WO2023074415A1 - キチン結合ポリペプチドならびにキチンの検出方法および検出キット - Google Patents

キチン結合ポリペプチドならびにキチンの検出方法および検出キット Download PDF

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WO2023074415A1
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chitin
seq
polypeptide
amino acid
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大輔 山中
将大 木村
禎之 安達
文隆 小山
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学校法人東京薬科大学
学校法人工学院大学
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a chitin-binding polypeptide, and a chitin detection method and detection kit using the chitin-binding polypeptide.
  • Chitin is a nitrogen-containing polysaccharide composed of poly- ⁇ -1,4-N-acetylglucosamine and is found in the cell walls of fungi such as mushrooms and molds, the exoskeletons of arthropods and crustaceans, and the exoskeletons of squid and the like. Included in many organisms, such as mollusks. Domestically and internationally, the application development of chitin to foods, cosmetics, pharmaceuticals, bioplastics, etc. is being actively promoted.
  • Chitin is a useful natural material with diverse possibilities, but it is also found in mites, cockroaches, parasites, and fungi, and is also a molecule that interferes with the human immune system and induces allergies.
  • detecting chitin there are techniques to detect mites or fungi themselves, but it is the carcasses and fine particles after crushing that are actually involved in human diseases, so it is difficult to visually distinguish them. difficult. Therefore, there is a demand for another technique for detecting such allergy-inducing molecules that are difficult to distinguish visually.
  • Structural analysis of chitin is performed on chitin purified through multiple steps, for example, using analysis methods such as NMR (nuclear magnetic resonance), HPLC (high performance liquid chromatography) and GC (gas chromatography).
  • analysis methods such as NMR (nuclear magnetic resonance), HPLC (high performance liquid chromatography) and GC (gas chromatography).
  • a method for quantifying chitin in addition to the Prosky method (enzyme-weight method), a method of chemically degrading chitin to quantify the glucosamine produced is used (Patent Document 1).
  • these methods lose measurement sensitivity and specificity. Therefore, in many cases, a purification process is required for test specimens, making them unsuitable for analysis of multiple specimens. I had a problem.
  • Chitinase which is a chitinolytic enzyme, is composed of a chitin-binding domain (CBD) that exhibits binding activity to chitin and a catalytic domain (Catalytic domain: CatD) that exhibits chitinolytic activity.
  • CBD chitin-binding domain
  • CatD catalytic domain
  • a chitin detection system applying CBD was developed early.
  • an application of Bacillus coagulans-derived chitinase A1 to chitin detection using CBD has been proposed (Patent Document 2).
  • the CBD of human chitinase is a molecular candidate for use in the detection of chitin and the treatment of fungal infections (US Pat.
  • the CBD that is applied for chitin detection has the advantage that a region composed of at least 49 amino acids exhibits chitin-binding activity and has a relatively small molecular weight.
  • CBD binds to insoluble chitin to some extent, but its binding force to soluble chitin oligosaccharides is at the mM level, which is very weak.
  • CBD does not bind to plant cellulose, bacterial peptidoglycan, etc., it has been found to have binding activity to hyaluronic acid (Non-Patent Document 1).
  • the purpose of the present invention is to provide a chitin-binding polypeptide, and a chitin detection method and detection kit using the chitin-binding polypeptide.
  • the present inventors focused on CatD, which is the catalytic region of chitinase, which had not been used as a chitin-binding molecule in the past, and attempted to modify its function. is obtained.
  • CatD the catalytic region of chitinase, which had not been used as a chitin-binding molecule in the past, and attempted to modify its function. is obtained.
  • the present inventors identified proteins with high sequence identity based on the obtained amino acid sequences of the chitin-binding molecules, and examined their chitin-binding ability. The present invention is made based on these findings.
  • the present invention is as follows: [1] (a) consists of an amino acid sequence A having a sequence identity of 80% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, (b) a polypeptide that has chitin-binding activity but does not exhibit chitinolytic activity; [2] In the amino acid sequence A, the amino acid at the position corresponding to position 119 is substituted based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6
  • the reagent comprises the polypeptide of any one of [1] to [7] and a reporter molecule; [9] the reporter molecule comprises a first split reporter molecule and a second split reporter molecule; the reagent is (1) a first fusion protein comprising the first polypeptide of any one of [1] to [7] and the first split reporter molecule, and (2) [1] to [7] a second fusion protein comprising the second polypeptide of any one of ] and the second split reporter molecule; an activated reporter molecule can be formed by pairing the first split reporter molecule and the second split reporter molecule; In the step (i), the chitin is bound to the first fusion protein and the second fusion protein, so that the activated form is activated by the first split reporter molecule and the second split reporter molecule.
  • a reporter molecule is formed,
  • a detection kit for detecting chitin includes a reagent, A detection kit, wherein the reagent comprises the polypeptide of any one of [1] to [7] and a reporter molecule; [14] the reporter molecule comprises a first split reporter molecule and a second split reporter molecule; the reagent is (1) a first fusion protein comprising the first polypeptide of any one of [1] to [7] and the first split reporter molecule, and (2) [1] to [7] a second fusion protein comprising the second polypeptide of any one of ] and the second split reporter molecule; the first split reporter molecule and the second split reporter molecule are paired to form an active reporter molecule; detection, wherein chitin binds to the first
  • Fig. 3 is an SDS-PAGE image (CBB staining) of HiBiT-fused chitotriosidase-CatD-E140Q expressed in E. coli.
  • Chitinolytic activity of chitotriosidase-CatD-E140Q was evaluated using the synthetic chromogenic substrate 4-NP-(GlcNAc) 2 at 37° C. for 30-60 minutes.
  • a comparison of the binding capacities of HiBiT-fused chitotriosidase-CatD-E140Q (0-200 nM) and a ⁇ -1,6-glucan probe (ie, Neg1-E321Q, negative control) to chitin magnetic beads is shown.
  • FIG. 3 is an SDS-PAGE image (CBB staining) of LgBiT-fused chitotriosidase-CatD-E140Q and SmBiT-fused CatD-E140Q expressed in E. coli.
  • glucans used are crab shell chitin, ethylene glycol chitin (EGC), zymosan A, GlcNAc monomer, cellulose, curdlan, pustulan, mannan, xylan, dextran, hyaluronan and heparin, in order from the upper left.
  • Fig. 3 shows reactivity of luciferase fragment complementation assay using chitotriosidase-CatD-E140Q against viable and heat-killed cells of the yeast type C. albicans.
  • Fig. 2 shows real-time monitoring results of heat-killed Candida cell wall structural changes by luciferase fragment complementation assay using chitotriosidase-CatD-E140Q.
  • FIG. 10 compares the reactivity of highly deacetylated chitosan (deacetylation rates: 89.9% and 97.4%) with chitin in a luciferase fragment complementation assay using chitotriosidase-CatD-E140Q.
  • the minimum GlcNAc unit that can be bound by chitotriosidase-CatD-E140Q was determined by adding CatD-E140Q-HiBiT (50 ng/ml) and Results evaluated by competitive ELISA using EGC-coated microplates (50 ng/ml) are shown. It is the result of monitoring the binding of chitotriosidase-CatD-E140Q-HiBiT to the EGC-labeled sensor chip by the BLI method and calculating the dissociation constant (K D ). Response curves of 3-fold serial dilutions of EGC (Blank, 2.7-2000 pg/mL) by sandwich ELISA are shown.
  • 1 shows the wild-type amino acid sequence of human chitotriosidase CatD (SEQ ID NO: 1).
  • 2 shows the wild-type amino acid sequence of human acid mammalian chitinase CatD (SEQ ID NO:2).
  • 3 shows the wild-type amino acid sequence of mouse chitotriosidase CatD (SEQ ID NO:3).
  • 4 shows the wild-type amino acid sequence of mouse acid mammalian chitinase CatD (SEQ ID NO:4).
  • 5 shows the wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of cat chitotriosidase CatD.
  • 6 shows the wild-type amino acid sequence of canine acid mammalian chitinase CatD (SEQ ID NO: 6).
  • a first aspect of the present invention is (a) consists of an amino acid sequence A having a sequence identity of 80% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6; (b) Polypeptides that have chitin-binding activity but do not exhibit chitinolytic activity.
  • Chitinase contains a chitin-binding domain (CBD) that exhibits chitin-binding activity and a catalytic domain (Catalytic domain: CatD) that exhibits chitinolytic activity.
  • CBD chitin-binding domain
  • CatD catalytic domain
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 are the wild-type amino acid sequences of the chitinase catalytic domain (hereinafter also referred to as “CatD”).
  • CBD was often used to detect chitin.
  • fluorescently-labeled CBD labeled with fluorescent molecules has been put into practical use and is commercially available, but CBD has a structure similar to plant lectins and has low chitin structure specificity in binding.
  • An improved tool was sought.
  • the present inventors focused on CatD, which is the catalytic domain of chitinase, instead of CBD, which was conventionally recognized as a carbohydrate-binding molecule, and attempted to modify its function, resulting in a molecule with strong chitin-binding ability. was newly found to be obtained.
  • polypeptide of the present invention consists of an amino acid sequence (corresponding to "amino acid sequence A") having a certain percentage or more of sequence identity with the wild-type amino acid sequence of CatD, which is the catalytic domain of chitinase.
  • the polypeptide having the catalytic domain CatD of a chitinase is selected from the group consisting of chitinases with a characterized catalytic domain (CatD) of the GH18 family.
  • Examples of such polypeptides include Chitotriosidase (Chitinase-1), and Acidic mammalian chitinase (AMCase) is mentioned.
  • Wild-type sequences of CatD include, for example, the wild-type amino acid sequence of human chitotriosidase CatD (SEQ ID NO: 1), the wild-type amino acid sequence of human acid mammalian chitinase CatD (SEQ ID NO: 2), and the wild-type of mouse chitotriosidase CatD.
  • Amino acid sequence (SEQ ID NO:3), mouse acid mammalian chitinase CatD wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO:4), cat chitotriosidase CatD wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO:5) and dog acid mammalian chitinase CatD wild-type amino acid sequence (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO: 6) ( Figures 7A-7F).
  • Amino acid sequence A typically has 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6, but in another embodiment, for example, SEQ ID NO: 1, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, with the amino acid sequence shown in 2, 3, 4, 5 or 6, It may be 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • Amino acid sequence A includes, for example, the amino acid sequences of chitinase-3-like protein 1 (YKL-40), chitinase-3-like protein 2 (YKL-39), chitinase-like protein 3 (Ym1) and chitinase-like protein 4 (Ym2) may be included.
  • amino acid sequence A is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (described below in the Examples).
  • the origin of the polypeptide of the present invention consisting of amino acid sequence A is, for example, mammals, more specifically, for example, humans, chimpanzees, gorillas, mice, rats, dogs, or cats, but is not limited thereto. .
  • Amino acid sequence A is a sequence obtained by performing at least one amino acid substitution with respect to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
  • amino acid sequence A the amino acid residue at the position corresponding to position 119 is substituted based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
  • amino acid residue at the corresponding position is a reference amino acid sequence (specifically In the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 (hereinafter also referred to as "reference sequences"), when aligned with a contrasting amino acid sequence (specifically, amino acid sequence A), a specific position in the reference sequence It refers to the amino acid residue at the position opposite to.
  • reference sequences specifically In the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6
  • amino acid sequence A specifically, amino acid sequence A
  • amino acid sequence A specifically, amino acid sequence A
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 human Chitinase-1-CatD wild type
  • porcine chitinase-1-CatD amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (Fig. 8A).
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 119 based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6 is Where appropriate, different amino acids have been substituted.
  • amino acid sequence A contains a conserved catalytic "DXDXE” motif (SEQ ID NO: 7) involved in chitinolytic activity.
  • amino acid sequence A comprises an amino acid sequence in which glutamic acid (E) in the catalytic "DXDXE” motif is replaced with a different amino acid. That is, amino acid sequence A contains a sequence in which glutamic acid (E) in the amino acid sequence (DXDXE) shown in SEQ ID NO:7 is mutated.
  • amino acid sequence A has a sequence in which glutamic acid (E) in the catalytic "DXDXE" motif is alanine (A), arginine (R), asparagine (N), aspartic acid (D), cysteine (C), glutamine (Q), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), leucine (L), lysine (K), methionine (M), phenylalanine (F), proline (P), serine (S), threonine (T), Contains amino acid sequences with tryptophan (W), tyrosine (Y) or valine (V) substitutions.
  • amino acid sequence A comprises an amino acid sequence in which glutamic acid (E) in the catalytic "DXDXE" motif is replaced with glutamine (Q).
  • E in the amino acid sequence (DXDXE) shown in SEQ ID NO: 7 is residue 119 in amino acid sequence A.
  • the polypeptide of the present invention does not exhibit chitinolytic activity, but has chitin-binding activity.
  • the absence of chitinolytic activity may or may not be due to modifications to the natural amino acid sequence. That is, the polypeptide according to the present invention may have a wild-type amino acid sequence that does not inherently have chitinolytic activity.
  • the polypeptides of the present invention are also referred to as "chitin-binding polypeptides" or "chitin-binding proteins”.
  • the polypeptide of the present invention specifically binds to a region containing 4 or more ⁇ -1,4-N-acetylglucosamines in chitin.
  • the polypeptide according to the present invention has an affinity of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 M or less, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, when the affinity for ethylene glycol chitin is measured by the Bio-layer interferometry (BLI) method, for example. It binds to ethylene glycol chitin with a dissociation constant (K D ) of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 M or less or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 M or less.
  • K D dissociation constant
  • chitin is poly- ⁇ -1,4-N-acetylglucosamine composed of 4 or more ⁇ -1,4-N-acetylglucosamines. Chitin is more preferably composed of 5 or more ⁇ -1,4-N-acetylglucosamines, still more preferably 6 or more ⁇ -1,4-N-acetylglucosamines.
  • Another aspect of the present invention is a recombinant microorganism or cell into which a nucleotide sequence encoding the aforementioned polypeptide has been introduced.
  • cells refer to cell lines that are widely and commonly used in cell engineering techniques, such as CHO cells, HEK293T cells and insect cells.
  • a second aspect of the present invention is a method for detecting chitin, comprising the following steps: (i) contacting a test specimen containing chitin with a reagent to obtain a product formed by said test specimen and said reagent; and (ii) said product formed in said step (i). comprising the step of detecting Said reagent relates to a detection method comprising a chitin-binding polypeptide of the invention and a reporter molecule.
  • the term “detection” also includes the concept of "quantification”.
  • the method for detecting chitin may be a method for measuring the amount of chitin contained in a test sample.
  • quantitation refers to the extent of the index generated depending on the reporter molecule in the detection method including standards containing various amounts of chitin, the chitin-binding polypeptide of the present invention, and the reporter molecule. It can be obtained by converting the amount of chitin contained in the sample into the weight of the standard product. In addition, the correlation between the amount of chitin and the degree of index dependent on the reporter molecule is determined in advance, and the amount of chitin contained in the unknown sample is measured from the degree of index dependent on the reporter molecule derived from the unknown sample. You can also
  • test specimen and the reagent are brought into contact.
  • the test specimen may contain crude, purified, or partially purified chitin. Chitin and test specimens containing chitin may be soluble or insoluble in water.
  • the origin of the chitin contained in the test specimen is not particularly limited, and may be, for example, basidiomycetes such as mushrooms, bacteria, yeast, algae, cell walls of plants, extracts, or extracellularly secreted chitin.
  • the test sample may contain chitin as a constituent or extract of an animal, or chitin secreted outside the body of an animal.
  • it may be chitin that exists in environments such as indoors, soil, rivers, seawater, air, and outer space.
  • the animals include, for example, arthropods, mollusks, cnidarians, echinoderms, flatworms and vertebrates.
  • Arthropods include, for example, hexapods, crustaceans, chelicerae and myriapods.
  • Specific examples of arthropods include mites, cockroaches, shrimp, crabs, scorpions, centipedes, flies, wasps and butterflies.
  • Specific examples of animals other than arthropods include shellfish, jellyfish, squid, parasites (tapeworms, anisakis, etc.) and plankton.
  • the examples given as chitin-derived animals are merely examples, and are not intended to be limiting.
  • the reagent contains the chitin-binding polypeptide of the present invention and a reporter molecule.
  • the reporter molecule has the function of presenting an indicator for detection.
  • the function of the reporter molecule indicates that it directly or indirectly results in a detectable signal that is observed visually, detected electrically, or recorded by other means; Examples include, for example, changes in luminescence, radiation, color development, aggregation, magnetic and electrical properties.
  • Luminescence includes fluorescence and phosphorescence, although fluorescence emission is typically used for detection.
  • the reporter molecule exhibits luminescence, it includes, for example, fluorescent dyes, luminescent proteins (such as luciferase and fluorescent proteins), and proteins that catalyze the luminescent reaction of the molecule.
  • the reporter molecule exhibits radiation, it includes, for example, a radioactive isotope.
  • the reporter molecule When the reporter molecule develops color, the molecule includes, for example, a color-developing dye, or enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, galactosidase, etc.) capable of amplifying a signal by color development.
  • a color-developing dye or enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, galactosidase, etc.) capable of amplifying a signal by color development.
  • enzymes eg, peroxidase, alkaline phosphatase, galactosidase, etc.
  • colored high molecular weight colloidal materials, particulate materials such as latex beads, magnetic or paramagnetic beads can also be used. Additionally, they can be used in combination with methods that amplify the signal by interacting with a biosensor.
  • the reporter molecule comprises a first split reporter molecule and a second split reporter molecule.
  • the first split reporter molecule and the second split reporter molecule can pair to form an active reporter molecule.
  • paired means that the first split reporter molecule and the second split reporter molecule are in close proximity to each other or bind to each other to form a pair.
  • the first and second split reporter molecules do not function as reporter molecules when they are separated from each other, but when these split reporter molecules are in close proximity or attached to each other, they function as reporter molecules. function.
  • the structure of the split reporter molecule is not specifically limited as long as the formed activated reporter molecule can be identified when the first and second split reporter molecules are adjacent to each other or bound together.
  • the split reporter molecule may be configured such that when the first and second split reporter molecules are brought into proximity or binding, structural complementarity is promoted to form an active reporter molecule.
  • the reporter molecule is a reporter protein.
  • the split reporter molecule is a split reporter protein
  • the split reporter protein comprises a first split reporter protein and a second split reporter protein
  • bioluminescence resonance energy transfer when the first split reporter protein and the second split reporter protein are in proximity or associated.
  • BRET Bioluminescence resonance energy transfer
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the activated reporter protein and the first and second split reporter proteins are brought into close proximity or binding to each other to cause BRET or FRET.
  • the reporter proteins are those that cause BRET or FRET, one or the other of the split reporter proteins may be configured to bind a fluorescent substance.
  • the split reporter protein may be configured such that protein splicing forms an active reporter protein when the first and second split reporter proteins are in proximity or bound. This can be accomplished by having a protein splicing domain fused to each of the first and second split reporter proteins. Protein splicing domains include, for example, Synechocystis sp. A combination with DnaEn and DnaEc, which are protein splicing domains derived from the DnaE gene of , can be exemplified.
  • reporter proteins include enzymes and fluorescent proteins.
  • enzymes include luciferase, alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, invertase, ⁇ -galactosidase and ⁇ -glucuronidase, and variants of these enzymes.
  • fluorescent proteins include green fluorescent protein (GFP) and variants of GFP.
  • the reagent is (1) a first fusion protein comprising a first polypeptide selected from the chitin-binding polypeptides of the present invention and a first split reporter molecule; and (2) selected from the chitin-binding polypeptides of the present invention.
  • a second fusion protein comprising a second polypeptide and a second split reporter molecule; an active reporter molecule can be formed by pairing the first split reporter molecule and the second split reporter molecule;
  • step (i) chitin is bound to the first fusion protein and the second fusion protein to form an active reporter molecule with the first split reporter molecule and the second split reporter molecule
  • the activated reporter molecule formed in step (i) is detected.
  • the reagent comprises: (1) a first fusion protein comprising a first polypeptide selected from the chitin-binding polypeptides of the present invention and a first split reporter protein; and (2) a chitin-binding polypeptide selected from the chitin-binding polypeptides of the present invention. and a second fusion protein comprising the second polypeptide and said second split reporter protein.
  • a linker peptide whose length is adjusted appropriately is inserted to avoid steric hindrance.
  • the linker peptide consists of a peptide of 1 to about 20 residues, and the amino acid sequence thereof can be exemplified by the amino acid sequences of general linkers used in the production of fusion proteins. can.
  • GS linker consisting of a repeating sequence containing Gly-Ser
  • DDAKK linker consisting of a repeating sequence of Asp-Asp-Ala-Lys-Lys
  • Glu-Ala-Ala-Ala-Lys EAAAK linkers are included.
  • the region where the split reporter protein is fused is not limited to either the N-terminal side or the C-terminal side, but is fused according to the characteristics of the chitin-binding polypeptide. A region is preferably determined. A fusion protein fused to both the N-terminal side and the C-terminal side may also be used.
  • the term "fused" means that the split reporter molecule is directly linked to the chitin-binding polypeptide of the present invention, and the split reporter molecule is articulated to the chitin-binding polypeptide of the present invention via another molecule.
  • a fusion protein can also be used by binding a split reporter molecule to an antibody (eg, His-tag antibody) that detects the chitin-binding polypeptide of the present invention.
  • split reporter molecules include, for example, luciferase.
  • the first fusion protein is a fusion protein in which the first split reporter molecule is fused to the N-terminal side or the C-terminal side of the first polypeptide; •
  • the second fusion protein is a fusion protein in which a second split reporter molecule is fused to the N-terminus or C-terminus of the second polypeptide.
  • the first fusion protein is a fusion protein in which the first split reporter molecule is fused to the N-terminal side of the first polypeptide, and the second fusion protein is the C-terminal side of the second polypeptide a fusion protein in which a second split reporter molecule is fused to or
  • the first fusion protein is a fusion protein in which the first split reporter molecule is fused to the C-terminal side of the first polypeptide, and the second fusion protein is the N-terminal side of the second polypeptide to a second split reporter molecule.
  • the first fusion protein is a fusion protein in which the first split reporter molecule is fused to the N-terminal side and the C-terminal side of the first polypeptide
  • the second fusion protein is a fusion protein in which the second split reporter molecule is fused to the N-terminal side and the C-terminal side of the second polypeptide.
  • step (i) chitin binds to the first fusion protein and the second fusion protein to form an active reporter molecule with the first split reporter molecule and the second split reporter molecule, followed by In step (ii), the activated reporter molecule formed in step (i) is detected.
  • step (ii) the product formed in step (i) is detected.
  • the reporter molecule is a reporter protein
  • the activity of the formed active reporter protein is detected. For example, if the activity of the formed active reporter protein is higher than in the absence of chitin, it indicates the presence of chitin in the test sample.
  • the reporter molecule is a fluorescent substance
  • the formed activated reporter molecule is irradiated with excitation light, and emitted fluorescence is detected. For example, a higher fluorescence emitted from the fluorescent material compared to the absence of chitin indicates the presence of chitin in the test sample.
  • the difference between the activity of the unactivated reporter protein (background) observed in the absence of chitin having the structure of interest and the activity of the reconstituted reporter protein in the presence of chitin shows about 300 times higher sensitivity.
  • the detection means is not particularly limited, and a known technique or device can be appropriately selected according to the type and structure of the reporter molecule.
  • Detection methods and detection devices include, for example, a luminescence photometer, a spectrophotometer, a fluorophotometer, a flow cytometer, a multiplex, a method of quantitatively analyzing an image detected by a chromatography, a CCD camera, etc., using a computer, and physical contact. is identified by a sensor chip and quantitatively analyzed.
  • Steps (i) and (ii) can be performed by directly supplying reagents containing the first fusion protein and the second fusion protein into a test tube containing the test sample, or by expressing these fusion proteins. It can also be carried out using the cells obtained by the treatment. In this case, the expression of the first fusion protein and the second fusion protein may be transient or constitutive. Thus, cell lines that stably express the first and second fusion proteins can be used.
  • the first and second fusion proteins can be exemplified by, for example, those produced in E. coli, yeast, plants, animal cells and cell-free expression systems, and in particular those produced in E. coli in large amounts. things are preferred.
  • a crude solution such as a lysate of cells expressing the first and second fusion proteins may be used. It is preferred to use a fusion protein.
  • peptide tags include GST tag, Protein A tag, antibody Fc region, polyhistidine tag, V5 tag, Myc tag, SBP tag, Halo tag, Strep tag and the like.
  • cells used here include animal cells, insect cells, plant cells, and the like, and established cell lines are preferable because they are easy to use.
  • a third aspect of the present invention relates to a detection kit for detecting chitin,
  • the kit includes a reagent,
  • the reagent comprises a chitin-binding polypeptide of the invention and a reporter molecule.
  • the details of the reagents, fusion proteins and reporter molecules in the detection kit are the same as those described for the detection method.
  • the peptide according to the present invention has improved binding specificity and binding activity for chitin, chitin can be detected efficiently and easily.
  • the peptide can detect chitin regardless of its purification purity and properties such as solubility/insolubility.
  • chitin contained in test specimens can be detected and/or quantified at high throughput without requiring complicated washing operations.
  • the chitin detection method of the present invention it is expected that chitin that is derived from various species and purification methods and that exhibits various forms such as soluble/insoluble solubility, gel-like and particulate-like can be screened. be done.
  • the detection method of the present invention does not require a step of washing the test specimen, etc., and can efficiently detect and/or quantify chitin.
  • the method for detecting chitin or the kit for detecting chitin according to the present invention it is possible to visualize the risk of allergy induction in the living environment. That is, by detecting and/or quantifying chitin in the living environment, the risk of developing allergy due to chitin can be predicted.
  • washings obtained by washing blood, secretions, organs, organs, organs or organs of a subject e.g., alveolar washings, mouth washings and intraperitoneal washings
  • washing fluid e.g., alveolar washings, mouth washings and intraperitoneal washings
  • concentration of chitin contained in urine to predict the possibility of developing infectious diseases such as mycosis, bacteriosis and parasitic diseases and the possibility of developing allergies, and infectious diseases and It is expected that it will be possible to observe the state of the body before, during, and after the onset of allergy.
  • Bovine serum albumin BSA
  • 4-nitrophenyl N,N′-diacetyl- ⁇ -D-chitobioside [4-NP-(GlcNAc) 2 ] and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) )-derived cell wall polysaccharides, zymosan A, mannan ( ⁇ -1,6-/ ⁇ -1,2-mannan, ⁇ -1,3-mannan) were purchased from Sigma-Aldrich.
  • Chitin, ethylene glycol chitin (EGC), cellulose powder ( ⁇ -1,4-D-glucan), curdlan ( ⁇ -1,3-D-glucan), dextran ( ⁇ -1,4-/ ⁇ -1, 6-glucan), hyaluronan, heparin and Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) were obtained from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries.
  • Pustulan ⁇ -1,6-D-glucan was purchased from InvivoGen.
  • GlcNAc monomer, GlcNAc dimer, trimer, tetramer, pentamer, hexamer and endo- ⁇ -1,3-glucanase (zymolyase 100T) were purchased from Seikagaku Corporation.
  • N-acetyl-D-glucosamine (>98.0%) and corn cob derived xylan were purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • His-tagged recombinant human Dectin-1 was purchased from R&D Systems.
  • a DNA fragment encoding a modified HiBiT tag is added to the C-terminus or N-terminus of CBD49 and CatD-E140Q with a GS linker peptide (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly sequence ).
  • a GS linker peptide Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly sequence
  • the DNA sequence of the eight-residue peptide sequence Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys
  • ST-II strep-tag II
  • the expression vector was transformed into E. coli for protein expression, and the cells were cultured at 37°C in LB medium supplemented with ampicillin. After preculture, the cells were cooled to 15°C and cultured for 24 to 48 hours to induce expression of the recombinant protein. After washing, the cell suspension with added protease inhibitors was sonicated on ice. The soluble fraction collected by centrifugation was bound to a His-tagged protein purification cobalt column (Takara Bio Inc.) and washed with PBS containing imidazole (15 mM). Proteins bound to the column were eluted with PBS containing imidazole (150 mM) and dialyzed to remove imidazole.
  • Protein concentration was determined using a commercial kit (Bradford method). Recombinant proteins were expressed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using a commercially available kit. The separated proteins were stained with a silver staining II kit (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or CBB dye (Quick Blue stain; Biodynamics Laboratory). The amino acid sequence of CatD-E140Q is shown in SEQ ID NO:9 ( Figure 9).
  • Chitin Staining and Fluorescence Microscopy Chitin or curdlan (1 mg/ml, 10 ⁇ L) was mixed with 0.5 ⁇ g of His-tagged glucan-binding protein (CBD49, CatD-E140Q-HiBiT and human dectin-1) and heated at 4°C. for 30 minutes. Unbound proteins were washed away, and Alexa Fluor 647-labeled anti-His tag monoclonal antibody (MBL) was added and incubated at 4°C. After washing, images were taken using the EVOS FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific).
  • CBD49 His-tagged glucan-binding protein
  • MBL Alexa Fluor 647-labeled anti-His tag monoclonal antibody
  • Luciferase Fragment Complementation Assay Mixed solutions (5 ⁇ L) of NanoLuc fragment-fused chitin-binding probes (200 nM) were added to test samples (10 ⁇ L) in 96-well white plates and incubated for 30 minutes under shaking conditions. The structure of chitin was analyzed using a combination of CBD49-LgBiT and CBD49-SmBiT, or a combination of CatD-E140Q-LgBiT and CatD-E140Q-SmBiT. After shaking, 15 ⁇ L of furimazine substrate solution (Promega) was added to the wells and the luminescence signal from the reconstituted NanoLuc was measured using a GloMax luminometer (Promega).
  • Chitinolytic activity was measured using a synthetic chromogenic substrate, 4-NP-(GlcNAc) 2 .
  • Substrate (200 ⁇ M) in pH 5.0 McIlvain buffer was mixed with chitotriosidase-CatD-E140Q-HiBiT or E. coli expressed mouse chitotriosidase (mChit1) (160 ng/mL each) and incubated at 37°C. Incubated for 30-60 minutes. Released 4-NP was detected at 405 nm using a microplate reader (MTP450; Corona).
  • Magnetic chitin beads (New England Biolabs) were washed and suspended in PBS containing BSA and Tween 20 (BPBST). Magnetic chitin beads and HiBiT-tag fused CatD-E140Q or Neg1-E321Q (0-200 nM, 25 ⁇ L) were mixed in a 96-well white plate (Greiner Bio-one) and incubated for 5 minutes. Plates were washed using a washer with magnetic plate carrier (TECAN).
  • TECAN magnetic plate carrier
  • the HiBiT tag-derived signal from the chitin bead-bound protein was detected by adding 25 ⁇ L of LgBiT and substrate (Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System; Promega) mixture and Reconstituted luciferase activity was measured using a plate reader (GloMax).
  • Candida albicans NBRC 1385 (NITE Bioresource Center, Japan) was plated on YPD agar plates and yeast colonies were suspended in PBS at a concentration of 10 7 cells/mL. . Half of the suspension was heated at 90° C. for 10 minutes and used as heat-killed C. albicans (HKCA). 10 ⁇ L of live cell (LiveCA) and HKCA suspensions were utilized for luciferase fragment complementation assays using chitotriosidase-CatD-E140Q. For arthropod test samples, frozen bodies of Dermatophagoides farinae and D.
  • pteronyssinus or lyophilized powder of Blattella germanica were suspended in PBS (4 mg/mL), metal Beads were added and treated with a bead crusher (FastPrep-24; MP Biomedicals) for 20 seconds.
  • D. farinae, D. pteronyssinus and B. germanica disruption solutions were boiled for 10 minutes and utilized in a luciferase fragment complementation assay using chitotriosidase-CatD-E140Q.
  • a sandwich ELISA-like test was constructed for the purpose of detecting and quantifying soluble chitin with high sensitivity.
  • Microplates were coated with CatD-E140Q-ST-II (2 ⁇ g/ml) and blocked with BPBST. After washing, 3-fold serially diluted EGC was added to the plate and incubated for 1 hour. Plates were washed and CatD-E140Q-HiBiT (1 ⁇ g/ml) was added and incubated for 1 hour. After sufficient washing, the signal derived from the HiBiT tag was measured in the same manner as above.
  • Various mammalian chitinase CatD-variants-HiBit used here were prepared by adding a HiBit tag to a variant in which Glu (E) at position 119 was replaced with Gln (Q) in each sequence shown in FIG. It is.
  • To detect the signal from the HiBit tag from the EGC-bound CatD-variant free LgBiT and substrate (Nano-Glo HiT Lytic Detection System) were added to the wash plate (20-25 ⁇ L/well) and a microplate reader (GloMax ) was used to measure luciferase activity.
  • CBD49-LgBiT and CBD49-SmBiT luciferase fragment-fused CBD49
  • Luciferase fragment complementation assays with CatD derivatives showed low background in the absence of chitin beads (ligand) or either protein, and only in the presence of both proteins, ligand and substrate. , a strong luciferase signal was observed (Fig. 3C).
  • luciferase fragment complementation assay Detection of chitin structures in natural products using CatD-E140Q-luciferase fragment complementation assay (Fig. 5) Live C. albicans (LiveCA) or heat-killed C. albicans was then cultured. The direct detection of chitin on the cell surface of H. albicans (HKCA) was tested. CatD-E140Q-luciferase fragment complementation assay significantly increased luciferase activity in a cell concentration dependent manner for both LiveCA and HKCA (Fig. 5A).
  • CatD-E140Q-luciferase fragment complementation assay was used as a tool to evaluate the positional relationship of each polysaccharide structure on the cell wall surface.
  • Polysaccharides on the HKCA cell wall were degraded with a glycolytic enzyme, and structural changes occurring in the cell wall were analyzed in real time using a CatD-E140Q-luciferase fragment complementation assay.
  • endo- ⁇ -1,4-N-acetylglucosaminidase recombinant murineAMCase

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Abstract

（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示すアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列Ａからなり、（ｂ）キチン結合活性を有するが、キチン分解活性を示さない、ポリペプチドに関する。

Description

キチン結合ポリペプチドならびにキチンの検出方法および検出キット
　本発明は、キチン結合ポリペプチド、ならびに、当該キチン結合ポリペプチドを用いたキチンの検出方法および検出キットに関する。
　キチン（Ｃｈｉｔｉｎ）はポリ－β－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミンにより構成される窒素含有多糖であり、キノコおよびカビなどの真菌細胞壁、節足動物および甲殻類の外骨格、ならびに、イカなどの軟体動物など、多くの生物に含まれる。国内外で、キチンを利用した食品、化粧品、医薬品およびバイオプラスチックなどへの応用開発が活発に進められている。
　キチンは、多様な可能性を持つ有益な天然素材である一方、例えばダニ、ゴキブリ、寄生虫および真菌などに含まれ、ヒトの免疫系に干渉してアレルギーを誘導する分子でもある。キチンの検出に当たり、ダニ自体または真菌自体を検出する技術があるが、実際にヒトの疾患に大きく関与しているのは、これらの死骸および破砕後の微粒子であるため、目視で判別することが難しい。よって、目視での判別が難しい、このようなアレルギー誘導分子を検出する別の技術が求められている。
　キチンの構造解析は、複数の工程を経て精製したキチンに対して、例えば、ＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）およびＧＣ（Ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）などの分析方法を用いて行われる。キチンの定量法としては、プロスキー法（酵素－重量法）のほか、化学的な処理によりキチンを分解し、生成するグルコサミンを定量する方法などが用いられる（特許文献１）。しかしながら、これらの方法では、アミノ酸および糖類などの夾雑物存在下では、測定感度および特異性が低下するため、多くの場合、試験検体の精製プロセスが要求され、多検体の解析には適さないという問題があった。
　上記の問題を解決するため、キチンを特異的に認識する分子を応用してキチンを検出する試みがされている。キチンへの結合活性を示す分子としては、例えば、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ－ｗｈｉｔｅ（ＣＦＷ）などの蛍光色素およびＷｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）などのレクチンが挙げられ、これらを応用したキチン検出方法が複数開発され、現在も多くの研究で使用されている。しかしながら、ＣＦＷについては、植物のセルロースなどにも反応性を示すこと、ＷＧＡについては、末端にＮ－アセチルグルコサミンを有するペプチドグリカンならびにシアル酸とも結合することから、これらの検出方法の反応特異性は十分でなかった。
　キチンへの反応特異性を向上するために、キチン分解酵素の一部を用いたキチン検出方法も開発されている。キチン分解酵素であるキチナーゼ（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）は、キチンへの結合活性を示すキチン結合ドメイン（Ｃｈｉｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ：ＣＢＤ）と、キチン分解活性を持つ触媒ドメイン（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎ：ＣａｔＤ）とから構成されている。キチナーゼのこれらのドメインのうち、ＣＢＤを応用したキチン検出システムは早期に開発された。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ由来ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　Ａ１のＣＢＤを用いたキチン検出への応用例が提案されている（特許文献２）。また、ヒトキチナーゼのＣＢＤ（３９２～４４５位のアミノ酸から構成される）は、キチンの検出および真菌感染症の治療に用いるための分子候補である（特許文献３）。
　キチン検出のために応用されるＣＢＤは、例えば、ヒトキチナーゼの場合、最小で４９アミノ酸から構成される領域がキチン結合活性を示し、分子量が比較的小さいことが利点である。その一方で、ＣＢＤは、不溶性キチンに対してはある程度結合するが、可溶性キチンオリゴ糖との結合力は、ｍＭレベルであり、非常に弱い。また、ＣＢＤは植物セルロース、細菌のペプチドグリカンなどとの結合性はないが、ヒアルロン酸との結合活性が認められていた（非特許文献１）。
　夾雑物存在下において、不溶性および可溶性のキチンを、簡便に且つ高感度で、検出および／または定量するためには、従来用いられてきたキチン認識タンパク質と比べて、キチンへの結合特異性および結合活性の改善された、新たな候補分子が求められていた。
特開２００４－０２０２６６号公報 国際公開第２００５／００５９５５号 米国特許第６３９９５７１号明細書
　本発明は、キチン結合ポリペプチド、ならびに、当該キチン結合ポリペプチドを用いたキチンの検出方法および検出キットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、従来はキチン結合分子として用いられていなかった、キチナーゼの触媒領域であるＣａｔＤに着目し、その機能改変を試みたところ、驚くべきことに、強力なキチン結合力を持つ分子が得られることを見出した。また、当該分子を活用し、キチンの精製純度および可溶性／不溶性といった性状に関わらず、洗浄工程等を必要とすることなく、効率よく、キチンを検出および／または定量することが可能であることをさらに見出した。さらに、本発明者らは、得られたキチン結合分子のアミノ酸配列に基づき、配列同一性の高いタンパク質を特定し、これらのキチン結合能について検討を行った。本発明は、これらの知見に基づき成されたものである。
　即ち、本発明は以下のとおりである：
［１］（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示すアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列Ａからなり、
　（ｂ）キチン結合活性を有するが、キチン分解活性を示さない、ポリペプチド；
［２］前記アミノ酸配列Ａにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示すアミノ酸配列を基準として、１１９位に対応する位置のアミノ酸が置換されている、［１］に記載のポリペプチド；
［３］前記アミノ酸配列Ａが、配列番号７に示すアミノ酸配列（ＤＸＤＸＥ）におけるＥが置換されたアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載のポリペプチド；
［４］哺乳類に由来する、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
［５］ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マウス、ラット、イヌまたはネコに由来する、［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチド；
［６］１．０×１０－６Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でエチレングリコールキチンに結合する、［１］～［５］のいずれか１項に記載のポリペプチド；
［７］前記キチンが、４以上のβ－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミンを含む、［１］～［６］のいずれか１項に記載のポリペプチド；
［８］キチンの検出方法であって、以下の工程：
　（ｉ）キチンを含む試験検体と、試薬とを接触させて、前記試験検体と前記試薬とによって形成された生成物を得る工程、および
　（ｉｉ）前記工程（ｉ）で形成された前記生成物を検出する工程
を含み、
　前記試薬は、［１］～［７］のいずれか１項に記載のポリペプチドとレポーター分子とを含む、検出方法；
［９］前記レポーター分子が、第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とを含み、
　前記試薬が、
　（１）［１］～［７］のいずれか１項に記載の第１のポリペプチドと前記第１のスプリットレポーター分子とを含む第１の融合タンパク質、および
　（２）［１］～［７］のいずれか１項に記載の第２のポリペプチドと前記第２のスプリットレポーター分子とを含む第２の融合タンパク質
を含み、
　前記第１のスプリットレポーター分子と前記第２のスプリットレポーター分子とが一対となることによって活性型レポーター分子を形成可能であり、
　前記工程（ｉ）において、前記キチンと、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質とが結合することで、前記第１のスプリットレポーター分子および前記第２のスプリットレポーター分子により前記活性型レポーター分子が形成され、
　前記工程（ｉｉ）において、前記工程（ｉ）で形成された前記活性型レポーター分子を検出する、［８］に記載の検出方法；
［１０］前記第１の融合タンパク質は、前記第１のポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に前記第１のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であり、
　前記第２の融合タンパク質は、前記第２のポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に前記第２のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質である、［８］または［９］に記載の検出方法；
［１１］前記レポーター分子が、タンパク質である、［８］～［１０］のいずれか１項に記載の検出方法；
［１２］前記試験検体が、水に対して可溶性または不溶性である、［８］～［１１］のいずれか１項に記載の検出方法；
［１３］キチンを検出するための検出キットであって、
　前記キットは、試薬を含み、
　前記試薬は、［１］～［７］のいずれか１項に記載のポリペプチドとレポーター分子とを含む、検出キット；
［１４］前記レポーター分子が、第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とを含み、
　前記試薬が、
　（１）［１］～［７］のいずれか１項に記載の第１のポリペプチドと前記第１のスプリットレポーター分子とを含む第１の融合タンパク質、および
　（２）［１］～［７］のいずれか１項に記載の第２のポリペプチドと前記第２のスプリットレポーター分子とを含む第２の融合タンパク質
を含み、
　前記第１のスプリットレポーター分子と前記第２のスプリットレポーター分子とが一対となることで活性型レポーター分子を形成可能であり、
　キチンと、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質とが結合することで、前記第１のスプリットレポーター分子および前記第２のスプリットレポーター分子により前記活性型レポーター分子が形成される、検出キット；
［１５］前記レポーター分子が、タンパク質である、［１３］または［１４］に記載の検出キット；
［１６］［１］～［７］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む、組換え微生物または細胞。
　本発明によれば、キチン結合ポリペプチド、ならびに、当該キチン結合ポリペプチドを用いたキチンの検出方法および検出キットを提供することができる。
キトトリオシダーゼ－ＣＢＤ－Ｈｉｓ、ＬｇＢｉＴ融合ＣＢＤおよびＳｍＢｉＴ融合ＣＢＤの模式図である。 大腸菌で発現させた６×Ｈｉｓ標識キトトリオシダーゼ－ＣＢＤタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像（銀染色）である。 キトトリオシダーゼ－ＣＢＤ（ＣＢＤ４９－Ｈｉｓ）のキチン粒子への直接結合の蛍光顕微鏡像を示す。 非洗浄キトトリオシダーゼ－ＣＢＤ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイに対する、キチンおよびカードラン（β－１，３－グルカン）の反応性を示す。 ＨｉＢｉＴタグ融合キトトリオシダーゼＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの模式図である。 大腸菌で発現させたＨｉＢｉＴ融合キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像（ＣＢＢ染色）である。 キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑのキチン分解活性を、３０～６０分間３７℃で合成色素基質４－ＮＰ－（ＧｌｃＮＡｃ）２を用いて評価した結果を示す。 キチン磁気ビーズに対する、ＨｉＢｉＴ融合キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ（０～２００ｎＭ）およびβ－１，６－グルカンプローブ（即ち、Ｎｅｇ１－Ｅ３２１Ｑ。ネガティブコントロール）の結合能の比較を示す。 キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴの、キチンまたはカードラン（β－１，３－グルカン）への直接結合の蛍光顕微鏡画像を示す。 ＬｇＢｉＴ融合キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱおよびＳｍＢｉＴ融合ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの模式図である。 大腸菌で発現させた、ＬｇＢｉＴ融合キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱおよびＳｍＢｉＴ融合ＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像（ＣＢＢ染色）である。 キチンに対するバイオセンサーとしてのキトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイの確認を示す。 キトトリオシダーゼ－ＣＢＤ４９－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイおよびＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイからの再構成ルシフェラーゼ活性の比較を示す。 種々の市販のグルカンに対するキトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイの結果を示す。使用したグルカンは、左上から順に、カニ殻キチン、エチレングリコールキチン（ＥＧＣ）、ザイモサンＡ、ＧｌｃＮＡｃ単量体、セルロース、カードラン、プスツラン、マンナン、キシラン、デキストラン、ヒアルロナンおよびヘパリンである。 酵母型カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の生菌および加熱死菌体に対するキトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイの反応性を示す。 キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイによるカンジダ加熱死菌体細胞壁構造変化のリアルタイムモニタリング結果を示す。 キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイによる、コナヒョウヒダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびチャバネゴキブリ（Ｂ．ｇｅｒｍａｎｉｃａ）の検出を示す。 キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイに対する高脱アセチル化キトサン（脱アセチル化率：８９．９％および９７．４％）の反応性をキチンと比較した図である。 キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑが結合可能な最小ＧｌｃＮＡｃ単位を、（ＧｌｃＮＡｃ）１－６（２００μｍ）またはＥＧＣ（２００μｇ／ｍｌ、ポジティブコントロール）の存在下、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＣコーティングマイクロプレート（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いた競合ＥＬＩＳＡにより評価した結果を示す。 キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴのＥＧＣ標識センサーチップへの結合をＢＬＩ法によりモニターし、解離定数（ＫＤ）を算出した結果である。 サンドイッチＥＬＩＳＡによる、ＥＧＣの３倍連続希釈液（Ｂｌａｎｋ、２．７～２０００ｐｇ／ｍＬ）の反応曲線を示す。 ヒトキトトリオシダーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号１）を示す。 ヒト酸性哺乳類キチナーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号２）を示す。 マウスキトトリオシダーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号３）を示す。 マウス酸性哺乳類キチナーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号４）を示す。 ネコキトトリオシダーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号５）を示す。 イヌ酸性哺乳類キチナーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号６）を示す。 ブタキトトリオシダーゼＣａｔＤのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。 ヒトキトトリオシダーゼＣａｔＤのアミノ酸配列（配列番号１）と、配列番号１に対して８０．９％の配列同一性を有するブタキトトリオシダーゼＣａｔＤのアミノ酸配列（配列番号８）との、アラインメント結果を示す。 ヒトキトトリオシダーゼ由来ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。 変異型マウスＡＭＣａｓｅ－ＣａｔＤのキチン結合活性を示す。 変異型ネコＣｈｉｔ１－ＣａｔＤのキチン結合活性を示す。 変異型マウスＣｈｉｔ１－ＣａｔＤのキチン結合活性を示す。 変異型イヌＡＭＣａｓｅ－ＣａｔＤのキチン結合活性を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。また、本明細書において特に断りのない限り、ヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。
　本発明の第１の側面は、
　（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示すアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列Ａからなり、
　（ｂ）キチン結合活性を有するが、キチン分解活性を示さない、ポリペプチドに関する。
　キチナーゼは、キチンへの結合活性を示すキチン結合ドメイン（Ｃｈｉｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ：ＣＢＤ）と、キチン分解活性を持つ触媒ドメイン（Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎ：ＣａｔＤ）とを含む。配列番号１～６に示すアミノ酸配列は、キチナーゼの触媒ドメイン（以下、「ＣａｔＤ」とも称する。）の野生型アミノ酸配列である。
　従来、糖質への結合は、糖質分解酵素内に存在する糖結合ドメインに依存するとの認識が一般的であったところ、キチンの検出にはＣＢＤが利用されることが多かった。例えば、蛍光分子で標識した蛍光標識ＣＢＤは、実用化され、市販されているものの、ＣＢＤは、植物レクチン類似の構造を有しており、結合におけるキチン構造特異性が低いという点で、特性を改善したツールが求められていた。上述したとおり、本発明者らは、従来、糖質結合分子として認識されていたＣＢＤではなく、キチナーゼの触媒領域であるＣａｔＤに着目し、その機能改変を試み、強力なキチン結合力を持つ分子が得られることを新たに見出した。したがって、本発明にかかるポリペプチドは、キチナーゼの触媒領域であるＣａｔＤの野生型アミノ酸配列に対して一定割合以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（「アミノ酸配列Ａ」に相当する）からなる。
　一態様において、キチナーゼの触媒領域ＣａｔＤを有するポリペプチドは、ＧＨ１８ファミリーの特徴とされる触媒領域（ＣａｔＤ）を有するキチナーゼからなる群より選択される。当該ポリペプチドとしては、例えば、
　・キトトリオシダーゼ（Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－１））、および
　・酸性哺乳類キチナーゼ（Ａｃｉｄｉｃ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ（ＡＭＣａｓｅ））
が挙げられる。
　ＣａｔＤの野生型配列としては、例えば、ヒトキトトリオシダーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号１）、ヒト酸性哺乳類キチナーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号２）、マウスキトトリオシダーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号３）、マウス酸性哺乳類キチナーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号４）、ネコキトトリオシダーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号５）およびイヌ酸性哺乳類キチナーゼＣａｔＤの野生型アミノ酸配列（配列番号６）が挙げられる（図７Ａ～７Ｆ）。
　アミノ酸配列Ａは、典型的には、配列番号１、２、３、４、５または６に示すアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上であるが、例えば、別の態様において、配列番号１、２、３、４、５または６に示すアミノ酸配列と配列同一性が６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列Ａには、例えば、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－３－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＹＫＬ－４０）、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－３－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＹＫＬ－３９）、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ３（Ｙｍ１）およびＣｈｉｔｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ４（Ｙｍ２）のアミノ酸配列が包含されていてもよい。一態様において、アミノ酸配列Ａは、配列番号９（実施例において後述する）に示すアミノ酸配列である。
　アミノ酸配列Ａからなる本発明のポリペプチドの由来は、例えば、哺乳類であり、より具体的には、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マウス、ラット、イヌ、またはネコであるが、これらに限定されない。
　アミノ酸配列Ａは、配列番号１、２、３、４、５または６に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換が行われた配列である。一態様では、アミノ酸配列Ａにおいて、配列番号１、２、３、４、５または６に示すアミノ酸配列を基準として、１１９位に対応する位置のアミノ酸残基が置換されている。
　本発明において、「対応する位置のアミノ酸残基」は、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）配列解析ソフトウェアを使用し、基準とするアミノ酸配列（具体的には、配列番号１～６に示すアミノ酸配列。以下「基準配列」とも称する。）と、対比するアミノ酸配列（具体的には、アミノ酸配列Ａ）とを整列させたとき、基準配列における特定位置と相対する位置のアミノ酸残基のことを指す。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列（ヒトＣｈｉｔｉｎａｓｅ－１－ＣａｔＤ野生型）と、ブタ由来のＣｈｉｔｉｎａｓｅ－１－ＣａｔＤのアミノ酸配列（配列番号８のアミノ酸配列（図８Ａ）。配列番号１に示すアミノ酸配列と８０．９％の配列同一性を有する）とを、ＢＬＡＳＴ配列解析ソフトウェアを使用して整列させたときのアラインメント結果を図８Ｂに示す。図８Ｂに示すとおり、ブタ由来のＣｈｉｔｉｎａｓｅ－１－ＣａｔＤのアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列の１１９位（配列番号１ではグルタミン酸残基）に対応する位置のアミノ酸残基は、１１９位のグルタミン酸残基である。
　好ましい態様において、本発明にかかるポリペプチドは、アミノ酸配列Ａにおいて、配列番号１、２、３、４、５または６に示すアミノ酸配列を基準として、１１９位に対応する位置のアミノ酸残基が、適宜異なるアミノ酸で置換されている。
　アミノ酸配列Ａは、キチン分解活性に関わる保存された触媒「ＤＸＤＸＥ」モチーフ（配列番号７）を含む。一態様において、アミノ酸配列Ａは、当該触媒「ＤＸＤＸＥ」モチーフにおけるグルタミン酸（Ｅ）が異なるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む。すなわち、アミノ酸配列Ａは、配列番号７に示すアミノ酸配列（ＤＸＤＸＥ）におけるグルタミン酸（Ｅ）が変異した配列を含む。例えば、アミノ酸配列Ａは、触媒「ＤＸＤＸＥ」モチーフにおけるグルタミン酸（Ｅ）が、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはバリン（Ｖ）に置換されたアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸配列Ａは、触媒「ＤＸＤＸＥ」モチーフにおけるグルタミン酸（Ｅ）が、グルタミン（Ｑ）に置換されたアミノ酸配列を含む。一態様において、配列番号７に示すアミノ酸配列（ＤＸＤＸＥ）におけるＥは、アミノ酸配列Ａにおいて１１９位の残基である。
　上記のようなアミノ酸配列を有することにより、本発明にかかるポリペプチドは、キチン分解活性を示さない一方で、キチン結合活性を有する。キチン分解活性の非存在は、天然のアミノ酸配列に対する改変に起因するものであっても、アミノ酸配列の改変によらないものであってもよい。すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、野生型のアミノ酸配列にて本来、キチン分解活性を有さないものであってもよい。以下、本発明にかかるポリペプチドを「キチン結合ポリペプチド」または「キチン結合タンパク質」とも称する。
　本発明にかかるポリペプチドは、キチン中の、４以上のβ－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミンを含む領域に特異的に結合する。
　本発明にかかるポリペプチドは、例えば、Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）法でエチレングリコールキチンに対する親和性を測定した時に、１．０×１０－６Ｍ以下、１．０×１０－７Ｍ以下、１．０×１０－８Ｍ以下または１．０×１０－９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でエチレングリコールキチンに結合する。
　好ましい態様において、キチンは、４以上のβ－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミンから構成されるポリ－β－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミンである。キチンは、より好ましくは５以上のβ－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミン、さらにより好ましくは６以上のβ－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミンから構成される。
　本発明の別の側面は、先述のポリペプチドをコードする塩基配列が導入された組換え微生物または細胞である。ここで、細胞とは、細胞工学的手法において広く一般に使用される細胞株を示し、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および昆虫細胞などである。
　本発明の範囲には、本発明のキチン結合ポリペプチドを利用したキチンの検出も包含される。すなわち、本発明の第２の側面は、キチンの検出方法であって、以下の工程：
　（ｉ）キチンを含む試験検体と、試薬とを接触させて、前記試験検体と前記試薬とによって形成された生成物を得る工程、および
　（ｉｉ）前記工程（ｉ）で形成された前記生成物を検出する工程
を含み、
　前記試薬は、本発明のキチン結合ポリペプチドとレポーター分子とを含む検出方法に関する。
　本明細書において、「検出」の語は、「定量」の概念をも包含するものとする。具体的には、キチンの検出方法は、試験検体中に含まれるキチンの量を測定する方法であってもよい。
　本明細書における「定量」では、様々な量のキチンを含む標準品と、本発明によるキチン結合ポリペプチドとレポーター分子とを含む検出方法におけるレポーター分子に依存して生じた指標の度合いから、未知検体に含まれるキチン量を標準品重量に換算することによって求めることが出来る。その他、あらかじめキチン量とレポーター分子に依存して生じた指標の度合いの相関を決定し、未知検体から誘導されるレポーター分子に依存して生じた指標の度合いから未知検体に含まれるキチン量を測定することもできる。
　工程（ｉ）では、試験検体と試薬とを接触させる。試験検体は、未精製の、精製された、または粗精製されたキチンを含むものであってよい。キチンおよびキチンを含む試験検体は、水に対して可溶性であっても、不溶性であってもよい。
　試験検体に含まれるキチンの由来は特に限定されず、例えば、キノコなど担子菌類、細菌類、酵母、藻類、植物などの細胞壁、抽出物、菌体外に分泌されたキチンであってよい。また、試験検体に含まれるのは、動物の構成物もしくは抽出物としてのキチン、または動物の体外に分泌されたキチンであってよい。さらには、室内、土壌、河川、海水、大気中、宇宙空間等環境中に存在するキチンであってもよい。
　前記動物には、例えば、節足動物、軟体動物、刺胞動物、棘皮動物、扁形動物および脊椎動物などが含まれる。節足動物には、例えば、六脚類、甲殻類、鋏角類および多足類が含まれる。節足動物の具体例としては、ダニ、ゴキブリ、エビ、カニ、サソリ、ムカデ、ハエ、ハチおよびチョウなどが挙げられる。節足動物以外の動物の具体例としては、貝類、クラゲ、イカ、寄生虫（サナダムシ、アニサキスなど）およびプランクトンが挙げられる。ここで、キチンの由来動物として挙げた例は、例示に過ぎず、これらに限定することを意図するものではない。
　試薬は、本発明のキチン結合ポリペプチドとレポーター分子とを含む。
　レポーター分子は、検出するための指標を呈する機能を有する。ここで、レポーター分子の機能とは、視覚的に観察される、電気的に検出される、またはその他の手段によって記録される、検出可能なシグナルを、直接的または間接的にもたらすことを示し、具体的に、例えば、発光、放射線、発色、凝集、磁気および電気的特性の変化が挙げられる。発光としては、蛍光およびりん光が挙げられるが、代表的には蛍光発光が検出に利用される。レポーター分子が発光を呈する場合、当該分子としては、例えば、蛍光色素、発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質など）および分子の発光反応を触媒するタンパク質が挙げられる。レポーター分子が放射線を呈する場合、当該分子としては、例えば、放射性同位体が挙げられる。レポーター分子が発色を呈する場合、当該分子としては、例えば、発色染料、あるいは発色によりシグナルを増幅することができる酵素類（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼなど）が挙げられる。その他、着色された高分子量コロイド物質、例えばラテックスビーズなどの微粒子物質、磁気性、常磁性のビーズ類も利用することができる。さらに、これらはバイオセンサーとの相互作用によってシグナルを増幅させる方法との組み合わせに用いることもできる。
　好ましい一態様において、レポーター分子は、第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とを含む。第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とは、一対となることによって活性型レポーター分子を形成可能である。ここで、「一対となる」とは、第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とが、互いに近接または結合して、対を形成することを意味する。
　具体的には、第１および第２のスプリットレポーター分子は、それぞれが離れて存在する状態では、レポーター分子としての機能を示さないが、これらのスプリットレポーター分子が互いに近接または結合すると、レポーター分子としての機能を示すようになる。スプリットレポーター分子の構造は具体的には限定されず、第１および第２のスプリットレポーター分子が、互いに近接または結合した場合に、形成された活性型レポーター分子を識別可能であればよい。
　一態様において、スプリットレポーター分子は、第１および第２のスプリットレポーター分子が近接または結合した場合に、構造的相補性が促進されて活性型レポーター分子が形成されるように構成されていてもよい。
　好ましい一態様において、レポーター分子は、レポータータンパク質である。
　スプリットレポーター分子がスプリットレポータータンパク質である場合の構成について以下に説明する。例えば、スプリットレポータータンパク質が第１のスプリットレポータータンパク質および第２のスプリットレポータータンパク質を含む場合、第１のスプリットレポータータンパク質と第２のスプリットレポータータンパク質とが近接または結合した場合に、生物発光共鳴エネルギー移動（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＢＲＥＴ）または蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）が生じるように構成されていてもよい。この場合、活性型レポータータンパク質と、第１および第２のスプリットレポータータンパク質が近接または結合してＢＲＥＴまたはＦＲＥＴを生じる状態になったものをいう。レポータータンパク質がＢＲＥＴまたはＦＲＥＴを生じるものである場合、スプリットレポータータンパク質の一方または他方に蛍光物質を結合させる構成としてもよい。
　さらに、スプリットレポータータンパク質は、第１および第２のスプリットレポータータンパク質が近接または結合した場合に、プロテインスプライシングにより活性型のレポータータンパク質が形成されるように構成されていてもよい。これは、第１および第２のスプリットレポータータンパク質のそれぞれに、プロテインスプライシングドメインを融合させておくことにより実現することができる。プロテインスプライシングドメインとしては、例えば、シネコシスティスｓｐ．のＤｎａＥ遺伝子由来のプロテインスプライシングドメインである、ＤｎａＥｎおよびＤｎａＥｃとの組み合わせなどを例示することができる。
　レポータータンパク質の具体例としては、例えば、酵素および蛍光タンパク質が挙げられる。酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、インベルターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼ、ならびに、これらの酵素の改変体を例示することができる。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｏｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）およびＧＦＰの改変体を例示することができる。
　好ましい一態様において、試薬は、
　（１）本発明のキチン結合ポリペプチドから選択される第１のポリペプチドと第１のスプリットレポーター分子とを含む第１の融合タンパク質、および
　（２）本発明のキチン結合ポリペプチドから選択される第２のポリペプチドと第２のスプリットレポーター分子とを含む第２の融合タンパク質
を含み、
　第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とが一対となることによって活性型レポーター分子を形成可能であり、
　工程（ｉ）において、キチンと、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質とが結合することで、第１のスプリットレポーター分子および第２のスプリットレポーター分子により活性型レポーター分子が形成され、
　工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）で形成された活性型レポーター分子を検出する。
　レポーター分子が、第１のスプリットレポータータンパク質と第２のスプリットレポータータンパク質とを含むレポータータンパク質である態様において、試薬は、
　（１）本発明のキチン結合ポリペプチドから選択される第１のポリぺプチドと第１のスプリットレポータータンパク質とを含む第１の融合タンパク質、および
　（２）本発明のキチン結合ポリペプチドから選択される第２のポリぺプチドと前記第２のスプリットレポータータンパク質とを含む第２の融合タンパク質
を含む。
　この場合、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質において、キチン結合ポリペプチドとスプリットレポータータンパク質とを融合させる際に、立体障害を回避するために適切に長さを調節したリンカーペプチドを挿入することが好ましい。リンカーペプチドとしては、１残基～約２０残基のペプチドからなり、そのアミノ酸配列としては、融合タンパク質の作製の際に使用される一般的なリンカーのアミノ酸配列と同様のものを例示することができる。具体的には、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む繰り返し配列からなるＧＳリンカー、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓの繰り返し配列からなるＤＤＡＫＫリンカーおよびＧｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓの繰り返し配列からなるＥＡＡＡＫリンカーが挙げられる。また、第１および第２の融合タンパク質において、スプリットレポータータンパク質を融合する領域は、Ｎ末端側またはＣ末端側のどちらか一方を限定するものではなく、キチン結合ポリペプチドの特性に合わせて融合する領域を決定することが好ましい。また、Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に融合した融合タンパク質で
あってもよい。
　本明細書において、スプリットレポーター分子および本発明のキチン結合ポリペプチドに関し、「融合した」とは、スプリットレポーター分子が、本発明のキチン結合ポリペプチドに直接的に連結する態様に加え、スプリットレポーター分子が、別の分子を介して、本発明のキチン結合ポリペプチドに関節的に連結する態様も包含するものとする。
　さらに、本発明のキチン結合ポリペプチドを検出する抗体（例えばＨｉｓタグ抗体）にスプリットレポーター分子を結合させて融合タンパク質を用いることもできる。この場合、スプリットレポーター分子としては、例えばルシフェラーゼが挙げられる。
　一態様において、
　・第１の融合タンパク質は、第１のポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に第１のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であり、
　・第２の融合タンパク質は、第２のポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に第２のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質である。
　別の一態様において、
　・第１の融合タンパク質は、第１のポリペプチドのＮ末端側に第１のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であり、かつ、第２の融合タンパク質は、第２のポリペプチドのＣ末端側に第２のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であるか、
または、
　・第１の融合タンパク質は、第１のポリペプチドのＣ末端側に第１のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であり、かつ、第２の融合タンパク質は、第２のポリペプチドのＮ末端側に第２のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であってよい。
　さらに別の一態様において、
　・第１の融合タンパク質は、第１のポリペプチドのＮ末端側およびＣ末端側に第１のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であり、および／または、
　・第２の融合タンパク質は、第２のポリペプチドのＮ末端側およびＣ末端側に第２のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質である。
　工程（ｉ）では、キチンと、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質とが結合することで、第１のスプリットレポーター分子および第２のスプリットレポーター分子により活性型レポーター分子が形成され、後続の工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）で形成された前記活性型レポーター分子を検出する。
　工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）で形成された生成物を検出する。レポーター分子がレポータータンパク質である場合は、形成された活性型レポータータンパク質の活性を検出する。例えば、形成された活性型レポータータンパク質の活性がキチンの非存在下と比較して高い場合は、試験検体中にキチンが存在していることを示す。レポーター分子が蛍光物質である場合は、形成された活性型レポーター分子を励起光照射し、放出される蛍光を検出する。例えば、蛍光物質から放出される蛍光がキチンの非存在下と比較して高い場合は、試験検体中にキチンが存在していることを示す。
　実施例において後述するように、対象となる構造を持つキチンの非存在下において観測される非活性化レポータータンパク質の活性（バックグラウンド）とキチンの存在下で再構成されるレポータータンパク質の活性の差は約３００倍と高感度を示す。
　工程（ｉｉ）における検出には、検出手段は、特に限定されず、レポーター分子の種類および構造に応じて、公知の手法または装置を適宜選択することができる。検出手法および検出装置としては、例えば、発光光度計、分光高度計、蛍光光度計、フローサイトメーター、マルチプレックス、クロマトグラフィーおよびＣＣＤカメラ等により検出した画像をコンピューターで定量解析する方法および物理的な接触をセンサーチップで識別して定量解析する方法が挙げられる。
　工程（ｉ）および（ｉｉ）では、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を含む試薬を、試験検体を含む試験管内に直接供給して実施することもできるし、これらの融合タンパク質を発現した細胞等を用いて実施することもできる。この場合、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質の発現は一過性の発現であってもよいし、恒常性の発現であってもよい。すなわち、第１および第２の融合タンパク質の安定発現細胞株を用いることができる。
　具体的には、第１および第２の融合タンパク質は、例えば、大腸菌、酵母、植物、動物細胞および無細胞発現系で産生されたものを例示することができ、特に大腸菌で大量に産生されるものが好ましい。また、第１および第２の融合タンパク質を発現する細胞の破砕液など粗精製の溶液を用いても良いが、一般的な低分子量のペプチドタグを融合し、カラム精製などによって高純度に精製された融合タンパク質を用いることが好ましい。この場合、ペプチドタグとしては、ＧＳＴタグ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａタグ、抗体Ｆｃ領域、ポリヒスチジンタグ、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＳＢＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｓｔｒｅｐタグ等を例示することができる。また、ここで使用される細胞としては、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞等を例示することができ、樹立された細胞株が使いやすく好ましい。
　本発明の第３の側面は、キチンを検出するための検出キットに関し、
　当該キットは、試薬を含み、
　当該試薬は、本発明のキチン結合ポリペプチドとレポーター分子とを含む。
　検出キットにおける、試薬、融合タンパク質およびレポーター分子の詳細については、検出方法について説明したのと同様である。
　本発明に従うペプチドは、キチンに対する改善した結合特異性および結合活性を有するため、キチンを効率よく、かつ、簡便に検出することができる。また、当該ペプチドは、キチンの精製純度および可溶性／不溶性といった性状に関わらず、キチンを検出することが可能である。
　本発明に従うキチンの検出方法によれば、煩雑な洗浄操作等を要することなく、ハイスループットで試験検体中に含まれるキチンを検出および／または定量することができる。本発明のキチン検出方法を応用することにより、様々な生物種および精製方法に由来し、かつ、可溶性／不溶性の溶解性、ゲル状および粒子状等の様々な形態を示すキチンをスクリーニングできることが期待される。また、本発明の検出方法は、試験検体の洗浄工程等が不要であり、効率よくキチンを検出および／または定量することができる。
　また、本発明に従うキチンの検出方法またはキチンの検出キットによれば、生活環境におけるアレルギー誘発リスクを可視化することが可能である。すなわち、生活環境中のキチンを検出および／または定量することにより、キチンによるアレルギーの発症リスクを予測することができる。
　さらには、本発明に従うペプチドをＥＬＩＳＡ等の分析手法に応用することにより、キチンを簡便に検出するツールを提供することができる。また、本発明に従うキチンの検出方法またはキチンの検出キットによって、被験体の血液、分泌液、臓器、器官、臓器もしくは器官を洗浄して得られる洗浄液（例えば、肺胞洗浄液、口内洗浄液および腹腔内洗浄液）または尿に含まれるキチンの濃度を定量することで、真菌症、細菌症および寄生虫症などの感染症発症の可能性およびアレルギーの発症の可能性を予測すること、ならびに、感染症およびアレルギーの発症前、発症時および寛解後の体内の状態を観察することが可能になると期待される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
　＜１＞材料および方法
　（１）材料
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４－ニトロフェニルＮ，Ｎ’－ジアセチル－β－Ｄ－キトビオシド［４－ＮＰ－（ＧｌｃＮＡｃ）２］およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来細胞壁多糖であるザイモサンＡ、マンナン（α－１，６－／α－１，２－マンナン、α－１，３－マンナン）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。キチン、エチレングリコールキチン（ＥＧＣ）、セルロース粉末（β－１，４－Ｄ－グルカン）、カードラン（β－１，３－Ｄ－グルカン）、デキストラン（α－１，４－／α－１，６－グルカン）、ヒアルロナン、ヘパリンおよびダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）は、富士フイルム和光純薬株式会社から入手した。プスツラン（β－１，６－Ｄ－グルカン）は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入した。ＧｌｃＮＡｃ単量体とＧｌｃＮＡｃ２量体、３量体、４量体、５量体、６量体およびエンド－β－１，３－グルカナーゼ（ｚｙｍｏｌｙａｓｅ　１００Ｔ）は、生化学工業株式会社より購入した。Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（＞９８．０％）およびトウモロコシ芯由来キシランは、東京化学工業株式会社から購入した。Ｈｉｓタグ組換えヒトデクチン－１は、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。高脱アセチル化キトサンＤＡＣ－１００［脱アセチル化度（ＤＡＣ）：各ロットにつき、８９．９％および９７．４％。コロイド滴定法を用いて決定］は、甲陽ケミカル株式会社から提供された。
　（２）プラスミド構築
ヒトキトトリオシダーゼ－１（Ｃｈｉｔ１、Ｕｎｉｐｏｒｔ：Ｑ１３２３１、ＥＣ：３．２．１．１４）の最小キチン結合領域（ＣＢＤ４９）（参考文献１）としてのＣ末端４９アミノ酸（Ｔｈｒ４１８～Ａｓｎ４６６）をコードするＤＮＡおよびＧｌｕ１４０（配列番号１に示すアミノ酸配列の１１９位に相当）上の点突然変異を有するＣａｔＤ（Ａｌａ２２～Ｐｒｏ３８８）をコードするＤＮＡ（ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ）を、ｐＣｏｌｄ　Ｉ　ＤＮＡベクター（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社）にクローニングした。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ　ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ由来ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＮａｎｏＬｕｃ）のＮ末端サブユニット（ＬｇＢｉＴ、１８ｋＤａ）またはＮａｎｏＬｕｃのＣ末端領域の１１アミノ酸残基（ＬｇＢｉＴに低親和結合性を有するＳｍＢｉＴタグ、またはＬｇＢｉＴに高親和結合性を有するその改変ＨｉＢｉＴタグ）をコードするＤＮＡ断片を、ＣＢＤ４９およびＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱのＣ末端またはＮ末端に、ＧＳリンカーペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列）と共に挿入した。また、８残基ペプチド配列（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ）、Ｓｅｒ－Ａｌａ残基から成るｓｔｒｅｐ－ｔａｇ　ＩＩ（ＳＴ－ＩＩ）（参考文献２）のＤＮＡ配列をＧＳリンカー配列と共にＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱのＮ末端に挿入したものを作製した。ＣＢＤ４９誘導体およびＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ誘導体に用いられたＤＮＡ断片の大部分は、大腸菌用にコドン最適化して合成した。マウス酸性哺乳類キチナーゼ（Ｍｕｒｉｎｅ　ａｃｉｄｉｃ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ；ＡＭＣａｓｅ）をコードする遺伝子（Ｃｈｉａ、Ｔｙｒ２２～Ｐｒｏ４７３）も、ｐＣｏｌｄ　Ｉベクターにクローニングした。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ由来のエンドβ－１，６－グルカナーゼ（Ｎｅｇ１）の発現ベクターも作成し（参考文献３）、本試験のためにＨｉＢｉＴ融合Ｎｅｇ１－Ｅ３２１Ｑを設計した。すべてのタンパク質発現プラスミドベクターを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、増殖させプラスミドベクターを精製した。
　（３）タンパク質の調製
　発現ベクターは、タンパク質発現用大腸菌に形質転換し、細胞をアンピシリン添加ＬＢ培地中、３７℃で培養した。前培養後、１５℃に冷却して２４～４８時間培養することにより、組換えタンパク質の発現を誘導した。洗浄後、プロテアーゼ阻害剤を添加した細胞懸濁液を氷上で超音波処理した。遠心分離により集めた可溶性画分を、Ｈｉｓタグタンパク質精製用のコバルトカラム（タカラバイオ社）に結合させ、イミダゾール（１５ｍＭ）を含むＰＢＳで洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、イミダゾール（１５０ｍＭ）を含むＰＢＳで溶出し、透析してイミダゾールを除去した。タンパク質濃度は市販のキット(Ｂｒａｄｆｏｒｄ法)を用いて測定した。組換えタンパク質の発現は、市販のキットを用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を行った。分離したタンパク質は銀染色ＩＩキット(富士フイルム和光純薬株式会社）またはＣＢＢ色素（クイックブルー染色液；バイオダイナミクス研究所）を用いて染色した。ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑのアミノ酸配列を配列番号９に示す（図９）。
　（４）キチン染色および蛍光顕微鏡
　キチンまたはカードラン（１ｍｇ／ｍｌ、１０μＬ）を、Ｈｉｓタグ融合グルカン結合タンパク質０．５μｇ（ＣＢＤ４９、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴ及びヒトｄｅｃｔｉｎ－１）と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。非結合タンパク質を洗浄し、さらにＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（ＭＢＬ社）を加えて４℃でインキュベートした。洗浄後、ＥＶＯＳ　ＦＬ　Ｃｅｌｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて撮像した。
　（５）ルシフェラーゼ断片相補性アッセイ
　ＮａｎｏＬｕｃ断片融合キチン結合プローブ（２００ｎＭ）の混合溶液（５μＬ）を、９６ウェル白色プレート中の試験試料（１０μＬ）に加え、振盪条件下で３０分間インキュベートした。ＣＢＤ４９－ＬｇＢｉＴとＣＢＤ４９－ＳｍＢｉＴとの組み合わせ、または、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＬｇＢｉＴとＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＳｍＢｉＴとの組合せを用いて、キチンの構造を解析した。振盪後、フリマジン基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１５μＬをウェルに添加し、ＧｌｏＭａｘルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、再構成ＮａｎｏＬｕｃからの発光シグナルを測定した。
　（６）キチン分解活性の測定
　キチン分解活性は、合成発色基質、４－ＮＰ－（ＧｌｃＮＡｃ）2を用いて測定した。ｐＨ５．０のＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝剤中の基質（２００μＭ）は、キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴまたは大腸菌で発現させたマウスキトトリオシダーゼ（ｍＣｈｉｔ１）と混合し（各１６０ｎｇ／ｍＬ）、３７℃で３０分～６０分間インキュベートした。放出された４－ＮＰを、４０５ｎｍにてマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ４５０；コロナ社）を用いて検出した。
　（７）キチンビーズ結合アッセイ
　磁気キチンビーズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）を洗浄し、ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＢＰＢＳＴ）に懸濁した。磁気キチンビーズとＨｉＢｉＴ－ｔａｇ融合ＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱまたはＮｅｇ１－Ｅ３２１Ｑ（０～２００ｎＭ、２５μＬ）を９６ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－ｏｎｅ社）内で混合し、５分間インキュベートした。プレートは、磁気プレートキャリア付き洗浄器（ＴＥＣＡＮ社）を用いて洗浄した。各タンパク質の結合能を評価するために、キチンビーズ結合タンパク質からのＨｉＢｉＴタグ由来シグナルを、２５μＬのＬｇＢｉＴと基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ　ＨｉＢｉＴ　ＬｙｔｉｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ；　Ｐｒｏｍｅｇａ社）混合液を添加することによって検出し、マイクロプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ）を用いて再構成されたルシフェラーゼ活性を測定した。
　（８）真菌試料および節足動物試料の調製
　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ＮＢＲＣ　１３８５（ＮＩＴＥ生物資源センター、日本）をＹＰＤ寒天平板上に播種し、酵母コロニーを１０7細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に懸濁した。懸濁液の半分を９０℃で１０分間加熱し、熱殺菌したカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＨＫＣＡ）として用いた。１０μＬの生細胞（ＬｉｖｅＣＡ）とＨＫＣＡ懸濁液を、キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイに利用した。節足動物試験試料について、コナヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ　ｆａｒｉｎａｅ）およびヤケヒョウヒダニ（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）の凍結体、または、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ　ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（Ｂｉｏｓｔｉｒ社）の凍結乾燥粉末をＰＢＳに懸濁し（４ｍｇ／ｍＬ）、金属ビーズを加えてビーズ破砕機（ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４；ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）で２０秒間処理した。コナヒョウヒダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）、ヤケヒョウヒダニ（Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）およびチャバネゴキブリ（Ｂ．ｇｅｒｍａｎｉｃａ）破砕溶液を１０分間煮沸し、キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイに利用した。
　（９）キトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたＥＬＩＳＡ様試験
　ＥＧＣ固相化マイクロプレート（５０ｎｇ／ｍｌ）をＢＰＢＳＴでブロッキングし、ＧｌｃＮＡｃオリゴマー（モノマーからヘキサマー、２００μｍ）またはＥＧＣ（２００μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉｔ（５０ｎｇ／ｍｌ）にてインキュベートした。ＥＧＣ結合ＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱからのＨｉＢｉｔタグ由来のシグナルを検出するため、遊離ＬｇＢｉＴおよび基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ　ＨｉＴ　Ｌｙｔｉｃ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を洗浄プレートに添加し（２０～２５μＬ／ウェル）、マイクロプレートリーダ（ＧｌｏＭａｘ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。可溶性キチンを高感度に検出・定量する目的でサンドイッチＥＬＩＳＡ様試験を構築した。マイクロプレートをＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＳＴ－ＩＩ（２μｇ／ｍｌ）でコーティングし、ＢＰＢＳＴによりブロッキングした。洗浄後、３倍連続希釈したＥＧＣをプレートに添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴ（１μｇ／ｍｌ）を添加して1時間インキュベートした。十分な洗浄後、上記と同様にＨｉＢｉＴタグ由来のシグナルを測定した。
　（１０）Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）による結合親和性測定
　固定化ＥＧＣに対するキトトリオシダーゼ－ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの結合親和性を、ＢＬＩバイオセンサー（ＢＬＩｔｚシステム；Ｐａｌｌ　ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を用いて計算した。ビオチン化ＥＧＣ（５０μｇ／ｍＬ）をセンサーチップと１２０秒間反応させ、結合させた。２倍連続希釈したＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴ（４５ｋＤａ）とＥＧＣ結合センサーチップを反応させて、結合速度定数（ｋa）、解離速度定数（ｋd）および平衡解離定数（ＫD）を算出した。データはＢＬＩｔｚ　Ｐｒｏソフトウェア（Ｐａｌｌ　ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を用いて解析した。
　（１１）各種哺乳類キチナーゼ－ＣａｔＤ－改変体を用いたＥＬＩＳＡ様試験
　ＥＧＣ固相化マイクロプレート（０ｎｇ／ｍＬ，１２．５ｎｇ／ｍＬ，５０ｎｇ／ｍＬ，２００ｎｇ／ｍＬ（マウスＡＭＣａｓｅの改変体の場合）または０μｇ／ｍＬ，０．２５μｇ／ｍＬ，１，４μｇ／ｍＬ（その他の改変体の場合））をＢＰＢＳＴでブロッキングし、各種哺乳類キチナーゼＣａｔＤ－改変体－ＨｉＢｉｔ（２μｇ／ｍｌ）にてインキュベートした。ここで用いた各種哺乳類キチナーゼＣａｔＤ－改変体－ＨｉＢｉｔは、図７に示す各配列において、１１９番目のＧｌｕ（Ｅ）をＧｌｎ（Ｑ）に置換した改変体に、ＨｉＢｉｔタグを付加して作製したものである。ＥＧＣ結合ＣａｔＤ－改変体からのＨｉＢｉｔタグ由来のシグナルを検出するため、遊離ＬｇＢｉＴおよび基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ　ＨｉＴ　Ｌｙｔｉｃ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を洗浄プレートに添加し（２０～２５μＬ／ウェル）、マイクロプレートリーダ（ＧｌｏＭａｘ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
　＜２＞結果
　（１）キチン結合タンパク質融合ルシフェラーゼ断片相補性アッセイによるキチンの検出（図１）
　簡便かつ迅速なキチン検出システムを実証するべく、まずヒトＣｈｉｔ１のＣＢＤを用いた。Ｃｈｉｔ１の最後の４９個のＣ末端残基（ＣＢＤ４９）は、キチン結合タンパク質として証明されている（参考文献１および４）。６×Ｈｉｓタグ組換えＣＢＤ４９およびＮａｎｏＬｕｃ断片融合体は大腸菌で発現させることに成功し、精製したタンパク質のそれぞれについて予想される分子量の単一バンドが検出された（図１ＡおよびＢ）。リコンビナントＣＢＤ４９－Ｈｉｓは、不溶性のカニ殻キチンに結合活性を示し（図１Ｃ）、ルシフェラーゼ断片融合ＣＢＤ４９（ＣＢＤ４９－ＬｇＢｉＴおよびＣＢＤ４９－ＳｍＢｉＴ）は、キチンとともに存在する場合のみ、用量依存的に再活性化されたが、β－グルカン粒子（カードラン）の存在下では再活性化されなかった（図１Ｄ）。これらの結果から、キチンの簡便な検出法のコンセプトが実証された。しかし、ＣＢＤ４９を用いたアッセイでは十分なキチン検出感度を提供できなかった。
　（２）ヒトキトトリオシダーゼＣａｔＤ改変体の潜在的なキチン結合活性(図２)
　ルシフェラーゼ断片相補性アッセイのキチン検出感度を改善するため、ＧＨ１８キチナーゼ（参考文献５）に保存されたＤＸＤＸＥモチーフ上のＧｌｕ１４０をＧｌｎに置換し、不活性型キトトリオシダーゼＣａｔＤ（ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ）をコードするプラスミドを作製し、ＨｉＢｉＴ融合タンパク質として大腸菌で発現させた（図２Ａおよび２Ｂ）。ＣＢＤ領域を除去したＣａｔＤ（野生型）は、完全長Ｃｈｉｔ１と同様に、キチン分解活性を示すことが知られているが（参考文献６）、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ変異体は、合成発色性基質に対する糖分解活性を示さなかった（図２Ｃ）。
　次いで、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑのキチンに対する結合能が保存されているかどうかを評価した。ＨｉＢｉＴ融合ＣａｔＤ－Ｅ１４０ＱおよびＮｅｇ１－Ｅ３２１Ｑ（ネガティブコントロール）を、キチン磁気ビーズと混合したが、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑのみがキチンビーズに対して有意な結合活性を示した（図２Ｄ）。
　さらに、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの潜在的なキチン結合能およびその構造特異性も、蛍光顕微鏡観察から次の結果によって証明された：（ｉ）キチン粒子はＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑと直接結合するが、ネガティブコントロールとして使用したデクチン－１（主要なβ－１，３－グルカン受容体）とは結合しない、（ｉｉ）デクチン－１は、β－１，３－グルカン粒子（カードラン）に強く結合するが、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑはカードランと結合しない（図２Ｅ）。以上より、適切に改変されたＣａｔＤは、グリコヒドロラーゼ活性を有さない一方でキチン結合活性を保持しており、キチン認識プローブの新たな候補になることが示された。
　（３）キチン構造を検出・定量するためのスプリットＮａｎｏＬｕｃ融合ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ（図３）
　高感度な無洗浄キチン検出・定量法を確立すべく、ルシフェラーゼ断片相補性アッセイにＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを使用した。Ｃ端末側と融合したＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＳｍＢｉＴは、ＨｉＢｉＴ融合の場合のように、大腸菌で発現させることに成功した（図３Ａおよび３Ｂ）。一方、ＬｇＢｉＴをＣａｔＤのＣ端末に融合した場合、大腸菌による発現効率は低かった。そこで、ＬｇＢｉＴのＣａｔＤのＮ末端への融合を設計したところ、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＬｇＢｉＴを得ることが出来た（図３Ａおよび図３Ｂ）。
　ＣａｔＤ誘導体を用いたルシフェラーゼ断片相補性アッセイでは、キチンビーズ（リガンド）またはいずれかのタンパク質が存在しない場合には、バックグラウンドが低く、両方のタンパク質、リガンドおよび基質のいずれもが存在する場合にのみ、強いルシフェラーゼシグナルが観察された（図３Ｃ）。
　次いで、市販のキチン粒子試薬に対する反応性を、ＣＢＤ４９－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイとＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイとで比較した。いずれの方法においても、リガンドであるキチンの存在下にて、バックグラウンド（ブランク）と比較して、ルシフェラーゼシグナルの有意な増加が観察されたが、シグナル対ノイズ比は、ＣＢＤ４９－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイでは約７．７、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイでは約３４０であった（図３Ｄ）。これらの結果は、改変型ＣａｔＤを使用することにより、感度が大幅に改善したことを示している。
　（４）ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイのリガンド認識における構造特異性（図４）
　ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイのリガンド認識における構造特異性について、市販の試薬を用いて検証した。ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑは、不溶性（カニ殻キチン）および可溶性（ＥＧＣ）の両形態のキチン構造、または、酵母粗精製粒子（ザイモサンＡ）のキチン構造に反応したが、ＧｌｃＮＡｃモノマー、セルロース、カードラン、プスツラン、マンナン、キシラン、デキストラン、ヒアルロナンおよびヘパリンのようなキチン構造を含まないとされる他の試薬には反応しなかった（図４）。この結果より、改変前のＣａｔＤの持つ厳密な基質特異性が、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑに継承されていることを証明した。
　（５）ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイを用いた天然物中のキチン構造の検出（図５）
　次に、生きたカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＬｉｖｅＣＡ）または加熱殺菌したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＨＫＣＡ）の細胞表面上のキチンを、直接検出できるかどうか試験した。ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイは、ＬｉｖｅＣＡおよびＨＫＣＡの両方に対して、細胞濃度依存的にルシフェラーゼ活性を有意に増加させた（図５Ａ）。
　続いて、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイが細胞壁表面上の各多糖構造の位置関係を評価するツールとして利用できるか評価した。ＨＫＣＡ細胞壁上の多糖を糖質分解酵素で分解し、細胞壁に生じる構造変化をＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイを用いて、リアルタイムに解析した。細胞壁キチン上で再構築されたルシフェラーゼ活性を検出する際、基質にエンド－β－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（組換えｍｕｒｉｎｅＡＭＣａｓｅ）を加えた場合、発光シグナルは、対照（ＰＢＳ）に比べて時間の経過とともに減少し、表面キチン構造の損失を示した（図５Ｂ）。一方、β－１，３－またはβ－１，６－グルカナーゼの存在下では、発光シグナルは時間依存的に増加した。特に、発光シグナルはβ－１，３－グルカナーゼ処理により大きく増加し、キチンが、β－１，３－グルカンによって高度に覆われていることを示した。
　また、主要な２種類のダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅおよびＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）の虫体ならびにチャバネゴキブリ（Ｂ．ｇｅｒｍａｎｉｃａ）粉体に含まれるキチンを直接検出することが可能か検証した。その結果、検体の濃度依存的に発光強度が増加したことから、これらの天然検体中の微量キチンにおいても、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイ由来の発光シグナルが検出できることを確認した（図５Ｃ）。
　（６）ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑのキチンへの分子構造依存性結合およびサイズ依存性結合（図６）
　ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの結合性をさらに理解するために、（ｉ）類似のキトサン構造との交差反応性の有無、（ｉｉ）ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑとの結合に必要なＧｌｃＮＡｃユニット数、および、（ｉｉｉ）結合親和性の強さについて調べた。天然物は、キチン構造とキトサン構造との両方を含むことがあるため、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑが、キチンとキトサンとを明確に区別することができるかどうかを評価した。この試験のために、高度に脱アセチル化したキトサン（ＤＡＣ　８９．９％および９７．４％、コロイド滴定法）を入手し、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ルシフェラーゼ断片相補性アッセイのキチンまたはキトサンに対する反応性を比較した。
　図６Ａに示すように、キトサン（ＤＡＣ　８９．９％）に対するＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの反応性は、キチンへの反応性と比べ、大幅に低下し、キトサン（ＤＡＣ　９７．４％）ではほとんど消滅した。次に、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの結合に必要な最小ＧｌｃＮＡｃ単位を明らかにするため、ＥＧＣ固相化マイクロプレートを用いた競合ＥＬＩＳＡを実施した。固相ＥＧＣとＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴとの相互作用は、４量体以上のＧｌｃＮＡｃユニットおよび可溶性ＥＧＣによって有意に抑制された（図６Ｂ）。
　続いて、ＢＬＩを用いてバイオセンサー上に結合したＥＧＣに対するＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＨｉＢｉＴの結合力（ＫＤ値）を算出した。計算により得られた親和性（ＫＤ：９．９×１０-8 Ｍ）は、一般的な抗体と同等レベルの値を示した（図６Ｃ）。ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑが予想よりも強いＫＤ値を示したため、最後に、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを構築することで、検出・定量可能な微量キチンの濃度を求めた。
　ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑ－ＳＴ－ＩＩコート済みマイクロプレートおよびＨｉＢｉＴ融合ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑを用いてサンドイッチ－ＥＬＩＳＡを確立し、２．７～２，０００ｐｇ／ｍｌのＥＧＣ濃度に対する反応曲線を得た（図６Ｄ）。この反応曲線から算出された定量限界は１３．６ｐｇ／ｍＬであった。これらの結果から、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑは、キトサン、ＧｌｃＮＡｃ１量体～３量体に結合しないこと、ならびに、ピコグラムレベルの可溶性キチンが、ＣａｔＤ－Ｅ１４０Ｑの高い結合親和性により、サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出できることが実証された。
　（７）各種哺乳類キチナーゼ－ＣａｔＤ－改変体のキチン結合活性
　上記（１１）のＥＬＩＳＡ様試験から、各種哺乳類キチナーゼ－ＣａｔＤ－改変体のキチン結合活性が示された（図１０Ａ～１０Ｄ）。
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Claims (16)

  1. 　（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示すアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列Ａからなり、
    　（ｂ）キチン結合活性を有するが、キチン分解活性を示さない、ポリペプチド。
  2. 　前記アミノ酸配列Ａにおいて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示すアミノ酸配列を基準として、１１９位に対応する位置のアミノ酸が置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　前記アミノ酸配列Ａが、配列番号７に示すアミノ酸配列（ＤＸＤＸＥ）におけるＥが置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 　哺乳類に由来する、請求項１または２に記載の組換えポリペプチド。
  5. 　ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マウス、ラット、イヌまたはネコに由来する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  6. 　１．０×１０－６Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でエチレングリコールキチンに結合する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  7. 　前記キチンが、４以上のβ－１,４－Ｎ－アセチルグルコサミンを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  8. 　キチンの検出方法であって、以下の工程：
    　（ｉ）キチンを含む試験検体と、試薬とを接触させて、前記試験検体と前記試薬とによって形成された生成物を得る工程、および
    　（ｉｉ）前記工程（ｉ）で形成された前記生成物を検出する工程
    を含み、
    　前記試薬は、請求項１または２に記載のポリペプチドとレポーター分子とを含む、検出方法。
  9. 　前記レポーター分子が、第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とを含み、
    　前記試薬が、
    　（１）請求項１に記載の第１のポリペプチドと前記第１のスプリットレポーター分子とを含む第１の融合タンパク質、および
    　（２）請求項１に記載の第２のポリペプチドと前記第２のスプリットレポーター分子とを含む第２の融合タンパク質
    を含み、
    　前記第１のスプリットレポーター分子と前記第２のスプリットレポーター分子とが一対となることによって活性型レポーター分子を形成可能であり、
    　前記工程（ｉ）において、前記キチンと、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質とが結合することで、前記第１のスプリットレポーター分子および前記第２のスプリットレポーター分子により前記活性型レポーター分子が形成され、
    　前記工程（ｉｉ）において、前記工程（ｉ）で形成された前記活性型レポーター分子を検出する、請求項８に記載の検出方法。
  10. 　前記第１の融合タンパク質は、前記第１のポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に前記第１のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質であり、
    　前記第２の融合タンパク質は、前記第２のポリペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に前記第２のスプリットレポーター分子が融合した融合タンパク質である、請求項９に記載の検出方法。
  11. 　前記レポーター分子が、タンパク質である、請求項８に記載の検出方法。
  12. 　前記試験検体が、水に対して可溶性または不溶性である、請求項８に記載の検出方法。
  13. 　キチンを検出するための検出キットであって、
    　前記キットは、試薬を含み、
    　前記試薬は、請求項１または２に記載のポリペプチドとレポーター分子とを含む、検出キット。
  14. 　前記レポーター分子が、第１のスプリットレポーター分子と第２のスプリットレポーター分子とを含み、
    　前記試薬が、
    　（１）請求項１に記載の第１のポリペプチドと前記第１のスプリットレポーター分子とを含む第１の融合タンパク質、および
    　（２）請求項１に記載の第２のポリペプチドと前記第２のスプリットレポーター分子とを含む第２の融合タンパク質
    を含み、
    　前記第１のスプリットレポーター分子と前記第２のスプリットレポーター分子とが一対となることで活性型レポーター分子を形成可能であり、
    　キチンと、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質とが結合することで、前記第１のスプリットレポーター分子および前記第２のスプリットレポーター分子により前記活性型レポーター分子が形成される、検出キット。
  15. 　前記レポーター分子が、タンパク質である、請求項１３に記載の検出キット。
  16. 　請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含む、組換え微生物または細胞。
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