KR101350823B1 - 샤페론 단백질을 이용한 바이오매스의 당화 효율 증강용 조성물, 바이오매스의 당화 효율 증가 방법 및 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샤페론(charperone) 단백질을 당화 과정(saccharification)에 첨가함으로써 당화 효율을 높이는 신규한 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx)를 사용하여 셀룰로오즈(cellulose)를 포함한 바이오매스(biomass)의 당화 효율을 증강시키는 조성물 및 상기 방법을 통하여 당 생산률을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 기존의 당화 공정은 당화 과정 동안 형성되는 환원당에 의해 당화 효소, 특히 셀룰라아제(cellulase)의 활성이 저하되어 고가의 당화 효소를 지속적으로 투여해야 한다는 단점이 있었다. 이에 본 발명은 당화 효율(sacchrification efficiency)을 증진시키기 위하여, 당화 과정에 샤페론 단백질, 특히 Prx 단백질을 셀룰라아제와 함께 사용하여 셀룰라아제의 활성이 당화 과정 동안 저하되는 것을 방지함으로써 당화 효율을 높이는 방법을 제공하여 기존의 당화 과정에 대한 문제점을 해결할 수 있는 방안을 제공하였다.

Description

샤페론 단백질을 이용한 바이오매스의 당화 효율 증강용 조성물, 바이오매스의 당화 효율 증가 방법 및 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법{Composition for increasing saccharification efficiency of biomass, method for increasing saccharification efficiency of biomass and method for preparing bioethanol derived from biomass on a large scale using charperone protein}
본 발명은 샤페론 단백질을 이용하여 당화 효율(sacchrification efficiency)을 증가시키는 신규한 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 셀룰라아제와 함께 샤페론(chaperone) 활성을 갖는 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx)을 처리하여 셀룰로오즈의 당화 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
바이오매스로부터 에탄올 에너지를 얻기 위한 공정은 크게 당화 및 발효 공정으로 나누어진다. 이에 있어서 가수분해(hydrolysis) 공정은 셀룰로오즈 분자체인을 분해하여 당으로 전환하는 공정을 지칭하는데 산(acid)를 사용한 방법과 효소를 사용한 방법으로 나뉘어진다. 화학적 방법은 산을 통해 셀룰로오즈를 분해하는 것으로, 상기 화학적 가수분해 공정이 갖는 혹독한 조건으로 인해 독성을 가진 분해물이 만들어지게 되어 발효공정을 어렵게 만든다. 셀룰라아제 효소를 사용하여 셀룰로오즈체인을 글루코오즈(glucose)로 전환시키는 방법을 사용한다. 이러한 반응은 소나 양과 같은 반추동물의 위장 내에서 체온 정도의 온도에서 반응이 일어나게 되는데, 반응공정의 각 단계마다 다양한 효소들을 사용하게 된다. 이때 작용하는 주요 효소들로는 엔도글루카나아제(endoglucanase), 엑소글루카나아제(exoglucanase), 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) 등이 있으며 상기 효소가 시너지 현상을 일으키며 가수분해를 통한 당화가 이루어진다. 기존의 당화 과정에 있어서, 리그닌 파괴를 위한 전처리 과정의 난이성 등의 문제점이 있으나 극복해야 할 가장 큰 문제 중 하나는 당화 과정에서 생산되는 환원당에 의해 당화 공정 동안 셀룰라아제의 활성이 저하(공정 시작 1분 후부터 활성이 저하되기 시작하여 24시간이 지나면 최초 활성의 2% 수준까지 저하)되어 당화 과정 동안에 셀룰라아제의 지속적인 투입이 필요하다는 것이다. 셀룰라아제의 고가성을 감안할 때, 상기 효소의 지속적인 투입에 의해 당화 과정은 높은 재정적인 지원이 필요하기 때문에 그 산업성에 있어서 경제적 제약을 받아왔다.
샤페론(chaperone) 단백질은 단백질의 접힘(folding)에 관여하는 단백질로서(대한민국 공개특허 특2003-0085417), 예를 들어 단백질이 열 충격(heat shock)과 같은 스트레스를 받게 되면 단백질은 고유의 3차 구조가 풀리게 되어(변성) 그 단백질로서의 기능을 상실하게 되는데, 샤페론 단백질은 이렇게 풀려진 단백질을 인식하고 결합하여 이들이 다시 제대로 접힐 수 있도록 도와주는 단백질을 의미한다(대한민국 등록특허 제10-0476347호). 분자적 샤페론 활성(molecular chaperone activity)은 홀다아제(Holdase)와 폴다아제(Foldase) 활성으로 구별한다. 홀다아제는 예를 들어, 단백질이 스트레스(산화적 스트레스, 열 스트레스)에 노출로 인해 변성(denaturation)되면, 소수성의 아미노산 잔기들이 노출되어지게 되어 변성된 단백질들이 불규칙적으로 뭉쳐 결합체(aggregates)로 변하게 되고, 이는 단백질 분해효소(protease)에 의해 분해되는데, 이때 샤페론 단백질(SHSPs, DnaJ)은 스트레스에 의해 일부 풀어진 단백질의 소수성 아미노산에 결합하여 결합(aggregation)으로 진행되는 것을 방지하고, 다시 원래의 3차 구조로 돌아갈 수 있도록 하는 기능을 말한다(대한민국 공개특허 제10-2011-0014884호).
Figure 112012028596445-pat00001
반면에 폴다아제는 예를 들어, 새로운 단백질이 mRNA를 주형으로 리보좀(Ribosome) 단백질에 의해 합성되면, 원래 정해진 3차원 구조로 단백질이 접힘(Folding)을 형성하는데, 이때 샤페론 단백질(GroEL/ES, DnaK/J/E)이 새로이 신장된 아미노산 사슬에 결합하여 정확한 3차 구조를 형성할 수 있도록 도와주는 기능을 말한다.
Figure 112012028596445-pat00002

퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질은 인산화, 산화환원, 및 가능하게는 올리고머화(oligomerization) 상태에 의해 조절되는 대표적인 샤페론 단백질 중 하나이다. Prx 단백질은 3가지 종류가 있다; 전형적(classical) 2-Cys Prx 단백질; 비전형적(atypical) 2-Cys Prx 단백질; 및 1-Cys Prx 단백질. 상기 3가지 종류는 동일한 기본 촉매작용 기전을 공유하는데, 그 기전은 활성부위에 있는 산화환원-활성 시스테인(redox-active cystein)이 퍼옥시드 기질(peroxide substrate)에 의해 술펜산으로 산화되는 것이다. 2-Cys Prx 및 1-Cys Prx 단백질의 차이점은 술페닉산이 다시 티올(thiol)로 돌아가는 과정(recycling)에 있다; 2-Cys 퍼옥시레독신(peroxiredoxins)은 글루타치온과 같은 티올에 의해 환원되는 반면, 1-Cys Prx 단백질는 GST-의 존재하에 아스코르빅산 또는 글루타치온에 의해 환원될 수 있는 것이다.
2-시스테인 퍼옥시레독신(peroxiredoxin, Prx) 단백질이 퍼옥시다아제(peroxidase)와 샤페론 단백질의 이중 효소 활성을 가지는 것은 이미 알려져 있다(Rhee SG et al. Free Radic Biol Med 38:1543-1552, 2005). 또한, 2개의 시스테인 이외의 과잉 시스테인(additional cysteine)이 퍼옥시레독신의 구조적 변화에 영향을 미치는 것이 알려져 있다. 특히, 본 연구팀이 Pseudomonas putida(KT2440)로부터 동정 분리한 Prx PP1084 단백질은 2개의 잘 보존된 활성 시스테인(Cys 51 및 Cys 171)을 갖는 2-Cys Prx로서, 상기 단백질은 두개의 활성 시스테인 사이에 하나의 시스테인 잔기(Cys 112)를 추가적으로 갖는다. 상기 Cys 112는 Prx 단백질의 활성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다. 또한, 상기 Prx PP1084 단백질의 활성은 그 구조에 의존하는데, 즉 저분자 중합체일 경우 퍼옥시다아제(peroxidase)의 활성이 강하며 고분자 중합체일 경우에는 강한 샤페론의 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 하지만 상기 샤페론 활성을 갖는 Prx 단백질에 있어서, 당화 효율을 높이기 위한 용도는 전혀 보고된 바가 없다.
이에 있어서, 본 발명자들은 당화 효율을 높이기 위한 방법을 모색한 결과 샤페론 단백질, 특히 Prx 단백질을 당화 효소, 예를 들면 셀룰라아제와 같은 가수분해 효소와 함께 사용하여 당화 효율을 측정한 결과, 당화 효율이 샤페론 단백질을 첨가하지 않은 경우 24.9%인 것에 비하여 샤페론 단백질을 첨가하였을 경우 32.2%로 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 상기 샤페론 단백질의 당화 효율 증가 효과는 높은 샤페론 활성을 나타내는 셀룰레이즈(cellulase)를 포함한 당화 효소 : 샤페론 단백질이 1 : 1 이상, 보다 구체적으로 1 : 1 내지 1 : 5의 비율 경우에 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 샤페론 단백질을 당화 공정에 이용하여 당화 효소의 활성을 지속적으로 유지시켜 당화 효율을 증가시키기 위해 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 당화 효율(saccharification efficiency)을 높이기 위해, 당화 공정 동안에 셀룰라아제(cellulase) 또는 셀룰라아제를 포함한 당화 효소 조성물의 활성이 저하되는 기존의 문제점을 해결하기 위해 샤페론 단백질, 보다 구체적으로는 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질을 이용하여 상기 효소 또는 효소 조성물의 활성을 유지시켜 당화 효율을 높이기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 샤페론(chaperone) 단백질과 당화효소 또는 당화효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이오매스(biomass)의 당화 효율(saccharification efficiency) 증강용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 샤페론(chaperone) 단백질과 셀룰라아제(cellulase) 또는 셀룰라아제를 포함한 당화효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 셀룰로오즈(cellulose)의 당화 효율(saccharification efficiency) 증강용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이오매스에 샤페론 단백질과 당화효소 또는 당화효소 조성물을 함께 처리하는 단계를 포함하는, 바이오매스의 당화 효율 증가 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 셀룰로오즈에 셀룰라아제 및 샤페론 단백질을 함께 처리하는 단계를 포함하는 셀룰로오즈의 당화 효율 증가 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 바이오매스에 샤페론 단백질과 당화 효소 또는 당화효소 조성물을 함께 처리하여 상기 바이오매스를 당화시키는 단계; 및
2) 단계 1)의 당화에 의해 생성된 단당류를 알코올 발효시켜 에탄올을 제조하는 단계를 포함하는, 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법.
아울러, 본 발명은
1) 셀룰로오즈에 셀룰라아제 또는 셀룰라아제를 포함한 조성물과 샤페론 단백질을 함께 처리하여 상기 셀룰로오즈를 당화시키는 단계; 및
2) 단계 1)의 당화에 의해 생성된 단당류를 알코올 발효시켜 에탄올을 제조하는 단계를 포함하는, 셀룰로오즈로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명은 당화 효율(saccharification efficiency)을 증진시키기 위해 샤페론 단백질을 셀룰로오즈(cellulose)를 포함한 당화 과정에 사용함으로써 당화 효율을 증가시키는 효과를 제시하였다. 보다 구체적으로 식물성 바이오매스를 이용한 기존의 당화 공정은 셀룰로오즈를 포함한 다당류로부터 단당류를 생산하는 당화 과정 동안 생산되는 환원당에 의해 당화 효소, 특히 셀룰라아제의 활성이 당화 과정 24시간 후에는 최초효율의 2%까지 저하되는 문제점을 갖고 있었으며, 따라서 고가의 당화 효소를 지속적으로 투여해야 하는 경제적 제약이 있었다. 이에 있어서 본 발명은 당화 과정에 샤페론 단백질, 특히 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질을 당화효소와 함께 사용하였을 경우에, 상기 샤페론 단백질이 당화 과정 동안 당화 효소의 활성을 유지시킴으로써 샤페론 단백질을 사용하지 않았을 때보다 약 13% 가량 증진된 당 생산률이 나타내는 것을 확인하여, 당화 효율을 증진시키기 위한 샤페론 단백질의 신규한 용도 제공하였다. 따라서, 본 발명을 통해 샤페론 단백질을 사용하여 셀룰로오즈(cellulose)가 포함된 식물성 바이오매스(biomass)로부터 당 생산률(glucose yield) 높일 수 있다.
도 1은 실시예 1에 기재된 것과 같은 방법으로 수득된 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) PP1084 단백질의 샤페론 활성을 알아보기 위한 것으로서, 흡광도(OD360nm)를 측정함으로써 Prx PP1084의 함량에 따른 43℃의 열적 스트레스에 대한 말산 탈수소화효소(malate dehydrogenase; MDH)의 변성 정도를 나타내는 그래프이다.
도 2는 Prx의 DNA 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타내는 그림이다. PP1084는 전형적인 2-Cys Prx에 해당하는 퍼옥시레독신으로서 잘 보존된 2개의 활성 시스테인(빨간색)을 보유하고 있으며, 이 활성 시스테인 사이에 또 다른 하나의 시스테인(파란색)을 가지고 있다.
도 3은 Prx 단백질이 첨가되지 않은 음성 대조군과 Prx PP1084 단백질이 첨가된 경우의 당화 효율(saccharification efficiency)을 비교하기 위해 밀대로부터 측정한 당 생산량(glucose yield)을 나타내는 그래프이다.
도 4는 Prx 단백질을 셀룰라아제(cellulase)와 다양한 비율로 첨가한 경우 당화 효율을 비교하기 위해 측정한 당 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 수득한 Prx PP1084의 서열 유사성을 알아보기 위해 다른 생물체 8종의 아미노산 서열과 비교한 것을 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 서술한다.
본 발명은 샤페론(chaperone) 단백질과 당화효소 또는 당화효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이오매스(biomass)의 당화 효율(saccharification efficiency) 증강용 조성물을 제공한다.
상기 샤페론 단백질은 열 스트레스, 산화적 스트레스 등을 포함하는 스트레스에 대해 단백질의 3차 구조가 변성되는 것을 방지하는 샤페론 활성을 지닌 단백질을 포함한다. 상기 단백질은, 보다 구체적으로는 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질, 보다 더 구체적으로는 서열 번호 3의 아미노산을 갖는 Prx 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 당화효소는 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 자일라나아제(xylanase)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 첨가되는 당화 효소가 상기 세 효소의 혼합된 경우일 경우, 그 비율(셀룰라아제 : 베타-글루코시다아제 : 자일라네이즈)은 1 내지 10 : 1 내지 10 : 1 내지 10, 보다 구체적으로는 1 내지 10 : 1 내지 5 : 1 내지 5, 보다 더 구체적으로는 6 : 1 : 1로 혼합된 효소 칵테일일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 바이오매스는 셀룰로오즈(cellulose)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 당화 효율 증강용 조성물을 이용하는 당화 공정은 통상적인 방법에 따라 산 당화(acid saccharification)가 아닌 효소 당화(enzymatic saccharification)에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다. 상기 당화효소 또는 당화효소를 포함한 당화효소 조성물 : 샤페론 단백질은 1 : 1 내지 1 : 5, 보다 구체적으로는 1 : 1 내지 1 : 2의 비율로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 방법에 있어서, 당화는 25 내지 45℃의 온도 하의 pH 4.5 내지 6.5에서, 보다 구체적으로는 30 내지 40℃ 이하의 온도하의 pH 4.5 내지 6.0에서, 보다 더 구체적으로는 37℃의 온도하의 pH 5에서 당화시키는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 당화 공정 시간에 있어서는 12 내지 120시간, 보다 구체적으로는 24 내지 96시간일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 기재한 바와 같이, 본 발명은 샤페론 단백질과 셀룰라아제 또는 셀룰라아제를 포함한 당화효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 셀룰로오즈의 당화 효율(saccharification efficiency) 증강용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 Prx 단백질 유전자를 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida KT2440)의 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 서열 번호 1의 정방향 프라이머 및 서열 번호 2의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 Prx 단백질 유전자 단편(PP1084)를 수득하고, 클로닝 벡터인 pGEMT-easy 벡터에 클로닝하였다. Prx PP1084 유전자를 T7 프로모터 시스템을 갖고있는 발현벡터인 pRETa에 클로닝하고, 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환체 E. coli를 완성하였다. 상기 형질전환체 E. coli를 배양하고, 얻은 배양액을 순수정제하여 Prx PP1084 단백질을 수득하였다. 이에 있어 본 발명자들은 상기 수득한 Prx PP1084 단백질의 샤페론 활성을 확인하고자 열에 민감한 효소인 말산 탈수소화 효소(malate dehydrogenase; MDH)를 이용하였다. 43℃로 가열하게 되면 MDH는 변성되기 시작하여 결집체(aggregate)로 변하게 되는데, 이는 OD350nm에서 측정한 흡광도를 통해 그 변성 정도를 특정할 수 있다. 3차 구조가 깨진 변성 단백질은 높은 OD350nm 흡광도를 갖기 때문에 OD350nm 흡광도는 MDH 가열시간에 비례하여 증가하게 된다. 본 발명자들은 상기 기술된 것과 같이 수득된 Prx PP1084 단백질을 MDH에 다양한 비율로 첨가하여 43℃의 열을 지속적으로 가하여 15분까지 그 흡광도를 관찰한 결과, 샤페론 활성을 가진 Prx PP1084 단백질이 존재할 경우, Prx PP1084 단백질의 함량이 높을수록 낮은 OD350nm 흡광도를 보였다. 이는 Prx PP1084 단백질에 의해 열에 의한 MDH의 변성이 억제되었다는 것을 의미한다. 또한, 이러한 샤페론의 활성은 15 분 이상에서도 지속되는 것을 보임(도 1 참조)으로써 상기 수득된 Prx PP1084 단백질의 높은 샤페론 활성을 확인하였다.
이에 의거하여, 본 발명자들은 Prx 단백질이 당화 효율에 어떠한 영향을 주는지 알아보고자, Prx 단백질 존재하에 당 생성률 및 에탄올 함량 분석을 실시하였다. 먼저, 밀대를 분쇄하고 고온고압처리를 하여 셀룰로오즈(cellulose)를 포함하는 바이오매스(biomass)를 준비하였다. 당화 효소로서 셀룰레이즈(cellulase), 베타-글리코시다아제(beta-glycosidase) 및 자일라네이즈(xylanase)의 효소 칵테일(셀룰레이즈 : 베타-글리코시다아제 : 자일라네이즈 = 6 : 1 : 1)과 Prx PP1084 단백질을 상기 준비된 바이오매스와 혼합하여 사용한 당 생성률을 측정하였다. 그 결과 Prx PP1084 단백질이 없는 음성 대조군보다 Prx PP1084 단백질이 있는 실험군에서 약 13%의 높은 당 생성율을 보였다(도 3 참조). 또한, 유의적으로 당 생성률을 높일 수 있는 Prx PP1084 단백질의 첨가량을 알아보고자 상기 효소 칵테일 : Prx PP1084 단백질의 다양한 비율을 사용하여 당 생성률을 측정한 결과, 상기 비율이 1 : 1 내지 1 : 5에서 유의적으로 높은 당 생성률을 보였다(도 4 참조).
따라서, 본 발명자들은 샤페론 활성을 가진 Prx 단백질이 당 생산률, 즉 당화 효율(saccharification)을 높이는데 효과적으로 사용될 수 있다는 새로운 용도를 보였다.
또한, 본 발명은 바이오매스에 샤페론 단백질과 당화효소 또는 당화효소 조성물을 함께 처리하는 단계를 포함하는, 바이오매스의 당화 효율 증가 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 샤페론 단백질은 단백질의 3차 구조를 유지시켜주는 샤페론 활성을 가진 모든 단백질을 포함할 수 있고, 구체적으로는 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질, 보다 더 구체적으로는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 Prx 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 당화효소는 셀룰라아제, 베타-글루코시다아제 및 자일라나아제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 첨가되는 당화 효소가 상기 세 효소의 혼합된 경우일 경우, 그 비율(셀룰라아제 : 베타-글루코시다아제 : 자일라네이즈)은 1 내지 10 : 1 내지 10 : 1 내지 10, 보다 구체적으로는 1 내지 10 : 1 내지 5 : 1 내지 5, 보다 더 구체적으로는 6 : 1 : 1로 혼합된 효소 칵테일일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 바이오매스는 셀룰로오즈를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 당화 공정은 통상적인 방법에 따라 산 당화가 아닌 효소 당화에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다. 상기 셀룰라아제 : 샤페론 단백질은 1 : 1 내지 1 : 5, 보다 구체적으로는 1 : 1 내지 1 : 2의 비율로 처리하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 방법에 있어서, 당화는 25℃ 내지 45℃의 온도 하의 pH 4.5 내지 6.5에서 당화시키는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한 당화 공정 시간에 있어서는 12 내지 120시간일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 기재한 바와 같이, 본 발명은 셀룰로오즈에 셀룰라아제 및 샤페론 단백질을 함께 처리하는 단계를 포함하는 셀룰로오즈의 당화 효율 증가 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 바이오매스에 샤페론 단백질과 당화 효소 또는 당화효소 조성물을 함께 처리하여 상기 바이오매스를 당화시키는 단계; 및
2) 단계 1)의 당화에 의해 생성된 단당류를 알코올 발효시켜 에탄올을 제조하는 단계를 포함하는, 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 바이오매스는 셀룰로오즈를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 샤페론 단백질은 샤페론 활성을 갖는 모든 단백질일 수 있으며, 보다 구체적으로는 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질, 보다 더 구체적으로는 서열 번호: 3의 아미노산을 갖는 Prx 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 셀룰라아제 또는 셀룰라아제를 포함한 당화 효소 조성물 : 샤페론 단백질의 비율은 1 : 1 내지 1 : 5의 비율로 처리하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 당화효소는 셀룰라아제, 베타-글루코시다아제 및 자일라나아제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 발효시키는 조건은 단당류에 효모를 처리한 후, 혐기성 조건에서 25 내지 45℃, 보다 구체적으로는 30 내지 35℃에서 배양하는 것으로 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 기재한 바와 같이, 본 발명은
1) 셀룰로오즈에 셀룰라아제 또는 셀룰라아제를 포함한 당화 효소 조성물과 샤페론 단백질을 함께 처리하여 셀룰로오즈를 당화시키는 단계; 및
2) 단계 1)의 당화에 의해 생성된 단당류를 알코올 발효시켜 에탄올을 제조하는 단계를 포함하는, 셀룰로오즈로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명에서는, 바이오에탄올 생산을 위하여, 당화 과정과 발효 과정을 각각 다른 반응기에서 수행하는 '분리 당화 및 발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF) 공정'과 하나의 반응기에서 당화 과정과 발효 과정을 동시에 수행하는 '동시 당화 및 발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF) 공정' 중 어느 것도 사용가능하다. 여기서, 분리 당화 및 발효 공정은 당화 과정과 발효 과정에서 효소와 효모에 대해 각각 최적화된 조건 하에 반응시킬 수 있다는 장점이 있는 반면, 효소반응은 그 중간생성물과 최종생성물인 셀로바이오스와 글루코오즈에 의해 억제영향을 받기 때문에 반응이 진행됨에 따라 축적된 글루코오즈의 농도가 높아지면 반응이 종결되는 단점이 있으며, 이를 극복하기 위해 효소의 양을 늘려야만 하므로 경제적이지 못한 측면이 있다. 이에 비해, 동시 당화 발효 공정에서는 당화 과정에서 글루코오즈가 생성되자마자 효모가 발효 과정에 의해 글루코오즈를 바로 제거하고 반응기 내에 당의 축적을 최소화할 수 있으므로, 분리 당화 및 발효 공정에서 나타나는 최종 생성물의 억제작용을 방지할 수 있고 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있으며, 부가적으로 장치비의 절감과 낮은 효소 투입량에 의한 비용감소 효과를 볼 수 있고, 반응기 내에 에탄올이 존재하므로 오염문제를 감소시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명에서는 동시 당화 및 발효 공정을 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
바이오에탄올 생산을 위한 발효균주로는 효모(yeast), 높은 당 농도에서도 발효를 수행할 수 있는 내당성 균주와 효소 당화의 최적 온도인 40 ~ 45℃ 부근에서도 에탄올 전환이 가능한 내열성 균주, 고가의 효소 사용량 절감과 고농도의 에탄올 생산을 위해 당화 및 발효를 동시에 수행할 수 있는 재조합 균주, 예를 들어, 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) P2, 브레타노마이세스 커스터시(Brettanomyces curstersii), 사카로마이세스 우브즈런(Saccharomyces uvzrun), 캔디다 브래시카에(Candida brassicae) 등 당업계에 알려진 통상적인 균주, 보다 구체적으로는 사카로미시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
따라서, 본 발명은 당화 효율을 증진시키기 위해 샤페론 단백질을 바이오매스의 당화 과정에 사용함으로써 당화 효율을 증가시키는 효과를 제시하였으므로, 단당류를 알코올 발효시켜 에탄올을 제조하는 바이오에탄올의 대량생산 방법에 상기 당화 효율 증진 방법을 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 퍼옥시레독신 ( peroxiredoxin ; Prx ) PP1084 유전자 클로닝 및 단백질의 정제
<1-1> 퍼옥시레독신 ( peroxiredoxin ; Prx ) 유전자 클로닝
Prx 단백질 유전자는 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida, KT2440)의 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 수득되었다. 클로닝 벡터(cloning vector)인 pEGMT-easy벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝 하였고, 염기서열 분석(sequencing analysis)을 통하여 유전자를 확인하였다. 이후, 발현 벡터인 pRSETa 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site)의 제한효소 자리에 유전자를 서브-클로닝(Sub-cloning) 하였다.
우선, PP1084 유전자의 클로닝을 위해 하기와 같은 조건에서 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440의 유전체 DNA(genomic DNA) 10ng, dNTP 0.2μM, 정방향 프라이머 20pmol, 역방향 프라이머 20pmol, Taq 중합효소(polymerase) 1unit 및 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 94℃에서 30초 동안 변성(denature), 50℃에서 45초 동안 어닐링(annealing), 및 72℃에서 45초 동안 연장(extension)의 과정을 35회 반복한 후, 마지막 연장(extension) 과정을 72℃에서 10분 동안 시행하여, PCR 산물을 획득하였다. PCR에 사용한 프라이머는 하기와 같다 :
수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440 정방향 프라이머 : 5'-ccgctcgagatgagcgtactc-3'(서열번호 1); 및
수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440 역방향 프라이머 : 3'-cgagctcttacagcttgccagc-5'(서열번호 2).
수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440의 유전체 DNA(genomic DNA)는 XhoI과 ScaI 제한효소 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 획득하였다. Prx 유전자는 클로닝 벡터인 pGEMT-easy 벡터에 삽입하고 염기서열 분석(sequencing analysis)를 이용하여 유전자의 염기서열을 확인하였다. 그리고, 발현 벡터인 pRSETa 벡터의 다중 제한효소 클로닝 부위(multi-cloning site)상의 제한효소 자리에 유전자를 서브 클로닝(sub-cloning)하였다.
그 후, 발현벡터 pRSETa에 삽입된 PP1084 유전자로부터 Prx 단백질의 발현과 순수분리 정제를 위하여, E. coli(KRX strain; Promega, USA)에 형질전환 하였다. pRSETa 벡터 시스템은 T7 프로모터(Promoter)를 이용하여 삽입된 유전자의 단백질인 Prx 단백질을 과발현시키고, Prx 단백질의 용이한 순수분리를 위해 Prx 단백질의 N-말단에 6개의 히스티딘(Histidine; His)을 붙여서 단백질을 합성하였다. pRSETa 벡터 시스템의 T7 프로모터의 작동을 위해서 숙주 E. coli 세포내에서 T7 RNA 중합효소(polymerase)를 공급하였다. KRX 계(strain)는 L-람노스(L-rhamnose)에 의해 T7 RNA 중합효소의 공급이 조절되는 숙주 E. coli 이다. Prx 단백질의 순수분리 정제를 위해 Prx PP1084 단백질 형질전환체 클론을 만들었다.
<1-2> 퍼옥시레독신 ( peroxiredoxin ; Prx ) 단백질의 정제
상기 기술된 것과 같은 방법으로 pRSETa 발현벡터에 클로닝된 Prx 유전자(PP1084)를 대량 생산하기 위하여, 500mL의 LB(Luria-Bertani)배지가 들어있는 2L 삼각플라스크에 1/100(v/v)으로 종균배양을 접종하고, 37℃에서 150rpm으로 배양하였다. OD600nm에서 그 수치가 0.4가 될 때까지 배양한 후, 최종 0.2 %의 20% L-람노스(L-rhamnose)를 첨가하고, 37℃에서 150rpm으로 배양하였다. 1mL의 L-람노스에 의해서 유도된 세포를 4℃, 6000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포들을 수득하고, 0.02% triton X-100이 첨가된 결합 버퍼(Binding buffer)[20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 M NaCl, 5 mM Imidazole]을 이용하여 현탁한 후, -20℃에 냉동 보관하였다. 결합 버퍼는 400mL의 LB에 대하여 30mL을 첨가하였다. 초음파 분쇄기(sonicator)(VCX500; Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA)를 이용하여 세포를 파쇄 시킨 후, 용해물을 4℃, 15000rpm에서 40분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 미리 평형(equilibration)시킨 NTA-킬레이트 레진(NTA-chelate resin; peptron, daejeon, korea)에 상기 상등액을 첨가하고, 4℃에서 1시간 이상 로테이팅 휠(Rotating wheel)에서 교반하여 레진에 결합하도록 하였다. 교반이 끝나고 4℃, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 레진과 상등액을 분리하였다. 분리된 레진에 레진의 양에 대하여 약 5배 정도 되는 워시 버퍼(wash buffer)[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5M NaCl, 50mM Imidazole]을 첨가하고, 20-30분 동안 4℃에서 1시간 이상 로테이팅 휠에서 교반하여 상등액을 제거하는 과정을 5회 반복하였다. 레진에 대하여 0.5-1배 정도의 용리 버퍼(elution buffer)[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5M NaCl, 200-400 mM Imidazole]을 씻겨진 레진에 첨가하고, 1시간 이상 4℃에서 로테이팅 휠에서 교반한 후, 상등액을 수득하였다. 그 후, 용리 버퍼를 첨가하여 상등액을 수득하는 과정을 3회 반복하고, 상기 수득된 용리 분획물을 막 튜브(membrane tube)에 옮긴 후, 1L의 50mM 히피스[Hepes(pH 8.0)]를 이용하여 투석(dialysis)을 3회 반복하고, 센트리콘(centricon)(Millipore, Carrigtwohill, Co. Cork, Ireland))으로 농축하였으며, 실험하기 전까지 -80℃에서 냉동보관하였다.
< 실시예 2> 퍼옥시레독신 ( peroxiredoxin ; Prx ) PP1084 단백질의 아미노산 서열과 다른 생물체의 유사 단백질과의 상동성 비교
상기 정제된 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) PP1084와 다른 종에서 발견되는 퍼옥시레독신의 상동성을 비교하기 위해 본 실험을 수행하였다.
질량분석기를 이용하여 동정된 단백질 PP1084의 아미노산 서열을 NCBI에 등록된 다른 생물들의 아미노산 서열과 블라스트(blast)하였다.
그 결과, 다른 생물체 8종의 아미노산 서열과 유사성이 높은 것으로 나타났으며, 활성 시스테인(active cysteine)이 포함된 활성 시스테인 모티프(active cysteine motif)[VCP 모티프(Val-Cys-Pro motif)]가 유사한 것을 확인할 수 있었다(도 5). 또한, 이들 8종의 단백질들은 항산화 단백질인 알킬 하이드로퍼록사이드 환원효소(alkyl hydroperoxide reductase C; AhpC), 티오레독신 의존 퍼록시레독신(thioredoxin-dependent peroxiredoxin; TPx), 페록시레독신(peroxiredoxin; Prx)으로 명명되어진 단백질로 알려져 있었다.
< 실시예 3> 퍼옥시레독신 ( peroxiredoxin ; Prx ) PP1084 단백질의 샤페론 활성 측정
퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) PP1084 단백질의 샤페론 활성을 측정하기 위해 본 실험을 수행하였다. 일반적으로 분자 샤페론 활성은 상기에 기술된 것과 같이 홀다아제(holdase)와 폴다아제(foldase) 활성으로 구별하는데, 본 실험에서는 샤페론 활성 중 홀다아제의 기능을 분석하였다.
홀다아제의 기능을 분석하기 위해 스트레스는 43℃의 열 스트레스(heat stress)를 사용하였고, 사용된 효소는 온도에 민감한 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase; MDH)를 사용하였다. MDH는 43℃로 가열하게 되면 변성되어 결집체(aggregate)로 변하고, 이는 OD340nm에서 측정한 흡광도를 통해 그 변성 정도를 특정할 수 있으며, 따라서 OD340nm 흡광도는 MDH 가열시간에 비례하여 증가하게 된다. 총 반응용량을 300㎕로 하여, 50μM의 HEPES(pH8.0) 내에서 MDH 또는 샤페론 활성이 있는 Prx PP1084 단백질이 첨가된 MDH를 43℃로 15분 동안 분광광도계(EVOLUTION 300 UV-VIS spectrophotometer, Thermoscientific, Worcester, MA, USA)를 이용하여 OD340nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. 음성 대조군으로서 Prx PP1084 단백질 없이 MDH 단백질만 존재하는 것을 사용하였고, 실험군으로서 하기의 표 1과 같이 MDH 효소에 대한 다양한 비율의 Prx PP1084 단백질을 첨가하여 OD340nm로 흡광도를 측정하였다.
음성 대조군 실험군 1 실험군 2 실험군 3
MDH 및 Prx PP1084의 비율
(몰비율(molar ratio))		 1 : 0 1 : 0.1 1 : 0.5 1 : 1
Prx PP1084
(1 ㎍/uL)		 0 1.33 ㎕ (1.33 ㎍) 6.6 ㎕ (6.6 ㎍) 13.3 ㎕ (1.33 ㎍)
MDH (총 20 ㎍) 6.5 μL 6.5 μL 6.5 μL 6.5 μL
1M HEPES(pH8.0) (최종농도: 50 mM) 15 μL 15 μL 15 μL 15 μL
DW 278.5 μL 277.17 μL 271.9 μL 265.2 μL
총량(Total) 300 μL 300 μL 300 μL 300 μL
그 결과, 43℃의 열 스트레스에 대해 MDH의 OD340nm 흡광도가 Prx PP1084의 함량에 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 샤페론 단백질의 활성은 15분 이상의 42℃ 열 스트레스에 대해서도 지속되는 것을 확인하였다(도 1).
< 실시예 4> 퍼옥시레독신 ( peroxiredoxin ; Prx ) 단백질에 의해 증진된 바이오매스의 당화 효율 분석
실시예 1에서 수득한 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질이 당화 효율에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 본 실험을 수행하였다.
<4-1> 바이오매스 시료 준비
당화 효율과의 상관관계를 규명하고자 밀대를 분쇄하여 하기와 같이 5개의 각기 다른 크기의 채(sieve)를 사용하여 분리하였다 : 200μm 이하, 200-510μm, 510-710μm, 710-1000μm 및 1000μm 이상. 상기 채에 의하여 분리된 시료에 약한 황산(3%)을 첨가한후 121℃에서 30분간 고온고압 처리를 실시하였다.
<4-2> 방사선 조사 Prx 의 첨가에 따른 바이오매스의 당화 효율 증가
Prx PP1084 단백질의 유무에 따른 바이오매스의 당화 효율을 측정하기 위하여, R-10 셀룰라아제(cellulase)(onozuka, Japan), 베타-글루코시다아제(glucosidase) (Sigma, USA) 및 자일라네이즈(xylanase)(Sigma, USA)를 6 : 1 : 1의 비율(160 ㎍/mL : 27 ㎍/mL : 27 ㎍/mL)로 섞은 효소 칵테일에, 상기 실시예 1에서 분리된 Prx PP1084 단백질을 효소 칵테일에 대해 각각 1 : 0, 1 : 0.5, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4 및 1 : 5의 비율(몰비율, 셀룰라아제와 PP1084 비율이 1:1 일때 800 ㎍ 셀룰라아제 : 200 ㎍ PP1084)로 사용하여 첨가한 후, 단백질 당화 효율(saccharification efficiency)을 비교하였다. 그리고 음성 대조군으로서, Prx PP1084 단백질을 제외하고 상기 동일한 조건에서 당화 효율을 비교하였다.
각각의 샘플에 대한 당화 효율은 다음과 같이 측정하였다. 먼저, 1L 삼각 플라스크에 밀대 분말 5g와 487mL의 시트르산 버퍼(citrate buffer) [citric acid 1-hydrate 10.57g/L (pH 5.0)]에 넣고 1시간 동안 37℃, 140rpm으로 진탕하여 셀룰라아제 칵테일의 최적 환경을 조성하였다. 13mL의 셀룰라아제 칵테일을 487mL 반응액에 첨가하고, 총 500mL의 당화 반응액을 만든 후, 37℃, 140rpm에서 96시간 동안 진탕하여 밀대 분말을 당화시켰다. 당화 공정을 마친 반응액을 원심분리(6000rpm, 10분, 4℃)하여 잔존 분말을 침강시켜 제거하고, 상등액만을 수득한 후, 표준곡선을 이용하여 반응액 중 절대 글루코오즈(glucose) 및 자일로오즈(xylose)의 농도(mg/mL)를 HPLC분석하였다. 낮은 글루코오즈 농도의 반응액을 40℃로 가열하면서 감압농축(evaporation)하고, 잔존 수분을 동결 건조하여 완전히 분말화 하였다. 에탄올(ethanol) 발효 과정에 절대 글루코오즈 양으로 당화 분말을 첨가하기 위해 분말화된 글루코오즈 혼합물의 절대 글루코오즈 함량(g/g)을 구하고 절대량을 산출하였다.
<4-3> 방사선 조사 Prx 의 첨가에 따른 바이오매스의 에탄올 함량 증가
알코올 발효를 위해 본 연구에서는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae , KCCM11626) 균주를 이용하였다. 10mL YPG[(glucose : 5g, yeast extract : 0.5g, peptone : 0.5g, MgSO4 : 0.1g, K2HPO4 : 0.1g/100mL (pH 5)]의 완전 배지가 들어 있는 시험관에 S. cerevisiae 세포를 접종하고 30℃, 180rpm으로 전배양 하였다. 알코올 발효를 위한 본배양은 1L 삼각 플라스크에 밀대 분말로부터 당화시킨 글루코오즈 5g 및 보조 영양요소[(yeast extract : 0.5g, peptone : 0.5g, MgSO4 : 0.1g, K2HPO4 : 0.1g/100mL (pH 5)]가 들어있는 495mL의 배지를 만들어 멸균하고 전배양액 5mL을 접종하여, 산소가 차단되도록 밀봉한 후, 30℃, 140rpm으로 48시간 배양하였다. 알코올발효에 의해 생성된 배양액 중의 알코올 정량은 배양액을 원심분리(6000rpm, 10분, 4℃)하여 상기 사용된 S. cerevisiae 세포를 침강시켜 제거하고, 상등액만을 취하여 배양액 중의 절대 알코올 농도(mL/mL)를 HPLC를 이용하여 분석하였다.
그 결과, Prx PP1084 단백질이 첨가되지 않은 음성 대조군에 비해 당 생성률(glucose yield)이 약 13% 증가하는 것을 보였다(도 3). 또한, 상기 사용된 효소 칵테일에 대해 샤페론 단백질의 비율이 1 : 1 이상일 경우, 음성 대조군에 비해 약 6%의 당 생성률이 증가하는 것을 보였으며, 또한 그 비율이 1 : 2가 될 경우 당 생성률이 약 13%가 증가하는 것을 보였다(도 4).
기존에 당화 과정에서 생성되는 환원당은 셀룰라아제(cellulase)의 활성을 저하시킴으로써 당 생성률을 저하시키는 문제를 야기하였다. 따라서 고가의 셀룰라아제를 지속적으로 투여해야 하므로 높은 생산단가를 나타내었다. 이에 있어, 본 발명자들은 샤페론 단백질, 보다 구체적으로는 퍼옥시레독신(peroxiresdoxin; Prx) 단백질을 당화 과정에 첨가함으로써 당 생성률(glucose yield)을 증기시키는 새로운 방법을 제시하였다. 이것은 기존의 단점이었던 시간이 지남에 따른 당화 효소 활성의 저하에 의한 당 생성률의 감소를 극복하여 당화 과정을 산업적으로 보다 효율적으로 할 것이다.
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Claims (19)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 퍼옥시레독신(peroxiredoxin; Prx) 단백질과 당화효소 또는 당화효소 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이오매스(biomass)의 당화 효율(saccharification efficiency) 증강용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 당화효소는 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 자일라나아제(xylanase)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증강용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 바이오매스는 셀룰로오즈(cellulose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증강용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 조성물은 당화효소 또는 당화효소 조성물 : 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 퍼옥시레독신 단백질이 1:1 내지 1:5의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증강용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 조성물은 당화효소 또는 당화효소 조성물 : 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 퍼옥시레독신 단백질이 1:1 내지 1:2의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증강용 조성물.
  8. 바이오매스에 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 퍼옥시레독신 단백질과 당화효소 또는 당화효소 조성물을 함께 처리하는 단계를 포함하는, 바이오매스의 당화 효율 증가 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 바이오매스는 셀룰로오즈(cellulose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증가 방법.
  10. 삭제
  11. 제 8항에 있어서, 당화효소는 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 자일라나아제(xylanase)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증가 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 당화효소 또는 당화효소 조성물 : 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 퍼옥시레독신 단백질이 1:1 내지 1:5의 비율로 처리하는 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증가 방법.
  13. 제 8항에 있어서, 당화는 30 내지 40℃의 온도 하의 pH 4.5 내지 6에서 당화되는 것을 특징으로 하는 바이오매스의 당화 효율 증가 방법.
  14. 1) 바이오매스에 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 퍼옥시레독신 단백질과 당화효소 또는 당화효소 조성물을 함께 처리하여 상기 바이오매스를 당화시키는 단계; 및
    2) 단계 1)의 당화에 의해 생성된 단당류를 알코올 발효시켜 에탄올을 제조하는 단계를 포함하는, 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 단계 1)의 바이오매스는 셀룰로오즈(cellulose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법.
  16. 삭제
  17. 제 14항에 있어서, 단계 1)에서 당화효소 또는 당화효소 조성물 : 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 퍼옥시레독신 단백질이 1:1 내지 1:5의 비율로 처리하는 것을 특징으로 하는 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법.
  18. 제 14항에 있어서, 단계 1)의 당화효소는 셀룰라아제(cellulase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 자일라나아제(xylanase)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 단계 2)의 알코올 발효는 단당류에 효모를 처리한 후, 혐기성 조건에서 30 내지 35℃에서 배양함에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오매스로부터 바이오에탄올의 대량생산 방법.
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