CN114836393B

CN114836393B - 毛栓孔菌漆酶基因及其重组漆酶的制备方法和应用

Info

Publication number: CN114836393B
Application number: CN202210274102.7A
Authority: CN
Inventors: 潘程远; 贾轶通
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2022-03-20
Filing date: 2022-03-20
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-03-20
Also published as: CN114836393A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种毛栓孔菌漆酶基因的克隆、重组漆酶的制备以及重组漆酶在水稻秸秆产糖中的应用。本发明公开了一种来自毛栓孔菌MX2的漆酶基因LacF，DNA序列如SEQ ID No：1所述。本发明还同时公开了漆酶基因LacF的克隆方法、重组漆酶工程菌的制备方法。本发明的重组漆酶的用途是：用于水稻秸秆产糖。

Description

毛栓孔菌漆酶基因及其重组漆酶的制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种毛栓孔菌漆酶基因的克隆、重组漆酶的制备以及重组漆酶在水稻秸秆产糖中的应用。

背景技术

我国是农业大国，农作物种类丰富、播种面积大，每年可产生近10亿吨的农作物秸秆，这些由木质纤维素所组成的农业废弃物构成了丰富的生物质资源。目前，农作物秸秆主要以有机肥、动物饲料或燃料等方式被人们利用。通过破除木质素来降解纤维素形成低聚糖是农作物秸秆资源化利用的又一途径，在此过程中，如何高效破解木质素是秸秆糖原化生产的关键，而利用微生物或其分泌的酶系是降解秸秆木质素的有效方法。

白腐真菌是一类生长在木材中引起白色腐烂的担子菌亚门真菌，它们能分泌木质素酶、半纤维素酶和纤维素酶来降解木质纤维素，其中的木质素酶主要由木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶组成。漆酶是一类含铜原子的氧化酶，在介体存在下，能降解酚类和非酚类物质，作用底物广泛，且其催化过程中仅产生水分子，无有毒的副产物，所以被人们称为“绿色工业酶”。研究发现，漆酶主要通过断键、修饰和耦合作用降解木质素，目前，人们已从白腐真菌中筛选得到多种漆酶蛋白，但是由于不同来源的漆酶催化性能差异大，且从原始菌株中生产出来的漆酶产量低，不能满足漆酶降解秸秆的工业化需求，从环境中筛选漆酶并异源表达是实现上述工业化需求的途径。

毛栓孔菌Trametes hirsuta是一种能分泌多种漆酶同工酶的白腐真菌，在其基因组中含有7个漆酶基因。人们根据这些基因的同源性将毛栓孔菌漆酶分为A-H组(B和E被归为同一组)。研究发现，这些同工酶具有不同的理化性质，例如，漆酶A为组成型漆酶，它在真菌的任何生长阶段以及任何培养条件下都能分泌，具有耐酸性；漆酶B-H为诱导型漆酶，它们在真菌中需要被一些化合物诱导产生，最适pH接近于中性，不耐高温。目前，已有一些毛栓孔菌漆酶在变灰青霉Penicillium canescens和毕赤酵母Pichia pastoris中得到表达，表达量可达100U/mL以上，且表现出对染料具有很好的脱色效果。但是，到目前为止人们还没有对毛栓孔菌重组漆酶降解木质纤维素以及产糖的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种源于毛栓孔菌的漆酶基因，以及提供一种源于毛栓孔菌重组漆酶在秸秆产糖中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供一种来自毛栓孔菌MX2的漆酶基因LacF，基因LacF的DNA序列如SEQ ID No：1所述。

本发明还同时提供了上述漆酶基因LacF编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。

本发明还同时提供了漆酶基因LacF的克隆方法：

提取毛栓孔菌MX2总RNA，经反转录得到cDNA，以此为模板，设计引物LacFF和LacFR，扩增得到LacF漆酶基因，

LacFF：CGGAATTCGGGATCGGTCCCGTGACCGACCTCA(内含EcoR I酶切位点)

LacFR:ATTTGCGGCCGCTCACTGGTCGCTCTCGTCAAGCGCG(内含Not I酶切位点)。

其开发阅读框为1500bp。

本发明还同时提供了重组漆酶工程菌的制备方法，包括以下步骤：

1)、提取毛栓孔菌MX2总RNA，反转录成cDNA；

2)、以cDNA为模板，LacFF和LacFR为上、下游引物，扩增漆酶LacF基因；

3)、将漆酶LacF与表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pPIC9K-LacF；

4)、重组质粒pPIC9K-LacF经线性化后，转化毕赤酵母GS115，构建获得毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-LacF；

5)、将毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-LacF进行诱导发酵，筛选获得具有水稻秸秆产糖性能的重组漆酶。

作为本发明的重组漆酶工程菌的制备方法的改进，步骤4)：使用10μg线性化的pPIC9K-LacF重组质粒，通过电击转化法转化至毕赤酵母，电击参数为1750V，5.0ms。

作为本发明的重组漆酶工程菌的制备方法的进一步改进，步骤5)包括以下步骤：

①、将转化的毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-LacF接种于MD固体培养基中，28℃培养3～4天；

②、挑取步骤①所得的单菌落，接种到MD固体培养基(新的MD固体培养基)中，并依次编号，28℃培养4～6天；

③、挑取步骤②所得的编号菌落，分别接种于500μL BMMY液体培养基中，250rpm、28℃振荡培养24小时；

④、在步骤③所得的培养产物中加入200μL 1mM的ABTS(pH＝4.0)进行显色反应，≥30分钟后观察：如液体颜色变为绿色或墨绿色，则对应编号的菌落为具漆酶活性的毕赤酵母工程菌。

本发明还同时提供了利用上述方法所得的重组漆酶工程菌制备重组漆酶的方法，包括以下步骤：

一)、重组漆酶工程菌发酵，得重组漆酶的粗酶液；

二)、将粗酶液经过超滤、硫酸铵沉淀透析和离子交换层析，得重组漆酶。

所得的重组漆酶具有如下一种或多种特性：

①、重组漆酶分子量约为60kDa；

②、以ABTS为底物时的最适pH值为2.6，最适温度为60℃；

③、对ABTS、DMP和GUA的Km值分别为27.6、42.0和1228.5uM；

④、浓度为10mM的镁离子、锰离子和铜离子对重组漆酶活性有促进作用；

⑤、具有机溶剂耐受性，在5％的甲醇、乙醇、异丙醇和二甲基亚砜中的相对酶活分别为83.4％、87.6％、87.5％和86.3％。

本发明还同时提供了重组漆酶用途：进行水稻秸秆产糖。

本发明还同时提供了利用重组漆酶进行水稻秸秆产糖的方法，包括以下步骤：

①、利用范氏洗涤法获得水稻秸秆中性洗涤纤维(NDF)；

②、将NDF与纤维素酶在乙酸钠缓冲液(pH＝4.8，温度45℃)中振荡处理6小时(转速200rpm)，之后离心(9000rpm)分别收集上清液RS1和残留物R1；

③、将R1与重组漆酶在乙酸钠缓冲液(pH＝4.0，温度45℃)中振荡处理24小时(转速150rpm)，之后离心(9000rpm)分别收集上清液RS2和残留物R2；

④、将R2与半纤维素酶在乙酸钠缓冲液(pH＝5.0，温度45℃)中振荡处理6小时(转速200rpm)，之后离心(9000rpm)分别收集上清液RS3和残留物R3；

⑤、三步处理所得的RS1、RS2和RS3总和即为产生的还原糖。

本发明解决了目前所存在的以下问题：适合工业化需求的漆酶来源较少的问题，从原始菌株中产量较低的问题。

本发明具有如下有益效果：

1)、本发明从毛栓孔菌MX2中扩增得到一个全新的漆酶基因LacF。

2)、本发明成功构建了具漆酶活性的毕赤酵母工程菌。

3)、镁、锰和铜离子对毕赤酵母工程菌表达的重组漆酶活性具有促进作用，且重组漆酶具有耐有机溶剂能力。

4)、利用本发明的重组漆酶以及处理顺序与条件能对水稻秸秆产糖提升16.2-62.2％，对实际生物质产糖具有较大应用潜力。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是毛栓孔菌MX2漆酶基因LacF的PCR扩增电泳图.其中：M为DNA Marker，1为漆酶基因LacF；

图2是重组质粒pPIC9K-LacF的酶切验证电泳图.其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pPIC9K-LacF经EcoR I和Not I双酶切后条带；

图3是筛选具有漆酶活性毕赤酵母工程菌的过程图；其中，显色为蓝色的对应菌株即为具漆酶活性的工程菌；

图4是毕赤酵母工程菌诱导发酵产生的漆酶活性图；漆酶活性测定是以ABTS为底物来测定的(pH＝4.0，25℃)；

图5是重组漆酶离子交换层析后的吸光值和漆酶活性图；其中，峰2即为重组漆酶；

图6是测定重组漆酶分子量的SDS-PAGE电泳图；其中，M是标准蛋白Marker，泳道1为离子交换后重组漆酶；

图7是pH(A)和温度(B)对重组漆酶活力的影响；

图8是金属离子对重组漆酶活力的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明。

本发明所使用的毛栓孔菌为Trametes hirsuta MX2，公开于：木腐真菌的鉴定及对不同木材的腐朽能力[J].浙江农林大学学报，2015，32(1)：1-10，现保存于浙江农林大学植物保护学科微生物实验室。

三种漆酶底物(ABTS、DMP和GUA)和四种染料(RBBR、RB5、CV和NR)均购自Sigma-Aldrich公司。

诱导培养基(g/L)：白杨木屑20g，酵母提取物10g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸铵2.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钙0.1g，去离子水定容至1L。

实施例1、毛栓孔菌MX2漆酶基因LacF的克隆

将毛栓孔菌MX2在诱导培养基中于28℃振荡(150rpm)培养7天，收集菌丝，用液氮将菌丝研磨成粉状，并以此为材料，利用RNA提取试剂盒(MiniBest RNA Extraction Kit，购买自大连宝生物工程有限公司)提取毛栓孔菌MX2总RNA。

以毛栓孔菌MX2总RNA为模板，利用cDNA合成试剂盒(PrimeScript^TM II 1^st StandcDNA Synthesis Kit，购买自大连宝生物工程有限公司)按说明书步骤反转录合成cDNA。

以毛栓孔菌MX2反转录得到的cDNA为模板，采用LacFF(5'-CGGAATTCGGGATCGGTCCCGTGACCGACCTCA-3'，下划线为EcoR I酶切位点)和LacFR(5'-ATTTGCGGCCGCTCACTGGTCGCTCTCGTCAAGCGCG3'，下划线为Not I酶切位点)为上下游引物，PCR扩增漆酶基因LacF。PCR反应体系为：DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase，购买自大连宝生物工程有限公司)0.5μL、反应缓冲液(5×PrimeSTAR Buffer Mg²⁺ plus，DNA聚合酶中自带)10μL、dNTP混合物(2.5mM each)4μL、LacFF 0.5μL、LacFR 0.5μL、cDNA2μL和灭菌蒸馏水32.5μL。反应程序为：98℃预变性10s；98℃变性10s，65℃退火5s，72℃延伸1.5min，33个循环；最后72℃延伸反应10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，得到约1500bp的条带(图1)，用胶回收试剂盒(MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit，购买自大连宝生物工程有限公司)纯化回收PCR产物，得到本发明的毛栓孔菌MX2漆酶基因LacF，该基因的DNA序列如SEQ ID No：1所示。漆酶基因LacF编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述，末尾为终止子。

实施例2、具漆酶活性毕赤酵母工程菌的构建、筛选及扩大培养

①、构建pPICK9-LacF重组载体

将实施例1中回收纯化的PCR产物----毛栓孔菌MX2漆酶基因LacF连接到pMD19-T克隆载体(购买自大连宝生物工程有限公司)中，并转化大肠杆菌JM109(购买自大连宝生物工程有限公司)，筛选阳性克隆(含LacF片段)，再将阳性克隆用EcoR I和Not I双酶切，回收LacF片段。

pPIC9K质粒(购买自Invitrogen公司)同样用EcoR I和Not I双酶切处理，回收pPIC9K载体片段。

将上述回收的LacF片段与pPIC9K载体片段连接后转化至大肠杆菌JM109中，在含卡那霉素的LB固体培养基上挑取阳性单菌落，经过摇菌、质粒提取、EcoR I和Not I双酶切验证后(图2)，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pPIC9K-LacF，及内含的重组质粒pPIC9K-LacF(表达载体pPIC9K-LacF)。

具体为：将LacF片段0.3pmol与pPIC9K载体片段0.03pmol混合在一起，再加入DNA连接试剂盒中Solution I 10μL，并用蒸馏水补充至20μL反应体系，混匀后在16℃下反应12h，得连接产物。将20μL连接产物与100μL大肠杆菌JM109感受态细胞(OD₆₀₀＝0.5)在4℃下混匀，并在42℃下反应45s，而后立即加入1mL LB液体培养基，并在37℃振荡培养(150rpm)1h，得转化后的培养液。取上述转化后的培养液50μL均匀涂抹在含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养10-12h后，得多个单菌落菌斑。任意取单菌落重新培养于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养(150rpm)8-10h，离心后得菌体，并根据质粒回收试剂盒步骤，提取菌体内质粒。将提取的质粒用EcoR I和Not I双酶切处理，并进行电泳拍照后验证，如图2所示，则该质粒即为重组质粒pPIC9K-LacF。

②、重组载体转化毕赤酵母细胞

先用Sac I内切酶对重组质粒pPIC9K-LacF进行线性化处理，再将10μg的线性化重组质粒pPIC9K-LacF加入到80μL毕赤酵母GS115(购买自Invitrogen公司)感受态细胞(细胞浓度为OD₆₀₀＝1.3～1.5)中，之后转移到预冷的电击杯(0.2cm)中，冰浴5min，电击一次(1750V，5.0ms)。电击完成后，立即加入1ml预冷的1mol/L山梨醇溶液，再将混合液体迅速涂布于MD培养基(w/v，2％葡萄糖，1.34％酵母基本氮源，4×10^-5％生物素)中，28℃培养3-4d，形成阳性菌落(即，能在MD培养中生长出来的白色菌落)。

③、具漆酶活性工程菌的筛选及扩大培养

将步骤②所得的若干阳性菌落分别重新接种于一块新的MD培养基中，并对每个菌落进行编号，28℃培养4～6天。然后按菌落编号分别接种于500μL的BMMY液体培养基(w/v，2％蛋白胨，1％酵母提取物，1.34％酵母基本氮源，0.5％甲醇，4×10^-5％生物素，余量为0.1M pH6.0的磷酸缓冲液)中，250rpm 28℃振荡培养24小时。再往培养后的BMMY液体培养基(即，培养所得物)中加入200μL 1mM的ABTS(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，溶解于0.1M醋酸钠pH为4的缓冲液中)进行显色反应，≥30分钟后观察，液体颜色变为绿色或墨绿色，则对应编号的菌落即为具漆酶活性的毕赤酵母工程菌(图3)。

挑取一个具漆酶活性的毕赤酵母工程菌，接种于25ml BMGY液体培养基(配方同BMMY，只是用甘油代替甲醇)，28℃、250rpm培养24h后，4000rpm，4℃离心5min，弃上清，收集菌体，用BMMY液体培养基重悬沉淀至OD₆₀₀＝1.00(约100-200ml)，继续在相同条件下振荡培养(28℃、250rpm培养24h)，期间每隔24h加甲醇至终浓度为1％。连续培养10d后，并每天收集上清液(4℃，4000rpm离心30min得到上清液)，测定漆酶活性。从图4结果发现，培养7天后的漆酶活性最高，所以确定7天后的培养上清液定为粗酶液。

实施例3、重组漆酶的纯化制备

将实施例2中的粗酶液，经超滤、硫酸铵沉淀透析和离子交换层析等步骤后，纯化制得重组漆酶。

①、超滤：

粗酶液经Millipore 25kDa超滤管，4℃，4000rpm离心25min，得超滤液；

②、硫酸铵沉淀透析：

在盛有超滤液的烧杯中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵浓度为50％，再分多次往烧杯中加入少量硫酸铵固体，玻璃杯搅拌至完全溶解，直至硫酸铵终浓度为80％。期间注意加样、搅拌速度要缓慢以免造成蛋白变性(即，加样时间控制在60-90分钟，搅拌速度控制在20-30次/分钟)。4℃静置过夜，4000rpm，4℃离心30min取沉淀，用少量的20mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)将沉淀溶解(即，磷酸盐缓冲液的用量只需确保沉淀被溶解即可)，得酶液；

将酶液转移至12-14kDa透析袋，至一半体积，并将透析袋置于4℃，20mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中24h，期间更换缓冲液2-4次；透析袋中的截留液体即为透析液；

③、离子交换层析：

将2ml透析液以0.4mL/min的流速上样到已平衡过的DEAE-Sepharose FF层析柱(25*16mm)中，在AKTA purifier蛋白纯化系统用0-0.5mol/L NaCl和0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)梯度洗脱，流速0.8mL/min，用Fraction Collector Frac-920收集器每1mL收集1管，同时测定每管漆酶活性，洗脱曲线图5共出现3个峰，用ABTS分别检测各峰值处洗脱液，发现峰2处具有很高的漆酶活性，超滤浓缩峰2处收集液(即，将第10-14管的洗脱液收集后，按照上述①超滤的工艺参数进行超滤浓缩)，得到重组漆酶。

实验1、重组漆酶的含量测定

重组漆酶纯化过程中含量变化如表1所示。表1所述的体积量分别为实施例2所得的粗酶液、实施例3步骤①所得的超滤液、实施例3步骤②所得的透析液、实施例3步骤③所得的重组漆酶。对上述各步纯化产物进行漆酶活性以及总蛋白含量测定，漆酶活性测定使用ABTS为底物，蛋白质含量测定使用蛋白质定量检测试剂盒(上海生工)。纯化后的重组漆酶比活力为104.8U/mg，纯化倍数为4.2，回收率为11.4％；见表1。

表1、重组漆酶的纯化制备

本发明中漆酶活性测定以对ABTS的氧化来表示。反应体系(300μL)：280μL含1mMABTS的醋酸钠缓冲液(0.1M，pH 4.0)，20μL酶液。使用酶标仪测定3min内混合液在420nm的吸光值变化，反应温度为25℃。已知420nm处摩尔消光系数ε₄₂₀＝3.6×10⁴M^-1·cm^-1，以1min内转化1μmol ABTS所需的酶量为一个酶活单位(U)。

比活力(U/mg)＝总酶活/总蛋白；

纯化倍数＝比活力_n/比活力₀(比活力_n为纯化步骤n时的比活力，比活力₀为粗酶液比活力)；

回收率(％)＝总酶活_n/总酶活₀(总酶活_n为纯化步骤n时的总酶活，总酶活₀为粗酶液总酶活)。

实验2、重组漆酶的酶学性质测定

①、重组漆酶分子量

将重组漆酶与5×SDS-PAGE的上样缓冲液按照1：10的用量比混匀，在100℃金属浴中加热10min，得上样液；取10μL上样液在常规的12％分离胶和5％浓缩胶制成的凝胶上进行SDS-PAGE电泳；电泳完成后，用考马斯亮蓝R-250染色，并脱色拍照，再根据凝胶中标准蛋白Marker估算重组漆酶分子量。

图6为重组漆酶SDS-PAGE电泳图，其中第1泳道为纯化后的重组漆酶，估算的重组漆酶分子量约为60kDa；M是标准蛋白Marker。

②、重组漆酶的最适pH值和最适温度

最适pH值测定，以ABTS(1mM)为底物，配制pH值为2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0的柠檬酸磷酸盐缓冲液(20mM)，在25℃测量它们的漆酶活力。以活力最高的为100％，测定不同pH值所对应的相对漆酶活力。

最适温度是在最适pH(2.6)条件下，以ABTS(1mM)为底物，在柠檬酸磷酸盐缓冲液(20mM)中，测量0、10、20、30、40、50、60、70、80和90℃下的漆酶活力，以活力最高的为100％，测定不同温度下的相对酶活力。

从图7A中可以看出，重组漆酶在强酸性条件下，活性更高，在所测试的pH值下，最适pH值为2.6，其活性随着pH值的增大而逐渐降低，当pH＝7.0时，重组漆酶几乎失活。

图7B显示，在0-60℃中，重组漆酶活性随着温度的提高而增强，其最适反应温度为60℃，而当温度高于最适温度后，酶活逐渐下降。当温度为90℃时，重组漆酶完全失活。

③、重组漆酶的酶动力学参数

以不同浓度的ABTS(0.01-0.2mM)、DMP(0.1-1mM，2,6-二甲基亚酚，购买自Sigma公司)、GUA(0.1-1mM，愈创木酚，购买自Sigma公司)为底物，在最适pH(2.6)和最适温度(60℃)下，测量纯化重组漆酶的活性。采用Lineweaver-Burk作图法，分别以底物浓度([S])的倒数为横坐标，对应的酶活([v])的倒数为纵坐标制作标准曲线，由曲线换算得出Km(mM)和V_max(U/mg)，并由公式换算得到k_cat(s^-1)，公式为V_max＝k_cat×[E]，[E]为纯酶液样品的蛋白浓度。

从表2中可以看出，米氏常数K_m数值从小到大排序为：ABTS＜DMP＜GUA，K_m数值越小表示酶进行反应所需的底物浓度越低，酶与底物之间亲和力越大，因此重组漆酶对ABTS的亲和力最好；转换数k_cat从小到大排序为：DMP＜ABTS＜GUA，转换数k_cat表示单个酶分子在一秒内转化底物的数量，数值越大表示酶对底物的转化速率越快，所以重组漆酶对GUA转化速率最快；催化效率k_cat/K_m从小到大排序为：GUA＜DMP＜ABTS，数值越大，效率越高，说明重组漆酶对ABTS的催化效率最高。综合上述结果，采用ABTS作为重组漆酶酶学性质的底物最为合适。

表2、重组漆酶的酶动力学参数

底物	K_m(mM)	k_cat(s^-1)	k_cat/K_m(s^-1 mM^-1)
				ABTS	0.0276	0.3620	13.1159
DMP	0.0420	0.1468	3.4952
				GUA	1.2285	0.5196	0.4230

④、金属离子对重组漆酶活性的促进作用

以ABTS(1mM)为反应底物，将重组漆酶与含有不同浓度(1、10、50、100mM)金属离子(Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Na⁺、Fe²⁺)的20mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH＝2.6)混合，25℃水浴5min，测定漆酶活力。以不添加任何金属离子的酶活设为对照，计为100％，通过比较酶活力的大小，探究各金属离子对漆酶活力的影响。

即，在300μL体系中含280μL缓冲液和20μL重组漆酶，其中缓冲液为含有不同浓度(1、10、50、100mM)的各种金属离子及1mM ABTS的20mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液。

从图8中可以看出，六种离子Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Na⁺、Fe²⁺在不同浓度下对漆酶的活力影响差异明显，表现为Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺四种离子在适宜浓度下对漆酶活力有促进作用，Na⁺、Fe²⁺两种离子表现为抑制作用。其中，10mM的Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺对重组漆酶活性提升作用最多，分别提高了10.2、17.7和17.3％。

⑤、重组漆酶对有机溶剂的耐受性

将重组漆酶与含有5％和10％体积浓度有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二甲基亚砜)的20mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH＝2.6)混合，以ABTS(1mM)为反应底物，25℃保温反应5min，测定漆酶活力。以不添加有机溶剂的空白酶为对照，计此时的酶活为100％。

即，在300μL体系中含280μL缓冲液和20μL重组漆酶，其中缓冲液为含有不同体积浓度(5％或10％)有机溶剂及1mM ABTS的20mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液。

从表3中可以看出，在5％有机溶剂中，重组漆酶的相对酶活为77.9-87.6％，而在10％有机溶剂中，其相对酶活为53.7-69.3％，该结果说明，重组漆酶对低浓度的有机溶剂存在一定的耐受性。

表3、有机溶剂对重组漆酶的活性影响

有机溶剂	浓度(％)	相对酶活(％)
			甲醇	5	83.4±5.8
甲醇	10	69.3±6.9
			乙醇	5	87.6±6.9
乙醇	10	53.7±11.6
			异丙醇	5	87.5±8.0
异丙醇	10	60.8±2.2
			乙腈	5	77.9±10.0
乙腈	10	57.6±3.1
			二甲基亚砜	5	86.3±2.4
二甲基亚砜	10	56.7±2.2

实验3、重组漆酶对水稻秸秆产糖的影响

利用范氏洗涤法获得水稻秸秆中性洗涤纤维(NDF)，其纤维素、半纤维素、木质素和灰分百分占比分别为32.5％、35.2％、20.7％和11.6％。从上海源叶生物公司购买纤维素酶(400U/mg)和半纤维素酶(20U/mg)。本实验利用纤维素酶、半纤维素酶和制备而得重组漆酶共同处理NDF进行产糖。处理方式采用三种酶的分步处理法，即三步法。由于漆酶对木质纤维素的作用对象为木质素，使得木质纤维素暴露出纤维素和半纤维素，有利于后两者的进一步水解，所以在三步法处理NDF的实验设计中，并没有把重组漆酶设置在第三步。三步法实验设计见表4。每种酶处理NDF的条件见表5。

表4、三步法处理NDF的实验设计

组别	第一步	第二步	第三步
				1	重组漆酶	半纤维素酶	纤维素酶
2	重组漆酶	纤维素酶	半纤维素酶
				3	半纤维素酶	重组漆酶	纤维素酶
4	纤维素酶	重组漆酶	半纤维素酶

表5、三种木质纤维素水解酶对NDF的处理条件

纤维素酶维对应的是pH＝4.8乙酸钠缓冲液；重组漆酶在对应的是pH＝4.0的乙酸钠缓冲液；半纤维素酶对应的是pH＝5.0的乙酸钠缓冲液。

具体为：称取NDF 0.1g，加入至50mL离心管中，在第一步处理时，加入第一种酶，按表5设置相应酶的处理条件，处理完后将离心管于9000rpm离心，收集2mL上清液RS1，保留残留物R1，用于第二步处理；在第二步处理前，先用第二种酶对应的乙酸钠缓冲液对R1洗涤三次，然后按第二种酶处理条件处理R1，处理完后将离心管于9000rpm离心，收集2mL上清液RS2，保留残留物R2，用于第三步处理；同样地，在第三步处理前，先用第三种酶对应的乙酸钠缓冲液对R2洗涤三次，然后按第三种酶处理条件处理R2，处理完后将离心管于9000rpm离心，收集2mL上清液RS3。

采用二硝基水杨酸法(DNS法)测定三步法上清液中的还原糖含量，其总和即为水稻秸秆产生的还原糖。从表6的结果可以发现，利用纤维素酶→重组漆酶→半纤维素酶(组别4)处理NDF产生的还原糖最多，达到694.8mg/L，组别4比组别1、组别2和组别3产生的还原糖分别提升了62.2％、16.2％和34.4％，结果说明四种实验设计中，组别4是处理水稻秸秆产糖最优的方式。

表6 四种实验设计对NDF产糖的影响

实验设计组别	还原糖含量(mg/L)
		1	428.4±25.2
2	598.0±11.6
		3	517.1±25.1
4	694.8±16.6

对比例1、将本发明的“毛栓孔菌MX2漆酶基因LacF”改成登录号为MN327570的基因，按照上述方法进行检测，所得结果显示其重组漆酶对水稻秸秆还原糖的产出量为205.6mg/L，因此对水稻秸秆产量效果远不如本发明。

对比例2、专利号2020100289021的发明《重组真菌漆酶的制备方法及其应用》，真菌漆酶基因Lac1对应所得的重组漆酶按照上述实验3进行检测，发现其不具有水稻秸秆产糖的性能。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 毛栓孔菌漆酶基因及其重组漆酶的制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggatcggtc ccgtgaccga cctcacgatc tccaacgaga acgtctcgcc cgatggcttc 60

acgcgtgcgg ccgtcgtcgc gaacggcaag gctcctgggc ccctcatcac cggccagaag 120

ggcgaccgct tccagatcaa cgtggtcaac aagctgtcga accacaccat gctcaagtca 180

accagcattc actggcacgg cttcttccag aagggcacta actgggcgga cggccctgcg 240

ttcgtgaacc agtgcccgat cgccactggc cattcgttcc tctacgactt ccaggtcccc 300

gatcaggccg gaactttctg gtaccacagt catctgtcta cgcagtactg tgacggtctg 360

aggggaccgt tcgttgtcta tgacccgaat gacccgaacg ctagcctgta cgacgtcgac 420

aacgacgata ccgtcatcac cctcgcggac tggtaccatg tcgctgcgaa actcgggcct 480

gcgtttcctc ctcgttccga tgcaacgttg atcaacggtc tcgggcgtac gagcgatact 540

cctaacgcag acgtggctgt cattacggtc acgactggca agcggtaccg cttccgcctt 600

atttcgctgt cctgcgaccc cgcatacacc ttcagtatcg acaaccacga catgacaatt 660

atcgaggctg atggcgtcaa cacccagcag ctcacggtcg actccctgca gatcttcgcc 720

ggccaacgct actcattcgt gctagaggcg aaccagaagt cgggcaacta ctgggtgcgc 780

gcgaacccgt tcttcggcac gaccggattc gcgggcggta tcaactctgc gatcttgcgg 840

tacgacgacg ccgtgccggc tgagccgacg tctgaaccag gaacatcgac gaagccgttg 900

aaggagacgg acctgcatcc gcttgctgcg atgcccgtgc cgggctctgc tgtttcgggc 960

ggtgtggaca aggcgatcaa cttcgcgttc agcttcaacg gctccaactt cttcatcaac 1020

ggcgcgacgt tccagccccc gaccacgccc gtgttgctgc agatcatgag cggtgcgcag 1080

gacgcgaagg accttcttcc gtctggtgat gtctacgcct tgccctcgga cgcgacaatt 1140

gagctgtcct tcccggcctc gactggtgct cccggcgctc cccacccctt ccacctgcac 1200

ggccacacct tcgctgttgt acgcagcgcg ggcagcacgg agtacaacta cgacaacccg 1260

atctggcgtg atgttgtcag caccggcact ccccaggcgg gcgacaacgt taccatccgc 1320

ttcaggaccg acaaccctgg tccgtggttc ctccactgcc acattgactt ccacttggag 1380

gccggcttcg cggtggtcat ggccgaggat atccctggca ccaagctcgc caaccccgtt 1440

cctcaggcgt ggtcggacct ctgccccatc tacgacgcgc ttgacgagag cgaccagtga 1500

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ile Gly Pro Val Thr Asp Leu Thr Ile Ser Asn Glu Asn Val Ser

1 5 10 15

Pro Asp Gly Phe Thr Arg Ala Ala Val Val Ala Asn Gly Lys Ala Pro

20 25 30

Gly Pro Leu Ile Thr Gly Gln Lys Gly Asp Arg Phe Gln Ile Asn Val

35 40 45

Val Asn Lys Leu Ser Asn His Thr Met Leu Lys Ser Thr Ser Ile His

50 55 60

Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn Trp Ala Asp Gly Pro Ala

65 70 75 80

Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala Thr Gly His Ser Phe Leu Tyr Asp

85 90 95

Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu

100 105 110

Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro Phe Val Val Tyr Asp

115 120 125

Pro Asn Asp Pro Asn Ala Ser Leu Tyr Asp Val Asp Asn Asp Asp Thr

130 135 140

Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Val Ala Ala Lys Leu Gly Pro

145 150 155 160

Ala Phe Pro Pro Arg Ser Asp Ala Thr Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg

165 170 175

Thr Ser Asp Thr Pro Asn Ala Asp Val Ala Val Ile Thr Val Thr Thr

180 185 190

Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Ile Ser Leu Ser Cys Asp Pro Ala

195 200 205

Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Asn His Asp Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp

210 215 220

Gly Val Asn Thr Gln Gln Leu Thr Val Asp Ser Leu Gln Ile Phe Ala

225 230 235 240

Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Glu Ala Asn Gln Lys Ser Gly Asn

245 250 255

Tyr Trp Val Arg Ala Asn Pro Phe Phe Gly Thr Thr Gly Phe Ala Gly

260 265 270

Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Asp Ala Val Pro Ala Glu

275 280 285

Pro Thr Ser Glu Pro Gly Thr Ser Thr Lys Pro Leu Lys Glu Thr Asp

290 295 300

Leu His Pro Leu Ala Ala Met Pro Val Pro Gly Ser Ala Val Ser Gly

305 310 315 320

Gly Val Asp Lys Ala Ile Asn Phe Ala Phe Ser Phe Asn Gly Ser Asn

325 330 335

Phe Phe Ile Asn Gly Ala Thr Phe Gln Pro Pro Thr Thr Pro Val Leu

340 345 350

Leu Gln Ile Met Ser Gly Ala Gln Asp Ala Lys Asp Leu Leu Pro Ser

355 360 365

Gly Asp Val Tyr Ala Leu Pro Ser Asp Ala Thr Ile Glu Leu Ser Phe

370 375 380

Pro Ala Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His

385 390 395 400

Gly His Thr Phe Ala Val Val Arg Ser Ala Gly Ser Thr Glu Tyr Asn

405 410 415

Tyr Asp Asn Pro Ile Trp Arg Asp Val Val Ser Thr Gly Thr Pro Gln

420 425 430

Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Arg Thr Asp Asn Pro Gly Pro

435 440 445

Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala

450 455 460

Val Val Met Ala Glu Asp Ile Pro Gly Thr Lys Leu Ala Asn Pro Val

465 470 475 480

Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Ile Tyr Asp Ala Leu Asp Glu

485 490 495

Ser Asp Gln

Claims

1.一种来自毛栓孔菌MX2的漆酶基因LacF，其特征在于：基因LacF的DNA序列如SEQ IDNo：1所示。

2.如权利要求 1 所述的漆酶基因LacF编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如 SEQ ID NO：2 所示。

3.漆酶基因LacF的克隆方法，其特征在于：

提取毛栓孔菌MX2总RNA，经反转录得到cDNA，以此为模板，设计引物LacFF和LacFR，扩增得到LacF漆酶基因，

LacFF：CGGAATTCGGGATCGGTCCCGTGACCGACCTCA；

LacFR: ATTTGCGGCCGCTCACTGGTCGCTCTCGTCAAGCGCG；

所述漆酶基因LacF的DNA序列如SEQ ID No：1所示。

4.重组漆酶工程菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）、提取毛栓孔菌MX2总RNA，反转录成cDNA；

2）、以cDNA为模板，LacFF和LacFR为上、下游引物，扩增漆酶LacF基因；

3）、将漆酶LacF与表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pPIC9K-LacF；

4）、重组质粒pPIC9K-LacF经线性化后，转化毕赤酵母GS115，构建获得毕赤酵母工程菌GS115/ pPIC9K-LacF；

5）、将毕赤酵母工程菌GS115/ pPIC9K-LacF进行诱导发酵，筛选获得具有水稻秸秆产糖性能的重组漆酶；

所述漆酶LacF基因的DNA序列如SEQ ID No：1所示。

5.根据权利要求4所述的重组漆酶工程菌的制备方法，其特征在于所述步骤4）：使用10µg 线性化的pPIC9K-LacF重组质粒，通过电击转化法转化至毕赤酵母，电击参数为1750 V，5.0 ms。

6.根据权利要求5所述的重组漆酶工程菌的制备方法，其特征在于所述步骤5）包括以下步骤：

①、将转化的毕赤酵母工程菌GS115/ pPIC9K-LacF接种于MD固体培养基中，28℃培养3~4天；

②、挑取步骤①所得的单菌落，接种到MD固体培养基中，并依次编号，28℃培养4~6天；

③、挑取步骤②所得的编号菌落，分别接种于500 µL BMMY液体培养基中，250 rpm、 28℃振荡培养24小时；

④、在步骤③所得的培养产物中加入200 µL 1mM的ABTS进行显色反应，≥ 30分钟后观察，如液体颜色变为绿色或墨绿色，则对应编号的菌落即为具漆酶活性的毕赤酵母工程菌。

7.利用权利要求 4~6 任一方法所得的重组漆酶工程菌制备重组漆酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

一）、重组漆酶工程菌发酵，得重组漆酶的粗酶液；

二）、将粗酶液经过超滤、硫酸铵沉淀透析和离子交换层析，得重组漆酶。

8.如权利要求7所得的重组漆酶的用途，其特征在于：用于水稻秸秆产糖。

9.利用如权利要求7所得的重组漆酶进行水稻秸秆产糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

①、获得水稻秸秆中性洗涤纤维NDF；

②、将NDF与纤维素酶在pH = 4.8的乙酸钠缓冲液中于45℃中振荡处理6小时，之后离心分别收集上清液RS1和残留物R1；

③、将R1与重组漆酶在pH = 4.0的乙酸钠缓冲液中于45℃中振荡处理24小时，之后离心分别收集上清液RS2和残留物R2；

④、将R2与半纤维素酶在pH = 5.0的乙酸钠缓冲液中于45℃中振荡处理6小时，之后离心分别收集上清液RS3和残留物R3；

⑤、三步处理所得的RS1、RS2和RS3总和为产生的还原糖。