CN113913483A - 一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。利用安全菌株谷氨酸棒杆菌过量表达海藻糖合酶并利用曲拉通X‑100处理重组谷氨酸棒杆菌获得透性化细胞，可使用全细胞催化麦芽糖合成海藻糖。在催化制备海藻糖的反应液中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，将体系中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，可降低葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成速率。待海藻糖合成反应平衡，反应液离心收集谷氨酸棒杆菌和黑曲霉菌体，所得菌体可重复利用。所得反应液上清中添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体，将反应液中剩余麦芽糖水解成葡萄糖并氧化成葡萄糖酸，获得含海藻糖和葡萄糖酸的反应液。本发明可同时生产海藻糖和葡萄糖酸，并能提高原料利用率。

Description

一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。

背景技术

海藻糖是一种由α,α-1,1-糖苷键联结两分子葡萄糖组成的非还原性双糖，对生物大分子、细胞和生物体组织具有特异性保护作用。可用于保持细胞活性、提升食品品质、增强保湿类化妆品功能。因此，海藻糖在医药、食品和化妆品行业应用前景广阔。海藻糖合酶可催化麦芽糖合成海藻糖，工艺简单，工业化生产潜力较大。海藻糖合酶催化麦芽糖合成海藻糖为可逆反应，当反应体系中海藻糖积累到一定浓度比例反应达到平衡，海藻糖积累量不再增加，并残留一定浓度的底物麦芽糖。同时，海藻糖合酶催化麦芽糖合成海藻糖过程中会有副产物葡萄糖生成，而且葡萄糖能够抑制海藻糖合酶活性。如南宁中诺生物工程有限责任公司韦宇拓等报道来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的海藻糖合酶能够高效催化麦芽糖合成海藻糖，反应后剩余部分麦芽糖并生成一定比例的葡萄糖，同时指出葡萄糖对该海藻糖合酶具有较强的抑制作用。同样地，南宁中诺生物工程有限责任公司李晓明等报道葡萄糖能够显著抑制来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合酶活性，葡萄糖浓度为5g/l时就可将海藻糖转化率降低50％以上。将该海藻糖合酶进行定点突变可降低葡萄糖对海藻糖合成的抑制作用，利用突变酶制备海藻糖，反应后剩余部分麦芽糖并生成一定比例的葡萄糖。海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖过程中会残留部分麦芽糖并生成葡萄糖，海藻糖、麦芽糖和葡萄糖性质相似度较高，加大了海藻糖的分离纯化难度。

葡萄糖酸由葡萄糖氧化而来，广泛用于食品、医药、建筑等行业。在食品工业中葡萄糖酸可用作酸味剂、防腐剂、蛋白凝固剂、膨松剂等。葡萄糖酸与钙、锌等离子形成葡萄糖酸盐，可用作营养剂和药物。在建筑业中葡萄糖酸钠用作水泥掺和剂，可增加混凝土的可塑性和强度。目前，葡萄糖酸的主要生产方法有酶催化法和微生物发酵法。酶催化法是利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶双酶组合在有氧条件下催化葡萄糖氧化生产葡萄糖酸，该法存在酶成本较高的问题，目前工业化应用较少。微生物发酵法生产葡萄糖酸，是在微生物培养过程中菌体生长并合成葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，继而催化葡萄糖氧化生产葡萄糖酸。因此，培养要求低和产酶能力强的微生物菌株可用于生产葡萄糖酸。发明人通过筛选获得一株产葡萄糖酸的黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1保藏编号为CCTCC M 20211310。该菌株具有较强的葡萄糖酸生产能力，并且发酵后收集的菌体可重复用于催化含葡萄糖的转化液生产葡萄糖酸。

针对海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖过程中葡萄糖的生成和抑制作用以及麦芽糖残留的问题，我们提供了一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。

发明内容

本发明提供了一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法。利用安全菌株谷氨酸棒杆菌过量表达自身来源海藻糖合酶，重组谷氨酸棒杆菌破碎液能够高效利用麦芽糖合成海藻糖，或利用曲拉通X-100处理重组谷氨酸棒杆菌获得透性化细胞，可使用全细胞催化麦芽糖合成海藻糖。在催化制备海藻糖的反应液中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，将体系中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，可降低葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成速率。待海藻糖合成反应平衡，反应液离心收集谷氨酸棒杆菌和黑曲霉菌体，所得菌体可重复利用。所得反应液上清中添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体，将反应液中剩余麦芽糖水解成葡萄糖并氧化成葡萄糖酸，获得含海藻糖和葡萄糖酸的反应液。

本发明所使用的黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1为发明人通过筛选获得，保藏编号为CCTCC M 20211310。

本发明所述一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，是在海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，降低反应体系中葡萄糖含量提高海藻糖合成速率，在海藻糖合成反应结束后添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体，将反应液中剩余麦芽糖水解成葡萄糖并氧化成葡萄糖酸，获得含海藻糖和葡萄糖酸的反应液。

优选地，所述海藻糖合酶来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述海藻糖合酶表达宿主为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032，表达质粒为pXMJ19。

优选地，所述海藻糖合酶为重组谷氨酸棒杆菌培养诱导于细胞中合成并积累。

优选地，所述海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程，所述海藻糖合酶由重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎液提供，也可由曲拉通X-100处理重组谷氨酸棒杆菌获得的透性化细胞提供。

优选地，所述曲拉通X-100处理重组谷氨酸棒杆菌获得透性化细胞，是在重组谷氨酸棒杆菌培养并诱导合成海藻糖合酶之后于培养液中添加10～20g/l曲拉通X-100在30℃、180r/min条件下处理2h，离心收集菌体并利用生理盐水洗涤一次，获得透性化细胞。

优选地，所述在海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，所述黑曲霉AnM1菌体为发酵产葡萄糖酸后收集的菌体，黑曲霉AnM1菌体添加量为湿重菌体1g/l。

优选地，所述在海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，反应温度为30℃，摇床转速160r/min，通过添加30g/l碳酸钙维持反应体系pH。

优选地，所述在海藻糖合成反应结束后添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体，所述海藻糖合成反应结束，海藻糖合成反应平衡海藻糖浓度增加缓慢即可认为海藻糖合成反应结束，反应液离心收集转化液上清和透性化重组谷氨酸棒杆菌和黑曲霉AnM1菌体。

优选地，所述收集的透性化重组谷氨酸棒杆菌和黑曲霉AnM1菌体可重复用于催化麦芽糖制备海藻糖。

优选地，所述在海藻糖合成反应结束后添加糖化酶，糖化酶催化转化液中剩余的麦芽糖水解成葡萄糖，所述商品化液体糖化酶活力单位为10万U/ml，糖化酶添加量为转化液体积的0.02％，糖化过程温度为50℃，pH为4.0～5.0，当葡萄糖浓度不再增加时即可结束糖化。

优选地，所述在海藻糖合成反应结束后添加黑曲霉AnM1菌体，所述添加黑曲霉AnM1菌体是在转化液糖化后温度降至37℃，添加碳酸钙40g/l后进行黑曲霉AnM1菌体的添加，黑曲霉AnM1菌体添加量为湿重菌体5g/l，反应温度为37℃，摇床转速为220r/min，反应体系葡萄糖浓度降至0.5～1g/l时即可结束反应，反应液离心收集黑曲霉AnM1菌体并获得含海藻糖和葡萄糖酸的上清。

优选地，所述收集的黑曲霉AnM1菌体可重复用于葡萄糖氧化产生葡萄糖酸。

本发明的有益效果：

(1)利用安全菌株谷氨酸棒杆菌过量表达海藻糖合酶，能够增加海藻糖产品的安全性。对重组谷氨酸棒杆菌进行透性化处理，利用透性化重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化麦芽糖合成海藻糖，可节省细胞破碎成本，菌体可重复利用能够降低细胞培养成本。

(2)在海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，将体系中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，可降低葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成速率。

(3)海藻糖合成反应结束后添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体，将转化液中剩余麦芽糖水解成葡萄糖并氧化成葡萄糖酸，获得含海藻糖和葡萄糖酸的反应液。原料麦芽糖基本全部转化为海藻糖和葡萄糖酸，提高原料利用率。黑曲霉AnM1菌体为葡萄糖酸发酵后收集的菌体，并可重复利用，相比添加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶来氧化葡萄糖产葡萄糖酸，具有成本低的优势。同时，海藻糖和葡萄糖酸容易分离，便于产品的纯化精制。

附图说明

图1：黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1斜面生长菌落。

图2：实施例2中葡萄糖酸标准品液相色谱图。

图3：实施例2中黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1发酵液液相色谱分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1：过表达海藻糖合酶重组谷氨酸棒杆菌构建

利用PCR扩增技术，利用引物19-CgtrsHindIIIF：CCCAAGCTTAAAGGAGGGAAATCATGAATTCTCAGCCGAGTGCAG(SEQ ID NO.2)和19-CgtrsXbaIR：CTAGTCTAGATTATTCCATATCGTCCTTTTCATCG(SEQ ID NO.3)以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板扩增海藻糖合酶基因Cgtrs。PCR扩增获得的Cgtrs基因片段和pXMJ19质粒利用HindIII和XbaI限制性内切酶双酶切并连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态，挑取转化子并提取质粒验证，构建质粒pXMJ19-Cgtrs。将pXMJ19-Cgtrs质粒电击转化C.glutamicum ATCC13032，经1800V，5ms电击后涂布于含有氯霉素(10mg/l)的LBG固体培养基平板，30℃培养36h，长出的转化子菌株进行培养并提取质粒验证，验证正确的菌株命名为pXMJ19-Cgtrs/13032。(序列如SEQ IDNO.1所示)

实施例2：重组谷氨酸棒杆菌表达合成海藻糖合酶

将实施例1得到的重组谷氨酸棒杆菌pXMJ19-Cgtrs/13032划线于含有氯霉素(10mg/l)的LBG固体培养基平板，30℃培养36h。利用接种针划取平板上菌苔接种至10mlLBG液体培养基中，30℃、180r/min培养12h。取1ml培养液转接入50ml LBG液体培养基中，30℃、180r/min培养3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG继续30℃、180r/min培养12h。

实施例3：重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎

将实施例2中培养结束的发酵液离心收集菌体，利用原发酵液50％体积的生理盐水悬浮菌体，冰浴条件下超声破碎细胞，细胞破碎液离心取上清得到含海藻糖合酶的粗酶液。

实施例4：重组谷氨酸棒杆菌透性化

在实施例2中培养结束的发酵液中直接添加0g/l、10g/l和20g/l的曲拉通X-100在30℃、180r/min条件下处理2h，离心收集菌体并利用生理盐水洗涤菌体一次，然后离心收集菌体并利用原发酵液50％体积的生理盐水悬浮获得透性化细胞。

对照实施例1：重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎液催化麦芽糖合成海藻糖

取实施例3中的重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎液加入碳酸钙30g/l和麦芽糖250g/l，在30℃、160r/min条件下转化，转化14h海藻糖合成反应平衡，海藻糖浓度为127g/l。底物麦芽糖中含有少量葡萄糖，反应体系初始葡萄糖浓度为11g/l，反应结束后葡萄糖浓度为19g/l。

对照实施例2：重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化麦芽糖合成海藻糖

取实施例4中不添加曲拉通X-100(添加量0g/l)处理的重组谷氨酸棒杆菌细胞悬浮液加入碳酸钙30g/l和麦芽糖250g/l，在30℃、160r/min条件下转化，转化14h海藻糖浓度为53g/l，葡萄糖浓度为2g/l。未经曲拉通X-100处理的重组谷氨酸棒杆菌全细胞仍具有代谢活性，可将反应体系中的葡萄糖吸收利用，因此葡萄糖浓度降低。

实施例5：透性化重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化麦芽糖合成海藻糖

取实施例4中分别添加10g/l和20g/l曲拉通X-100处理的重组谷氨酸棒杆菌细胞悬浮液加入碳酸钙30g/l和麦芽糖250g/l，在30℃、160r/min条件下转化，转化14h海藻糖浓度分别为112g/l和123g/l，葡萄糖浓度为分别为16g/l和19g/l。与对照实施例1、2相比，曲拉通X-100处理后的重组谷氨酸棒杆菌可有效催化麦芽糖合成海藻糖。

转化后，转化液离心收集20g/l曲拉通X-100处理的重组谷氨酸棒杆菌菌体，菌体重悬后在相同条件下重新催化麦芽糖合成海藻糖，菌体重复利用3次，转化14h海藻糖产量仍在110g/l以上。

实施例6：黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1的筛选、摇瓶发酵及菌体收集

黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1的筛选：

实验室微生物发酵实验剩余的含高浓度葡萄糖的培养液敞口放置3天，发现培养液表面有白色绒状菌落出现。将白色绒状菌落挑出，在LBG固体培养基(酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l)上37℃培养。菌落生长迅速，白色绒毛状菌丝发散状生长，菌落中央逐渐变成淡黄色，培养时间延长菌落黄色加深。培养至72h，菌丝体上产生黑色不规则形颗粒，应该为球状分生孢子，继续培养，黑色颗粒增多。无菌条件下，利用浸水接种针蘸取黑色颗粒并在新鲜LBG固体培养基上划线培养。培养24h出现白色绒状菌落，继续培养菌落黄色加深，并且重新产生黑色颗粒，在菌落密集区域菌落背面出现褶皱(图1)。将黑色颗粒划线至含有溴甲酚紫指示剂的培养基(葡萄糖20g/l，玉米浆5g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，琼脂粉20g/l，pH7.0)37℃培养，菌落周围培养基颜色由紫色变成黄色，表明菌株能够产酸。将平板上菌丝体取下置于研钵中液氮冷冻研磨，使用DNA提取试剂盒提取基因组，以基因组为模板使用18S rDNA通用引物进行PCR扩增和测序，经过18S rDNA鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，将该菌株命名为黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1。黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1，已于2021年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211310，保藏地址为中国武汉武汉大学。

用斜面培养黑曲霉孢子，斜面培养基组成(g/l)：葡萄糖20，玉米浆5，磷酸二氢钾0.3，七水合硫酸镁0.2，轻质碳酸钙5，琼脂粉20。孢子培养温度为37℃，培养至菌落表面布满孢子颗粒。用无菌水冲洗斜面，获得孢子悬液。孢子悬液1ml接入500ml挡板摇瓶中的50ml发酵培养基，发酵培养基组成(g/l)：葡萄糖100，玉米浆1，磷酸二氢钾0.3，七水合硫酸镁0.2，轻质碳酸钙30。发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min。发酵过程中取样检测葡萄糖浓度，发酵培养基中葡萄糖浓度降至3～5g/l结束发酵。高效液相色谱法检测发酵液中是否有葡萄糖酸，并且对葡萄糖酸浓度进行分析。葡萄糖酸标准品和发酵液样品同时进行高效液相色谱检测分析(图2、图3)，结果表明发酵液中存在葡萄糖酸，而且葡萄糖酸是主要有机酸产物，发酵液中葡萄糖酸浓度为89g/l，葡萄糖到葡萄糖酸得率为0.92g/(g葡萄糖)。

孢子培养同上。孢子悬液1ml接入500ml挡板摇瓶中的50ml发酵培养基，发酵培养基组成(g/l)：葡萄糖120，玉米浆0.5，磷酸二氢钾0.2，七水合硫酸镁0.2，轻质碳酸钙40。发酵温度为37℃，摇床转速为220r/min。发酵结束后，发酵液中葡萄糖酸浓度为109g/l，葡萄糖到葡萄糖酸得率为0.95g/(g葡萄糖)。

黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1的摇瓶发酵及菌体收集：

用斜面培养黑曲霉孢子，斜面培养基组成(g/l)：葡萄糖20，玉米浆5，磷酸二氢钾0.3，七水合硫酸镁0.2，轻质碳酸钙5，琼脂粉20。冻存的黑曲霉(Aspergillus niger)AnM1甘油孢子悬液划线于斜面培养基上，孢子培养温度为37℃，培养至菌落表面布满孢子颗粒。用无菌水冲洗斜面，获得孢子悬液。孢子悬液1ml接入500ml挡板摇瓶中的50ml发酵培养基，发酵培养基组成(g/l)：葡萄糖150，玉米浆1，磷酸二氢钾0.3，七水合硫酸镁0.2，轻质碳酸钙30。发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min。发酵过程中产生葡萄糖酸与碳酸钙反应，碳酸钙逐渐溶解，当葡萄糖酸积累到120～130g/l培养基中的碳酸钙基本全部溶解。当发酵液中碳酸钙固体基本溶解后停止发酵，发酵液离心收集黑曲霉AnM1菌体。

实施例7：重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎液催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加黑曲霉AnM1菌体

取实施例3中的重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎液加入碳酸钙30g/l和麦芽糖250g/l，加入实施例6中收集的黑曲霉AnM1菌体，黑曲霉AnM1菌体添加量为湿重菌体1g/l。在30℃、160r/min条件下转化。转化11h海藻糖合成反应平衡，海藻糖浓度为124g/l，葡萄糖浓度为3.7g/L。

与对照实施例1相比，重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎液催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加黑曲霉AnM1菌体，将体系中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，降低体系中葡萄糖的浓度，可降低葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成速率。

实施例8：透性化重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化麦芽糖合成海藻糖的过程中添加黑曲霉AnM1菌体

取实施例4中添加20g/l曲拉通X-100处理的重组谷氨酸棒杆菌细胞悬浮液加入碳酸钙30g/l和麦芽糖250g/l，加入实施例6中收集的黑曲霉AnM1菌体，黑曲霉AnM1菌体添加量为湿重菌体1g/l。在30℃、160r/min条件下转化。转化12h海藻糖合成反应平衡，海藻糖浓度为126g/l，葡萄糖浓度为4.2g/L。

转化后，转化液离心收集重组谷氨酸棒杆菌菌体和黑曲霉AnM1菌体，混合菌体重悬后在相同条件下重新催化麦芽糖合成海藻糖，菌体重复利用3次，转化12h海藻糖产量仍在110g/l以上。

与实施例5相比，透性化重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化麦芽糖合成海藻糖的过程中添加黑曲霉AnM1菌体，将体系中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，降低体系中葡萄糖的浓度，可降低葡萄糖对海藻糖合酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成速率。

实施例9：海藻糖转化液中麦芽糖水解与葡萄糖氧化

实施例8中海藻糖合成反应结束，离心收集重组谷氨酸棒杆菌和黑曲霉AnM1菌体后获得的转化液上清中含有海藻糖、葡萄糖酸、未转化的麦芽糖和少量葡萄糖。转化液上清添加糖化酶，糖化酶活力单位为10万U/ml，糖化酶添加量为转化液体积的0.02％，糖化过程温度为50℃，pH为4.0～5.0，糖化过程检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度不再增加时即可结束糖化。转化液糖化后温度降至37℃，添加碳酸钙40g/l，添加实施例6中收集的黑曲霉AnM1菌体，黑曲霉AnM1菌体添加量为湿重菌体5g/l。反应温度为37℃，摇床转速为220r/min，反应体系葡萄糖浓度降至0.5～1g/l时即可结束反应，获得含海藻糖118g/l和葡萄糖酸127g/l的反应液。

结束反应后，反应液离心收集黑曲霉AnM1菌体，菌体可重复用于葡萄糖氧化产生葡萄糖酸，重复利用3次葡萄糖氧化效率未有明显下降。离心后所获反应液上清可用于海藻糖和葡萄糖酸的分离精制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 常州大学

<120> 一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法

<141> 2021-11-23

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1797

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

atgaattctc agccgagtgc agatcaccac cctgatcacg cggctcgccc agttcttgat 60

gcccacggct tgatcgttga gcacgaatcg gaagagtttc cagtccccgc acccgctccc 120

ggtgaacagc cctgggagaa gaaaaaccgc gagtggtaca aagacgccgt tttctacgaa 180

gtgctggttc gtgccttcta cgatccagaa ggcaacggag tcggatcgtt gaaaggcctg 240

accgaaaaac tggattacat ccagtggctc ggcgtggatt gcatttggat cccaccgttt 300

tatgattccc cactgcgcga cggcggttac gatatccgca acttccgtga aatcctgccc 360

gaattcggca ccgtcgatga cttcgtggaa ctcgttgacc acgcccaccg ccgtggcctg 420

cgtgttatca ccgacttggt catgaatcac acctccgacc agcacgcatg gttccaagaa 480

tcccggcgcg acccaaccgg cccctacgga gatttctatg tgtggagcga tgatcccacc 540

ctgtacaacg aagcccgcat catctttgta gatacagaag aatccaactg gacctatgat 600

ccggtgcgtg gccagtactt ctggcaccgc ttcttctccc accaaccaga cctcaactac 660

gacaaccccg cagtccaaga ggccatgcta gatgtcttgc gtttctggct ggacctggga 720

cttgatggtt tccgactaga tgccgttcct tatctttttg aacgcgaagg caccaacggc 780

gaaaacctca aagaaaccca cgatttcctc aaactgtgtc gctctgtcat tgagaaggaa 840

taccccggcc gaatcctgct cgcagaagcc aaccaatggc cccaagatgt ggtcgaatac 900

ttcggtgaaa aagacaaagg cgatgaatgc cacatggcct tccacttccc tttgatgccg 960

cgcatcttca tgggagttcg ccaaggttca cgcaccccga tcagtgagat cctggccaac 1020

accccggaga ttcccaagac tgcccaatgg ggtattttcc tgcgtaatca tgatgagctc 1080

acccttgaaa tggtctccga tgaggaacgc agctacatgt actcccaatt cgcctccgaa 1140

cctcgcatgc gcgccaacgt aggaatccgc aggcgccttt ccccactgct tgaaggcgac 1200

cgcaaccagc tggaactcct tcacggtttg ttgctgtctc tacctggctc acccgtgttg 1260

tattacggtg atgaaattgg catgggcgac aatatctggc tccacgaccg cgacggagtg 1320

cgcaccccca tgcagtggtc caacgaccgc aacggtggtt tctccaaagc tgatcctgaa 1380

cgcctgtacc ttccagcgat ccaaaatgat caatacggct acgcccaagt aaacgtggaa 1440

agccaactca accgcgaaaa ctccctgctg cgctggctcc gaaaccaaat ccttatccgc 1500

aagcagtacc gcgcatttgg tgccggaacc taccgtgaag tgtcctccac caatgagtca 1560

gtgttgacat ttttacgaga acacaagggc caaaccattt tgtgtgtcaa caacatgagc 1620

aaatatcctc aggcagtctc gcttgatttg cgtgaatttg caggacacac ccctcgagag 1680

atgtcgggcg ggcagctgtt ccctaccatt gctgaacggg agtggattgt cactttagcc 1740

cctcacggat tcttctggtt tgatctcacc gccgatgaaa aggacgatat ggaataa 1797

Claims (10)

1.一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：在海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，在海藻糖合成反应结束后回收菌体，在反应液中添加糖化酶和黑曲霉AnM1菌体；将反应液中剩余麦芽糖水解成葡萄糖并氧化成葡萄糖酸，获得含海藻糖和葡萄糖酸的反应液。

2.根据权利要求1所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：所述海藻糖合酶来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：黑曲霉的保藏编号为CCTCC M 20211310。

4.根据权利要求1所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：所述海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程，所述海藻糖合酶由重组谷氨酸棒杆菌细胞破碎液提供，或由曲拉通X-100处理重组谷氨酸棒杆菌获得的透性化细胞提供。

5.根据权利要求4所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：曲拉通X-100处理重组谷氨酸棒杆菌获得透性化细胞是在重组谷氨酸棒杆菌培养并诱导合成海藻糖合酶之后于培养液中添加10～20g/l曲拉通X-100在30℃、180r/min条件下处理2h，离心收集菌体并利用生理盐水洗涤一次，获得透性化细胞。

6.根据权利要求1所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：所述在海藻糖合酶催化麦芽糖制备海藻糖的过程中添加产葡萄糖酸黑曲霉AnM1菌体，其中黑曲霉AnM1菌体添加量为湿重菌体1g/l，制备海藻糖的过程反应温度为30℃，摇床转速160r/min，通过添加碳酸钙维持反应体系pH。

7.根据权利要求1所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：所述海藻糖合成反应结束的特征为海藻糖合成反应平衡海藻糖浓度增加缓慢，海藻糖合成反应结束后反应液离心收集转化液上清和透性化重组谷氨酸棒杆菌和黑曲霉AnM1菌体，收集的透性化重组谷氨酸棒杆菌和黑曲霉AnM1菌体可重复用于催化麦芽糖制备海藻糖。

8.根据权利要求1所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：所述在海藻糖合成反应结束后的反应液中添加糖化酶，所述糖化酶催化转化液上清中剩余的麦芽糖水解成葡萄糖，所述商品化液体糖化酶活力单位为10万U/ml，糖化酶添加量为转化液体积的0.02％，糖化过程温度为50℃，pH为4.0～5.0，当葡萄糖浓度不再增加时结束糖化。

9.根据权利要求1所述的一种海藻糖和葡萄糖酸联产的方法，其特征在于：所述在海藻糖合成反应结束后的反应液中添加黑曲霉AnM1菌体，所述添加黑曲霉AnM1菌体是在转化液糖化后温度降至37℃，添加碳酸钙40g/l后进行黑曲霉AnM1菌体的添加，黑曲霉AnM1菌体添加量为湿重菌体5g/l，反应温度为37℃，摇床转速为220r/min，反应体系葡萄糖浓度降至0.5～1g/l时结束反应，反应液离心收集黑曲霉AnM1菌体并获得含海藻糖和葡萄糖酸的上清。

10.根据权利要求9所述的反应液离心收集黑曲霉AnM1菌体，其特征在于：所述收集的黑曲霉AnM1菌体可重复用于葡萄糖氧化产生葡萄糖酸。

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