CN111172089A

CN111172089A - 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法

Info

Publication number: CN111172089A
Application number: CN202010093045.3A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 吴傲; 张显; 杨套伟; 徐美娟; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2020-05-19

Abstract

本发明公开了一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法，属于生物工程技术领域。本发明首次利用pXMJ19和pDXW‑10等载体将海藻糖合成酶在谷氨酸棒杆菌中进行表达，得到一种重组谷氨酸棒杆菌，以此为工程菌种，进行发酵培养，再用高压匀浆破碎细胞的方法获得大量的海藻糖合成酶酶液，同时并将其应用于海藻糖的制备。本发明的优点主要是利用食品安全的表达系统来进行海藻糖合成酶的生产和海藻糖的合成，表达的海藻糖合成酶没有抗菌活性、内毒素等安全隐患，可以满足食品应用级酶制剂的要求，进一步促进了海藻糖的制备，麦芽糖转化率达40％，扩展了海藻糖的应用范围。

Description

一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法

技术领域

本发明涉及一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成天然非还原性二糖，广泛存在于细菌、真菌、酵母、低等蕨类植物、藻类、昆虫以及无脊椎动物中。

海藻糖对酸和热具有高度稳定性，可防止淀粉老化、蛋白质变性和抑制脂肪酸败，具有矫味矫臭的功能和低吸湿性、低甜度等特性，也被应用于疫苗、酶、活体组织和细胞等的重要活性保护剂。另外，据报道，海藻糖对骨质疏松症、亨廷顿舞蹈症、干眼症等也具有一定程度的辅助治疗作用，所以海藻糖在食品加工业、医药和生化制品业、农业和化妆品等行业都有着广泛的应用，具有巨大的市场需求和广阔的市场前景。可以说，海藻糖已成为世界上最重要的低聚糖资源之一。

目前已知海藻糖合成酶可以利用麦芽糖为底物一步反应生产海藻糖，途径简单方便，产率较高，适用于工业化大规模的生产，具有较强的竞争优势。据研究海藻糖合成酶途径存在于众多不同的微生物中，而且已经有不少直接从原始菌落中进行提取或者利用大肠杆菌进行异源表达的报道。但是原始菌落中提取得到的海藻糖合成酶一般存在浓度和酶活较低的问题，而现有通过微生物法构建基因工程菌来发酵生产海藻糖合成酶的方法中，利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母异源表达海藻糖合成酶也均出现过相关报道，但都存在某些不足。如在大肠杆菌中海藻糖合成酶表达量高，但易形成包涵体，且存在着内毒素等缺陷问题，限制了海藻糖的安全性应用及制备；目前据报道构建产海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌海藻糖合成酶，以5升发酵罐发酵制备海藻糖合成酶，产量最高可达175.89±6.83mg/L。如广西大学黄日波教授团队以整合型枯草芽孢杆菌25℃下转化30g/L麦芽糖合成海藻糖的转化率可达65％，但海藻糖产量较低。北京化工大学张靖坤等在毕赤酵母中进行异源表达且经过基因拷贝数筛选等改进后，可得海藻糖合成酶酶活最高约5000U，但酵母为真核生物，发酵周期较长，进一步应用于工业化稳定生产海藻糖合成酶及海藻糖仍然需要更多的研究。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)现在主要被应用于氨基酸和其他小分子化合物等的生产，有着无内毒素、蛋白分泌能力强、胞外无水解酶活性等优点，是一种极具应用潜力和开发价值的安全性蛋白表达宿主。随着对生物医药重组蛋白生产安全性的重视程度越来越高，已经有利用整合型重组枯草芽孢杆菌中进行海藻糖合成酶的生产和制备海藻糖的研究，但尚还没有在谷氨酸棒杆菌中进行海藻糖合成酶的表达和生产的报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌，是以谷氨酸棒杆菌为宿主，表达编码海藻糖合成酶的基因，所述海藻糖合成酶的来源包括天蓝色链霉菌、谷氨酸棒杆菌或水栖嗜热菌。

在本发明的一种实施方式，所述海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10中的任一所示。

在本发明的一种实施方式，所述海藻糖合成酶来源于天蓝色链霉菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式，所述海藻糖合成酶来源于谷氨酸棒杆菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式，所述海藻糖合成酶来源于水栖嗜热菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主包括谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以pXMJ19或pDXW-10为载体。

本发明的第二个目的是提供应用上述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产海藻糖合成酶的方法，所述发酵的条件是25-35℃、180-200r·min^-1。

本发明的第三个目的是提供一种生产海藻糖的方法，取含上述重组谷氨酸棒杆菌的酶蛋白加入到麦芽糖溶液中，于32-38℃、200-220r·min^-1的条件下进行反应制备海藻糖。

本发明的第四个目的是提供一种可用于生产海藻糖的制剂，所述制剂的成分包含上述重组谷氨酸棒杆菌。

本发明的第五个目的是提供上述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，是用pXMJ19或pDXW-10与编码海藻糖合成酶的基因构建重组质粒，首先导入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组质粒和海藻糖合成酶表达的验证，再从重组大肠杆菌中提取验证正确及可正常表达的重组质粒，转化到谷氨酸棒杆菌中；所述海藻糖合成酶的来源包括天蓝色链霉菌、谷氨酸棒杆菌或水栖嗜热菌。

在本发明的一种实施方式中，所述转化是应用电转转化法进行的。

本发明的第六个目的是提供上述重组谷氨酸棒杆菌在食品、制药或化工领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次将海藻糖合成酶基因在谷氨酸棒杆菌中进行表达，约18h后，海藻糖转化率可达40％。另外，利用食品药品安全的菌株来生产海藻糖合成酶，进行海藻糖的制备，不会产生内毒素，可达到食品级酶制剂和产品的要求，有利于海藻糖的制备，扩展了其应用范围。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大肠杆菌BL21(DE3)购自北纳生物；下述实施例中涉及的Corynebacterium glutamicum ATCC13032购自美国模式培养物集存库(American typeculture collection)，保藏编号为ATCC13032；下述实施例中涉及的Streptomycescoelicolor GDM 4.65购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDM 4.65；下述实施例中涉及的pXMJ19质粒、pDXW-10质粒购自普如汀生物技术(北京)有限公司；下述实施例中涉及的麦芽糖一水合物、葡萄糖、海藻糖二水合物均购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的脑心肉汤BHI液体培养基购自青岛海博生物(上述菌株大肠杆菌BL21(DE3)、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Streptomyces coelicolor GDM 4.65均可以购买得到)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g·L^-1、酵母膏5g·L^-1、NaCl 10g·L^-1。

LB固体培养基(LB平板)：蛋白胨10g·L^-1、酵母膏5g·L^-1、NaCl 10g·L^-1、2％琼脂粉(v/v)。

培养C.glutamicum ATCC13032的脑心肉汤(BHI)培养基：称取购买的成品粉末38.5g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中(固体培养基加入2％左右的琼脂粉即可)。

种子培养基：葡萄糖25g·L^-1、K₂HPO₄·3H₂O 1.5g·L^-1、MgSO₄ 0.6g·L^-1、玉米浆30g·L^-1、FeSO₄·7H₂O 0.005g·L^-1、MnSO₄·4H₂O 0.005g·L^-1、尿素2.5g·L^-1，pH 7.0-7.2。

发酵培养基：葡萄糖140g·L^-1、K₂HPO₄·3H₂O 1.0g·L^-1、MgSO₄ 0.6g·L^-1、玉米浆5g·L^-1、FeSO₄·7H₂O 0.002g·L^-1、MnSO₄·4H₂O 0.002g·L^-1、尿素7.0g·L^-1，pH 7.0-7.2。

补料培养基：葡萄糖600g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

海藻糖合成酶比酶活的测定方法：

1、海藻糖合成酶酶活的测定

将粗酶液用0.2μm的滤膜过滤处理后通过Ni-NTA亲和层析，利用咪唑进行洗脱获得纯化后的酶；反应体系包含100g/L麦芽糖、50mmol/L pH 7.0的磷酸钠缓冲液、30μg纯化后的酶，35℃水浴反应1h，沸水浴10min终止反应；使用HPLC法检测酶活。

HPLC分析：采用HPLC示差法测定底物与产物浓度；其中，色谱条件：色谱柱：NH2柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相：乙腈-水(V/V＝75:25)，检测器：RID Detector，柱温：40℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min。

酶活定义为：每1min生成1μmol的海藻糖的酶量为1个酶活力单位。

2、海藻糖合成酶比酶活的测定

海藻糖合成酶比酶活＝海藻糖合成酶酶活(U)/酶浓度(μg·mL^-1)。

海藻糖转化率的测定方法：

海藻糖转化率＝海藻糖浓度(g·L^-1)/麦芽糖底物浓度(g·L^-1)×100％。

实施例1：构建重组质粒pXMJ19-ScTreS

(1)设计引物：

19/ScT-F：5’-aaacagaattaattaagcttAAAGGAGGGAAATCATGATCGTCAACGAGCCCGTGC-3’(SEQ ID NO.1)，

19/ScT-R：5’-acctgcaggcatgcaagcttTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCGGCGTCCTTGCGCAGG-3’(SEQ ID NO.2)；

以Streptomyces coelicolor GDM 4.65的基因组为模板，根据预先设计好的引物进行PCR扩增后回收扩增产物，得到编码天蓝色链霉菌来源的海藻糖合成酶基因(SEQ IDNO.3)；

(2)含有编码海藻糖合成酶的基因的重组菌的构建

用Hind III对于37℃条件下水浴1h的载体pXMJ19进行单酶切，回收酶切产物并与(1)中回收得到的基因一起用同源重组连接试剂盒混匀后于37℃保持30min进行连接，得到连接产物；将连接产物加入E.coli BL21感受态细胞中后冷激热激，加入800μL LB液体培养基，于37℃、180r·min^-1条件下培养1-1.5h，离心，弃上清；将沉淀在含有10μg·mL^-1氯霉素的平板上涂布并置于37℃培养箱中培养12h；分别挑取阳性克隆子于含有10μg·mL^-1氯霉素的LB液体培养基中，置于37℃培养箱中振荡培养10h；提取质粒进行酶切验证，得到验证成功的重组质粒pXMJ19-ScTreS。

在超净工作台中取5μL pXMJ19-ScTreS质粒与90μL C.glutamicum ATCC13032感受态细胞轻轻混匀，然后将其转移至预冷无菌电极杯中，放入电击仪中电击，电压为1850V，Tc＝5ms；在超净工作台中，向电极杯中加入800μL BHI液体培养基，轻轻对着电击杯中缝隙中菌液吹吸几次，将电极杯中的菌液转移至无菌1.5mL EP管中，46℃水浴6min；将其置于30℃培养箱中振荡培养1-2h；8000r·min^-1离心1min，用移液枪吸700μL上清液丢掉，用移液枪轻轻混匀剩下的液体；将混匀的菌液吸到含有10μg/mL氯霉素的BHI固体培养基上涂布均匀，倒置30℃培养箱中培养16-24h；挑取阳性克隆子于加入10mL含有10μg/mL氯霉素的的BHI液体培养基中，并置于30℃培养箱中振荡培养16-24h；提取质粒进行酶切验证，得到验证成功的重组菌C.glutamicum pXMJ19-ScTreS。

实施例2：构建重组质粒pXMJ19-CgTreS

(1)设计引物：19/CgT-F：aaacagaattaattaagcttAAAGGAGGGAAATCATGAATTCTCAGCCGAGTGCAG(SEQ ID NO.4)；19/CgT-R：acctgcaggcatgcaagcttTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCCATATCGTCCTTTTCA(SEQ ID NO.5)，

以Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的基因组为模板，根据预先设计好的引物进行PCR扩增后回收扩增产物，得到编码谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合成酶基因(SEQ ID No.6)；

(2)同上用Hind III酶切载体pXMJ19，并将回收产物与所得海藻糖合成酶基因连接并先转化导入到E.coli BL21中获得重组质粒pXMJ19-CgTreS。再用电转的方法将质粒pXMJ19-CgTreS导入到谷氨酸棒杆菌中，获得重组菌C.glutamicum pXMJ19-CgTreS。

实施例3：构建重组质粒pXMJ19-TtTreS

将来源于水栖嗜热菌(Thermus aquaticus)的海藻糖糖合酶编码基因进行密码子优化后，通过人工合成的方式获得(SEQ ID NO.7)，并用与实施例1或2类似的方式构建重组质粒pXMJ19-TtTreS，电转化导入谷氨酸棒杆菌中，获得重组菌C.glutamicum pXMJ19-TtTreS。

实施例4：海藻糖合成酶在谷氨酸棒杆菌宿主中的表达

将实施例1得到的重组菌C.glutamicum pXMJ19-ScTreS加入10mL BHI液体培养基中，于30℃、180r·min^-1的条件下培养16h后，以1％的接种量转接入含有10μg·mL^-1氯霉素的50mL BHI液体培养基中，于30℃、180r·min^-1的条件下继续培养5-8h后加入终浓度0.5mM的IPTG于16℃的条件下继续诱导培养12h，得到发酵液。

将发酵液离心，收集菌体，用pH 7.0 50mM磷酸钠缓冲液洗涤并悬浮，加入20μL0.2mg·mL^-1的溶菌酶在冰上静置2h，超声破碎离心取上清得到粗酶液后，检测粗酶液中的海藻糖合成酶酶活。

检测结果为：重组菌C.glutamicum pXMJ19-ScTreS发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶比酶活为33.5U·mg^-1。可见，天蓝色链霉菌来源的海藻糖合成酶可在谷氨酸棒杆菌宿主中表达。利用同样的方法分别测得重组菌C.glutamicum pXMJ19-CgTreS和C.glutamicum pXMJ19-TtTreS的海藻糖比酶活分别为28U·mg^-1、31U·mg^-1。

实施例5：海藻糖的制备

将比酶活较高的实施例1得到的重组菌C.glutamicum pXMJ19-ScTreS在含10μg·mL^-1氯霉素的固体BHI平板划线活化，30℃恒温培养箱培养12-18h，然后挑取单菌落接种于10mL含相同浓度氯霉素的种子培养基小瓶中,30℃、180r·min^-1条件下培养24h获得一级种子。然后按5％的接种量将一级种子液转接入相同的200mL种子培养基大瓶中，于30℃180r·min^-1条件下培养18h左右获得二级种子液，再按10％接种量将二级种子液转接入到含2L发酵培养基的5L发酵罐中，温度控制在30℃，pH通过50％氨水控制在7.0-7.2，通气量1.5vvm，转速600r·min^-1，发酵6-8h，待菌体浓度OD₆₀₀达到20左右时，添加终浓度为0.5mmol·L^-1的IPTG进行诱导产酶。发酵约24h左右，检测残糖低于20-30g·L^-1时，开始补料。继续发酵约40h左右后，发酵结束。发酵液用500mL离心瓶分装，在8000r·min^-1、4℃离心30min，去除培养基上清，用pH 7.0的50mmol·L^-1磷酸钠缓冲液洗涤两次，利用高压匀浆破碎机破碎细胞后再次在8000r·min^-1、4℃的条件下离心30min，取上清即得到海藻糖合成酶粗酶液。

取适量的粗酶液加入到2L pH 7.0的50mM磷酸钠缓冲液配制的100g·L^-1麦芽糖溶液中，于35℃、200r·min^-1的条件下进行反应制备海藻糖。约18h后，麦芽糖转化率可达40％，海藻糖产量达40g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

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<400> 2

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<212> DNA

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ccggattggt tcaagcgcgc cgtcttctac gaggtcctgg tccgctcctt ccaggacagc 120

aacggcgacg gcgtcggcga cctcaaaggc ctgacggcca aactcgacta tctgcaatgg 180

ctcggcgtcg actgcctgtg gctgccgccc ttcttcaagt caccgctgag ggacggcggc 240

tacgacgtct ccgactacac ctccgtactc cccgaattcg gcgacctcgc cgacttcgtg 300

gaattcgtgg actccgccca ccagcgcggt atgcgggtca tcatcgactt cgtcatgaac 360

cacaccagcg accagcaccc gtggttccag gagtcgagga aagaccccga cggcccctac 420

ggcgactact acgtgtgggc cgacgacgac aaggcatacg gcgacgcgcg catcatcttc 480

gtcgacaccg aggcctccaa ctggaccttc gacccggtcc gcaagcagta cttcttccac 540

cgcttcttct cccaccagcc ggatctcaac tacgagaacc cgaccgtgca ggaggagatc 600

atctccgccc tgcggttctg gctggacctg ggaatcgacg gcttccggct cgatgccgtg 660

ccgtatctgt atgcgcagga gggcaccaac tgcgagaacc tgccggcgac ccatgagttc 720

ctcaagcggg tccgcaagga gatcgacgcc cactacccgg acacggtgct gctggcggag 780

gccaaccagt ggccggagga cgtcgtcgac tatttcggcg acttccgcag cggcggcgac 840

gagtgccaca tggccttcca cttcccggtg atgccgcgga tcttcatggc cgtacggcgg 900

gaatcccgct acccggtctc ggaaatcctc gccaagacac cggccatccc ctccggctgc 960

caatggggca tcttcctgcg caaccacgac gagctgaccc tcgaaatggt caccgacgag 1020

gaacgcgact acatgtacgc ggagtacgcg aaggacccgc gtatgcgcgc caacatcggt 1080

atccgcaggc gcctcgcccc gctcctcgac aacgaccgca accagatcga gctgttcacc 1140

gccttgctgc tgtcgctccc cggctcgccg atcctctact acggcgacga gatcggcatg 1200

ggcgacaaca tctggctcgg cgaccgcgac gccgtccgca cgcccatgca gtggaccccg 1260

gaccgcaacg cgggcttctc gtccagtgac ccggggcggc tgttcctgcc ggcgatcatg 1320

gacccggtct acggctacca ggtgaccaac gtcgaggcgt cgatggcctc cccgtcctca 1380

ctcctgcact ggacgcgccg gatgatcgag atccgcaagc agaaccccgc tttcggactc 1440

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<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

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acctgcaggc atgcaagctt ttagtggtgg tggtggtggt gttccatatc gtccttttca 60

<210> 6

<211> 1797

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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aaatatcctc aggcagtctc gcttgatttg cgtgaatttg caggacacac ccctcgagag 1680

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<400> 7

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gacggttacg acatctctga ctactaccag atcctgccgg ttcacggtac cctggaagac 240

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tacctgtacg aacgtgaagg tacctcttgc gaaaacctgc cggaaaccat cgaagctgtt 660

aaacgtctgc gtaaagctct ggaagaacgt tacggtccgg gtaaaatcct gctggctgaa 720

gttaacatgt ggccggaaga aaccctgccg tacttcggtg acggtgacgg tgttcacatg 780

gcttacaact tcccgctgat gccgcgtatc ttcatggctc tgcgtcgtga agaccgtggt 840

ccgatcgaaa ccatgctgaa agaagctgaa ggtatcccgg aaaccgctca gtgggctctg 900

ttcctgcgta accacgacga actgaccctg gaaaaagtta ccgaagaaga acgtgaattc 960

atgtacgaag cttacgctcc ggacccgaaa ttccgtatca acctgggtat ccgtcgtcgt 1020

ctgatgccgc tgctgggtgg tgaccgtcgt cgttacgaac tgctgaccgc tctgctgctg 1080

accctgaaag gtaccccgat cgtttactac ggtgacgaaa tcggtatggg tgacaacccg 1140

ttcctgggtg accgtaacgg tgttcgtacc ccgatgcagt ggtctcagga ccgtatcgtt 1200

gctttctctc gtgctccgta ccacgctctg ttcctgccgc cggtttctga aggtccgtac 1260

tcttaccact tcgttaacgt tgaagctcag cgtgaaaacc cgcactctct gctgtctttc 1320

aaccgtcgtt tcctggctct gcgtaaccag cacgctaaaa tcttcggtcg tggttctctg 1380

accctgctgc cggttgaaaa ccgtcgtgtt ctggcttacc tgcgtgaaca cgaaggtgaa 1440

cgtgttctgg ttgttgctaa cctgtctcgt tacacccagg ctttcgacct gccgctggaa 1500

gcttaccagg gtctggttcc ggttgaactg ttctctcagc agccgttccc gccggttgaa 1560

ggtcgttacc gtctgaccct gggtccgcac ggtttcgctc tgttcgctct gaaaccggtt 1620

gaagctgttc tgcacctgcc gtctccggac tgggctgaag aaccggctcc ggaagaagct 1680

gacctgccgc gtgttcacat gccgggtggt ccggaagttc tgctggttga caccctggtt 1740

cacgaacgtg gtcgtgaaga actgctgaac gctctggctc agaccctgaa agaaaaatct 1800

tggctggctc tgaaaccgca gaaagttgct ctgctggacg ctctgcgttt ccagaaagac 1860

ccgccgctgt acctgaccct gctgcagctg gaaaaccacc gtaccctgca ggtttctctg 1920

ccgctgctgt ggtctccgca gcgtcgtgaa ggtccgggtc tgttcgctcg tacccacggt 1980

cagccgggtt acttctacga actgtctctg gacccgggtt tctaccgtct gctgctggct 2040

cgtctgaaag aaggtttcga aggtcgttct ctgcgtgctt actaccgtgg tcgtcacccg 2100

ggtccggttc cggaagctgt tgacctgctg cgtccgggtc tggctgctgg tgaaggtgtt 2160

tgggttcagc tgggtctggt tcaggacggt ggtctggacc gtaccgaacg tgttctgccg 2220

cgtctggacc tgccgtgggt tctgcgtccg gaaggtggtc tgttctggga acgtggtgct 2280

tctcgtcgtg ttctggctct gaccggttct ctgccgccgg gtcgtccgca ggacctgttc 2340

gctgctctgg aagttcgtct gctggaatct ctgccgcgtc tgcgtggtca cgctccgggt 2400

accccgggtc tgctgccggg tgctctgcac gaaaccgaag ctctggttcg tctgctgggt 2460

gttcgtctgg ctctgctgca ccgtgctctg ggtgaagttg aaggtgttgt tggtggtcac 2520

ccgctgctgg gtcgtggtct gggtgctttc ctggaactgg aaggtgaagt ttacctggtt 2580

gctctgggtg ctgaaaaacg tggtaccgtt gaagaagacc tggctcgtct ggcttacgac 2640

gttgaacgtg ctgttcacct ggctctggaa gctctggaag ctgaactgtg ggctttcgct 2700

gaagaagttg ctgaccacct gcacgctgct ttcctgcagg cttaccgttc tgctctgccg 2760

gaagaagctc tggaagaagc tggttggacc cgtcacatgg ctgaagttgc tgctgaacac 2820

ctgcaccgtg aagaacgtcc ggctcgtaaa cgtatccacg aacgttggca ggctaaagct 2880

ggtaaagctt aa 2892

<210> 8

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Ile Val Asn Glu Pro Val Gln Asp Thr Phe Glu Asp Thr Pro Ala

1 5 10 15

Lys Asp Arg Asp Pro Asp Trp Phe Lys Arg Ala Val Phe Tyr Glu Val

20 25 30

Leu Val Arg Ser Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu

35 40 45

Lys Gly Leu Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Val Asp

50 55 60

Cys Leu Trp Leu Pro Pro Phe Phe Lys Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Thr Ser Val Leu Pro Glu Phe Gly Asp Leu

85 90 95

Ala Asp Phe Val Glu Phe Val Asp Ser Ala His Gln Arg Gly Met Arg

100 105 110

Val Ile Ile Asp Phe Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Pro Trp

115 120 125

Phe Gln Glu Ser Arg Lys Asp Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Asp Tyr Tyr

130 135 140

Val Trp Ala Asp Asp Asp Lys Ala Tyr Gly Asp Ala Arg Ile Ile Phe

145 150 155 160

Val Asp Thr Glu Ala Ser Asn Trp Thr Phe Asp Pro Val Arg Lys Gln

165 170 175

Tyr Phe Phe His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Glu

180 185 190

Asn Pro Thr Val Gln Glu Glu Ile Ile Ser Ala Leu Arg Phe Trp Leu

195 200 205

Asp Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr

210 215 220

Ala Gln Glu Gly Thr Asn Cys Glu Asn Leu Pro Ala Thr His Glu Phe

225 230 235 240

Leu Lys Arg Val Arg Lys Glu Ile Asp Ala His Tyr Pro Asp Thr Val

245 250 255

Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Asp Val Val Asp Tyr Phe

260 265 270

Gly Asp Phe Arg Ser Gly Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe

275 280 285

Pro Val Met Pro Arg Ile Phe Met Ala Val Arg Arg Glu Ser Arg Tyr

290 295 300

Pro Val Ser Glu Ile Leu Ala Lys Thr Pro Ala Ile Pro Ser Gly Cys

305 310 315 320

Gln Trp Gly Ile Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met

325 330 335

Val Thr Asp Glu Glu Arg Asp Tyr Met Tyr Ala Glu Tyr Ala Lys Asp

340 345 350

Pro Arg Met Arg Ala Asn Ile Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu

355 360 365

Leu Asp Asn Asp Arg Asn Gln Ile Glu Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu

370 375 380

Ser Leu Pro Gly Ser Pro Ile Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met

385 390 395 400

Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly Asp Arg Asp Ala Val Arg Thr Pro Met

405 410 415

Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala Gly Phe Ser Ser Ser Asp Pro Gly

420 425 430

Arg Leu Phe Leu Pro Ala Ile Met Asp Pro Val Tyr Gly Tyr Gln Val

435 440 445

Thr Asn Val Glu Ala Ser Met Ala Ser Pro Ser Ser Leu Leu His Trp

450 455 460

Thr Arg Arg Met Ile Glu Ile Arg Lys Gln Asn Pro Ala Phe Gly Leu

465 470 475 480

Gly Thr Tyr Thr Glu Leu Gln Ser Ser Asn Pro Ala Val Ile Ala Phe

485 490 495

Leu Arg Glu Tyr Glu Asp Asp Leu Val Leu Cys Val Asn Asn Phe Ser

500 505 510

Arg Phe Ala Gln Pro Thr Glu Leu Asp Leu Arg Arg Phe Asn Gly Arg

515 520 525

His Pro Val Glu Leu Phe Gly Gly Val Arg Phe Pro Ala Ile Gly Glu

530 535 540

Leu Pro Tyr Leu Leu Thr Leu Gly Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Arg

545 550 555 560

Leu Arg Lys Asp Ala Ala

565

<210> 9

<211> 598

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Asn Ser Gln Pro Ser Ala Asp His His Pro Asp His Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Val Leu Asp Ala His Gly Leu Ile Val Glu His Glu Ser Glu Glu

20 25 30

Phe Pro Val Pro Ala Pro Ala Pro Gly Glu Gln Pro Trp Glu Lys Lys

35 40 45

Asn Arg Glu Trp Tyr Lys Asp Ala Val Phe Tyr Glu Val Leu Val Arg

50 55 60

Ala Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Gly Val Gly Ser Leu Lys Gly Leu

65 70 75 80

Thr Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Trp Leu Gly Val Asp Cys Ile Trp

85 90 95

Ile Pro Pro Phe Tyr Asp Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp Ile

100 105 110

Arg Asn Phe Arg Glu Ile Leu Pro Glu Phe Gly Thr Val Asp Asp Phe

115 120 125

Val Glu Leu Val Asp His Ala His Arg Arg Gly Leu Arg Val Ile Thr

130 135 140

Asp Leu Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Ala Trp Phe Gln Glu

145 150 155 160

Ser Arg Arg Asp Pro Thr Gly Pro Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Trp Ser

165 170 175

Asp Asp Pro Thr Leu Tyr Asn Glu Ala Arg Ile Ile Phe Val Asp Thr

180 185 190

Glu Glu Ser Asn Trp Thr Tyr Asp Pro Val Arg Gly Gln Tyr Phe Trp

195 200 205

His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Asp Asn Pro Ala

210 215 220

Val Gln Glu Ala Met Leu Asp Val Leu Arg Phe Trp Leu Asp Leu Gly

225 230 235 240

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Phe Glu Arg Glu

245 250 255

Gly Thr Asn Gly Glu Asn Leu Lys Glu Thr His Asp Phe Leu Lys Leu

260 265 270

Cys Arg Ser Val Ile Glu Lys Glu Tyr Pro Gly Arg Ile Leu Leu Ala

275 280 285

Glu Ala Asn Gln Trp Pro Gln Asp Val Val Glu Tyr Phe Gly Glu Lys

290 295 300

Asp Lys Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe Pro Leu Met Pro

305 310 315 320

Arg Ile Phe Met Gly Val Arg Gln Gly Ser Arg Thr Pro Ile Ser Glu

325 330 335

Ile Leu Ala Asn Thr Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ala Gln Trp Gly Ile

340 345 350

Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ser Asp Glu

355 360 365

Glu Arg Ser Tyr Met Tyr Ser Gln Phe Ala Ser Glu Pro Arg Met Arg

370 375 380

Ala Asn Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asp

385 390 395 400

Arg Asn Gln Leu Glu Leu Leu His Gly Leu Leu Leu Ser Leu Pro Gly

405 410 415

Ser Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile

420 425 430

Trp Leu His Asp Arg Asp Gly Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Ser Asn

435 440 445

Asp Arg Asn Gly Gly Phe Ser Lys Ala Asp Pro Glu Arg Leu Tyr Leu

450 455 460

Pro Ala Ile Gln Asn Asp Gln Tyr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Val Glu

465 470 475 480

Ser Gln Leu Asn Arg Glu Asn Ser Leu Leu Arg Trp Leu Arg Asn Gln

485 490 495

Ile Leu Ile Arg Lys Gln Tyr Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Tyr Arg

500 505 510

Glu Val Ser Ser Thr Asn Glu Ser Val Leu Thr Phe Leu Arg Glu His

515 520 525

Lys Gly Gln Thr Ile Leu Cys Val Asn Asn Met Ser Lys Tyr Pro Gln

530 535 540

Ala Val Ser Leu Asp Leu Arg Glu Phe Ala Gly His Thr Pro Arg Glu

545 550 555 560

Met Ser Gly Gly Gln Leu Phe Pro Thr Ile Ala Glu Arg Glu Trp Ile

565 570 575

Val Thr Leu Ala Pro His Gly Phe Phe Trp Phe Asp Leu Thr Ala Asp

580 585 590

Glu Lys Asp Asp Met Glu

595

<210> 10

<211> 963

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Asp Pro Leu Trp Tyr Lys Asp Ala Val Ile Tyr Gln Leu His Val

1 5 10 15

Arg Ser Phe Phe Asp Ala Asn Asn Asp Gly Tyr Gly Asp Phe Glu Gly

20 25 30

Leu Arg Arg Lys Leu Pro Tyr Leu Glu Glu Leu Gly Val Asn Thr Leu

35 40 45

Trp Leu Met Pro Phe Phe Gln Ser Pro Leu Arg Asp Asp Gly Tyr Asp

50 55 60

Ile Ser Asp Tyr Tyr Gln Ile Leu Pro Val His Gly Thr Leu Glu Asp

65 70 75 80

Phe Thr Val Asp Glu Ala His Gly Arg Gly Met Lys Val Ile Ile Glu

85 90 95

Leu Val Leu Asn His Thr Ser Ile Asp His Pro Trp Phe Gln Glu Ala

100 105 110

Arg Lys Pro Asn Ser Pro Met Arg Asp Trp Tyr Val Trp Ser Asp Thr

115 120 125

Pro Glu Lys Tyr Lys Gly Val Arg Val Ile Phe Lys Asp Phe Glu Thr

130 135 140

Ser Asn Trp Thr Phe Asp Pro Val Ala Lys Ala Tyr Tyr Trp His Arg

145 150 155 160

Phe Tyr Trp His Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Ser Pro Glu Val Glu

165 170 175

Lys Ala Ile His Gln Val Met Phe Phe Trp Ala Asp Leu Gly Val Asp

180 185 190

Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Tyr Glu Arg Glu Gly Thr

195 200 205

Ser Cys Glu Asn Leu Pro Glu Thr Ile Glu Ala Val Lys Arg Leu Arg

210 215 220

Lys Ala Leu Glu Glu Arg Tyr Gly Pro Gly Lys Ile Leu Leu Ala Glu

225 230 235 240

Val Asn Met Trp Pro Glu Glu Thr Leu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Asp

245 250 255

Gly Val His Met Ala Tyr Asn Phe Pro Leu Met Pro Arg Ile Phe Met

260 265 270

Ala Leu Arg Arg Glu Asp Arg Gly Pro Ile Glu Thr Met Leu Lys Glu

275 280 285

Ala Glu Gly Ile Pro Glu Thr Ala Gln Trp Ala Leu Phe Leu Arg Asn

290 295 300

His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Lys Val Thr Glu Glu Glu Arg Glu Phe

305 310 315 320

Met Tyr Glu Ala Tyr Ala Pro Asp Pro Lys Phe Arg Ile Asn Leu Gly

325 330 335

Ile Arg Arg Arg Leu Met Pro Leu Leu Gly Gly Asp Arg Arg Arg Tyr

340 345 350

Glu Leu Leu Thr Ala Leu Leu Leu Thr Leu Lys Gly Thr Pro Ile Val

355 360 365

Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Pro Phe Leu Gly Asp

370 375 380

Arg Asn Gly Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Ser Gln Asp Arg Ile Val

385 390 395 400

Ala Phe Ser Arg Ala Pro Tyr His Ala Leu Phe Leu Pro Pro Val Ser

405 410 415

Glu Gly Pro Tyr Ser Tyr His Phe Val Asn Val Glu Ala Gln Arg Glu

420 425 430

Asn Pro His Ser Leu Leu Ser Phe Asn Arg Arg Phe Leu Ala Leu Arg

435 440 445

Asn Gln His Ala Lys Ile Phe Gly Arg Gly Ser Leu Thr Leu Leu Pro

450 455 460

Val Glu Asn Arg Arg Val Leu Ala Tyr Leu Arg Glu His Glu Gly Glu

465 470 475 480

Arg Val Leu Val Val Ala Asn Leu Ser Arg Tyr Thr Gln Ala Phe Asp

485 490 495

Leu Pro Leu Glu Ala Tyr Gln Gly Leu Val Pro Val Glu Leu Phe Ser

500 505 510

Gln Gln Pro Phe Pro Pro Val Glu Gly Arg Tyr Arg Leu Thr Leu Gly

515 520 525

Pro His Gly Phe Ala Leu Phe Ala Leu Lys Pro Val Glu Ala Val Leu

530 535 540

His Leu Pro Ser Pro Asp Trp Ala Glu Glu Pro Ala Pro Glu Glu Ala

545 550 555 560

Asp Leu Pro Arg Val His Met Pro Gly Gly Pro Glu Val Leu Leu Val

565 570 575

Asp Thr Leu Val His Glu Arg Gly Arg Glu Glu Leu Leu Asn Ala Leu

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Ala Gln Thr Leu Lys Glu Lys Ser Trp Leu Ala Leu Lys Pro Gln Lys

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Val Ala Leu Leu Asp Ala Leu Arg Phe Gln Lys Asp Pro Pro Leu Tyr

610 615 620

Leu Thr Leu Leu Gln Leu Glu Asn His Arg Thr Leu Gln Val Ser Leu

625 630 635 640

Pro Leu Leu Trp Ser Pro Gln Arg Arg Glu Gly Pro Gly Leu Phe Ala

645 650 655

Arg Thr His Gly Gln Pro Gly Tyr Phe Tyr Glu Leu Ser Leu Asp Pro

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Gly Phe Tyr Arg Leu Leu Leu Ala Arg Leu Lys Glu Gly Phe Glu Gly

675 680 685

Arg Ser Leu Arg Ala Tyr Tyr Arg Gly Arg His Pro Gly Pro Val Pro

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Glu Ala Val Asp Leu Leu Arg Pro Gly Leu Ala Ala Gly Glu Gly Val

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Trp Val Gln Leu Gly Leu Val Gln Asp Gly Gly Leu Asp Arg Thr Glu

725 730 735

Arg Val Leu Pro Arg Leu Asp Leu Pro Trp Val Leu Arg Pro Glu Gly

740 745 750

Gly Leu Phe Trp Glu Arg Gly Ala Ser Arg Arg Val Leu Ala Leu Thr

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Gly Ser Leu Pro Pro Gly Arg Pro Gln Asp Leu Phe Ala Ala Leu Glu

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Val Arg Leu Leu Glu Ser Leu Pro Arg Leu Arg Gly His Ala Pro Gly

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Thr Pro Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu His Glu Thr Glu Ala Leu Val

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Arg Leu Leu Gly Val Arg Leu Ala Leu Leu His Arg Ala Leu Gly Glu

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Val Glu Gly Val Val Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Arg Gly Leu Gly

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Ala Phe Leu Glu Leu Glu Gly Glu Val Tyr Leu Val Ala Leu Gly Ala

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Glu Lys Arg Gly Thr Val Glu Glu Asp Leu Ala Arg Leu Ala Tyr Asp

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Val Glu Arg Ala Val His Leu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Ala Glu Leu

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Trp Ala Phe Ala Glu Glu Val Ala Asp His Leu His Ala Ala Phe Leu

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Gln Ala Tyr Arg Ser Ala Leu Pro Glu Glu Ala Leu Glu Glu Ala Gly

915 920 925

Trp Thr Arg His Met Ala Glu Val Ala Ala Glu His Leu His Arg Glu

930 935 940

Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Ile His Glu Arg Trp Gln Ala Lys Ala

945 950 955 960

Gly Lys Ala

Claims

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为宿主，表达编码海藻糖合成酶的基因；所述海藻糖合成酶的来源包括天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、谷氨酸棒杆菌或水栖嗜热菌(Thermus aquaticus)。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10中的任一所示。

3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述宿主包括谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。

4.根据权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以pXMJ19或pDXW-10为载体。

5.应用权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌发酵生产海藻糖合成酶的方法，其特征在于，所述发酵的条件是25-35℃、180-200r·min^-1。

6.一种生产海藻糖的方法，其特征在于，将含权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的酶蛋白加入到麦芽糖溶液中，于32-38℃、200-220r·min^-1的条件下进行反应制备海藻糖。

7.一种可用于生产海藻糖的制剂，其特征在于，所述制剂的成分包含权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌。

8.构建权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，所述方法是用pXMJ19或pDXW-10与编码海藻糖合成酶的基因构建重组质粒，首先导入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组质粒和海藻糖合成酶表达的验证，再从得到的重组大肠杆菌中提取验证正确且可正常表达的重组质粒，转化到谷氨酸棒杆菌中；所述海藻糖合成酶的来源包括天蓝色链霉菌、谷氨酸棒杆菌或水栖嗜热菌。

9.根据权利要求8所述的方法，所述转化是应用电转转化法进行的。

10.权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌在食品、制药或化工领域中的应用。