CN111593082B - 一种稳定木质纤维素酶解过程的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稳定木质纤维素酶解过程的方法,在向酶解罐的生物质物料中加入纤维素酶液进行酶解之前,先向生物质物料中加入有机酸盐溶液和有机酸复配液,其中,生物质物料为秸秆、玉米芯、甘蔗渣、木糖渣中任意一种,有机酸盐溶液包括甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠或琥珀酸钠溶液中的一种,有机酸复配液包括柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液中的至少一种。本发明利用多种有机酸进行复配,在木质纤维素高固酶解过程中加入复配有机酸,在木质纤维素物料高固酶解过程中能够保持纤维素酶蛋白活性,使得纤维素酶解转化率增加。
Description
技术领域
本发明属于木质纤维素酶解技术领域,特别涉及一种稳定木质纤维素酶解过程的方法。
背景技术
我国是农林业大国,每年产生数之不尽的农业废弃物(秸秆、玉米芯、甘蔗渣等)和林业废弃物(木材、枝叶等)。对这些这些废物高值化利用是非常有潜力的研究方向。
这些自然界产生的木质纤维素材料主要有纤维素(32%~36%)、半纤维素(35%~40%)、木质素(25%)三种组分。其中,玉米芯中半纤维素组分可以开发生产木糖、低聚木糖、糠醛、木糖醇等,而纤维素组分可以通过纤维素酶酶解,生产单体葡萄糖。酶解液经过后续精制工艺,可以生产葡萄糖浆产品,同时,酶解液通过微生物发酵,可以生产燃料乙醇等高价值产品。
利用木质纤维素物料中纤维素组分的关键步骤是纤维素酶酶解,纤维素酶解的过程中,由于酶解物料组分的复杂、高固酶解体系的变化,酶解过程中纤维素酶蛋白的活性会降低甚至失活。其中纤维素酶发挥高活性的限制条件主要有温度、pH值、微生物的生长、木质纤维素中木质素对酶蛋白的吸附、酶蛋白氧化失活等。目前,为保持酶蛋白活性,已经有许多针对性研究正在开展。
研究发现叠氮化钠和一些抗生素(四环素)有抑菌作用,能抑制杂菌的生长,减少酶活力的损失;硫代硫酸钠能防止酶蛋白的氧化失去活性。这些方法能在一定程度上保持纤维素酶蛋白活性,但是在生物质燃料乙醇工业生产中,大规模高固酶解体系中所需的纤维素酶量十分巨大,所需的保持的纤维素酶蛋白活性的物质也较多。而且使用叠氮化钠、抗生素、硫代硫酸钠这些物质经济效益较低,这些物质功能单一,维持纤维素酶蛋白活性效应不强。
现有木质纤维利用技术领域存在以下问题:
1.木质纤维素在高固酶解过程中纤维素酶需要在合适的pH值条件下才能充分发挥效果,但是由于粘度过高,pH值控制困难,需要合适的缓冲体系进行调节;
2.木质纤维素高固酶解体系较为复杂,容易滋生细菌、霉菌等微生物,需要添加抑菌物质,但是叠氮化钠、抗生素类物质(四环素)在大规模工业化中成本太高,我们需要找到一种合适工业化的抑菌方法;
3.木质纤维素酶解过程时间为3~5天,时间较长,使用的纤维素酶容易氧化变性,失去酶解能力,目前利用Vc、硫代硫酸钠等抗氧化剂能过防止酶蛋白变性,但是在大规模工业化中成本太高,而且这些物质功能单一。
调控pH值、抑制微生物、抗氧化都是木制纤维素高固酶解过程中出现的抑制酶蛋白活力的问题,现在没有一种方法能够兼顾这三个问题并一同解决。因此,本发明主旨为开发一种利用有机酸来解决上述三个问题的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种稳定木质纤维素酶解过程的方法,在木质纤维素物料高固酶解过程中能够保持纤维素酶蛋白活性的方法,使得纤维素酶解转化率增加。
本发明是这样实现的,提供一种稳定木质纤维素酶解过程的方法,在向酶解罐的生物质物料中加入纤维素酶液进行酶解之前,先向生物质物料中加入有机酸盐溶液和有机酸复配液,其中,生物质物料为秸秆、玉米芯、甘蔗渣、木糖渣中任意一种,有机酸盐溶液包括甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠或琥珀酸钠溶液中的一种,有机酸复配液包括柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液中的至少一种。
进一步地,有机酸盐溶液和有机酸复配液加入后,维持酶解体系的pH为4.6~5.6,使得酶解体系中生物质物料干物质量为15%~25%,纤维素酶液的加入量为生物质物料干物质量4%~6%。
进一步地,纤维素酶采用诺维信Cellic CTec2。
进一步地,酶解时,酶解罐的控制温度45℃~50℃、搅拌速度180rpm~220rpm,酶解48h~96h。
进一步地,取70mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,82g~85g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料15g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
进一步地,取65mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,70g~80g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料20g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.8g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
进一步地,取60mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,72g~75g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料25g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入1.0g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
进一步地,取70mL的0.1mmol/L甲酸钠有机酸盐溶液,82g~85g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料15g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为4.6,控制酶解罐的温度45℃、搅拌速度180rpm,酶解96h。
进一步地,取60mL的0.1mmol/L乙酸钠有机酸盐溶液,72g~75g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料25g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.8g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度220rpm,酶解48h。
与现有技术相比,本发明的稳定木质纤维素酶解过程的方法主要内容是利用多种有机酸进行复配,在木质纤维素高固酶解过程中加入复配有机酸,在木质纤维素物料高固酶解过程中能够保持纤维素酶蛋白活性,使得纤维素酶解转化率增加。
本发明还具有以下特点:
其一,酶解体系中加入有机酸,同时加入弱酸盐,例如柠檬酸-柠檬酸三钠体系,组成缓冲体系,维持酶解体系pH值稳定;
其二,多种有机酸联合作用,能在较高pH值(4~6)下达到抑制杂菌生长的作用;
其三,有机酸抗氧化能力较强,在酶解体系中能防止酶蛋白的氧化失去活性。
附图说明
图1为本发明实施例2的有机酸复配液在木质纤维素酶解过程中的抑菌作用对比示意图;
图2为本发明实施例2的有机酸复配液在木质纤维素酶解过程中稳定pH值的能力对比示意图;
图3a和图3b分别为本发明实施例2的有机酸复配液在木质纤维素酶解过程中葡萄糖浓度和纤维素转化率的对比示意图;
图4a和图4b分别为本发明实施例3的有机酸复配液在木质纤维素酶解过程中葡萄糖浓度和纤维素转化率的对比示意图;
图5a和图5b分别为本发明实施例4的有机酸复配液在木质纤维素酶解过程中葡萄糖浓度和纤维素转化率的对比示意图;
图6为本发明实施例5不同类型的有机酸复配液对生物质酶解促进作用对比示意图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明稳定木质纤维素酶解过程的方法的较佳实施例,在向酶解罐的生物质物料中加入纤维素酶液进行酶解之前,先向生物质物料中加入有机酸盐溶液和有机酸复配液,其中,生物质物料为秸秆、玉米芯、甘蔗渣、木糖渣中任意一种,有机酸盐溶液包括甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠或琥珀酸钠溶液中的一种,有机酸复配液包括柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液中的至少一种。
有机酸盐溶液和有机酸复配液加入后,维持酶解体系的pH为4.6~5.6,使得酶解体系中生物质物料干物质量为15%~25%,纤维素酶液的加入量为生物质物料干物质量4%~6%(w/w)。
有机酸盐溶液包括0.1mmol/L甲酸钠、0.1mmol/L乙酸钠、0.1mmol/L柠檬酸钠或0.1mmol/L琥珀酸钠溶液中的至少一种,纤维素酶采用诺维信Cellic CTec2。
酶解时,酶解罐的控制温度45℃~50℃、搅拌速度180rpm~220rpm,酶解48h~96h。
下面结合具体实施例来进一步说明本发明的稳定木质纤维素酶解过程的方法。
实施例1
通过牛津杯法抑菌试验,试图反映在相同pH值下,有机酸复配液的抑菌优势,其包括如下步骤:
步骤11、取柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合得到有机酸复配液。
步骤12、分别将盐酸HCl、硫酸及有机酸复配液稀释至pH为4.6~5.5,保持不同酸的稀释液pH一致。
步骤13、以大肠杆菌为指示菌,进行抑菌圈实验:
①利用LB培养基培养大肠杆菌,离心得到菌泥,加入生理盐水,配置1×106CFU/ml的菌液;
②取500mL菌液均匀涂布于LB培养基平板上,晾干;
③在平板上放置牛津杯,加入步骤12配制的各种酸稀释液(盐酸、硫酸、有机酸复配液);
④将平板放于恒温培养箱培养24h;
⑤测定平板抑菌圈大小。
经测定盐酸、硫酸、有机酸复配液三种不同酸的抑菌圈图大小,可以发现有机酸复配液的抑菌圈最大,抑菌效果最好。因此,在相同pH下,强酸(盐酸、硫酸)抑菌能力弱,有机酸复配液的抑菌效果最佳。
实施例2
本发明的稳定木质纤维素酶解过程的方法应用于15%干基的高固酶解体系中,试图显示有机酸复配液在木质纤维素酶解过程中的抑菌、稳定酶解过程pH以及对生物质酶解的促进作用,其包括如下步骤:
步骤21、取70mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,82g~85g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料15g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
步骤22、作为对比,进行另一组15%干基的高固酶解体系:取82g~85g的水加入玉米芯废渣生物质物料15g中,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,利用盐酸和NaOH调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
步骤23、将步骤21和步骤22中制备的96h酶解液,分别稀释103倍,然后取500mL酶解液稀释液,均匀涂布于LB琼脂平板上,培养24h,进行菌落计数对比,得到如图1所示的微生物菌落数对比示意图。
参照图1所示,添加有机酸复配液后,酶解液中的微生物数量明显少于无有机酸复配液的,说明在高固酶解过程中添加有机酸复配液能显著抑制微生物繁殖,保护纤维素酶,减少微生物性糖损失。
步骤24、分别测定在步骤21和步骤22中的酶解液在0h、24h、48h、72h、96h的pH值,得到如图2所示的对比示意图。
参照图2所示,对比两组酶解体系的pH值可以发现,添加有机酸复配液可以使酶解体系的pH稳定,波动量小。而无有机酸复配液的酶解体系的pH波动量大。
步骤25、测定酶解96h后步骤21和步骤22中酶解液葡萄糖浓度(液相色谱法),计算纤维素转化率,得到如图3a和图3b所示的对比示意图。
请参照图3a和图3b所示,在15%干基的高固酶解体系条件下,加入有机酸复配液酶解体系比无有机酸复配液的效果更好,其中,葡萄糖浓度从75.4g/L提高到83.7g/L,纤维素转化率从77.97%提高到86.56%。加入有机酸复配液提高15%干基酶解效果显著。
实施例3
本发明的稳定木质纤维素酶解过程的方法应用在20%干基的高固酶解体系中,试图显示有机酸复配液对生物质酶解的促进作用(20%干基),其包括如下步骤:
步骤31、取65mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,70g~80g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料20g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.8g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
步骤32、作为对比,进行另一组高固酶解体系:取70g~80g的水加入玉米芯废渣生物质物料20g中,再加入0.8g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,利用盐酸和NaOH调整酶解体系的pH为5.7,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
步骤33、测定酶解96h后步骤31和步骤32中酶解液葡萄糖浓度(液相色谱法),计算纤维素转化率,得到如图4a和图4b所示的对比示意图。
请参照图4a和图4b所示,在20%干基的高固酶解体系条件下,加入有机酸复配液酶解体系比无有机酸复配液的效果更好,其中,葡萄糖浓度从86.4g/L提高到104.7g/L,纤维素转化率从67.03%提高到81.23%。加入有机酸复配液提高20%干基酶解效果显著。
实施例4
本发明的稳定木质纤维素酶解过程的方法应用于25%干基的高固酶解体系中,试图显示有机酸复配液对生物质酶解的促进作用(25%干基),其包括如下步骤:
步骤41、取60mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,72g~75g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料25g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入1.0g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
步骤42、作为对比,进行另一组高固酶解体系:取72g~75g的水加入玉米芯废渣生物质物料25g中,再加入1.0g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,利用盐酸和NaOH调整酶解体系的pH为5.8,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
步骤43、测定酶解96h后步骤41和步骤42中酶解液葡萄糖浓度(液相色谱法),计算纤维素转化率,得到如图5a和图5b所示的对比示意图。
请参照图5a和图5b所示,在25%干基的高固酶解体系条件下,加入有机酸复配液酶解体系比无有机酸复配液的效果更好,其中,葡萄糖浓度从100.3g/L提高到126.5g/L,纤维素转化率从62.26%提高到78.53%。加入有机酸复配液提高25%干基酶解效果显著。
实施例5
比较不同有机酸复配液对生物质酶解的促进作用,其包括如下步骤:
步骤51、取70mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,82g~85g的类型A~G有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料15g中,其中,类型A~G有机酸复配液按照下表等质量混合配制,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
表1类型A~G有机酸复配液的配制
编号 | 柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸的溶液质量比例 |
A | 1:1:1:1:1:1:1 |
B | 1:1:1:1:1:1:0 |
C | 1:1:1:1:1:0:0 |
D | 1:1:1:1:0:0:0 |
E | 1:1:1:0:0:0:0 |
F | 1:1:0:0:0:0:0 |
G | 1:0:0:0:0:0:0 |
步骤52、分别测定在步骤51中类型A~G有机酸复配液下酶解96h后的葡萄糖浓度(液相色谱法),得到如图6所示的对比示意图。
请参照图6所示,添加有机酸复配液对高固酶解的效果影响较大,包含有4~7种有机酸混合后的酶解效果都较好,而单一有机酸的酶解效果不明显。同时给我们启示,我们可以更深入的寻找最佳的有机酸的混合方式,用于促进生物质高固酶解。
实施例6
本发明的稳定木质纤维素酶解过程的方法应用于15%干基的高固酶解体系中,其包括如下步骤:
步骤61、取70mL的0.1mmol/L甲酸钠有机酸盐溶液,82g~85g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料15g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为4.6,控制酶解罐的温度45℃、搅拌速度180rpm,酶解96h。
实施例7
本发明的稳定木质纤维素酶解过程的方法应用于25%干基的高固酶解体系中,其包括如下步骤:
步骤71、取60mL的0.1mmol/L乙酸钠有机酸盐溶液,72g~75g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料25g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸、乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.8g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度220rpm,酶解48h。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,在向酶解罐的生物质物料中加入纤维素酶液进行酶解之前,先向生物质物料中加入有机酸盐溶液和有机酸复配液,其中,生物质物料为秸秆、玉米芯、甘蔗渣、木糖渣中任意一种,有机酸盐溶液为甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠中的一种,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸和乳酸溶液按照等质量混合。
2.如权利要求1所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,有机酸盐溶液和有机酸复配液加入后,维持酶解体系的pH为4.6~5.6,使得酶解体系中生物质物料干物质量为15%~25%,纤维素酶液的加入量为生物质物料干物质量4%~6%。
3. 如权利要求2所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,纤维素酶采用诺维信Cellic CTec2。
4.如权利要求1所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,酶解时,酶解罐的控制温度45℃~50℃、搅拌速度180rpm~220rpm,酶解48h~96h。
5. 如权利要求1所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,取70mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,82g~85g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料15g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸和乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
6. 如权利要求1所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,取65mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,70g~80g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料20g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸和乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.8g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
7. 如权利要求1所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,取60mL的0.1mmol/L柠檬酸钠有机酸盐溶液,72g~75g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料25g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸和乳酸溶液按照等质量混合,再加入1.0g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度200rpm,酶解96h。
8. 如权利要求1所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,取70mL的0.1mmol/L甲酸钠有机酸盐溶液,82g~85g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料15g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸和乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.6g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为4.6,控制酶解罐的温度45℃、搅拌速度180rpm,酶解96h。
9. 如权利要求1所述的稳定木质纤维素酶解过程的方法,其特征在于,取60mL的0.1mmol/L乙酸钠有机酸盐溶液,72g~75g的有机酸复配液分别加入玉米芯废渣生物质物料25g中,其中,有机酸复配液为柠檬酸、琥珀酸、乙酸、酒石酸、乙二酸、苹果酸和乳酸溶液按照等质量混合,再加入0.8g诺维信Cellic CTec2纤维素酶,调整酶解体系的pH为5.5,控制酶解罐的温度50℃、搅拌速度220rpm,酶解48h。
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