CN113817709B

CN113817709B - 碳水化合物结合结构域cbm68及其应用

Info

Publication number: CN113817709B
Application number: CN202110923682.3A
Authority: CN
Inventors: 付晓平; 郑宏臣; 宋诙; 赵兴亚; 杨一凡; 徐健勇
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: CN113817709A

Abstract

本发明公开了碳水化合物结合结构域CBM68及其应用。本发明提供了蛋白质，为如下1)‑2)中至少一种：1)序列表中序列2第1‑109位氨基酸残基的蛋白；2)将1)所示蛋白的氨基酸末端添加标签序列得到的蛋白。本发明克隆出CBM68蛋白，该蛋白可融合目标蛋白提高目标蛋白在宿主细胞中的表达量，较其他常见的分子标签在目标蛋白表达量提高方面具有极大的优势。CBM68在目标蛋白表达过程中将部分目标蛋白分泌到细胞外，这也说明CBM68有一定信号肽的功能。

Description

碳水化合物结合结构域CBM68及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及碳水化合物结合结构域CBM68及其应用。

背景技术

碳水化合物结合结构域(carbohydrate-binding modules)简称CBM，指优先结合多糖或寡糖(碳水化合物)其水不溶性形式的多肽氨基酸序列，广泛存在于糖基水解酶中的非催化结构域。

CBM的主要功能是促进催化活性结构域与碳水化合物的结合；一方面，由于CBM结合底物具有特异性，同样的催化结构域如果与不同的CBM融合可能会降解不同类型的碳水化合物；另一方面，某些高温菌的CBM具有较高的稳定性，属于热稳定性结构域。

分子标签作为一种常用的分子工具，已发现的常用标签应用于促进翻译效率和帮助蛋白正确折叠的作用，促进蛋白可溶性表达等方面。

迄今为止，CBM作为分子标签的应用研究极少，因此开发更多有效的CBM新功能具有产业化应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，为如下1)-2)中至少一种：

1)序列表中序列2第1-109位氨基酸残基组成的蛋白；

2)将1)所示蛋白的氨基酸末端添加标签序列得到的蛋白。

编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。

含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞也是本发明保护的范围。

上述蛋白质在作为目的蛋白分子标签中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体或重组菌在提高目的蛋白表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述提高目的蛋白表达为提高目的蛋白表达量。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒或重组载体在提高目的蛋白在细胞内和/或细胞外表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒或重组载体在使目的蛋白分泌到细胞外表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述细胞为微生物细胞。

本发明另一个目的是提供一种提高目的蛋白表达的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述蛋白质作为目的蛋白的分子标签在宿主细胞中表达，实现提高目的蛋白在宿主细胞内和/或宿主细胞外的表达。

上述方法中，所述将上述蛋白质作为目的蛋白的分子标签在宿主细胞中表达为将包含上述蛋白质和目的蛋白的融合蛋白的编码核酸导入所述宿主细胞中。

含有或偶联上述蛋白质的融合蛋白也是本发明保护的范围

上述分子标签的作用是提高目的蛋白表达和/或诱导目的蛋白分泌到细胞外并能一定程度促进目标蛋白的正确折叠从而提高其活性。

本发明克隆出CBM68蛋白，该蛋白可融合目标蛋白提高目标蛋白在宿主细胞中的表达量，较其他常见的分子标签在目标蛋白表达量提高方面具有极大的优势。CBM68在目标蛋白表达过程中将部分目标蛋白分泌到细胞外，这也说明CBM68有一定信号肽的功能。目标蛋白尤其是各种工业酶的高产量表达是实现产业化降低成本的关键，分泌到细胞外更是节省成本的重要途径。因此，CBM68可以作为分子标签提高目的蛋白的表达及使目的蛋白分泌到胞外，适用于产业化生产目标蛋白。

附图说明

图1为CBM68-amy胞外蛋白电泳图。

图2为CBM68-76G1和CBM68-HV1蛋白电泳图，A：糖基转移酶HV1表达量电泳图，B：糖基转移酶76G1表达量电泳图。

图3为糖基转移酶76G1酶活检测HPLC图。

图4为糖基转移酶HV1酶活检测HPLC图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中序列如下：

序列1为含有CBM68-amy融合基因的片段；

序列2为CBM68-amy融合蛋白的氨基酸序列；

序列3为含有CBM68-76G1融合基因的片段；

序列4为LipA基因的核苷酸序列；

序列5为Yncm基因的核苷酸序列；

序列6为CBM34基因的核苷酸序列；

序列7为amyx基因的核苷酸序列；

序列8为含有CBM68-HV1融合基因的片段。

实施例1、CBM68蛋白在促进淀粉酶amy表达中的应用

一、重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-amy

1、重组载体的获得

重组载体PMA0911-CBM68-amy为将含有CBM68-amy融合基因的片段(序列1)通过无缝连接(solarbio HiFi seamless Assembly and Cloning Kit)到PMA0911载体(通用生物)中得到的载体，该载体表达CBM68-amy融合蛋白。

含有CBM68-amy融合基因的片段的核苷酸序列为序列1，其中序列1第1-22位为上游同源臂，第23-349位为CBM68蛋白基因序列，第350-1999位为amy蛋白基因序列，序列1第2000-2019位为下游同源臂。

CBM68-amy融合蛋白为将CBM68蛋白的C端融合amy得到的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列为序列2，其中序列2第1-109位为CBM68蛋白，第200-659位为amy蛋白。

重组载体PMA0911-LipA-amy为将含有LipA-amy融合基因的片段通过无缝连接到PMA0911载体中得到的载体，该载体表达LipA-amy融合蛋白。

含有LipA-amy融合基因的片段的核苷酸序列为将序列表中序列1中的第23-349位为CBM68蛋白基因替换为序列4所示的LipA基因，其他核苷酸不变。

重组载体PMA0911-Yncm-amy为将含有Yncm-amy融合基因的片段通过无缝连接到PMA0911载体中得到的载体，该载体表达Yncm-amy融合蛋白。

含有Yncm-amy融合基因的片段的核苷酸序列为将序列表中序列1中的第23-349位CBM68蛋白基因替换为序列5所示的Yncm基因，其他核苷酸不变。

重组载体PMA0911-CBM34-amy为将含有CBM34-amy融合基因的片段通过无缝连接到PMA0911载体中得到的载体，该载体表达CBM34-amy融合蛋白。

含有CBM34-amy融合基因的片段的核苷酸序列为将序列表中序列1中的第23-349位为CBM68蛋白基因替换为序列6所示的CBM34基因，其他核苷酸不变。

2、重组菌的获得

将重组载体PMA0911-CBM68-amy、PMA0911-LipA-amy、PMA0911-Yncm-amy和PMA0911-CBM34-amy分别电转入枯草芽孢杆菌SCK6(通用生物)中，得到重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-amy、SCK6/PMA0911-LipA-amy、SCK6/PMA0911-Yncm-amy和SCK6/PMA0911-CBM34-amy。

二、淀粉酶amy检测

1、CBM68-amy的制备及酶活测定

1)上述一制备的四种重组菌接种小试管，LB抗性培养14h；1％接种量从小试管取菌液接种250mL锥形瓶，瓶内含带抗性的SR培养基(胰蛋白胨1.5g、酵母粉2.5g、磷酸氢二钾0.3g，加蒸馏水30mL，搅拌均匀定容至50mL，121℃高压灭菌20min。)；37℃摇床220rpm培养48h，得到发酵菌液；

取2mL发酵菌液，12000rpm离心5min，收集上清液即为胞外粗酶液，可直接用于耐高温淀粉酶酶活测定；离心的菌体沉淀用2mL无菌水吹洗三次，取500μL菌体进行超声破碎，功率300W，超声5s，间歇5s，共10min。超声破碎后12000rpm离心5min，上清液即为胞内粗酶液，用于酶活测定。

2、淀粉酶酶活测定

淀粉酶酶活力定义及其计算方法：1ml液体酶，60℃、pH6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/ml表示。计算公式如下：X＝C*N。式中，X表示样品的酶活力U/ml；C表示测试的酶液浓度U/ml；N表示样品的稀释倍数。

根据国标GB 1886.174-2016食品工业酶制剂上规定的方法，对测定体系等比例缩小，进行耐高温α-淀粉酶活力的测定，具体步骤如下：

1)粗酶液应用pH6.0磷酸缓冲液梯度稀释，摸索最佳稀释倍数，确保待测酶液的酶活力在60U/mL-65U/mL范围内。

2)取2mL EP管，加入1mL可溶性淀粉(solarbio)和250μL pH6.0磷酸缓冲液，70℃金属浴锅800rpm预热5min。

3)向预热好的2mL EP管内加入50μL待测粗酶液，准确反应5min。

4)取100μL反应液加入含有500μL稀碘液和50μL盐酸溶液的1.5mL EP管内，混匀。

5)取200μL变色溶液加入96孔板，以未添加反应液的稀碘液和盐酸溶液为空白对照，测定660nm波长下吸光值，吸光值在0.29-0.39范围内为最佳。

6)根据国标给定的吸光度与α-淀粉酶酶浓度对照表计算酶活。

测定添加不同标签的淀粉酶酶活，测定结果见表1，可以看出，CBM68连接amy表达的淀粉酶的酶活高于其他标签。

表1为添加不同标签的淀粉酶酶活

酶活U/ml	LipA	Yncm	CBM68	CBM34
					胞内酶活	0	0	489	75
胞外酶活	100	50	1286	101

上表中，LipA、Yncm、CBM68和CBM34分别代表重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-amy、SCK6/PMA0911-LipA-amy、SCK6/PMA0911-Yncm-amy和SCK6/PMA0911-CBM34-amy产生的胞内或胞外的淀粉酶。

3、表达量的检测

将步骤1中发酵完成的重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-amy(CBM68)、SCK6/PMA0911-LipA-amy(LipA)、SCK6/PMA0911-Yncm-amy(Yncm)和SCK6/PMA0911-CBM34-amy(CBM34)分别取2ml菌体进行超声破碎,功率300w，超声5s，间歇5s，共10min。取超声破碎后的菌体15ul加入5ul上样缓冲液，煮沸10min，12000rpm离心10min，分别各取15ul上清液进行SDS-PAGE检测蛋白表达量。

结果如图1所示，CBM68为SCK6/PMA0911-CBM68-amy表达的蛋白，LipA为SCK6/PMA0911-LipA-amy表达的蛋白，Yncm为SCK6/PMA0911-Yncm-amy表达的蛋白，CBM34为PMA0911-CBM34-amy表达的蛋白，可以看出，CBM68-amy表达量显著高于lipA-amy、yncm-amy、CBM34-amy,此外CBM68在表达过程中有自动脱落的现象(可节省后续切标签)，因此在48h发酵电泳图中可见清晰明显的两条带。

3、淀粉酶的发酵生产

培养基配方:

LB培养基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L，余量为水，pH7.2。

发酵培养基B(百分比为质量体积比，1g:100ml):可溶性淀粉0.1％,蛋白胨0.5％,牛肉膏0.5％,葡萄糖0.5％,NaCl0.5％，余量为水，pH7.2。

1)种子液

将重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-amy接种在LB培养基中培养，得到种子液；

2)发酵

将重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-amy种子液以5％的接种量接入含有2L发酵培养基B的5L发酵罐中，在PH7.0、通气量2vvm、搅拌200r/min、30℃条件下培养24h后，得到发酵液，12000rpm离心30min，收集上清液(用于检测胞外酶活)和菌体。

高压匀浆(1500bar,4℃)破碎后菌体，12000rpm离心15min，上清液即为胞内粗酶液，用于酶活测定。

以将重组载体PMA0911-amy转入枯草芽孢杆菌SCK6得到的重组菌SCK6/PMA0911-amy为对照菌。

重组载体PMA0911-amy为将含有amy基因的片段通过无缝克隆连接到PMA0911载体中得到的载体，其中含有amy基因的片段为序列表中序列1第350-1999位。

3)酶活检测

酶活检测方法与上述2相同，按照国标GB 1886.174-2016，测定对照菌SCK6/PMA0911-amy与实验组重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-amy的胞内酶活和胞外酶活。

结果见表2。

表2为酶活检测结果

酶活U/ml	PMA0911-amy	pMA011-CBM68-amy
			胞内酶活	118	1200
胞外酶活	90	1300

上述结果可以看出，CBM68蛋白可以提高淀粉酶在枯草芽孢杆菌SCK6中的表达量，胞内加胞外总酶活可提高12倍。融合CBM68的淀粉酶酶活从初始未加标签的208u/ml提高至2500u/ml，为进一步放大生产提供基础。

综上结果显示：CBM68在提高淀粉酶表达量的同时还能将一部分淀粉酶分泌到细胞外，具有一定信号肽的功能。

实施例2、CBM68蛋白在促进糖基转移酶76G1表达中的应用

一、重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-76G1

1、重组载体的获得

重组载体PMA0911-CBM68-76G1为将含有CBM68-76G1融合基因的片段(序列3)通过无缝连接(solarbio HiFi seamless Assembly and Cloning Kit)到PMA0911载体(通用生物)中得到的载体，表达融合蛋白CBM68-76G1。

含有CBM68-76G1融合基因的片段的核苷酸序列为序列3，其中序列3第1-22位为上游同源臂，第23-349位为CBM68蛋白基因序列，第350-1726位为76G1蛋白基因序列，序列3第1727-1746位为下游同源臂。

2、重组菌的获得

将重组载体PMA0911-CBM68-76G1电转入枯草芽孢杆菌SCK6(通用生物)中，得到重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-76G1。

对照菌SCK6/pMA0911-76G1为将重组载体pMA0911-76G1转入枯草芽孢杆菌SCK6得到的重组菌SCK6/pMA0911-76G1为对照菌。

重组载体PMA0911-76G1为将含有76G1基因的片段通过无缝连接到PMA0911载体中得到的载体，其中含有76G1基因的片段为在序列3第350-1726位。

重组载体PMA0911-LipA-76G1为将含有LipA-76G1融合基因的片段通过无缝连接到PMA0911载体中得到的载体，表达融合蛋白LipA-76G1。

含有LipA-76G1融合基因的片段的核苷酸序列为将序列3中的第23-349位CBM68蛋白基因替换为序列4所示的LipA基因，其他核苷酸不变。

重组载体PMA0911-amyx-76G1为将含有amyx-76G1融合基因的片段通过无缝连接到PMA0911载体中得到的载体，表达融合蛋白amyx-76G1。

含有amyx-76G1融合基因的片段的核苷酸序列为将序列3中的第23-349位CBM68蛋白基因替换为序列7所示的amyx基因，其他核苷酸不变。

重组载体PMA0911-CBM34-76G1为将含有CBM34-76G1融合基因的片段通过无缝连接到PMA0911载体中得到的载体，表达融合蛋白CBM34-76G1。

含有CBM34-76G1融合基因的片段的核苷酸序列为将序列3中的第23-349位CBM68蛋白基因替换为序列6所示的CBM34基因，其他核苷酸不变。

2、重组菌的获得

将重组载体PMA0911-CBM68-76G1、PMA0911-LipA-76G1、PMA0911-amyx-76G1和PMA0911-CBM34-76G1分别电转入枯草芽孢杆菌SCK6(通用生物)中，得到重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-76G1、SCK6/PMA0911-LipA-76G1、SCK6/PMA0911-amyx-76G1和SCK6/PMA0911-CBM34-76G1。

二、糖基转移酶76G1检测

1、SCK6/PMA0911-CBM68-76G1的发酵培养

1)挑取重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-76G1、SCK6/PMA0911-amyx-76G1、SCK6/PMA0911-LipA-76G1、SCK6/PMA0911-CBM34-76G1单菌落于15mL LB液体培养基(含卡那霉素(50ug/mL))过夜培养，得到种子液。

2)将步骤1)获得的种子液接种到含25mL TB液体培养基(含卡那霉素(50ug/mL))的100mL摇瓶中，37℃、220r/min培养48h，得到培养产物。

2、CBM68-76G1的制备及酶活测定

1)将培养48后的培养产物离心去上清，取菌体沉淀，用磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.2)洗涤两次，洗涤后的沉淀悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共10min)，破碎后的液体于8000r/min，4℃离心15min，取上清即为粗酶液。

以SCK6/pMA0911-76G1为对照菌。

2)UDP-糖基转移酶76G1酶活测定

甜菊糖为底物酶法合成莱胞迪苷A(RebA)，根据甜菊糖的转化率判断UDP-糖基转移酶76G1酶活，即甜菊糖的转化率越高，UDP-糖基转移酶76G1酶活越高。

76G1酶活测定对照组：在反应体系中依次加入1.0g甜菊糖和4.0g蔗糖，取对照组SCK6/pMA0911-76G1超声破碎后粗酶液及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)至终体积20ml，混合均匀后置于40℃水浴，200r/min搅拌反应24h后加入70％甲醇终止反应。取500μl反应液，置于95℃水浴15min，再12,000r/min离心1min，取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测。

HPLC检测条件：流动相：HPLC乙腈，超纯水分别装于流动相瓶中，超声破30min排气泡。。4.6mm×250mm C18柱，进样量10μL，工作条件为柱温30℃，乙腈：水＝70％；30％，0.5mL/min的流速，紫外检测器进行检测，运行时间为20min。标准品为甜菊糖苷(ST)与莱胞迪苷A(RA)的混合物(毕得医药)。

甜菊糖(ST)转化率％＝(At(RA))/(A0(ST))*(805/967)*100

At:表示反应结束后产物莱胞迪苷RA增加的浓度,A0:表示反应之前底物甜菊糖ST的浓度,甜菊糖ST分子量是805,莱胞迪苷RA分子量是967；

甜菊糖的转化率为26％。

76G1酶活测定实验组：在反应体系中依次加入0.5g甜菊糖和4.0g蔗糖，取实验组SCK6/PMA0911-CBM68-76G1超声破碎后的粗酶液及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)至终体积20ml，混合均匀后置于40℃水浴，200r/min搅拌反应24h后加入70％甲醇终止反应。取500μl反应液，置于95℃水浴15min，再12,000r/min离心1min，取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测，检测方法同上。

甜菊糖转化HPLC检测结果见图3，A：源于实验组SCK6/PMA0911-CBM68-76G1(CBM68-76G1)的粗酶液反应结束后检测峰；B：源于实验组SCK6/PMA0911-amyx-76G1(amyx-76G1)的粗酶液反应结束后检测峰；C：源于实验组SCK6/PMA0911-LipA-76G1(LipA-76G1)的粗酶液反应结束后检测峰；D：源于实验组SCK6/PMA0911-CBM34-76G1(CBM34-76G1)的粗酶液反应结束后检测峰；E：标准品检测峰，甜菊糖保留时间为15.6分钟，莱胞迪苷RA保留时间为14.8分钟，可以看出，实验组中各个菌的粗酶液中含有莱胞迪苷RA。

经过计算，未融合CBM68的糖基转移酶76G1(对照组)甜菊糖转化率是26％，融合CBM68标签的糖基转移酶(实验组)甜菊糖转化率是100％；融合CBM68标签的76G1在相同的条件下将甜菊糖苷全部转化为莱胞迪苷RA，而LipA、amyx、CBM34转化率分别为39％、60％、32％。

3、蛋白表达量检测

取上述一得到的SCK6/PMA0911-CBM68-76G1、SCK6/PMA0911-LipA-76G1、SCK6/PMA0911-amyx-76G1和SCK6/PMA0911-CBM34-76G1，采用上述二的1和2的1)的方法，制备融合不同标签的粗酶液。

取粗酶液进行SDS-PAGE电泳，结果如图2右图所示，LipA、amyx、CBM34、CBM68和对照分别代表SCK6/PMA0911-LipA-76G1、SCK6/PMA0911-amyx-76G1、SCK6/PMA0911-CBM34-76G1、SCK6/PMA0911-CBM68-76G1和SCK6/PMA0911-76G1的粗酶液，可明显看出，融合CBM68的糖基转移酶表达量明显高于融合标签lipA、amyx、CBM34，且融合CBM34标签的蛋白表达量几乎没有提高。

此结果说明本发明CBM68对UDP-糖基转移76G1表达量的提高具有显著作用。

实施例3、CBM68蛋白在促进糖基转移酶HV1表达中的应用

一、重组菌SCK6/PMA0911-CBM68-HV1

1、重组载体的获得

重组载体PMA0911-CBM68-HV1为将含有CBM68-HV1融合基因的片段(序列8)通过无缝连接(solarbio HiFi seamless Assembly and Cloning Kit)到PMA0911载体(通用生物)中得到的载体，表达融合蛋白CBM68-HV1。

含有CBM68-HV1融合基因的片段的核苷酸序列为序列8，其中序列8第1-22位为上游同源臂，第23-349位为CBM68蛋白基因序列，第350-1743位为HV1蛋白基因序列，序列8第1744-1763位为下游同源臂。

融合蛋白CBM68-HV1为序列8第23-1743编码的蛋白，其由CBM68蛋白和HV1蛋白组成。

二、糖基转移酶HV1检测

1、SCK6/PMA0911-CBM68-HV1的发酵培养

1)挑取SCK6/PMA0911-CBM68-HV1单菌落于15mL LB液体培养基(含卡那霉素(50ug/mL))过夜培养，得到种子液。

2、CBM68-HV1的制备及酶活测定

1)将培养48后的菌体离心去上清，取菌体沉淀，用磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH7.2)洗涤两次，洗涤后的沉淀悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声处理细胞(功率300W，超声5s，间歇5s，共10min)，破碎后的液体于8000r/min，4℃离心15min，取上清即为粗酶液。

2)UDP-糖基转移酶HV1酶活测定

莱胞迪苷A为底物酶法合成莱胞迪苷D(RD)，根据甜菊糖的转化率判断UDP-糖基转移酶HV1酶活，即甜菊糖的转化率越高，UDP-糖基转移酶HV1酶活越高。

HV1酶活测定对照组：在反应体系中依次加入0.5g莱胞迪苷A和4.0g蔗糖，取对照组SCK6/pMA0911-HV1超声破碎后粗酶液及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)至终体积20ml，混合均匀后置于40℃水浴，200r/min搅拌反应24h后加入70％甲醇终止反应。取500μl反应液，置于95℃水浴15min，再12,000r/min离心1min，取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测。反应底物为莱胞迪苷RA(罗恩试剂R006894-25g)。

HPLC检测条件：流动相：HPLC乙腈，超纯水分别装于流动相瓶中，超声破30min排气泡。4.6mm×250mm C18柱，进样量10μL，工作条件为柱温30℃，乙腈：水＝70％；30％，0.5mL/min的流速，紫外检测器进行检测，运行时间为20min。标准品为莱胞迪苷RA：罗恩试剂R006894-25g；莱胞迪苷D：上海源叶生物B20696-10mg。

莱胞迪苷(RA)转化率％＝(At(RD))/(A0(RA))*(967/1129)*100；

At:表示反应结束后产物莱胞迪苷RD增加的浓度,A0:表示反应之前底物莱胞迪苷RA的浓度,莱胞迪苷RD分子量是1129,莱胞迪苷RA分子量是967；

HV1酶活测定实验组：在反应体系中依次加入0.5g莱胞迪苷A(RA)和4.0g蔗糖，取实验组SCK6/PMA0911-CBM68-HV1超声破碎后的粗酶液(2mg/ml总蛋白量)及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)至终体积20ml，混合均匀后置于40℃水浴，200r/min搅拌反应24h后加入70％甲醇终止反应。取500μl反应液，置于95℃水浴15min，再12,000r/min离心1min，取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测，检测方法同上。

莱胞迪苷A转化HPLC检测结果见图4，A：源于实验组SCK6/PMA0911-CBM68-HV1的粗酶液(PMA0911-CBM68-HV1 SCK6)反应结束后检测峰；B：源于对照组SCK6/pMA0911-HV1的粗酶液(PMA0911-HV1 SCK6)反应结束后检测峰。

标准品检测峰，莱胞迪苷A保留时间为14.8min，莱胞迪苷D保留时间为6.9min。

经过计算，结果表明：未融合CBM68的糖基转移酶HV1转化率是几乎为0，见融合CBM68标签的糖基转移酶转化率是59.4％。

3、蛋白表达量检测

取上述一得到的SCK6/PMA0911-CBM68-HV1和SCK6/pMA0911-HV1，采用上述二的1和2的1)的方法，制备融合标签粗酶液和不融合标签的粗酶液。

取各种粗酶液进行SDS-PAGE电泳，CBM68-HV1和HV1分别代表SCK6/PMA0911-CBM68-HV1和SCK6/pMA0911-HV1的粗酶液，图2左图A两组样品中均未发现HV1表达的条带。

结合酶活测定结果及糖基转移酶HV1的SDS-PAGE蛋白电泳图分析得出：对照SCK6/pMA0911-HV1没有酶活，且看不到表达条带，说明在表达过程中未正确折叠成功能酶；SCK6/PMA0911-CBM68-HV1虽然也没看到电泳条带，但是测定有少量酶活，说明CBM68可以帮助一部分HV1在表达过程中正确折叠成功能酶，但是由于大多数还是没有正确折叠故看不到表达条带。因此，CBM68具有促进或帮助酶活性部位正确折叠的作用，为目的蛋白的分子标签。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 碳水化合物结合结构域CBM68及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2019

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cctaaaaagg agcgatttac atatgccccc aaaacaacag tcgtttgaag cttatttaga 60

tgaattgaca atgattacta ttttatttcc gtgccatgtt gaccaaaaac gtgcaccgat 120

atttttttta cgcgatgata aaaaaacagc atatcgctta acgattcgtt caagtgagaa 180

gcatcattca tttataaaat atgagtgtct cgttcctttt atcgttgaat taggaaagcg 240

atatgtcgtt tacacggaag aagggtggca agttccattg caagtaggag ctgtgatgcg 300

cacgaaagcg tttgatgatt tgtatgcata tgacggaaat gatcttggta tgctaacgtt 360

tcaccgcatc attcgaaaag ggtgggtgtt cctgctcgcg ttttggctca ctgcctcgct 420

gttctgcccg acaggacagc ccgccaaggc tgccgcaccg tttaacggca ccatgatgca 480

gtattttgaa tggtacttgc cggatgatgg cacgttatgg accaaagtgg ccaatgaagc 540

caacaactta tccagccttg gcatcaccgc tctttggctg ccgcccgctt ataaaggaac 600

aagccgcagc gacgtagggt acggagtata cgacttgtat gacctcggcg aattcaatca 660

aaaagggacc gtccgcacaa aatacggaac aaaagctcaa tatcttcaag ccattcaagc 720

cgcccacgcc gctggaatgc aagtgtacgc cgatgtcgtg ttcgaccata aaggcggcgc 780

cgacggcacg gaatgggtgg acgccgtcga agtcaatccg tccgaccgca accaagaaat 840

ctcgggcacc tatcaaatcc aagcatggac gaaatttgat tttaacgggc ggggcaacac 900

ctactccagc tttaagtggc gctggtacca ttttgacggc gttgactggg acgaaagccg 960

aaaattaagc cgcatttaca aattccgcgg catcggcaaa gcgtgggatt gggaagtaga 1020

cacggaaaac ggaaactatg actacttaat gtatgccgac cttgatatgg atcatcccga 1080

agtcgtgacc gagctgaaaa actgggggaa atggtatgtc aacacaacga acattgatgg 1140

gttccggctt gatgctgtca agcatattaa gttcagtttt tttcctgatt ggttgtcgta 1200

tgtgcgttct cagactggca agccgctatt taccgtcggg gaatattgga gctatgacat 1260

caacaagttg cacaattaca ttacgaaaac aaacggaacg atgtctttgt ttgatgcccc 1320

gttacacaac aaattttata ctgcttccaa atcggggggc gcatttgata tgagcacgtt 1380

aatgaacaat actctcatga aagatcaacc gacattggcc gtcaccttcg ttgataatca 1440

tgacaccgaa cccggccaag cgctgcagtc atgggtcgac ccatggttca aaccgttggc 1500

ttacgccttt attctaactc ggcaggaagg atacccgtgc gtcttttatg gtgactatta 1560

tggcattcca caatataaca ttccttcact gaaaagcaaa atcgatccgc tcctcatcgc 1620

gcgcagggat tatgcttatg gaacgcaaca tgattatctt gatcactccg acatcatcgg 1680

gtggacaagg gaaggcgtta ccgaaaaacc aggatccgga ctggccgcac tgatcaccga 1740

tgggccggga ggaagcaaat ggatgtacgt tggcaaacaa cacgccggaa aagtgttcta 1800

tgaccttacc ggcaaccgga gtgacaccgt caccatcaac agtgatggat ggggggaatt 1860

caaagtcaat ggcggttcgg tttcggtttg ggttcctaga aaaacgaccg tctctactat 1920

cgcttggccg atcacaaccc gaccgtggac tggtgaattc gtccgttgga ccgaaccacg 1980

gttggtggca tggccttgag ctagcttggt acgtaccag 2019

<210> 2

<211> 659

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Pro Pro Lys Gln Gln Ser Phe Glu Ala Tyr Leu Asp Glu Leu Thr

1 5 10 15

Met Ile Thr Ile Leu Phe Pro Cys His Val Asp Gln Lys Arg Ala Pro

20 25 30

Ile Phe Phe Leu Arg Asp Asp Lys Lys Thr Ala Tyr Arg Leu Thr Ile

35 40 45

Arg Ser Ser Glu Lys His His Ser Phe Ile Lys Tyr Glu Cys Leu Val

50 55 60

Pro Phe Ile Val Glu Leu Gly Lys Arg Tyr Val Val Tyr Thr Glu Glu

65 70 75 80

Gly Trp Gln Val Pro Leu Gln Val Gly Ala Val Met Arg Thr Lys Ala

85 90 95

Phe Asp Asp Leu Tyr Ala Tyr Asp Gly Asn Asp Leu Gly Met Leu Thr

100 105 110

Phe His Arg Ile Ile Arg Lys Gly Trp Val Phe Leu Leu Ala Phe Trp

115 120 125

Leu Thr Ala Ser Leu Phe Cys Pro Thr Gly Gln Pro Ala Lys Ala Ala

130 135 140

Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn Leu

165 170 175

Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

180 185 190

Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

195 200 205

Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

210 215 220

Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met Gln

225 230 235 240

Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr

245 250 255

Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln Glu

260 265 270

Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe

290 295 300

Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr Lys

305 310 315 320

Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Asn

325 330 335

Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro

340 345 350

Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr

355 360 365

Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe

370 375 380

Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys

385 390 395 400

Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu

405 410 415

His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala

420 425 430

Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe

435 440 445

Asp Met Ser Thr Leu Met Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr

450 455 460

Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala

465 470 475 480

Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe

485 490 495

Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr

500 505 510

Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp

515 520 525

Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp

530 535 540

Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val Thr

545 550 555 560

Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly

565 570 575

Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe

580 585 590

Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp

595 600 605

Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val

610 615 620

Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Pro Ile Thr Thr Arg

625 630 635 640

Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala

645 650 655

Trp Pro Cys

<210> 3

<211> 1746

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cctaaaaagg agcgatttac atatgccccc aaaacaacag tcgtttgaag cttatttaga 60

tgaattgaca atgattacta ttttatttcc gtgccatgtt gaccaaaaac gtgcaccgat 120

atttttttta cgcgatgata aaaaaacagc atatcgctta acgattcgtt caagtgagaa 180

gcatcattca tttataaaat atgagtgtct cgttcctttt atcgttgaat taggaaagcg 240

atatgtcgtt tacacggaag aagggtggca agttccattg caagtaggag ctgtgatgcg 300

cacgaaagcg tttgatgatt tgtatgcata tgacggaaat gatcttggta tggaaaacaa 360

gaccgaaacc accgtgcgcc gtcgtcgccg tattattctg tttccggtgc cgtttcaggg 420

tcatattaat ccgatgctgc agctggccaa tgtgctgtat agcaaaggtt ttagtattac 480

cattttccat accaatttca acaagccgaa aaccagcaat tatccgcatt ttacctttcg 540

ctttattctg gataatgatc cgcaggatgt tcgtattagt aatctgccga cccacggtcc 600

gctggccgtg atgcgtattc tgattattaa tgaacatggc gccgatgaac tgcgtcgcga 660

actggaactg ctgatgctgg caagcgaaga agatggtgaa gttagttgtc tgattgcaga 720

tcagatttgg tattttaccc agagtgtggc agatagtctg aatctgcgtc gtctggttct 780

ggttaccagc agtctgttta attttcatgc ccatgttagc ctgccgcagt ttgatgaact 840

gggttatctg gatccggatg ataaaacccg tctggaagaa caggccagtg gttttccgat 900

gctgaaagtt aaagatatta agtgtagctt cagcatgtgg aaaaaatata aagaatactt 960

cgagaacatc accaaacaga ccaaagcaag cagcggcgtt atttggaata gttttaaaga 1020

actggaggaa agcgaactgg aaaccgttat tcgtgaaatt ccggcaccga gctttctgat 1080

tccgctgccg aaacatctga ccgccagtag tagcagtctg ctggatcatg atcgcaccgt 1140

ttttccgtgg ctggatcagc agccgagtcg tagtgttctg tatgtgagtt ttggtagcgg 1200

caccgaagtt ctggatgaaa aagattttct ggaaattgca cgcggtctgg ttgatagcaa 1260

acagagtttt ctgtgggtgg tgcgcccggg ctttgttaaa ggcagcacct gggtggaacc 1320

gctgccggat ggttttctgg gcgaacgtgg tcgcattgtg aaatgggttc cgcagcagga 1380

agttctggcc cacggtgcaa ttggcgcatt ttggacccat agcggctgga atagcaccct 1440

ggaaagcgtt tgcgaaggtg tgccgatgat ttttagcgat tttggtctgg atcagccgct 1500

gaatgcccgt tatatgagcg atgttctgaa agtgggcgtg tatctggaaa atggttggga 1560

acgtggtgaa attgccaatg caattcgccg tgttatggtg gatgaagaag gcgaatatat 1620

tcgtcagaat gcccgtgtgc tgaaacagaa agccgatgtg agtctgatga aaggcggtag 1680

cagctatgaa agcctggaaa gcctggtgag ctatattagc agcctggcta gcttggtacg 1740

taccag 1746

<210> 4

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgaaatttg tgaaacgcag aattattgcg ctggtgacaa ttctgatgct gagcgtgaca 60

agcctgtttg cgctgcaacc gagcgcgaaa gcg 93

<210> 5

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atggctaaac cgctgtcaaa aggcggcatt ctggttaaaa aagttctgat tgcaggcgca 60

gttggcacag cagtcctgtt tggcacgctg agtagcggca ttccgggact gccagcagct 120

gatgcg 126

<210> 6

<211> 369

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atggaatatg cagcgattca tcaccagcca ttcagcacag atgcttattc ttatgatggg 60

cggactgtgc atatcaagat tcggacgaaa aaaggtgatg cagatcacat tcgattcatt 120

tggggtgatc cctatgagta caacgacggc aaatggtcgg caaacgagca gccgatgagg 180

aaaattgctg ctacagaaat gcatgactat tggtttgctg aagtggtgcc gccatttagg 240

cgtttacaat atgcgtttgt tgtaacagac gatcatgaag acatcttttt cggaagttcg 300

ggtgtatgcc cttataacga aaaaacactg gaaacgattc attattactt taaatttccg 360

tttgttcac 369

<210> 7

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atggtcagca tccgccgcag cttcgaagcg tatgtcgatg acatgaatat cattactgtt 60

ctgattcctg ctgaacaaaa ggaaatcatg acaccgccg 99

<210> 8

<211> 1763

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cctaaaaagg agcgatttac atatgccccc aaaacaacag tcgtttgaag cttatttaga 60

tgaattgaca atgattacta ttttatttcc gtgccatgtt gaccaaaaac gtgcaccgat 120

atttttttta cgcgatgata aaaaaacagc atatcgctta acgattcgtt caagtgagaa 180

gcatcattca tttataaaat atgagtgtct cgttcctttt atcgttgaat taggaaagcg 240

atatgtcgtt tacacggaag aagggtggca agttccattg caagtaggag ctgtgatgcg 300

cacgaaagcg tttgatgatt tgtatgcata tgacggaaat gatcttggtg aattcatgga 360

cggtaactct tcctcttctc cattgcacgt tgttatctgt ccatggttgg ctttgggtca 420

cttgttgcca tgtttggaca ttgctgagag attggcttcc agaggtcaca gagtttcttt 480

cgtgtccact ccaagaaaca ttgccagatt gccaccattg aggccagctg ttgctccatt 540

ggttgatttc gttgctttgc cattgccaca cgttgacggt ttgccagaag gtgctgaatc 600

cactaacgat gtcccatacg acaagttcga gttgcacaga aaggctttcg atggtttggc 660

tgctccattc tccgagtttt tgagagctgc ttgtgctgaa ggtgcaggtt ctagacctga 720

ctggttgatc gttgatactt tccatcattg ggctgctgct gccgctgttg aaaacaaggt 780

tccatgtgtc atgttgttgt tgggtgctgc tactgttatc gctggtttcg ctagaggtgt 840

ttctgaacat gctgcagctg ccgtcggtaa agaaagacca gctgctgaag ctccatcttt 900

cgagactgag agaagaaagc tgatgactac tcagaacgct tccggtatga ctgttgccga 960

gagatacttc ttgaccctga tgagatctga cttggtcgcc attagatcct gtgctgaatg 1020

ggaaccagaa tccgttgctg ctttgactac tttggctggt aagccagttg tcccattggg 1080

tttgttacca ccatcacctg aaggtggtag aggtgtctct aaagaggatg ctgctgttag 1140

atggttggac gctcaaccag ctaagtccgt tgtttacgtt gccttgggtt ctgaggttcc 1200

attgagagcc gaacaagttc acgaattggc tcttggtttg gagttgtccg gtgctagatt 1260

tttgtgggcc ttgagaaagc caactgatgc tccagatgct gcagttttgc caccaggttt 1320

cgaagagaga actagaggta gaggtttggt tgttaccggt tgggttccac agattggtgt 1380

tttggctcat ggtgctgttg ctgccttttt gactcattgt ggttggaact ccaccatcga 1440

gggtttgttg tttggtcacc cactgattat gctgccaatt tcctctgacc aaggtccaaa 1500

cgccagattg atggaaggta gaaaggttgg tatgcaggtt ccaagagatg aatccgacgg 1560

ttcctttaga agagaggatg ttgccgctac cgttagagct gttgcagttg aagaagatgg 1620

tcgtagagtt ttcactgcca acgccaagaa gatgcaagag atcgttgctg atggtgcctg 1680

tcacgagaga tgcattgatg gtttcatcca gcagctgaga tcctacaagg cttaagcggc 1740

cgcgctagct tggtacgtac cag 1763

Claims

1.蛋白质在作为目的蛋白分子标签中的应用；

所述蛋白质为序列表中序列2第1-109位氨基酸残基组成的蛋白。

2.蛋白质或编码其的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌在提高目的蛋白表达中的应用；

3.蛋白质或编码其的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌在提高目的蛋白在细胞内和/或细胞外的表达中的应用；

4.蛋白质或编码其的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌在使目的蛋白分泌到细胞外表达中的应用；

5.一种提高目的蛋白表达的方法，包括如下步骤：将蛋白质作为目的蛋白的分子标签在宿主细胞中表达，实现提高目的蛋白在宿主细胞内和/或宿主细胞外的表达；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述将权利要求5中所述蛋白质作为目的蛋白的分子标签在宿主细胞中表达为将包含权利要求5中所述蛋白质和目的蛋白的融合蛋白的编码核酸导入所述宿主细胞中。