CN109355268B - 一种重组酶高效表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组酶高效表达的方法，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。此方法通过在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的linker连接氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的短肽大大提高了海藻糖合成酶在宿主细胞中的表达量，对于推动海藻糖的大规模工业化、降低海藻糖的生产成本具有重大的意义。

Description

一种重组酶高效表达的方法
技术领域
本发明涉及一种重组酶高效表达的方法，属于基因工程技术领域以及酶工程技术领域。
背景技术
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1,1键结合而成的非还原性双糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、低等植物及昆虫中。经研究发现，该糖具有独特的生物学功能，有保护生物大分子，保护细胞膜，保护蛋白质免受冷冻、干燥及渗透压变化等造成的破坏的作用，在食品、医药、化妆品、农业等领域均具有广泛应用。
我国海藻糖的生产起步比较晚，以前主要靠日本进口，但是，进口海藻糖的价格高达每吨4～5万元，对于工业生产来说十分昂贵，会大大增加企业的生产成本。
近几年，山东天力、内蒙梅花、湖南汇升等公司已经相继开始自主生产海藻糖，市场规模每年在以1万吨的销量递增，市场前景非常广阔。
但是，各公司的海藻糖都是新开发的产品，生产工艺各异，产品质量十分不稳定，尤其是在产量上，一直未达到领先水平，因此，急需找到一种提高海藻糖产量方法。
早期商业化的海藻糖是从酵母中提取的。1990年价格约700美元/kg，提取率过低，成本过高；1995年日本利用双酶法实现工业化生产，使得海藻糖价格由原来的2万日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg；中国2002年首次以双酶法实现海藻糖的产业化，价格79元/kg。
双酶法以淀粉为原料，在麦芽寡糖基海藻糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生产工艺复杂，难以推广，目前全世界只有几个公司能生产；而海藻糖合成酶以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，是相对经济的生产方法，但仍有很多问题需要研究解决，其中海藻糖合成酶的生产是关键。
因此，挖掘提高海藻糖合成酶的方法对于推动海藻糖的大规模工业化、降低产业成本具有重大的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了重组酶高效表达的方法。此方法通过在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的linker连接氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示的短肽大大提高了海藻糖合成酶在宿主细胞中的表达量，对于推动海藻糖的大规模工业化、降低海藻糖的生产成本具有重大的意义。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种海藻糖合成酶突变体，在海藻糖合成酶亲本的N端通过氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的linker连接氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的短肽。
在本发明的一种实施方式中，所述海藻糖合成酶亲本的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，所述海藻糖合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
本发明提供了编码上述突变体的基因。
本发明提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列、pET系列、或pGEX中的任意一种。
本发明提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
本发明提供了上述突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在高效表达海藻糖合成酶以及生产海藻糖方面的应用。
本发明提供了一种高效表达海藻糖合成酶的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到海藻糖合成酶。
有益效果：
本发明通过对来源于Thermobifida fusca YX的海藻糖合成酶进行改造，大大提高了其在宿主细胞中的表达量(较野生型提高了2.3倍)，对于推动海藻糖的大规模工业化、降低海藻糖的生产成本具有重大的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
酶活检测方法：
预热：取1.9mL的0.2％麦芽糊精溶液(DE 9～13pH 6.0磷酸盐缓冲液)于具塞试管中，置于50℃水浴锅中预热10min。
反应：加入0.1mL稀释后的粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入3mLDNS，振荡均匀，终止反应；煮沸7min，冷却。
测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀；在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。
(酶活定义：每分钟相当于转化一微摩尔葡萄糖变为非还原性糖所需要的酶量。)
海藻糖转化率检测方法：
将实施例3中的反应产物稀释沉淀后用高效液相色谱(HPLC)测定其中海藻糖含量，计算转化率；
转化率计算公式＝海藻糖质量/大米淀粉质量*100/％；
HPLC检测条件：流动相(乙腈：水＝80：20)；流速：0.8mL/min，柱温40℃，NH2柱(APS-2HYPERSIL，Thermo Scientific)，示差折光检测器(RID)。
实施例1：突变体的构建
(1)根据氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示的短肽(分别命名为P1、P2、P3、P4、P5)，化学合成其基因并分别连接至氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9所示的海藻糖合成酶基因序列的N端，并将其克隆至质粒pET24a(+)的Xho I和HindⅢ酶切位点之间，构建得到重组质粒pET24a(+)/P1-enzyme、pET24a(+)/P2-enzyme、pET24a(+)/P3-enzyme、pET24a(+)/P4-enzyme、pET24a(+)/P5-enzyme；
(2)根据氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的linker(分别命名为L1、L2、L3)，化学合成其基因并分别连接至pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-T/L1、pMD18-T/L2、pMD18-T/L3；
(3)以上述重组质粒为模板，设计引物并通过PCR获得线性化的(1)中所述的重组质粒片段以及(2)中所述的linker片段，将得到的两种片段进行同源重组，获得混合质粒(或直接通过化学合成得到短肽、linker以及海藻糖合成酶基因连接后的片段并克隆至质粒pET24a(+)的Xho I和HindⅢ酶切位点之间，获得混合质粒)。
实施例2：突变体的验证
将混合质粒以及转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含30μg/mL卡那霉素)中，在37℃摇床中培养48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液即为粗酶液。
将得到的粗酶液进行酶活检测，得到粗酶液酶活较含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌更高的重组菌，这些重组菌分别含有重组质粒pET24a(+)/P1-L3-enzyme、pET24a(+)/P3-L2-enzyme、pET24a(+)/P2-L3-enzyme以及pET24a(+)/P5-L1-enzyme。
将含有重组质粒pET24a(+)/P1-L3-enzyme、pET24a(+)/P3-L2-enzyme、pET24a(+)/P2-L3-enzyme以及pET24a(+)/P5-L1-enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活与含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶进行比较。
结果如下：含有重组质粒pET24a(+)/P1-L3-enzyme、pET24a(+)/P3-L2-enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活较含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活有了明显的提高，分别为含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活的2.3倍和1.9倍；而含有重组质粒pET24a(+)/P2-L3-enzyme、pET24a(+)/P5-L1-enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活较含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶没有明显改变，仅为含有重组质粒pET24a(+)/enzyme的重组菌分泌的海藻糖合成酶酶活的1.1倍和1.3倍。
实施例3：突变体的应用
在反应器中加入麦芽糖300g/L(含葡萄糖10％)，加入一定量实施例2中获得的野生酶和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的突变体P1-L3-enzyme、P3-L2-enzyme的粗酶液，用20％的氢氧化钠水溶液将pH调节到8.0，在30℃、150rpm的水浴摇床中反应30-50小时定时取样，煮沸10min终止反应后将样品12000rpm离心10min，取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析；
其中，色谱条件如下：示差折光检测器，NH2柱(APS-2HYPERSIL，ThermoScientific)，流动相(水:乙腈＝1:4)，流速：0.8mL·min-1，柱温：40℃。
根据海藻糖的产量，计算麦芽糖转化率(海藻糖与麦芽糖的质量比)，结果如表1所示，以工业级麦芽糖(含葡萄糖10％)为底物，野生酶生产海藻糖转化率为62.5％，而突变体P1-L3-enzyme、P3-L2-enzyme生产海藻糖的转化率并不比野生酶低，分别为61.7％、73.4％。
表1以工业级麦芽糖为底物生产海藻糖的转化率
酶 转化率(％)
野生酶 62.5％
P1-L3-enzyme 61.7％
P3-L2-enzyme 73.4％
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 湖南汇升生物科技有限公司
<120> 一种重组酶高效表达的方法
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Lys Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Lys Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp Lys Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp
1 5 10 15
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Lys Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp Lys Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp
1 5 10 15
Lys Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp
20
<210> 7
<211> 645
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys
1 5 10 15
Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp Lys Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp Lys
20 25 30
Glu Lys Glu Lys Asp Lys Asp Met Thr Thr Gln Pro Ala Pro Gly Ala
35 40 45
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65 70 75 80
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Leu Trp Leu Leu Pro Ile Tyr Glu Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr
115 120 125
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595 600 605
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645
<210> 8
<211> 632
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
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1 5 10 15
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115 120 125
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
His Phe Pro Leu Met Pro Arg Met Phe Met Ala Val Arg Arg Glu Gln
325 330 335
Arg Tyr Pro Ile Ser Glu Ile Leu Ala Gln Thr Pro Pro Ile Pro Arg
340 345 350
Asn Cys Gln Trp Ala Ile Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu
355 360 365
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370 375 380
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Pro Leu Leu Glu Asn Asp Leu Asn Gln Ile Lys Leu Phe Thr Ala Leu
405 410 415
Leu Leu Ser Leu Pro Gly Ser Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile
420 425 430
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245 250 255
Asp Arg Leu Tyr Pro Asp Arg Val Leu Leu Ser Glu Ala Asn Gln Trp
260 265 270
Pro Ala Asp Val Val Asp Tyr Phe Gly Asp Tyr Glu Ser Gly Gly Asp
275 280 285
Glu Cys His Met Asn Phe His Phe Pro Leu Met Pro Arg Met Phe Met
290 295 300
Ala Val Arg Arg Glu Gln Arg Tyr Pro Ile Ser Glu Ile Leu Ala Gln
305 310 315 320
Thr Pro Pro Ile Pro Arg Asn Cys Gln Trp Ala Ile Phe Leu Arg Asn
325 330 335
His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ser Asp Glu Glu Arg Asp Tyr
340 345 350
Met Tyr Ser Glu Tyr Ala Lys Asp Pro Arg Met Arg Ala Asn Met Gly
355 360 365
Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu Leu Glu Asn Asp Leu Asn Gln Ile
370 375 380
Lys Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu Ser Leu Pro Gly Ser Pro Val Leu
385 390 395 400
Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly Asp
405 410 415
Arg Asp Ser Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala
420 425 430
Gly Phe Ser Arg Cys Asp Pro Gly Arg Leu Tyr Leu Pro Val Ile Met
435 440 445
Asp Pro Ile Tyr Gly Tyr Gln Ala Ile Asn Val Glu Ala Gln Gln Asn
450 455 460
Asn Pro Asn Ser Leu Leu Asn Trp Thr Arg Asn Met Ile Gln Ile Arg
465 470 475 480
Lys Gln His Pro Val Phe Gly Thr Gly Asp Phe Thr Glu Leu His Ala
485 490 495
Ser Asn Pro Ser Val Phe Ala Phe Val Arg Glu Tyr Gly Asp Asp Arg
500 505 510
Met Leu Cys Val Asn Asn Leu Ser Arg Phe Pro Gln Pro Val Glu Leu
515 520 525
Asp Leu Arg Arg Phe Glu Gly Ile Thr Pro Ile Glu Cys Thr Gly Gly
530 535 540
Val His Phe Pro Pro Ile Gly Glu Leu Pro Tyr Leu Leu Thr Leu Pro
545 550 555 560
Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Gln Leu Pro Pro Val Ala Glu Glu Gln
565 570 575
Pro Leu Ala Gln Pro Val Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Gln Pro Pro
580 585 590
Ala Pro Ala Asp Arg Pro Ala Ser Asp Pro Thr Gln Arg Ser
595 600 605
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys
1 5 10 15

Claims (8)

1.一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体为pUC系列、pET系列、或pGEX中的任意一种。
5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
7.权利要求1所述的突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3或4所述的重组质粒或权利要求5或6所述的宿主细胞在高效表达海藻糖合成酶以及生产海藻糖方面的应用。
8.一种高效表达海藻糖合成酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求5或6所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到海藻糖合成酶。
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CN108395483A (zh) * 2018-02-13 2018-08-14 天津大学 一种基于贻贝粘附蛋白/两性离子多肽的三嵌段多功能融合蛋白的合成方法及应用
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