CN115011621A

CN115011621A - 一种重组蛋白及荧光检测底物的方法

Info

Publication number: CN115011621A
Application number: CN202210743997.4A
Authority: CN
Inventors: 李丕武; 魏晓凤; 汪俊卿; 王瑞明; 苏静; 王婷; 张子洋; 杨翠平; 马俊
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2022-09-06

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白及荧光检测底物的方法，具体为一种融合蛋白eYFPa‑YeCBM32编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，一种融合蛋白YeCBM32‑eYFPb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；融合蛋白eYFPa‑YeCBM32和融合蛋白YeCBM32‑eYFPb在检测聚半乳糖醛酸或果胶中的应用；本发明提供的融合蛋白eYFPa‑YeCBM32和融合蛋白YeCBM32‑eYFPb，在具有果胶或聚半乳糖醛酸底物的反应体系中，能够使用酶标仪检测到荧光明显增强。

Description

一种重组蛋白及荧光检测底物的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种重组蛋白及荧光检测底物的方法。

背景技术

聚半乳糖醛酸(Poly galacturonic acid)是果胶的主要组成部分,果胶(pectin)是由半乳糖醛酸通过α-1，4糖苷键连接而成的多聚物，在植物的整个生长发育过程中具有十分重要的作用。由于果胶降解不完全能够形成不同聚合度的聚半乳糖醛酸，作为一种功能性聚糖对动植物具有生物活性，例如抑菌、促进生长发育、抗癌等。

碳水化合物结合结构域(Carbohydrate-binding modules，简称CBM)是与碳水化合物结合的非催化蛋白结构域，不具有催化活性但参与碳水化合物降解的多糖结合模块，已在微生物中得到充分研究。它能够特异性结合多糖，有效提高碳水化合物酶的催化效率，因其独特的结合特性也成为了研究蛋白质-碳水化合物作用机制的模型。荧光探针可针对特定的目标物质产生荧光信号，进而达到分析检测的目的。作为一种重要检测手段，荧光探针的应用范围非常广泛，涉及生物医学、生命科学以及环境等方面。接下来各领域的交流将会使其应用的领域更加广泛。

随着蛋白质组学、合成生物学和计算机模拟技术的快速发展，研究人员可以借助使用CBM融合来达到探针筛选的作用。此外，目前多数研究针对多样CBM融合碳水化合物酶，以此提高酶分子的催化活性、稳定性以及酶分子与底物的结合特异性，但是利用CBM与荧光蛋白融合作为探针检测底物的方法仍然较少。

中国专利文献CN113881616(申请号：202111185375.6)公开了一种细菌纤维素基生物传感器及其应用。该专利文献公开了一种细菌纤维素基生物传感器，包括细菌纤维素和表面展示纤维素结合结构域CBM的细胞，其中，纤维素结合结构域CBM为可特异性结合纤维素结晶区的纤维素结合结构域，细胞通过纤维素结合结构域CBM与细菌纤维素链接。并未涉及对果胶、聚半乳糖醛酸的检测。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组蛋白及荧光检测底物的方法。

发明人将基因YeCBM32的N端通过Linker(连接肽)添加eYFP基因的a段(氨基酸序列1-155)构建融合蛋白eYFPa-YeCBM32，YeCBM32的C端通过Linker(连接肽)添加eYFP基因的b段(氨基酸序列156-238)构建融合蛋白YeCBM32-eYFPb。本发明发现这两个融合蛋白eYFPa-YeCBM32、YeCBM32-eYFPb由于分别带有黄色荧光蛋白基因的a、b段，故而在与特异性底物果胶或聚半乳糖醛酸同时发生结合时，能够产生强烈荧光，而融合蛋白eYFPa-YeCBM32、融合蛋白YeCBM32-eYFPb不与底物结合时不产生明显荧光，根据荧光强度可以检测果胶或聚半乳糖醛酸。

本发明技术方案如下：

一种融合蛋白eYFPa-YeCBM32编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种融合蛋白eYFPa-YeCBM32的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种融合蛋白YeCBM32-eYFPb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种融合蛋白YeCBM32-eYFPb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种重组载体，包含上述融合蛋白eYFPa-YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQID NO.1所示。

一种重组载体，包含上述融合蛋白YeCBM32-eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQID NO.3所示。

一种重组菌，包含上述融合蛋白eYFPa-YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1所示。

一种重组菌，包含上述融合蛋白YeCBM32-eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQ IDNO.3所示。

一种含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)合成融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)中制得的融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-eYFPa-YeCBM32；

(3)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(2)制得的重组质粒pET-20b(+)-eYFPa-YeCBM32转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌。

一种含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

①合成融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

②将步骤①中制得的融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-YeCBM32-eYFPb；

③制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤②制得的重组质粒pET-20b(+)-YeCBM32-eYFPb转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌。

根据本发明优选的，上述步骤(3)或步骤③中筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。

上述方法构建的含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白eYFPa-YeCBM32中的应用。

上述方法构建的含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白YeCBM32-eYFPb中的应用。

上述融合蛋白eYFPa-YeCBM32和融合蛋白YeCBM32-eYFPb在检测聚半乳糖醛酸或果胶中的应用。

一种定性检测聚半乳糖醛酸或果胶的方法，包括如下步骤：

将融合蛋白eYFPa-YeCBM32、融合蛋白YeCBM32-eYFPb和待测样品混合反应，利用酶标仪检测；

荧光强度增强，则确定待测样品中含有聚半乳糖醛酸或果胶；荧光强度没有增强，则确定待测样品中不含聚半乳糖醛酸和果胶。

根据本发明优选的，融合蛋白eYFPa-YeCBM32由上述构建的含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌发酵生产；融合蛋白YeCBM32-eYFPb由上述含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌生产。

根据本发明优选的，上述方法中，反应条件为23-26℃，pH9.0-10.0。

进一步优选的，反应条件为25℃，pH9.5。

有益效果

1、本发明提供的含黄色荧光蛋白片段的融合蛋白eYFPa-YeCBM32和融合蛋白YeCBM32-eYFPb，在具有果胶或聚半乳糖醛酸底物的反应体系中，能够使用酶标仪检测到荧光明显增强，尤其是在25℃，pH9.5的反应条件下具有良好的荧光强度。

2、本发明提供的检测方法，具有反应体系小、检测时间短、底物特异性以及操作简便的优点，拓宽了果胶或聚半乳糖醛酸检测的方法途径，为开发新的酶活检测方法提供了理论依据。

附图说明

图1为实施例6中不同浓度底物体系的检测结果图。

图2为实施例6中时间对不同浓度底物的检测结果图。

图3为实施例6中不同温度检测结果图。

图4为实施例6中不同pH值检测结果图。

图5为实施例6中不同底物检测结果图；

图中：D1-3为空白对照，使用配制底物缓冲液做空白；

E1-3为0.2％果胶、E4-6为0.2％聚半乳糖醛酸、E7-9为0.2％葡聚糖；

E10-12为0.2％羧甲基纤维素钠、F1-3为0.2％木聚糖、F4-6为0.2％木质素

F7-9为0.2％微晶纤维素、F10-12为0.2％普鲁兰糖。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。

实施例1

融合蛋白eYFPa-YeCBM32的基因构建

在YeCBM32基因的N端通过连接肽(Linker)，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，连接黄色荧光蛋白基因的a片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，得到eYFPa-YeCBM32基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，融合蛋白eYFPa-YeCBM32的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将eYFPa-YeCBM32插入到载体pET20b(+)上，构建pET-20b(+)-eYFPa-YeCBM32质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。

融合蛋白YeCBM32-eYFPb的基因构建

在YeCBM32基因的C端通过连接肽(Linker)，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，连接黄色荧光蛋白基因的b片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，得到YeCBM32-eYFPb基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，融合蛋白YeCBM32-eYFPb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将YeCBM32-eYFPb插入到载体pET20b(+)上，构建pET-20b(+)-YeCBM32-eYFPb质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。

实施例2

制备大肠杆菌感受态

(i)挑取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)单菌落接种至LB培养基中，220r/min、37℃培养过夜；

(ii)吸取0.1mL菌液至10mL的LB培养基中，300r/min、37℃培养至OD₆₀₀达0.6～0.8；

(iii)吸取1mLOD₆₀₀达0.6～0.8的菌液至1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；

(iv)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。

(v)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。

实施例3

大肠杆菌工程菌的构建

将实施例1构建的pET-20b(+)-eYFPa-YeCBM32质粒、pET-20b(+)-YeCBM32-eYFPb质粒添加ddH₂O使质粒浓度达到100ng/mL浓度后，进行化学转化，分别转化入实施例2制备的感受态细胞，得到的细胞在LB培养基37℃复苏培养1h后，离心弃上清，使用剩余的培养基重悬细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。

LB培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，余量水。

实施例4

阳性重组菌的培养及鉴定

挑取上述阳性重组菌落(即具有氨苄青霉素抗性的转化子)，接种到含100μg/mL氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA。

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，eYFPa-YeCBM32基因条带大小约为4600bp，与理论值4631bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌。

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，YeCBM32-eYFPb基因条带大小约为4400bp，与理论值4418bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌。

实施例5

融合蛋白eYFPa-YeCBM32、YeCBM32-eYFPb发酵测试和蛋白纯化。

将实施例4制备的含有融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌、含有融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌分别接种至100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，余量水)中200rpm 37℃下培养至发酵液OD₆₀₀至0.8，再加入IPTG诱导12h，取样。菌液12000rpm离心15min后得到菌体，使用0.2M PBS(pH7.4)重悬菌体，超声破碎后12000rpm离心15min收集上清，即为蛋白上清液。

实施例6

融合蛋白eYFPa-YeCBM32、YeCBM32-eYFPb的反应，使用实施例5制备的蛋白上清液。

(一)融合蛋白eYFPa-YeCBM32、YeCBM32-eYFPb在有果胶或聚半乳糖醛酸为底物的体系中能够使用酶标仪(501nm激发光，527nm发射光)检测到荧光信号。

反应条件：25℃、pH 7.4，反应体系如下：

①使用80μL eYFPa-YeCBM32蛋白上清、80μL YeCBM32-eYFPb蛋白上清，以及40μL质量分数为0.1％果胶、0.2％果胶、0.1％聚半乳糖醛酸或0.2％聚半乳糖醛酸，构建200μL的反应体系，检测结果见图1；反应30min后具有明显的荧光强度增加，反应在0-4h时间内荧光强度急剧增加，反应12h以后荧光强度趋于平稳，见图2。

②使用95μL eYFPa-YeCBM32蛋白上清、95μL YeCBM32-eYFPb蛋白上清，以及10μL质量分数为0.1％果胶、0.2％果胶、0.1％聚半乳糖醛酸或0.2％聚半乳糖醛酸，构建200μL的反应体系，检测结果见图1；

③使用90μL eYFPa-YeCBM32蛋白上清、90μL YeCBM32-eYFPb蛋白上清，以及200μL质量分数为0.1％果胶、0.2％果胶、0.1％聚半乳糖醛酸或0.2％聚半乳糖醛酸，构建200μL的反应体系，检测结果见图1。

由图1可知，分别测定0.1％、0.2％的果胶、聚半乳糖醛酸构建不同的200μL体系，本发明发现果胶底物的荧光强度要高于聚半乳糖醛酸的荧光强度，可能是果胶分子较大，能够发生更高浓度的聚集而荧光强度较高，另外体系中底物的浓度越高，荧光强度也相应提高。

由图2可知，反应30min后具有明显的荧光强度增加，反应在0-4h时间内荧光强度急剧增加，反应12h以后荧光强度趋于平稳。

(二)最适反应条件的检测

反应体系：使用80μL eYFPa-YeCBM32蛋白上清、80μL YeCBM32-eYFPb蛋白上清，以及40μL质量分数为0.2％果胶。

反应条件pH 7.4、反应时间2h，设置20-50℃(梯度为5℃)反应温度，其最适温度为25℃，见图3；

反应温度25℃，反应时间2h，设置反应pH 7.5-11.5(梯度为0.5)，其最适pH为9.5，见图4。

(三)不同反应底物的检测

反应体系：使用80μL eYFPa-YeCBM32蛋白上清、80μL YeCBM32-eYFPb蛋白上清，以及40μL反应底物，反应温度25℃、时间2h、pH9.5。

使用不同的反应底物：质量分数为0.2％果胶、0.2％聚半乳糖醛酸、0.2％葡聚糖、0.2％羧甲基纤维素钠、0.2％木聚糖、0.2％木质素、0.2％微晶纤维素、0.2％普鲁兰糖测定底物特异性，结果见表1、见图5。

表1

本发明发现只有底物为果胶(苹果果胶，购自sigma公司)、聚半乳糖醛酸时，反应体系才有荧光强度的显著增加，说明融合蛋白eYFPa-YeCBM32、YeCBM32-eYFPb具有良好的底物特异性。

木质素溶解后为不透明黑色，故而检测过程中木质素的荧光强度数值较其他不与CBM结合底物的数值稍高。由于底物物质不同会对荧光强度有一定的干扰，并且反应体系中两个融合蛋白也会发生缓慢的结合而对荧光强度有一定的影响，所以使用酶标仪检测时，即使融合蛋白不能于底物结合，也会检测到一定的荧光强度。这类荧光强度的干扰，不会随着反应时间的变化有明显变化。

对比例1

一种融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPa编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5示，其中CBM77_RfPL1/9属于CBM77家族，与YeCBM32功能相近，但与CBM32家族的YeCBM32基因序列存在差异。

一种融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6示。

Ⅰ融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPa的基因构建

(i)在CBM77_RfPL1/9基因的C端通过连接肽(Linker)连接黄色荧光蛋白基因的a片段(氨基酸序列1-155)，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将CBM77_RfPL1/9-eYFPa插入到载体pET20b(+)上，构建pET-20b(+)-CBM77_RfPL1/9-eYFPa的质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。

Ⅱ融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPb的基因构建

(i)在CBM77_RfPL1/9基因的C端通过连接肽(Linker)连接黄色荧光蛋白基因的b片段(氨基酸序列156-238)，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将CBM77_RfPL1/9-eYFPb插入到载体pET20b(+)上，构建pET-20b(+)-CBM77_RfPL1/9-eYFPb的质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。

说明:由于CBM77_RfPL1/9的蛋白结构，故而均选择在C端通过连接肽(Linker)连接黄色荧光蛋白片段。

Ⅲ制备大肠杆菌感受态

(v)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。

ⅣCBM77_RfPL1/9-eYFPa、CBM77_RfPL1/9-eYFPb基因转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)

步骤Ⅰ、步骤Ⅱ制备的质粒添加ddH₂O使质粒浓度达到100ng/mL浓度后，进行化学转化，得到的细胞使用LB培养基37℃复苏培养1h后，离心弃上清，使用LB培养基重悬细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。

LB培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，余量水

Ⅴ阳性重组菌的培养及鉴定

挑取上述阳性重组菌落，接种到含100μg/mL氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA。

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，CBM77_RfPL1/9-eYFPa条带大小约为4500bp，与理论值4583bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPa基因的大肠杆菌工程菌。

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，CBM77_RfPL1/9-eYFPb条带大小约为4300bp，与理论值4367bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌。

Ⅵ融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPa、CBM77_RfPL1/9-eYFPb发酵测试和蛋白纯化。

将制备的含有融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPa、CBM77_RfPL1/9-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌分别接种至100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，余量水)中200rpm37℃下培养至发酵液OD₆₀₀在0.8，再加入IPTG诱导12h，取样。菌液离心后得到菌体，使用0.2M PBS(pH7.4)重悬菌体，超声破碎后离心收集上清，即为蛋白上清液。

融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPa、CBM77_RfPL1/9-eYFPb在有果胶(或聚半乳糖醛酸)为底物的体系中使用酶标仪(501nm激发光，527nm发射光)检测荧光信号。结果显示融合蛋白CBM77_RfPL1/9-eYFPa、CBM77_RfPL1/9-eYFPb在不同比例浓度下，均无法在有果胶或聚半乳糖醛酸为底物的体系中检测到明显荧光信号差异，见表2。

表2

注：图表中的荧光强度几乎没有变化。

由对比例1提供的融合蛋白可以证明，并不是所有的CBM结构与荧光蛋白结合都可以与聚半乳糖醛酸、果胶产生荧光；本发明提供的融合蛋白与聚半乳糖醛酸、果胶结合具有特异性。

本发明提供的含黄色荧光蛋白片段的融合蛋白eYFPa-YeCBM32和融合蛋白YeCBM32-eYFPb，在具有果胶或聚半乳糖醛酸底物的反应体系中，能够使用酶标仪检测到明显的荧光增强，在25℃，pH9.5的反应条件下具有良好的荧光强度。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种重组蛋白及荧光检测底物的方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcaaag gtgaagaact gttcaccggt gttgtgccga tcctggttga actggatggc 60

gatgttaacg gtcacaaatt cagcgttagc ggtgaaggtg aaggtgatgc gacctacggt 120

aaactgaccc tgaaattcat ttgcaccacc ggtaaactgc cggttccgtg gccgaccctg 180

gttaccacct tcggctacgg cctgcagtgc ttcgcgcgtt acccggatca catgaaactg 240

cacgatttct tcaaatctgc gatgccggaa ggttacgttc aggaacgtac catcttcttc 300

aaagatgatg gtaactacaa aacccgtgcg gaagttaaat tcgaaggtga taccctggtt 360

aaccgtattg aactgaaagg tatcgatttc aaagaagatg gtaacatcct gggccacaaa 420

ctggaataca actacaacag ccacaacgtg tacatcatgg cggatagcgg tggcggcagc 480

ggcggcggct ccggcggtag cgcgcagatc gttgcggtta ccgcgtccgg ttacgatagc 540

gaaaaaggtc acgttccggc gaacattgcg gatggcgatg ttaaaacccg ttgggctgcg 600

agcggtgaaa gctgggttca gctggaactg gataaagaac agtctatcga aaacatcctg 660

atcgttccgt tcaaaccgac cgaacgtaaa ctgaaattca gcatcttcta ctctaacgat 720

ggcaaaaact ggcagccgct ggcagaaggt ctggaaacca gctctgcgga taaaaacggc 780

gaaaaactga ccttcacccc ggttaccgcg aaatacatca aactggatac cttcggcacc 840

gatgttaaca actggagcgc gattaacgaa atcgcgatca acagcgcggc ggcgctgccg 900

agccgtgcga tcaaa 915

<210> 2

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

50 55 60

Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Leu

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Ser Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Ile Val Ala Val Thr Ala Ser

165 170 175

Gly Tyr Asp Ser Glu Lys Gly His Val Pro Ala Asn Ile Ala Asp Gly

180 185 190

Asp Val Lys Thr Arg Trp Ala Ala Ser Gly Glu Ser Trp Val Gln Leu

195 200 205

Glu Leu Asp Lys Glu Gln Ser Ile Glu Asn Ile Leu Ile Val Pro Phe

210 215 220

Lys Pro Thr Glu Arg Lys Leu Lys Phe Ser Ile Phe Tyr Ser Asn Asp

225 230 235 240

Gly Lys Asn Trp Gln Pro Leu Ala Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ser Ala

245 250 255

Asp Lys Asn Gly Glu Lys Leu Thr Phe Thr Pro Val Thr Ala Lys Tyr

260 265 270

Ile Lys Leu Asp Thr Phe Gly Thr Asp Val Asn Asn Trp Ser Ala Ile

275 280 285

Asn Glu Ile Ala Ile Asn Ser Ala Ala Ala Leu Pro Ser Arg Ala Ile

290 295 300

Lys

305

<210> 3

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcgcaga tcgttgcggt taccgcgagc ggttacgata gcgaaaaagg ccacgttccg 60

gcgaacatcg cggatggcga tgttaaaacc cgttgggcgg cgagcggtga atcttgggtt 120

cagctggaac tggataaaga acagagcatc gaaaacatcc tgatcgttcc gttcaaaccg 180

accgaacgta aactgaaatt ctctatcttc tacagcaacg atggcaaaaa ctggcagccg 240

ctggcggaag gtctggaaac cagctctgcg gataaaaacg gcgaaaaact gaccttcacc 300

ccggttaccg cgaaatacat caaactggat accttcggca ccgacgttaa caactggtcc 360

gcgatcaacg aaatcgcgat caacagcgcg gcggcgctgc cgagccgtgc gatcaaaagc 420

ggcggtggta gcggtggcgg cagcggcggc tctaaacaga aaaacggcat caaagttaac 480

ttcaaaatcc gtcacaacat cgaagatggt agcgttcagc tggcggatca ctaccagcag 540

aacaccccga tcggtgatgg tccggttctg ctgccggata accactacct gtcttaccag 600

tctgcgctgt ctaaagatcc gaacgaaaaa cgtgatcaca tggttctgct ggaattcgtt 660

accgcggcgg gcatcaccct gggtatggat gaactgtaca aa 702

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Gln Ile Val Ala Val Thr Ala Ser Gly Tyr Asp Ser Glu Lys

1 5 10 15

Gly His Val Pro Ala Asn Ile Ala Asp Gly Asp Val Lys Thr Arg Trp

20 25 30

Ala Ala Ser Gly Glu Ser Trp Val Gln Leu Glu Leu Asp Lys Glu Gln

35 40 45

Ser Ile Glu Asn Ile Leu Ile Val Pro Phe Lys Pro Thr Glu Arg Lys

50 55 60

Leu Lys Phe Ser Ile Phe Tyr Ser Asn Asp Gly Lys Asn Trp Gln Pro

65 70 75 80

Leu Ala Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ser Ala Asp Lys Asn Gly Glu Lys

85 90 95

Leu Thr Phe Thr Pro Val Thr Ala Lys Tyr Ile Lys Leu Asp Thr Phe

100 105 110

Gly Thr Asp Val Asn Asn Trp Ser Ala Ile Asn Glu Ile Ala Ile Asn

115 120 125

Ser Ala Ala Ala Leu Pro Ser Arg Ala Ile Lys Ser Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn

145 150 155 160

Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp

165 170 175

His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro

180 185 190

Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn

195 200 205

Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly

210 215 220

Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230

<210> 5

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggcccgg ttgcgggtaa ctacgttcac gatttcaccg cgaacggcac cagcagcagc 60

ttctacacca tcgcgggcaa cctgagcacc agcaaaggca ccgcgaccta caacggtaaa 120

accctgaccc agtgcctgaa aatggaaacc gcgaccagca tcagcttcac cgcgccgagc 180

gcgggcaaac tgaccctggt tttcgcggaa gcggcggcga ccgcgaaagt tgatggcaac 240

aaagttaccg cgagcaacgg catcatcacc gttgatctgg cgcagggcgc gcacaccatc 300

accaaagcgg atgcgtgcaa cctgttctac atggaatatg cggcgctgga acacagcggt 360

ggcggcagcg gcggcggtag cggcggtggc agcatgagca aaggcgaaga actgttcacc 420

ggcgttgttc cgatcctggt tgaactggat ggcgatgtta acggccacaa attcagcgtt 480

agcggcgaag gcgaaggcga tgcgacctac ggcaaactga ccctgaaatt catctgcacc 540

accggcaaac tgccggttcc gtggccgacc ctggttacca ccttcggcta cggcctgcag 600

tgcttcgcgc gttacccgga tcacatgaaa ctgcacgatt tcttcaaaag cgcgatgccg 660

gaaggctacg ttcaggaacg taccatcttc ttcaaagatg atggcaacta caaaacccgt 720

gcggaagtta aattcgaagg cgataccctg gttaaccgta tcgaactgaa aggcatcgat 780

ttcaaagaag atggtaacat cctgggccac aaactggaat acaactacaa cagccacaac 840

gtttacatca tggcggat 858

<210> 6

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgggcccgg ttgcgggtaa ctacgttcac gatttcaccg cgaacggcac cagcagcagc 60

ttctacacca tcgcgggcaa cctgagcacc agcaaaggca ccgcgaccta caacggtaaa 120

accctgaccc agtgcctgaa aatggaaacc gcgaccagca tcagcttcac cgcgccgagc 180

gcgggcaaac tgaccctggt tttcgcggaa gcggcggcga ccgcgaaagt tgatggcaac 240

aaagttaccg cgagcaacgg catcatcacc gttgatctgg cgcagggcgc gcacaccatc 300

accaaagcgg atgcgtgcaa cctgttctac atggaatatg cggcgctgga acacagcggt 360

ggcggcagcg gcggcggtag cggcggtggc agcaagcaga aaaacggcat caaagttaac 420

ttcaaaatcc gtcacaacat cgaagatggt agcgttcagc tggcggatca ctaccagcag 480

aacaccccga tcggcgatgg cccggttctg ctgccggata accactacct gagctaccag 540

agcgcgctga gcaaagatcc gaacgaaaaa cgtgatcaca tggttctgct ggaattcgtt 600

accgcggcgg gcatcaccct gggcatggat gaactgtaca aa 642

<210> 7

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgagcaaag gtgaagaact gttcaccggt gttgtgccga tcctggttga actggatggc 60

gatgttaacg gtcacaaatt cagcgttagc ggtgaaggtg aaggtgatgc gacctacggt 120

aaactgaccc tgaaattcat ttgcaccacc ggtaaactgc cggttccgtg gccgaccctg 180

gttaccacct tcggctacgg cctgcagtgc ttcgcgcgtt acccggatca catgaaactg 240

cacgatttct tcaaatctgc gatgccggaa ggttacgttc aggaacgtac catcttcttc 300

aaagatgatg gtaactacaa aacccgtgcg gaagttaaat tcgaaggtga taccctggtt 360

aaccgtattg aactgaaagg tatcgatttc aaagaagatg gtaacatcct gggccacaaa 420

ctggaataca actacaacag ccacaacgtg tacatcatgg cggat 465

<210> 8

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaacagaaaa acggcatcaa agttaacttc aaaatccgtc acaacatcga agatggtagc 60

gttcagctgg cggatcacta ccagcagaac accccgatcg gtgatggtcc ggttctgctg 120

ccggataacc actacctgtc ttaccagtct gcgctgtcta aagatccgaa cgaaaaacgt 180

gatcacatgg ttctgctgga attcgttacc gcggcgggca tcaccctggg tatggatgaa 240

ctgtacaaa 249

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcggcggtg gtagcggtgg cggcagcggc ggctct 36

Claims

1.一种融合蛋白eYFPa-YeCBM32编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种融合蛋白eYFPa-YeCBM32的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种融合蛋白YeCBM32-eYFPb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种融合蛋白YeCBM32-eYFPb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述融合蛋白eYFPa-YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；

优选的，一种重组菌，包含权利要求1所述融合蛋白eYFPa-YeCBM32编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述融合蛋白YeCBM32-eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示；

优选的，一种重组菌，包含权利要求3所述融合蛋白YeCBM32-eYFPb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。

7.一种含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(2)制得的重组质粒pET-20b(+)-eYFPa-YeCBM32转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌；

优选的，一种含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

③制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤②制得的重组质粒pET-20b(+)-YeCBM32-eYFPb转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌；

优选的，步骤(3)或步骤③中筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。

8.权利要求7所述方法构建的含融合蛋白eYFPa-YeCBM32基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白eYFPa-YeCBM32中的应用；

优选的，权利要求7所述方法构建的含融合蛋白YeCBM32-eYFPb基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白YeCBM32-eYFPb中的应用。

9.权利要求2所述融合蛋白eYFPa-YeCBM32和权利要求4所述融合蛋白YeCBM32-eYFPb在检测聚半乳糖醛酸或果胶中的应用。

10.一种定性检测聚半乳糖醛酸或果胶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

荧光强度增强，则确定待测样品中含有聚半乳糖醛酸或果胶；荧光强度没有增强，则确定待测样品中不含聚半乳糖醛酸和果胶；

优选的，所述方法中，反应条件为23-26℃，pH9.0-10.0；

优选的，反应条件为25℃，pH9.5。