CN113151337A - 一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法和应用 - Google Patents
一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌利用EF‑Tu启动子表达海藻糖合酶的方法和应用，通过将谷氨酸棒杆菌ATCC13032中翻译延伸因子EF‑Tu的启动子PEF‑Tu融合于谷氨酸棒杆菌ATCC13032海藻糖合酶基因上游，并克隆至谷氨酸棒杆菌诱导表达质粒pXMJ19上，可在谷氨酸棒杆菌中不用经过诱导即可过量表达海藻糖合酶，并且可用于转化麦芽糖合成海藻糖。本发明利用谷氨酸棒杆菌内源强组成型表达启动子表达目标蛋白，可不用经过诱导即可实现过量表达，实际生产中有利于降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法和应用。
背景技术
海藻糖是一种由α,α-1,1-糖苷键联结葡萄糖分子组成的非还原性双糖，其稳定性远超麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等其他糖类小分子。海藻糖对生物体组织、细胞和生物大分子具有特异性保护作用。可用于保持细胞活性，防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质，增强保湿类化妆品功能。因此，海藻糖在医药、食品和化妆品行业具有广阔应用前景。
海藻糖可采用化学合成法、微生物发酵法和酶转化法生产。化学合成法生产海藻糖产率低、分离困难，难以实现工业化。微生物发酵法转化率低，发酵液副产物多，使海藻糖的分离纯化困难。日本味之素利用变异谷氨酸生产菌，发酵生产海藻糖产量为40g/L。酶转化法生产海藻糖工艺中海藻糖合成酶以麦芽糖为底物生成海藻糖，且不需要消耗能量物质。海藻糖合成酶可催化麦芽糖和海藻糖之间的异构化反应，即α,α-1,4糖苷键和α,α-1,1糖苷键之间的转化。酶法转化合成海藻糖，转化效率高，且催化剂可重复使用。
现有技术中的酶法转化合成海藻糖研究中通过将质粒重组到大肠杆菌中表达海藻糖合酶，但是应用重组菌株表达蛋白时，常用的用于蛋白表达的质粒所带启动子为诱导型启动子，因此重组蛋白表达大多需要经过诱导，如在合适的培养时间添加诱导剂或调整培养温度等。蛋白诱导表达操作增加了工艺流程和控制难度，实际生产中也会增加生产成本。
发明内容
针对现有技术中所涉及的如何获取非诱导型的表达海藻糖合酶的问题，本发明提出一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法和应用。
实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，包括以下步骤：
以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，将PEF-Tu启动子置于海藻糖合酶基因Cgtrs前端，获得PEF-Tu-Cgtrs基因片段；
将PEF-Tu-Cgtrs基因片段克隆至pXMJ19质粒HindIII、XbaI位点处，获得pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs质粒；
将pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs质粒电转化至C.glutamicum ATCC13032中，获得pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032菌株。
作为本发明的进一步改进，所述PEF-Tu启动子序列如SEQ ID NO.1-4所示。
作为本发明的进一步改进，所述海藻糖合酶基因Cgtrs序列如SEQ ID NO.5-35所示。
作为本发明的进一步改进，所述获得PEF-Tu-Cgtrs基因片段过程为
利用引物PEF-Tu-trsHindIIIF1和引物PEF-Tu-trsR1 PCR扩增PEF-Tu启动子基因片段，利用引物PEF-Tu-trsF2和引物PEF-Tu-trsXbaIR2 PCR扩增海藻糖合酶基因Cgtrs片段；
以PEF-Tu启动子基因片段和海藻糖合酶基因Cgtrs片段混合物为模板，利用引物PEF-Tu-trsHindIIIF1和PEF-Tu-trsXbaIR2重叠延伸PCR扩增获得PEF-Tu启动子与海藻糖合酶基因融合片段PEF-Tu-Cgtrs。
作为本发明的进一步改进，所述引物PEF-Tu-trsHindIIIF1序列如SEQ ID NO.36所示；
所述引物PEF-Tu-trsR1序列如SEQ ID NO.37所示；
所述引物PEF-Tu-trsF2序列如SEQ ID NO.38所示；
所述引物PEF-Tu-trsXbaIR2序列如SEQ ID NO.39所示。
作为本发明的进一步改进，所述获得pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032菌株过程中，所述电击的电压为1800V/mm，电击时间为5ms。
本发明还提供了一种转化麦芽糖合成海藻糖的谷氨酸棒杆菌，根据以上所述的一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法获得的菌株。
本发明的有益效果：本发明通过将C.glutamicum ATCC13032内源强组成型表达启动子PEF-Tu融合于C.glutamicum ATCC13032海藻糖合酶基因Cgtrs上游，获得融合片段PEF-Tu-Cgtrs。将PEF-Tu-Cgtrs基因片段克隆至pXMJ19质粒上，并电转化至C.glutamicumATCC13032。获得的菌株pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032可不用诱导即可表达海藻糖合酶，并能用于转化麦芽糖合成海藻糖。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.材料选择
所使用的谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032，通过购买获得。C.glutamicumATCC13032 PEF-Tu启动子序列如SEQ ID NO.1所示，C.glutamicum ATCC13032海藻糖合酶基因Cgtrs序列如SEQ ID NO.2所示。
2.引物设计
利用PCR扩增技术，以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板扩增PEF-Tu启动子基因片段和海藻糖合酶基因Cgtrs。所述设计的序列表1如下：
表1：引物序列
3.基因重组
(1)以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，利用引物PEF-Tu-trsHindIIIF1和PEF-Tu-trsR1 PCR扩增PEF-Tu启动子基因片段，利用引物PEF-Tu-trsF2和PEF-Tu-trsXbaIR2 PCR扩增海藻糖合酶基因Cgtrs片段。
(2)以PEF-Tu启动子基因片段和海藻糖合酶基因Cgtrs片段混合物为模板，利用引物PEF-Tu-trsHindIIIF1和PEF-Tu-trsXbaIR2重叠延伸PCR扩增获得PEF-Tu启动子与海藻糖合酶基因融合片段PEF-Tu-Cgtrs。
(3)PEF-Tu-Cgtrs基因片段和pXMJ19质粒利用HindIII和XbaI限制性内切酶双酶切并连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态，挑取转化子并提取质粒验证，构建质粒pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs。
(4)将pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs质粒电击转化C.glutamicum ATCC13032，经1800V，5ms电击后涂布于含有氯霉素的LBG固体培养基平板，30℃培养36h，长出的转化子菌株进行培养并提取质粒验证，验证正确的菌株命名为pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032。
4.结果验证
将pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032与C.glutamicum ATCC13032菌株利用LBG培养基在30℃、摇床转速180r/min条件下培养，并对pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032菌株设置不诱导和添加0.5mM的IPTG诱导实验。
将培养12h的菌液收集，4℃离心收集菌体，菌体利用50mM的pH7.0磷酸钾缓冲液悬浮，超声破碎细胞，细胞破碎液离心取上清得到粗酶液。粗酶液用于测定海藻糖合酶酶活力，并用于转化麦芽糖合成海藻糖。
海藻糖合酶酶活定义为：每1min生成1μg海藻糖的酶量为1个酶活力单位(1U)
海藻糖合酶比酶活为每毫克蛋白中含有的海藻糖合酶酶活。
海藻糖合酶酶活测定反应体系包含麦芽糖8g/L、10mM的pH7.0磷酸钾缓冲液和适量粗酶液，25℃水浴反应并取样，取样后沸水浴10min终止反应，检测样品中的海藻糖含量。
海藻糖合酶酶活情况列于表2。
表2：海藻糖合酶酶活分析
海藻糖合酶酶活测定体系反应6h，取样检测反应体系中海藻糖含量，结果列于表3。
表3：海藻糖含量分析
由此可知，通过本发明所采用的利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，将C.glutamicum ATCC13032内源强组成型表达启动子PEF-Tu融合于C.glutamicum ATCC13032海藻糖合酶基因Cgtrs上游，并克隆至pXMJ19质粒，利用EF-Tu启动子C.glutamicum不用经过诱导即可过量表达海藻糖合酶，并且可用于转化麦芽糖合成海藻糖。因此，利用EF-Tu启动子可在C.glutamicum中过量表达目标蛋白，并可省去诱导操作，实际生产中可降低生产成本。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 山东恒仁工贸有限公司
<120> 一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法和应用
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tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60
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ctagtctaga ttattccata tcgtcctttt catcg 35
Claims (7)
1.一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以C. glutamicum ATCC13032基因组为模板，将PEF-Tu启动子置于海藻糖合酶基因Cgtrs前端，获得PEF-Tu-Cgtrs基因片段；
将PEF-Tu-Cgtrs基因片段克隆至pXMJ19质粒HindIII、XbaI位点处，获得pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs质粒；
将pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs质粒电转化至C. glutamicum ATCC13032中，获得pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032菌株。
2.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，其特征在于：所述PEF-Tu启动子序列如SEQ ID NO.1-4所示。
3.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，其特征在于：所述海藻糖合酶基因Cgtrs序列如SEQ ID NO.5-35所示。
4.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，其特征在于：所述获得PEF-Tu-Cgtrs基因片段过程为
利用引物PEF-Tu-trsHindIIIF1和引物PEF-Tu-trsR1 PCR扩增PEF-Tu启动子基因片段，利用引物PEF-Tu-trsF2和引物PEF-Tu-trsXbaIR2 PCR扩增海藻糖合酶基因Cgtrs片段；
以PEF-Tu启动子基因片段和海藻糖合酶基因Cgtrs片段混合物为模板，利用引物PEF-Tu-trsHindIIIF1和PEF-Tu-trsXbaIR2重叠延伸PCR扩增获得PEF-Tu启动子与海藻糖合酶基因融合片段PEF-Tu-Cgtrs。
5.根据权利要求4所述的一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，其特征在于：
所述引物PEF-Tu-trsHindIIIF1序列如SEQ ID NO.36所示；
所述引物PEF-Tu-trsR1序列如SEQ ID NO.37所示；
所述引物PEF-Tu-trsF2序列如SEQ ID NO.38所示；
所述引物PEF-Tu-trsXbaIR2序列如SEQ ID NO.39所示。
6.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法，其特征在于：所述获得pXMJ19-PEF-Tu-Cgtrs/13032菌株过程中，所述电击的电压为1800V/mm，电击时间为5ms。
7.一种转化麦芽糖合成海藻糖的谷氨酸棒杆菌，其特征在于：根据权利要求1-6任一项所述的一种谷氨酸棒杆菌利用EF-Tu启动子表达海藻糖合酶的方法获得的菌株。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172089A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-19 | 江南大学 | 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法 |
| CN113913483A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-01-11 | 常州大学 | 一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018171488A1 (zh) * | 2017-03-21 | 2018-09-27 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种基于转录组测序筛选的棒杆菌组成型表达载体启动子及其筛选方法和应用 |
| CN111172089A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-19 | 江南大学 | 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法 |
-
2021
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018171488A1 (zh) * | 2017-03-21 | 2018-09-27 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种基于转录组测序筛选的棒杆菌组成型表达载体启动子及其筛选方法和应用 |
| CN111172089A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-19 | 江南大学 | 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KIM等: "Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032 chromosome, complete genome", 《GENBANK》, 27 December 2017 (2017-12-27) * |
| YUECHAO MA等: "Identification and application", 《MICROB CELL FACT》, vol. 17, no. 1, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 2, XP055981024, DOI: 10.1186/s12934-018-1031-7 * |
| 徐燕杉等: "谷氨酸棒杆菌ATCC14067海藻糖合酶基因的克隆及功能鉴定", 《食品科技》, no. 08, 20 August 2017 (2017-08-20) * |
| 王崇慧等: "Corynebacterium glutamicum组成型启动子及核糖体结合位点的研究", 《基因组学与应用生物学》, no. 05, 25 May 2017 (2017-05-25) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172089A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-19 | 江南大学 | 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法 |
| CN113913483A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-01-11 | 常州大学 | 一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法 |
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