  • ELISA-based quantification methods that combine insect ⁇ -glucan recognition protein (BGRP), spingoglycolipids, etc. (for example, Patent Documents 2, 3, 4, and Non-Patent Documents 1, 2, and 3). 4).
  • ⁇ -1,6-glucan As a method for quantifying ⁇ -1,6-glucan, an enzyme method or an ELISA in which a ⁇ -1,6-glucanase mutant having a specific binding activity to ⁇ -1,6-glucan is combined with an antibody, a lectin, or ⁇ -1,6-glucan is used.
  • a quantification method based on the method is known (for example, Non-Patent Document 5).
  • ⁇ -1,3-glucan-binding protein and ⁇ -1,6-glucan-binding protein can also be quantified.
  • Patent No. 5476251 International release WO92 / 16651
  • Patent US9885726B2 International release WO2010/107068
  • Patent Document 1 is a quantitative method using an enzyme, in which ⁇ -glucan branching ( ⁇ -1,3-glucan having a side chain due to a ⁇ -1,6-glucoside bond in one molecule) is formed. It is not something to detect.
  • ⁇ -glucan branching ⁇ -1,3-glucan having a side chain due to a ⁇ -1,6-glucoside bond in one molecule
  • the ELISA-based quantification method can quantify soluble ⁇ -glucan, it cannot quantify insoluble ⁇ -glucan because it requires a plurality of washing steps.
  • An object of the present invention is to provide a method and a kit capable of detecting and quantifying branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan.
  • the method for detecting and quantifying ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan of the present invention is used.
  • the reagent is The first fusion protein with a split reporter protein and With either a second fusion protein or a third fusion protein having a split reporter protein, Including The split reporter protein can form an active reporter protein by forming a pair of two separated proteins.
  • the first fusion protein comprises a ⁇ -1,3-glucan binding protein and one of the split reporter proteins.
  • the second fusion protein comprises a ⁇ -1,6-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the third fusion protein comprises a ⁇ -1,3-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan detection / quantification kit of the present invention comprises a first fusion protein having a split reporter protein.
  • a second fusion protein or a third fusion protein having a split reporter protein Equipped with reagents containing The split reporter protein can form an active reporter protein by forming a pair of two separated proteins.
  • the first fusion protein comprises a ⁇ -1,3-glucan binding protein and one of the split reporter proteins.
  • the second fusion protein comprises a ⁇ -1,6-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the third fusion protein comprises a ⁇ -1,3-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the active reporter protein By binding ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan to the first fusion protein and the second fusion protein, the active reporter protein can be formed by one and the other of the split reporter proteins. And By binding ⁇ -1,3-glucan to the first fusion protein and the third fusion protein, it is possible to form the active reporter protein by one and the other of the split reporter proteins. ..
  • ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan detection / quantification method and detection / quantification kit of the present invention the purification purity, solubility / insolubility of ⁇ -glucan, etc. Regardless of the properties, ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan can be efficiently detected and quantified without the need for a washing step.
  • split reporter protein fusion supBGRP first and third fusion proteins
  • split reporter protein fusion ⁇ -1,6-glucanase variant second fusion protein
  • Split reporter protein fusion supBGRP (1st and 3rd fusion proteins) and split reporter protein fusion ⁇ -1,6-glucanase variant (2nd fusion protein) were mixed with particulate ⁇ -glucan, an enzyme substrate and activated. It is a figure which shows the result of observing the biological luminescence emitted by a split reporter protein (enzyme).
  • Live yeast-type Candida alibicans with different cell numbers and split reporter protein fusion supBGRP (1st and 3rd fusion proteins) and split reporter protein fusion ⁇ -1,6-glucanase mutant (2nd fusion protein) as enzyme substrates It is a figure which shows the result of quantifying the biological luminescence emitted by the split reporter protein (enzyme) which was mixed and activated. It is an image showing the microscopic morphology of cultured C. albicans. The scale bar shows 50 ⁇ m. C.
  • albicans cultured for different times was mixed with the split reporter protein fusion supBGRP (1st and 3rd fusion proteins) and the split reporter protein fusion ⁇ -1,6-glucanase variant (2nd fusion protein) with the enzyme substrate.
  • the split reporter protein fusion supBGRP (1st and 3rd fusion proteins)
  • the split reporter protein fusion ⁇ -1,6-glucanase variant (2nd fusion protein) with the enzyme substrate.
  • ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan detection / quantification method of the present invention (hereinafter, simply referred to as “detection / quantification method” or “Protein-fragment complementation assay”.
  • detection / quantification method or “Protein-fragment complementation assay”.
  • the test specimen may contain purified or crudely purified ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan, and may be soluble or insoluble in nature. There may be.
  • the substances contained in the test sample are not particularly limited, for example, basidiomycetes such as mushrooms, bacteria, yeast, seaweeds, cell walls and extracts of plants, ⁇ -glucan secreted outside the cells, and indoors.
  • basidiomycetes such as mushrooms, bacteria, yeast, seaweeds, cell walls and extracts of plants
  • ⁇ -glucan secreted outside the cells and indoors.
  • ⁇ -Glucan existing in the environment such as soil, river, seawater, atmosphere, and space can be exemplified.
  • the first fusion protein with a split reporter protein comprises any of a second fusion protein having a split reporter protein and a third fusion protein having a split reporter protein.
  • the reagent comprises a combination of a first fusion protein and a second fusion protein and / or a combination of a first fusion protein and a third fusion protein.
  • the split reporter protein means a reporter protein divided into two, and an active reporter protein is formed by forming a pair (proximity or binding) between two separated reporters.
  • split reporter proteins when they are separated from each other, they do not function as a reporter protein. However, when one and the other of the split reporter proteins are in close proximity or bound, they become functional as reporter proteins.
  • the structure of the split reporter protein is not specifically limited, as long as one and the other of the split reporter proteins can be identified in close proximity or bound to each other.
  • the split reporter protein may be configured such that structural complementarity is promoted to form an active reporter protein when one and the other of the split reporter proteins are in close proximity.
  • the split reporter protein is such that when one and the other of the split reporter proteins are in close proximity, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET) or Fluorescence resonance energy transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) occurs. It may be configured.
  • the active reporter protein means a split reporter protein in which one and the other are in close proximity to generate BRET or FRET. When the reporter protein produces BRET or FRET, it may be configured to bind a fluorescent substance to one or the other of the split reporter proteins.
  • the split reporter protein may be configured such that protein splicing forms an active reporter protein when one and the other of the split reporter proteins are in close proximity. This can be achieved by fusing one and the other of the split reporter proteins with a protein splicing domain, respectively.
  • a protein splicing domain for example, a combination with DnaEn and DnaEc, which are protein splicing domains derived from the DnaE gene of Synechocystis sp., Can be exemplified.
  • More specific reporter proteins include enzymes, fluorescent proteins and the like.
  • the enzyme include luciferase, alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, invertase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, and variants of these enzymes.
  • the fluorescent protein include green fluorescent protein (GFP) and variants of GFP.
  • the first fusion protein contains a ⁇ -1,3-glucan binding protein and one of the split reporter proteins.
  • the second fusion protein contains a ⁇ -1,6-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the third fusion protein contains a ⁇ -1,3-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the ⁇ -1,3-glucan binding protein may be known and may be an antibody, Dectin-1, lectin, horseshoe crab factor G protein, insect ⁇ -glucan recognition protein (BGRP), supBGRP (in the examples described below). Description) and its derivatives can be exemplified, and it is preferable that soluble recombinant protein expression is easy.
  • the ⁇ -1,6-glucan binding protein may be known, has no cleaving activity for antibodies, lectins, ⁇ -1,6-glucans, and has specific binding to ⁇ -1,6-glucans. Examples thereof include active ⁇ -1,6-glucanase variants and derivatives thereof, and it is preferable that soluble recombinant protein expression is easy.
  • a reagent containing a first fusion protein and a second fusion protein, or a reagent containing a first fusion protein and a third fusion protein is directly supplied into a test tube containing a test sample. It can also be carried out using cells or the like expressing these fusion proteins.
  • the expression of the first fusion protein and the second fusion protein, or the first fusion protein and the third fusion protein may be transient expression or homeostatic expression. That is, a stable expression cell line of the first to third fusion proteins can be used.
  • the first to third fusion proteins can be exemplified by those produced in Escherichia coli, yeast, plants, animal cells, and cell-free expression systems, and those produced in large quantities in Escherichia coli are particularly used. Easy and preferable.
  • a crude solution such as a disrupted solution of cells expressing the first to third fusion proteins may be used, but a fusion protein fused with a general low molecular weight peptide tag and purified to high purity by column purification or the like. It is preferable to use.
  • GST tag, Protein A tag, antibody Fc region, polyhistidine tag, V5 tag, Myc tag, SBP tag, Halo tag, Strep tag and the like can be exemplified.
  • the cells, animal cells, insect cells, plant cells and the like can be exemplified, and established cell lines are easy to use and preferable.
  • one of the split reporter proteins may be fused to the N-terminal side of the ⁇ -1,3-glucan-binding protein, and the split reporter protein may be fused to the C-terminal side of the ⁇ -1,3-glucan-binding protein.
  • the other of the split reporter proteins may be fused to the N-terminal side of the ⁇ -1,6-glucan-binding protein, and the second fusion protein may be split to the C-terminal side of the ⁇ -1,6-glucan-binding protein.
  • the other of the reporter proteins may be fused.
  • the other of the split reporter proteins may be fused to the N-terminal side of the ⁇ -1,3-glucan-binding protein, and the third fusion protein may be split to the C-terminal side of the ⁇ -1,3-glucan-binding protein.
  • the other of the reporter proteins may be fused.
  • the linker peptide consists of a peptide having about 1 to 20 residues, and the amino acid sequence thereof shall be exemplified by the same amino acid sequence as that of a general linker used in the production of a fusion protein. Can be done.
  • a GS linker consisting of a repeating sequence containing Gly-Ser
  • a DDAKK linker consisting of a repeating sequence of Asp-Asp-Ala-Lys-Lys (SEQ ID NO: 1)
  • a DDAKK linker Glu-Ala-Ala-Ala-Lys
  • Examples thereof include an EAAAK linker composed of a repeating sequence of SEQ ID NO: 2).
  • the region for fusing one or the other of the split reporter proteins does not limit either the N-terminal side or the C-terminal side, and various types are used. It is preferable to determine the region to be fused according to the characteristics of the ⁇ -1,3-glucan-binding protein and the ⁇ -1,6-glucan-binding protein. Further, it may be a fusion protein fused to both the N-terminal side and the C-terminal side.
  • ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan When ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan is contained in the test sample in the first step, ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan and the first fusion protein are present. And the second fusion protein binds to one and the other of the split reporter proteins in close proximity or to each other to form an active reporter protein.
  • ⁇ -1,3-glucan including one having a side chain (branch)
  • ⁇ -1,3-glucan and the first fusion protein and the third fusion protein are contained in the test sample.
  • ⁇ -1,3-glucan and the first fusion protein and the third fusion protein are contained.
  • the split reporter proteins are in close proximity or bound to form an active reporter protein.
  • the active reporter protein formed in the first step is detected and quantified. If the activity of the reporter protein is high compared to the absence of ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan, then ⁇ -1,6-branched in the test specimen. It indicates the presence of ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan. This makes it possible to easily detect and quantify ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan contained in the test sample.
  • the method for detection / quantification is not particularly limited, and a known method can be appropriately adopted depending on the morphology of the reporter protein and the like.
  • the activity (background) of the deactivated reporter protein observed in the absence of ⁇ -glucan having the structure of interest and the reporter protein reconstituted in the presence of ⁇ -glucan is about 100 times, showing high sensitivity.
  • the detection / quantification method of the present invention does not require complicated cleaning operations and can screen the structure of ⁇ -glucan contained in the test sample with high throughput. Therefore, by applying the detection / quantification method of the present invention, various ⁇ -glucans derived from various biological species / extraction / purification methods and exhibiting various forms of soluble / insoluble (gel-like, particle-like, etc.) can be obtained. It is also possible to perform extensive analysis under the same conditions and screen for more beneficial ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan. In addition, the detection / quantification method of the present invention does not require a washing step of the test sample, and efficiently detects / quantifies ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan. can do.
  • the activity of the active reporter protein by the binding of ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan to the first fusion protein and the second fusion protein, and ⁇ -1 was identified. It can also be quantified.
  • the detection / quantification kit of the present invention is a detection / quantification kit for ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan.
  • the first fusion protein with a split reporter protein and With either a second fusion protein or a third fusion protein having a split reporter protein, It is equipped with reagents containing.
  • the split reporter protein can form an active reporter protein by pairing (proximating or binding) the two.
  • the first fusion protein contains a ⁇ -1,3-glucan binding protein and one of the split reporter proteins.
  • the second fusion protein contains a ⁇ -1,6-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the third fusion protein contains a ⁇ -1,3-glucan binding protein and the other of the split reporter proteins.
  • the detection / quantification kit of the present invention includes various materials and devices for detecting and quantifying ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan. And so on.
  • ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan or ⁇ -1,3-glucan detection / quantification method and detection / quantification kit of the present invention are not limited to the above embodiments.
  • fusion protein Preparation of fusion protein
  • An expression vector for the first fusion protein, an expression vector for the second fusion protein, and an expression vector for the third fusion protein were prepared based on the pColdI vector (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.). These were transformed into Escherichia coli Shuffle (manufactured by New England Biolabs) or BL21 (DE3), and then expressed in large quantities as a ⁇ 6 histidine tag (His-Tag) fusion protein in an Ampicillin-added LB medium. After purification using TALON Metal Affinity Resin (manufactured by Takara Bio Inc.), the presence of the purified protein was confirmed by SDS-PAGE (Fig. 1).
  • supBGRP prepared based on insect-derived BGRP was used.
  • the amino acid sequence of supBGRP is about 36 residues (caiko) based on the amino acid sequence of ⁇ -glucan-binding protein (BGRP) derived from various insects such as silkworm, which is conventionally known, and the findings so far by the present inventors. It is a ⁇ -1,3-glucan-binding protein artificially prepared by introducing an amino acid mutation (23 residues).
  • luciferase (NanoLuc, manufactured by Promega) derived from deep-sea shrimp (Oplophorus gracilirostris) was used as a reporter protein.
  • the split reporter protein (NanoLuc) used here consists of two subunits, a large fragment called LgBiT and a small fragment called SmBiT, and these two subunits form a complex to reactivate luciferase. It is composed. Therefore, the combination of LgBiT and SmBiT constitutes one and the other combination of split reporter proteins.
  • a fusion protein of LgBiT was prepared by sandwiching a 4 ⁇ DDAKK sequence as a linker peptide on the N-terminal side of supBGRP as the first fusion protein (supBGRP-LgBiT).
  • a SmBiT fusion (Neg1-E321Q-SmBiT) was prepared by sandwiching the GGSGGGSGG sequence (SEQ ID NO: 5) as a linker peptide on the N-terminal side of Neg1-E321Q.
  • a fusion protein of SmBiT (supBGRP-SmBiT) was prepared by sandwiching a 4 ⁇ DDAKK sequence as a linker peptide on the N-terminal side of supBGRP as a third fusion protein.
  • Zymosan A and supBGRP-LgBiT which are crude particulate ⁇ -glucans derived from bread yeast, are used.
  • Neg1-E321Q-SmBiT was mixed, NanoLuc substrate (NanoGlo, manufactured by Promega) was added, and the presence or absence of bioluminescence was observed.
  • Example 2 Examination of optimization of protein-fragment complementation assay In order to construct and optimize a protein-fragment complementation assay that does not require a washing step, the reactivity was investigated by changing the concentration and reaction time of the glucan probe. ..
  • a 200 nM mixed solution (5 ⁇ L) of supBGRP-LgBiT and Neg1-E321Q-SmBiT was placed in a 96-well plate and incubated with 0-1000 ng / mL Zymosan A (10 ⁇ L) for 10 minutes, 30 minutes and 60 minutes. Luciferase activity was measured by adding 15 ⁇ L of NanoLuc substrate. As a result, it was confirmed that 10 minutes of incubation was sufficient to obtain a reaction curve, but that the luciferase activity increased when the incubation time was further extended (Fig. 3B).
  • Example 3 Measurement of various ⁇ -glucans using fusion proteins
  • 5 ⁇ L of a mixture of protein (supBGRP-LgBiT) and third fusion protein (supBGRP-SmBiT) 200 nM each
  • 10 ⁇ L of various polysaccharide samples (0 to 50 ⁇ g / mL) in 96-well plates (white / Mix in (flat bottom) and shake on a plate shaker.
  • the polysaccharide samples used are shown in Table 1.
  • NanoLuc substrate After 30 minutes, 15 ⁇ L of NanoLuc substrate was added, and the bioluminescence level was measured with a luminometer (manufactured by Promega), and the results are shown in FIG.
  • the combination of the first fusion protein (supBGRP-LgBiT) and the second fusion protein (Neg1-E321Q-SmBiT) produces ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan.
  • Luminescence was observed in the sample containing ⁇ -1,3-glucan in the combination of the first fusion protein (supBGRP-LgBiT) and the third fusion protein (supBGRP-SmBiT) (supBGRP-LgBiT / supBGRP-SmBiT). Luminescence was observed.
  • sample containing ⁇ -1,6-branched ⁇ -1,3-glucan examples include Zymosan A, Pustulan, Scleroglucan, heat-sterilized C. albicans (HKCA), and the first fusion protein and the second.
  • the fusion protein mixture (supBGRP-LgBiT / Neg1-E321Q-SmBiT) showed reactivity with those samples. It was shown that not only the purified high-purity ⁇ -glucan but also the unpurified sample HKCA can be detected by the same operation.
  • sample containing ⁇ -1,3-glucan examples include Zymosan A, Curdlan, Pustulan, Scleroglucan, Paramylon, Pachyman, Laminarin, HKCA, etc., and a mixture of the first fusion protein and the third fusion protein.
  • the liquid supBGRP-LgBiT / supBGRP-SmBiT
  • Chitin, Dextran, Xylan, and Mannan which do not have a ⁇ -glucan structure, showed reactivity.
  • Example 3 Structural analysis of the natural cell wall of fungi
  • HKCA does not necessarily mimic the natural cell wall composition of C. albicans, as heat treatment often removes the mannan layer over the surface of ⁇ -glucan. Therefore, we investigated whether the Protein-fragment complementation assay could be applied to the analysis of the natural cell wall structure of living fungi. First, different numbers of yeast-type C.
  • albicans (0, 10 4 , 105, 10 6 / well) were washed in a 96-well V-bottom plate and suspended in 10 ⁇ L PBS. This is combined with 5 ⁇ L of a mixture of the first fusion protein and the third fusion protein (supBGRP-LgBiT / supBGRP-SmBiT) or a mixture of the first fusion protein and the second fusion protein (supBGRP-LgBiT / Neg1-E321Q-SmBiT). Mixed. After 30 minutes, 15 ⁇ L of NanoLuc substrate was added and the activation level of the reconstituted reporter protein on the surface of living cells was measured.
  • supBGRP-LgBiT / supBGRP-SmBiT a mixture of the first fusion protein and the second fusion protein
  • Yeast-type C. albicans (10 5 cells / well) was added to RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum deactivated in a 96-well V-bottom plate to induce hyphal formation at 37 ° C. for different times (0). , 2, 4, 7 hours) cultured. Confirmation of hyphal formation was performed by parallel culturing C. albicans under the same conditions using a transparent 96-well flat bottom plate. The microscopic morphology of C. albicans at each culture time is shown in FIG.
  • the washed hyphae are suspended in 10 ⁇ L PBS and 5 ⁇ L of the 1st fusion protein and 3rd fusion protein mixture (supBGRP-LgBiT / supBGRP-SmBiT) or the 1st fusion protein and 2nd fusion protein mixture (supBGRP-). It was mixed with LgBiT / Neg1-E321Q-SmBiT). After 30 minutes, NanoLuc substrate (15 ⁇ L) was added and bioluminescence levels were measured.
  • the structure of cell wall glucan dynamically changes under the action of various enzymes during the growth process of fungi. Therefore, Zymosan A, which is a particulate ⁇ -glucan, was treated with endo- ⁇ -1,6-glucanase (Neg1) or endo- ⁇ -1,3-glucanase (Zymolyase), and ⁇ -1,6 bound ⁇ -
  • endo- ⁇ -1,6-glucanase Neg1
  • endo- ⁇ -1,3-glucanase Zymolyase
  • the NanoLuc activity was measured 15 times every 2 minutes (30 minutes).
  • the emission intensity gradually decreased with the passage of time (spontaneous attenuation).
  • the luminescence intensity decreased sharply, and the bioluminescence level (RLU measurement value) after 30 minutes was about 1/3 of that in the untreated group. rice field.
  • the bioluminescence level (measured value of RLU) after 30 minutes was about 1/6 of that of the endo- ⁇ -1,3-glucanase-treated group and that of the endo- ⁇ -1,6-glucanase-treated group compared to the untreated group. Then it was reduced to about 1/14. From these results, the Protein-fragment complementation assay is not only suitable for structural analysis of ⁇ -glucan, but also monitors structural changes of long-chain ⁇ -1,6-branched- ⁇ -1,3-glucan in real time. It was confirmed that it could be done.
  • the first fusion protein (supBGRP-LgBiT) was immobilized on a 96-well plate (white / flat bottom) (2 ⁇ g / mL) and blocked with a PBS solution containing bovine serum albumin. After washing the plates, soluble and insoluble samples (0 to 1,000 ng / mL) were added. After 60 minutes, the cells were washed, and a biotin-labeled ⁇ -1,6-glucan-binding protein (Neg1-E321Q-Biotin, 2 ⁇ g / mL) was added and left for 60 minutes. After washing, streptavidin-labeled horseradish peroxidase was added, and the mixture was left for 20 minutes. After thoroughly washing the plate, a commercially available luminescent substrate for peroxidase was added, and the luminescence level was measured with a luminometer (manufactured by Promega).

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Abstract

第１工程において、試験検体中にβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンが含まれる場合は、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと第１融合タンパク質および第２融合タンパク質とが結合することで、スプリットレポータータンパク質の一方および他方による活性型レポータータンパク質が形成され、試験検体中にβ-1,3-グルカンが含まれる場合は、β-1,3-グルカンと第１融合タンパク質および第３融合タンパク質とが結合することで、スプリットレポータータンパク質の一方および他方による活性型レポータータンパク質が形成され、第２工程において、第１工程で形成された活性型レポータータンパク質を検出・定量する。

Description

β－１，６－分岐β－１，３－グルカンまたはβ－１，３－グルカンの検出・定量方法および検出・定量キット
　本発明は、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法および検出・定量キットに関する。
　β-グルカンは、酵母、藻類、キノコ類、カビ類、乳酸菌、細菌類、地衣類、その他微生物などの細胞壁、細胞内に多量に含まれており、また可溶性分子として菌体外に分泌されることもある。β-グルカンは、強い免疫増強作用を示し、食品や化粧品、飼料への応用が進められ、特に担子菌類由来の可溶性β-グルカンは、日本で医薬品としても利用されてきた。
　そして、キノコなどの担子菌類や酵母などが産生する多糖類の中でも、β-1,3-グルコシド結合を主鎖に有しβ-1,6‐グルコシド結合を側鎖に有するβ-1,6‐分岐β-1,3-グルカンは、とりわけ特徴的な生理活性を示すことが知られている。
　これらβ-グルカンの構造を解析及び評価するためには、NMR（nuclear magnetic resonance）やHPLC（High Performance Liquid Chromatography）、GC（Gas Chromatograph）などの分析方法が適しているが、そのために複雑な工程を含む高度な精製方法が要求される。また、このような分析方法では可溶性のβ-グルカンを精製する必要があり、粗精製検体の分析には不向きであった。
　そこで、粗精製検体に含まれるβ-1,3-/β-1,6-グルカンの定量方法が複数開発されている。その多くはα-グルカナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ、β-1,6-グルカナーゼなどの糖質分解酵素や硫酸法などの酸-加水分解法を組み合わせた方法であり、産生されたグルコース量を定量することで、対象の不溶性、可溶性を問わず試験検体中に含有されるβ-1,3-/β-1,6-グルカン量を推定することが可能となっている（例えば、特許文献１）。
　また、β-1,3-グルカンの定量法、β-1,6‐グルカンの定量法もそれぞれ開発されている。
　β-1,3-グルカンの定量法としては、カブトガニ体液を用いたリムルス法や酵素法、または、カブトガニ由来β-glucan結合タンパク質、抗体、哺乳動物のβ-グルカン受容体であるDectin-1、昆虫のβ-glucan recognition protein（BGRP）、スフィンゴ糖脂質などを組み合わせたELISAをベースとした定量法などが知られている（例えば、特許文献２、３、４、非特許文献1、２、３、４）。
　β-1,6‐グルカンの定量法としては、酵素法、または抗体、レクチン、β-1,6‐グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6‐グルカナーゼ変異体などを組み合わせたELISAをベースとした定量法などが知られている（例えば、非特許文献５）。
　さらに、これらのβ-1,3-グルカン結合タンパク質およびβ-1,6‐グルカン結合タンパク質を組み合わせ、サンドイッチELISAをベースとした定量法を構築することで、β-1,6‐分岐β-1,3-グルカンの定量も可能となっている。
特許5467251号 国際公開WO92/16651 米国特許US9885726B2 国際公開WO2010/107068 国際公開WO2018/212095
Appl Environ Microbiol. 2001 Dec; 67(12): 5420-5424. Int J Mol Sci. 2019 Jul 16;20(14):3498. J Immunol Methods. 2006 Jul 31;314(1-2):164-9. J Immunol Methods. 2011 Feb 28;365(1-2):158-65. J Biol Chem. 2020 Apr 17; 295(16): 5362-5376.
　しかしながら、特許文献１の方法は、酵素を用いた定量法であり、β-グルカンの分岐（１分子内にβ-1,6‐グルコシド結合による側鎖を持つβ-1,3-グルカン）を検出するものではない。また、ELISAをベースとした定量法では、可溶性のβ-グルカンの定量は可能であるものの、複数の洗浄工程を必要とすることから、不溶性のβ-グルカンを定量することはできない。
　本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、β-グルカンの精製純度や可溶性・不溶性といった性状に関わらず、洗浄工程等が不要であり、効率よくβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンを検出・定量可能な方法およびキットを提供することを課題としている。
　上記の課題を解決するため、本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法は、
以下の工程：
　試験検体と試薬とを接触させる第１工程；および、
　前記第１工程における生成物を検出・定量する第２工程、
を含み、
　前記試薬は、
　　スプリットレポータータンパク質を有する第１融合タンパク質と、
　　スプリットレポータータンパク質を有する、第２融合タンパク質および第３融合タンパク質のうちのいずれかと、
　を含み、
　前記スプリットレポータータンパク質は、離間する２つが一対となることで活性型レポータータンパク質を形成可能であり、
　前記第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの一方とを含み、
　前記第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
　前記第３融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
　前記第１工程において、前記試験検体中にβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンが含まれる場合は、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと前記第１融合タンパク質および前記第２融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質が形成され、
　前記試験検体中にβ-1,3-グルカンが含まれる場合は、β-1,3-グルカンと前記第１融合タンパク質および前記第３融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質が形成され、
　前記第２工程において、前記第１工程で形成された前記活性型レポータータンパク質を検出・定量する
ことを特徴としている。
　本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量キットは、　スプリットレポータータンパク質を有する第１融合タンパク質と、
　スプリットレポータータンパク質を有する、第２融合タンパク質および第３融合タンパク質のうちのいずれかと、
　を含む試薬を備え、
　前記スプリットレポータータンパク質は、離間する２つが一対となることで活性型レポータータンパク質を形成可能であり、
　前記第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの一方とを含み、
　前記第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
　前記第３融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
　β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと前記第１融合タンパク質および前記第２融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質を形成可能であり、
　β-1,3-グルカンと前記第１融合タンパク質および前記第３融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質を形成可能である
ことを特徴としている。
　本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法および検出・定量キットによれば、β-グルカンの精製純度や可溶性・不溶性といった性状に関わらず、洗浄工程を必要とせず、効率よくβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンを検出・定量することができる。
スプリットレポータータンパク質融合supBGRP（第１、第３融合タンパク質）およびスプリットレポータータンパク質融合β-1,6-グルカナーゼ変異体（第２融合タンパク質）をポリアクリルアミド電気泳動し、CBB染色した結果である。 スプリットレポータータンパク質融合supBGRP（第１、第３融合タンパク質）およびスプリットレポータータンパク質融合β-1,6-グルカナーゼ変異体（第２融合タンパク質）を粒子状β-グルカン、酵素基質と混合し、活性化したスプリットレポータータンパク質（酵素）が発する生物発光を観測した結果を示す図である。 異なる濃度およびインキュベーション時間がスプリットレポータータンパク質（酵素）の活性化レベルに与える影響を検討した結果を示す図である。 各種β-グルカンと、スプリットレポータータンパク質融合supBGRP（第１、第３融合タンパク質）およびスプリットレポータータンパク質融合β-1,6-グルカナーゼ変異体（第２融合タンパク質）を酵素基質と混合し、活性化したスプリットレポータータンパク質（酵素）が発する生物発光を定量した結果を示す図である。 異なる細胞数の生きた酵母型Candida alibicansと、スプリットレポータータンパク質融合supBGRP（第１、第３融合タンパク質）およびスプリットレポータータンパク質融合β-1,6-グルカナーゼ変異体（第２融合タンパク質）を酵素基質と混合し、活性化したスプリットレポータータンパク質（酵素）が発する生物発光を定量した結果を示す図である。 培養したC.albicansの顕微鏡的形態を示す画像である。スケールバーは、50μmを示している。 異なる時間培養したC.albicansと、スプリットレポータータンパク質融合supBGRP（第１、第３融合タンパク質）およびスプリットレポータータンパク質融合β-1,6-グルカナーゼ変異体（第２融合タンパク質）を酵素基質と混合し、活性化したスプリットレポータータンパク質（酵素）が発する生物発光を定量した結果を示す図である。 Protein-fragment complementation assayを用いて、粒子状β-グルカンであるZymosan Aの各種β-グルカン分解酵素処理中に生じる側鎖構造変化をリアルタイムモニタリングした結果を示す図である。 可溶性β-グルカンであるCSBGと、不溶性β-グルカンであるD-Zymosanとを用いて、スプリットレポータータンパク質を用いた測定方法と、従来のELISA法への反応性を比較した結果を示す図である。
　以下、本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法の一実施形態について説明する。
　本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法（以下、単に「検出・定量方法」または「Protein-fragment complementation assay」と記載する場合がある。）は、以下の工程：
　試験検体と試薬とを接触させる第１工程；および、
　前記第１工程における生成物を検出・定量する第２工程、
を含む。
　（第１工程）
　第１工程では、試験検体と試薬とを接触させる。
　試験検体は、精製あるいは粗精製されたβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンを含むものであってよく、その性状は、可溶性または不溶性のいずれであってもよい。
　また、試験検体に含まれる物質は特に限定されず、例えば、キノコなど担子菌類、細菌類、酵母、海藻類、植物などの細胞壁や抽出物、菌体外に分泌されたβ-グルカン、さらに室内、土壌、河川、海水、大気中、宇宙空間等環境中に存在するβ-グルカンなどを例示することができる。
　試薬は、
　スプリットレポータータンパク質を有する第１融合タンパク質と、
　スプリットレポータータンパク質を有する第２融合タンパク質およびスプリットレポータータンパク質を有する第３融合タンパク質のうちのいずれかと、を含む。
　すなわち、試薬は、第１融合タンパク質と第２融合タンパク質および／または第１融合タンパク質と第３融合タンパク質の組み合わせを含む。
　本明細書において、スプリットレポータータンパク質とは、２つに分割されたレポータータンパク質を意味し、離間する２つが一対となる（近接または結合する）ことで活性型レポータータンパク質を形成する。
　具体的には、スプリットレポータータンパク質のそれぞれが離れて存在する状態では、レポータータンパク質としての機能を示さない。しかしながら、スプリットレポータータンパク質の一方および他方が近接又は結合すると、レポータータンパク質としての機能を示すようになる。
　スプリットレポータータンパク質の構造は具体的に限定されず、スプリットレポータータンパク質のうちの一方および他方が近接または結合した場合に、これを識別可能であればよい。
　例えば、スプリットレポータータンパク質は、スプリットレポータータンパク質の一方および他方が近接した場合に、構造的相補性が促進されて活性型のレポータータンパク質が形成されるように構成されていてもよい。
　また、スプリットレポータータンパク質は、スプリットレポータータンパク質の一方および他方が近接した場合に、Bioluminescence Resonance Energy Transfer（生物発光共鳴エネルギー移動、BRET）又はFluorescence resonance energy transfer（蛍光共鳴エネルギー移動、FRET）が生じるように構成されていてもよい。この場合、活性型レポータータンパク質とは、スプリットレポータータンパク質の一方および他方が近接し、BRETまたはFRETを生じる状態になったものをいう。レポータータンパク質がBRETまたはFRETを生じるものである場合、スプリットレポータータンパク質の一方または他方に蛍光物質を結合させる構成としてもよい。
　さらに、スプリットレポータータンパク質は、スプリットレポータータンパク質の一方および他方が近接した場合に、プロテインスプライシングにより活性型のレポータータンパク質が形成されるように構成されていてもよい。これは、スプリットレポータータンパク質の一方及び他方に、それぞれプロテインスプライシングドメインを融合させておくことにより実現することができる。プロテインスプライシングドメインとしては、例えば、シネコシスティスsp.のDnaE遺伝子由来のプロテインスプライシングドメインである、DnaEn及びDnaEcとの組み合わせなどを例示することができる。
　より具体的なレポータータンパク質としては、酵素、蛍光タンパク質等が挙げられる。酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、インベルターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、これらの酵素の改変体等を例示することができる。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、GFPの改変体等を例示することができる。
　第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、スプリットレポータータンパク質のうちの一方とを含む。
　第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質と、スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含む。
　第３融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含む。
　β-1,3-グルカン結合タンパク質は、公知のものであってよく、抗体、Dectin-1、レクチン、horseshoe crab factor G protein、insect β-glucan recognition protein（BGRP）、supBGRP（後述する実施例に記載）およびその派生物などを例示することができ、可溶性組換えタンパク質発現が容易であることが好ましい。
　β-1,6-グルカン結合タンパク質は、公知のものであってよく、抗体、レクチン、β-1,6-グルカンの切断活性を持たず、かつ、β-1,6-グルカンに対する特異的結合活性を有するβ-1,6-グルカナーゼ変異体、およびその派生物などを例示することができ、可溶性組換えタンパク質発現が容易であることが好ましい。
　本発明の検出・定量方法では、第１融合タンパク質および第２融合タンパク質を含む試薬、あるいは、第１融合タンパク質および第３融合タンパク質を含む試薬を、試験検体を含む試験管内に直接供給して実施することもできるし、これらの融合タンパク質を発現した細胞等を用いて実施することもできる。この場合、第１融合タンパク質および第２融合タンパク質、あるいは第１融合タンパク質および第３融合タンパク質の発現は一過性の発現であってもよいし、恒常性の発現であってもよい。すなわち、第１～第３融合タンパク質の安定発現細胞株を用いることができる。
　具体的には、第１～第３融合タンパク質は、大腸菌や酵母、植物、動物細胞、無細胞発現系で産生されたものを例示することができ、特に大腸菌で大量に産生されるものが使いやすく好ましい。第１～第３融合タンパク質を発現する細胞の破砕液など粗精製の溶液を用いても良いが、一般的な低分子量のペプチドタグを融合し、カラム精製などによって高純度に精製された融合タンパク質を用いることが好ましい。この場合、GSTタグやProtein Aタグ、抗体Fc領域やポリヒスチジンタグ、V5タグ、Mycタグ、SBPタグ、Haloタグ、Strepタグ等を例示することができる。また、ここで、細胞としては動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を例示することができ、樹立された細胞株が使いやすく好ましい。
　第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質のＮ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合していてもよく、β-1,3-グルカン結合タンパク質のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の一方が融合していてもよい。また、第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質のＮ末端側にスプリットレポータータンパク質の他方が融合していてもよく、β-1,6-グルカン結合タンパク質のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の他方が融合していてもよい。さらに、第３融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質のＮ末端側にスプリットレポータータンパク質の他方が融合していてもよく、β-1,3-グルカン結合タンパク質のＣ末端側にスプリットレポータータンパク質の他方が融合していてもよい。この場合、第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、第３の融合タンパク質において、β-1,3-グルカン結合タンパク質またはβ-1,6-グルカン結合タンパク質とスプリットレポータータンパク質を融合させる際に、立体障害を回避するために適切に長さを調節したリンカーペプチドを挿入することが好ましい。
　ここで、リンカーペプチドとしては1残基から20残基程度のペプチドからなり、そのアミノ酸配列は、融合タンパク質の作製の際に使用される一般的なリンカーのアミノ酸配列と同様のものを例示することができる。具体的には、Gly-Serを含む繰り返し配列からなるGSリンカーや、Asp-Asp-Ala-Lys-Lys（配列番号１）の繰り返し配列からなるDDAKKリンカー、Glu-Ala-Ala-Ala-Lys（配列番号２）の繰り返し配列からなるEAAAKリンカーなどが挙げられる。また、第１融合タンパク質、第２融合タンパク質および第３融合タンパク質において、スプリットレポータータンパク質の一方または他方を融合する領域は、Ｎ末端側あるいはＣ末端側のどちらか一方を限定するものではなく、各種β-1,3-グルカン結合タンパク質及びβ-1,6-グルカン結合タンパク質の特性に合わせて融合する領域を決定することが好ましい。また、Ｎ末端側とＣ末端側の両方に融合した融合タンパク質であってもよい。
　そして、第１工程において、試験検体中にβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンが含まれる場合は、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと第１融合タンパク質および第２融合タンパク質とが結合することで、スプリットレポータータンパク質の一方および他方が近接または結合して活性型レポータータンパク質が形成される。
　また、試験検体中にβ-1,3-グルカン（側鎖（分岐）を有するものを含む）が含まれる場合は、β-1,3-グルカンと第１融合タンパク質および第３融合タンパク質とが結合することで、スプリットレポータータンパク質の一方および他方が近接または結合して活性型レポータータンパク質が形成される。
　（第２工程）
　第２工程では、第１工程で形成された活性型レポータータンパク質を検出・定量する。レポータータンパク質の活性がβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの非存在下と比較して高い場合は、試験検体中にβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンが存在していることを示している。これにより、試験検体中に含まれるβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンを簡便に検出・定量できる。検出・定量の方法は、特に限定されず、レポータータンパク質の形態などに応じて、公知の方法を適宜採用することができる。
　実施例において後述するように、対象となる構造を持つβ-グルカンの非存在下において観測される非活性化レポータータンパク質の活性（バックグラウンド）とβ-グルカンの存在下で再構成されるレポータータンパク質の活性の差は約100倍と高感度を示す。
　また、本発明の検出・定量方法では、煩雑な洗浄操作等が不要であり、ハイスループットで試験検体中に含まれるβ-グルカンの構造をスクリーニングすることができる。したがって、本発明の検出・定量方法を応用することにより、様々な生物種・抽出・精製方法に由来し、可溶性・不溶性（ゲル状・粒子状等）の様々な形態を示す各種β-グルカンを同条件で広範囲に解析し、より有益なβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンをスクリーニングすることも可能となる。また、本発明の検出・定量方法は、試験検体の洗浄工程等が不要であり、効率よくβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンを検出・定量することができる。
　さらに、例えば、同一の試験検体について、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと第１融合タンパク質および第２融合タンパク質との結合による活性型レポータータンパク質の活性と、β-1,3-グルカンと第１融合タンパク質および第３融合タンパク質との結合による活性型レポータータンパク質の活性とを比較することで、β-1,6-分岐を有していないβ-1,3-グルカンを定量することもできる。
　次に、本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量キットの一実施形態について説明する。本発明の検出・定量キットにおいて、上述した検出・定量方法と共通する内容については、説明を一部省略する。
　本発明の検出・定量キットは、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量キットであって、
　スプリットレポータータンパク質を有する第１融合タンパク質と、
　スプリットレポータータンパク質を有する、第２融合タンパク質および第３融合タンパク質のうちのいずれかと、
を含む試薬を備えている。
　スプリットレポータータンパク質は、２つが一対となる（近接または結合する）ことで活性型レポータータンパク質を形成可能である。
　第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、スプリットレポータータンパク質のうちの一方とを含む。
　第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質と、スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含む。
　第３融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含む。
　β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと、第１融合タンパク質および第２融合タンパク質とが結合することで、スプリットレポータータンパク質の一方および他方による活性型レポータータンパク質を形成可能である。
　β-1,3-グルカンと、第１融合タンパク質および第３融合タンパク質とが結合することで、スプリットレポータータンパク質の一方および他方による活性型レポータータンパク質を形成可能である。
　本発明の検出・定量キットは、上記の試薬以外にも、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出、定量のための各種の材料、装置などを含むことができる。
　本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法および検出・定量キットは、以上の実施形態に限定されるものではない。
　以下、本発明について、実施例とともに説明するが、本発明のβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法および検出・定量キットは以下の実施例に何ら限定されるものではない。
　＜実施例１＞融合タンパク質の作成
　第１融合タンパク質の発現ベクター、第２融合タンパク質の発現ベクターおよび第３融合タンパク質の発現ベクターを、pColdIベクター（タカラバイオ社製）を基に作製した。これらを大腸菌Shuffle（New England Biolabs社製）またはBL21（DE3）に形質転換後、Ampicillin添加LB培地にて×6ヒスチジンタグ（His-Tag）融合タンパク質として大量発現させた。TALON Metal Affinity Resin（タカラバイオ社製）を用いて精製後、SDS-PAGEにて精製タンパク質の存在を確認した（図１）。
　β-1,3-グルカン結合タンパク質として昆虫由来BGRPを基に作成したsupBGRPを使用した。supBGRPのアミノ酸配列は、従来知られているカイコなどの各種昆虫由来のβ－グルカン結合タンパク質（BGRP）のアミノ酸配列と、本発明者らのこれまでの知見に基づいて、約36残基（カイコに対しては23残基）のアミノ酸変異を導入することで人工的に作製したβ-1,3-グルカン結合タンパク質である。
　supBGRPのアミノ酸配列とDNA配列を以下に示す。
（配列番号３）
Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg His
Met Glu Leu Gly Thr Tyr Glu Val Pro Asp Ala Lys Leu Glu Ala Ile
Tyr Pro Lys Gly Leu Arg Val Ser Ile Pro Asp Asp Gly Phe Ser Leu 
Phe Ala Phe His Gly Lys Leu Asn Glu Glu Met Glu Gly Leu Glu Ala 
Gly Thr Trp Ser Arg Asp Ile Thr Lys Ala Lys Asn Gly Arg Trp Thr
Phe Arg Asp Arg Asn Ala Glu Leu Lys Ile Gly Asp Lys Ile Tyr Phe 
Trp Thr Tyr Val Ile Lys Asp Gly Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asn Gly 
Glu Trp Thr Val Thr Gly Tyr Val Asp Glu Asp Gly Asn Pro Val Asp 
Thr Asp Gly Pro Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Glu Phe Lys Leu Val 
Asp Leu Gln Ser Arg
（配列番号４）
atg aat cac aaa gtg cat cat cat cat cat cat atc gaa ggt agg cat 
atg gag ctc ggt acc tat gaa gtg cct gat gcg aaa ctc gaa gcc att 
tac ccc aaa ggg tta cgc gtt agc att ccg gat gat ggc ttt tcg ctg 
ttt gcc ttc cat ggg aaa ctg aac gag gag atg gaa ggt ctg gaa gct 
gga act tgg agt cgg gac atc acg aaa gcg aag aac ggt cgt tgg acc 
ttt cgt gac cgc aat gca gag ctg aaa att ggc gac aag atc tac ttc 
tgg acc tac gtc atc aaa gat ggc ttg ggt tat cgc cag gat aac gga 
gaa tgg acc gta acg ggc tat gtg gac gaa gat ggc aat ccg gtt gat 
acc gat ggt ccg act acg aca cca acc gga tcc gaa ttc aag ctt gtc 
gac ctg cag tct aga tag 
　β-1,6-グルカン結合タンパク質としてアカパンカビ由来β-1,6-グルカナーゼの変異体（Neg1-E321Q）を使用した（特許文献５）。
　また、レポータータンパク質として深海エビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼ（NanoLuc、プロメガ社製）を使用した。ここで使用したスプリットレポータータンパク質（NanoLuc）は、LgBiTと呼ばれる大きな断片とSmBiTと呼ばれる小さな断片の２つのサブユニットからなり、この２つのサブユニットが複合体を形成することで、活性化ルシフェラーゼが再構成されるものである。したがって、LgBiTおよびSmBiTの組み合わせは、スプリットレポータータンパク質の一方および他方の組み合わせを構成する。
　この実施例では、第１融合タンパク質としてsupBGRPのN末端側にリンカーペプチドとして４×DDAKK配列を挟んでLgBiTを融合したもの（supBGRP-LgBiT）を作製した。また第２融合タンパク質としてNeg1-E321QのN末端側にリンカーペプチドとしてGGSGGGSGG配列（配列番号５）を挟んでSmBiTを融合したもの（Neg1-E321Q-SmBiT）を作製した。さらに、第３融合タンパク質としてsupBGRPのN末端側にリンカーペプチドとして４×DDAKK配列を挟んでSmBiTを融合したもの（supBGRP-SmBiT）を作製した。
　β-グルカンの存在下で融合タンパク質が機能し、活性化レポータータンパク質が再構成されることを確認するために、パン酵母由来の粗精製な粒子状β-グルカンであるZymosan AとsupBGRP-LgBiTとNeg1-E321Q-SmBiTを混合し、NanoLuc基質（NanoGlo、プロメガ社製）を加えて生物発光の有無を観察した。
　結果を図２に示す。
　supBGRP-LgBiTとNeg1-E321Q-SmBiT、Zymosan AおよびNanoLuc基質が全て存在する場合のみ、生物発光が観察された。
　これらの結果から、Protein-fragment complementation assay がβ-glucanの簡易構造解析に利用できることが示された。
　＜実施例２＞Protein-fragment complementation assay の最適化の検討
　洗浄工程が不要なProtein-fragment complementation assay を構築し、最適化するために、グルカンプローブの濃度、反応時間を変えて反応性を調べた。
　異なる濃度（50、100、200、400nM）のsupBGRP-LgBiTとNeg1-E321Q-SmBiTの混合溶液（5μL）を96ウェルプレートで10μLのZymosan A（0～1000ng/mL）と30分間インキュベートし、15μLのNanoLuc基質を添加してルシフェラーゼ活性を評価した。その結果、図３Ａに示すように、ルシフェラーゼ活性は、各プローブの濃度に比例して増加することが確認された。少なくとも200nMの各プローブの存在下で、適切な反応曲線が得られた。
　次に、supBGRP-LgBiTとNeg1-E321Q-SmBiTの200nMの混合溶液（5μL）を96ウェルプレートに入れ、0～1000ng/mLのZymosan A（10μL）とともに10分、30分、60分インキュベートし、15μLのNanoLuc基質を添加してルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、反応曲線を得るためには10分間のインキュベーションで十分であるが、さらにインキュベーションの時間を長くするとルシフェラーゼ活性が上昇することが確認された（図３Ｂ）。
　＜実施例３＞融合タンパク質を用いた各種β-グルカンの測定
　第１融合タンパク質（supBGRP-LgBiT）と第２融合タンパク質（Neg1-E321Q-SmBiT）の混合液（それぞれ200 nM）、または第１融合タンパク質（supBGRP-LgBiT）と第３融合タンパク質（supBGRP-SmBiT）の混合液（それぞれ200 nM）を5 μLと、10 μLの各種多糖検体（0から50 μg/mL）を96ウェルプレート（白色・平底）内で混合し、プレートシェーカー上で振とうした。
　使用した多糖検体は表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　30分間後、15 μLのNanoLuc基質を添加し、ルミノメーター（プロメガ社製）で生物発光レベルを測定した
　結果を図４に示す。
　第１融合タンパク質（supBGRP-LgBiT）と第２融合タンパク質（Neg1-E321Q-SmBiT）の組み合わせ（supBGRP-LgBiT／Neg1-E321Q-SmBiT）ではβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンを含む検体において発光が認められ、第１融合タンパク質（supBGRP-LgBiT）と第３融合タンパク質（supBGRP-SmBiT）の組み合わせ（supBGRP-LgBiT／supBGRP-SmBiT）ではβ-1,3-グルカンを含む検体において発光が認められた。
　β-1,6-分岐β-1,3-グルカンを含む検体として具体的には、Zymosan A、Pustulan、Scleroglucan、加熱殺菌C.albicans（HKCA）などが挙げられ、第１融合タンパク質と第２融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／Neg1-E321Q-SmBiT）ではそれらの検体との反応性を示した。精製後の高純度β-グルカンのみならず、未精製検体であるHKCAも同様の操作で検出可能であることが示された。
　一方、β-1,3-グルカンを含む検体として具体的には、Zymosan A、Curdlan、Pustulan、Scleroglucan、Paramylon、Pachyman、Laminarin、HKCAなどが挙げられ、第１融合タンパク質と第３融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／supBGRP-SmBiT）ではそれらの検体との反応性を示した。
　これに対し、β-グルカン構造を持たないChitin、Dextran、Xylan、Mannanとはいずれの混合液も反応性を示さなかった。
　これらの結果から、本発明の方法によれば、多検体におけるβ-グルカンの構造解析を効率よく実施できることが確認された。
　＜実施例３＞真菌類の天然細胞壁の構造解析
　実施例２において、HKCAの表面にあるβ-1,3-グルカンまたは長鎖β-1,6-分岐-β-1,3-グルカンの存在を判定できることが実証された（図４Ｈ）。しかし、HKCAは、熱処理によってβ-グルカンの表面を覆うマンナン層がしばしば除去されるため、必ずしもC. albicansの天然細胞壁組成を模しているわけではない。そこで、Protein-fragment complementation assayを生きた真菌の天然細胞壁構造の分析に応用できるかどうかについて検討した。
　まず、異なる数の酵母型C. albicans（0、104、105、106個／ウェル）を96ウェルV底プレート内で洗浄し、10μLのPBSに懸濁した。これを5μLの第１融合タンパク質と第３融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／supBGRP-SmBiT）または第１融合タンパク質と第２融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／Neg1-E321Q-SmBiT）と混合した。30分間後、15μLのNanoLuc基質を添加し、生細胞表面に再構成されたレポータータンパク質の活性化レベルを測定した結果、supBGRP-LgBiT／supBGRP-SmBiTおよびsupBGRP-LgBiT／Neg1-E321Q-SmBiTの両方の組み合わせにおいて、105個／ウェル以上の酵母型C. albicansに対応して生物発光が有意に増加した（図５Ａ、図５Ｂ）。
　次に、この方法を用いて、一般的に解析が困難とされる菌糸状のC. albicansの細胞壁グルカン構造を直接分析できる可能性を検討した。菌糸形成を誘導するため、96ウェルV底プレート内で非働化したウシ胎児血清を10%含むRPMI1640培地に酵母型C. albicans（105個／ウェル）を加えて、37℃で異なる時間（0、2、4、7時間）培養した。菌糸形成の確認は、透明な96ウェル平底プレートを用いて同様の条件でC.albicansを並行培養して行った。各培養時間におけるC.albicansの顕微鏡的形態を図６に示す。
　洗浄した菌糸を10μLのPBSに懸濁し、5μLの第１融合タンパク質と第３融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／supBGRP-SmBiT）または第１融合タンパク質と第２融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／Neg1-E321Q-SmBiT）と混合した。30分間後にNanoLuc基質（15μL）を加え、生物発光レベルを測定した。表面のβ-1,3-グルカンまたは長鎖β-1,6-分岐-β-1,3-グルカンの量を示すルシフェラーゼの活性が、菌糸成長依存的に有意に上昇した（図７Ａ、Ｂ）。これらの結果は、本測定法が未処理の生きた真菌細胞壁のグルカン構造の分析に有用であることを示している。
　＜実施例４＞ β-グルカンの構造変化のリアルタイムモニタリングへのProtein-fragment complementation assayの応用
　例えば、細胞壁グルカンの構造は、真菌の成長過程で様々な酵素の作用を受けてダイナミックに変化する。そこで、粒子状β-グルカンであるZymosan Aをエンド-β-1,6-グルカナーゼ（Neg1）またはエンド-β-1,3-グルカナーゼ（Zymolyase）で処理し、β-1,6結合したβ-グルカン側鎖またはβ-1,3-グルカン鎖の構造の時間依存的な変化を本測定法で評価できるかどうかを検討した。
　10μLのZymosan A（10μg/mL）に5μLの第１融合タンパク質と第３融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／supBGRP-SmBiT）または第１融合タンパク質と第２融合タンパク質の混合液（supBGRP-LgBiT／Neg1-E321Q-SmBiT）を添加して、60分間インキュベートした。PBS、エンド-β-1,6-グルカナーゼ（最終濃度0.5μg/mL）、またはエンド-β-1,3-グルカナーゼ（最終濃度0.5μg/mL）を含むNanoLuc基質（15μL）を加え、再構成されたNanoLuc活性を2分ごとに15回測定した（30分間）。
　図８Ａに示すように、第１融合タンパク質と第３融合タンパク質の組み合わせ（supBGRP-LgBiT／supBGRP-SmBiT）において、未処理のコントロールサンプルでは、発光強度が時間経過に伴い徐々に低下した（自然減衰）。一方、エンド-β-1,3-グルカナ-ゼ処理したZymosan Aでは、発光強度が急激に低下し、30分後の生物発光レベル（RLU測定値）は未処理群の約1/3となった。Zymosan Aのβ-1,6結合側鎖を分解しても、supBGRPのグルカン結合能には影響がなかった。
　これに対し、第１融合タンパク質と第２融合タンパク質の組み合わせ（supBGRP-LgBiT／Neg1-E321Q-SmBiT）から再構成されたNanoLucの活性は、エンド-β-1,6-グルカナーゼまたはエンド-β-1,3-グルカナーゼで処理することにより劇的に低下した（図８Ｂ）。30分後の生物発光レベル（RLU測定値）は、未処理群に比べて、エンド-β-1,3-グルカナーゼ処理群では約1/6に、エンド-β-1,6-グルカナーゼ処理群では約1/14に減少していた。これらの結果から、Protein-fragment complementation assayは、β-グルカンの構造解析に適しているだけでなく、長鎖β-1,6-branched-β-1,3-グルカンの構造変化をリアルタイムでモニターできることが確認された。
　＜実施例５＞融合タンパク質を用いた測定法と従来のELISAとの反応性比較
　可溶性と不溶性のβ-グルカンを従来のELISA法と融合タンパク質を用いた測定法で測定し、その反応性を比較した。可溶性のβ-グルカンとして、Candida細胞壁から精製したCSBGの水溶液を用い、不溶性のβ-グルカンとして、Zymosanを熱アルカリ溶液で洗浄したDepleted-Zymosan（D-Zymosan、InvivoGen社）の懸濁液を用いた（表１）。
　第１融合タンパク質（supBGRP-LgBiT）と第２融合タンパク質（Neg1-E321Q-SmBiT）の混合液（それぞれ200 nM）を5 μLと、10 μLの可溶性および不溶性の各検体（0から1,000 ng/mL）を96ウェルプレート（白色・平底）内で混合し、プレートシェーカー上で振とうした。30分間後、15 μLのNanoLuc基質を添加し、ルミノメーター（プロメガ社製）で生物発光レベルを測定した。
　図９Ａに示したように、可溶性、不溶性を問わず、β-グルカンの添加濃度依存的な反応性の増強が確認された。
　一方、第１融合タンパク質（supBGRP-LgBiT）を96ウェルプレート（白色・平底）に固相化し（2 μg/mL）、ウシ血清アルブミンを含むPBS溶液でブロッキングした。プレートを洗浄後、可溶性および不溶性の各検体（0から1,000 ng/mL）を加えた。60分後に洗浄し、さらにビオチン標識したβ-1,6-グルカン結合タンパク質（Neg1-E321Q-Biotin、2 μg/mL）を加えて60分放置した。洗浄後、ストレプトアビジン標識された西洋わさびペルオキシダーゼを加え、20分後放置した。プレートをよく洗浄した後、市販のペルオキシダーゼ用発光基質を加え、ルミノメーター（プロメガ社製）で発光レベルを測定した。
　図９Ｂに示したように、従来のELISA法では、可溶性のβ-グルカンであるCSBGにおいて添加濃度依存的な反応性の上昇が認められたが、不溶性のβ-グルカンであるD-Zymosanでは反応性は示さなかった。
　これらの結果から、本発明の方法によれば、可溶性および不溶性のβ-グルカン量を、同一条件で正確に測定できることが確認された。

Claims (4)

  1. 　β-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量方法であって、以下の工程：
    　試験検体と試薬とを接触させる第１工程；および、
    　前記第１工程における生成物を検出・定量する第２工程、
    を含み、
    　前記試薬は、
    　　スプリットレポータータンパク質を有する第１融合タンパク質と、
    　　スプリットレポータータンパク質を有する、第２融合タンパク質および第３融合タンパク質のうちのいずれかと、
    　を含み、
    　前記スプリットレポータータンパク質は、離間する２つが一対となることで活性型レポータータンパク質を形成可能であり、
    　前記第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの一方とを含み、
    　前記第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
    　前記第３融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
    　前記第１工程において、前記試験検体中にβ-1,6-分岐β-1,3-グルカンが含まれる場合は、β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと、前記第１融合タンパク質および前記第２融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質が形成され、
    　前記試験検体中にβ-1,3-グルカンが含まれる場合は、β-1,3-グルカンと、前記第１融合タンパク質および前記第３融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質が形成され、
    　前記第２工程において、前記第１工程で形成された前記活性型レポータータンパク質を検出・定量する
    ことを特徴とする方法。
  2. 　前記第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の一方が融合した融合タンパク質であり、
    　前記第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質であり、
    　前記第３の融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に前記スプリットレポータータンパク質の他方が融合した融合タンパク質である
    ことを特徴とする請求項１の方法。
  3. 　前記試験検体が不溶性であることを特徴とする請求項１または２の方法。
  4. 　β-1,6-分岐β-1,3-グルカンまたはβ-1,3-グルカンの検出・定量キットであって、
    　スプリットレポータータンパク質を有する第１融合タンパク質と、
    　スプリットレポータータンパク質を有する、第２融合タンパク質および第３融合タンパク質のうちのいずれかと、
    　を含む試薬を備え、
    　前記スプリットレポータータンパク質は、離間する２つが一対となることで活性型レポータータンパク質を形成可能であり、
    　前記第１融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの一方とを含み、
    　前記第２融合タンパク質は、β-1,6-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
    　前記第３融合タンパク質は、β-1,3-グルカン結合タンパク質と、前記スプリットレポータータンパク質のうちの他方とを含み、
    　β-1,6-分岐β-1,3-グルカンと、前記第１融合タンパク質および前記第２融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質を形成可能であり、
    　β-1,3-グルカンと、前記第１融合タンパク質および前記第３融合タンパク質とが結合することで、前記スプリットレポータータンパク質の一方および他方による前記活性型レポータータンパク質を形成可能である
    ことを特徴とするキット。
      
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