CN103497917A - 一株可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇的嗜热地衣芽孢杆菌 - Google Patents

一株可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇的嗜热地衣芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌，该菌株名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）3F-3，其已于2012年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2012253。本发明的菌株能以木质纤维素原料(木糖、木糖母液及秸秆水解液)为底物，在42-55℃条件下以高于理论转化率90%的转化率生产2,3-丁二醇，其2,3-丁二醇浓度最高可达92克/升，体积生产效率最高可达1.1克/升/小时，具有很好的经济效益和社会效益。

Description

一株可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇的嗜热地衣芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及一株地衣芽孢杆菌，尤其涉及一株可利用木质纤维素原料的发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌，属于生物技术领域。
背景技术
2,3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域（Appl Microbiol Biotechnol,2001,55(1):10-18）。因其热值较高（27,200kJ/kg），同乙醇（29,100kJ/kg）相当，可用作燃料添加剂；可代替1,4-丁二醇，用于聚酯和聚亚安酯的合成；其脱水产物甲乙酮是一种低沸点溶剂，广泛应用于涂料、润滑剂、燃料等行业，同时又可作为有机合成香料、抗氧化剂等的中间体；其脱水产物1,3-丁二烯可用来合成橡胶单体，是一种重要的石油化工基础有机原料；同甲乙酮缩合加氢形成辛烷，可用于生产高级航空用油。
目前2,3-丁二醇的生产方法主要是微生物发酵法，通常采用的菌株包括克雷伯氏菌属（Klebsiella）、芽孢杆菌属（Bacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）等（J Biotechnol,1993,27(3):317-329）。用于2,3-丁二醇发酵的原料主要为葡萄糖、蔗糖、淀粉、木薯粉等原料，其中葡萄糖和蔗糖等精制糖，其产量较高，均在150克/升以上；但精制糖成本较高，不利于2,3-丁二醇的工业化生产。
木质纤维素是世界上最丰富的生物质可再生资源，其主要是由纤维素、半纤维素和木质素组成。目前国内外已知的利用发酵木质纤维素原料生产2,3-丁二醇的菌株多为克雷伯氏菌，但其潜在的致病性，限制了其在2,3-丁二醇生产中的应用。芽孢杆菌具有生物安全性，但芽孢杆菌对木质纤维素原料中木糖的利用能力较弱，如多粘芽孢杆菌，其以木糖为底物发酵24小时2,3-丁二醇产量为7.2克/升（Appl Microbiol Biotechnol,2004,64:112–119）；地衣芽孢杆菌发酵木糖24小时产量为13.8克/升(Biotechnol Bioeng,2012,109:1610-1621)，无法实现工业规模化生产。
嗜热芽孢杆菌由于其具有较高的发酵温度（42～60℃），可大大降低发酵过程中污染杂菌的机率；同时，以较高的温度进行发酵，还能降低发酵液粘度，有利于后续步骤的操作或处理，节约能耗和生产成本。然而经检索，可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇的嗜热地衣芽孢杆菌还未见报道。
发明内容
针对现有2,3-丁二醇生产中菌株及发酵方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株可利用木质纤维素原料的发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌。
本发明所述可利用木质纤维素原料的发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）3F-3，其已于2012年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山），保藏号为：CCTCCNO：M2012253。
上述的可利用木质纤维素原料的发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌，其生物学特征是：形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢；生理生化特征是：VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含70克/升NaCl的培养基中生长，可在42～60℃条件下生长；16S rDNA序列长度为1369bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述的可利用木质纤维素原料的发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列与已知的其他地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99～100%的相似性。
本发明所述嗜热地衣芽孢杆菌在利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇中的应用。
将本发明所述嗜热地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253以常规方法先接入种子培养基中，在42～55℃培养8～12小时，然后再以常规方法转接入发酵培养基，发酵条件为：培养温度42～55℃，培养方式为搅拌培养（通气量为0.5vvm～1.0vvm），搅拌转速200～500转/分钟，旋转半径为33mm，培养时间18～60小时，制得含有2,3-丁二醇的发酵液。
将发酵液8,000转/分钟离心10分钟，取上清液稀释，检测2,3-丁二醇含量。
上述种子培养基每升中含有：木糖30～50克，酵母粉5～10克，玉米浆干粉5～15克，磷酸二氢钾4克，乙酸钠2～6克，氯化钾1～2克，硫酸镁0.2克，余量为水；pH为6～7。115℃灭菌20分钟。
上述发酵培养基每升中含有：酵母粉5～20克，蛋白胨5～20克，玉米浆干粉5～20克，大豆肽5～20克，大豆蛋白胨5～20克五种氮源中的至少一种；另外每升发酵培养基中还含有：木质纤维素原料(如木糖、秸秆水解液或木糖母液等)80～160mL，其中原料中含有初糖量不少于500克/升，磷酸二氢钾4克，乙酸钠1～6克，氯化钾2克，硫酸镁0.2克，其余为水；pH为6～7。115℃灭菌20分钟。
上述发酵条件优选培养温度50～55℃，培养时间18～48小时。
本发明的特点及有益效果是：本发明提供的嗜热地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253是生物安全菌株，可同时利用木质纤维素原料中的葡萄糖和木糖；该菌株以木质纤维素原料为底物，在42～55℃条件下发酵获得的2,3-丁二醇最高浓度可达92克/升，生产强度可达1.1克/升/小时；相比已有产2,3-丁二醇菌株明显产量高，生产强度大；本发明提供的嗜热地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253在生产2,3-丁二醇中，利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小，并充分利用木质纤维素原料，符合可持续发展的国策，具有很好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。
实施例1：利用木糖发酵生产2,3-丁二醇筛选嗜热地衣芽孢杆菌菌株
从果园等地取得土样，用筛选培养基浸泡2小时，在500mL锥形瓶中装浸泡液100mL，在50℃条件下，置于摇床上以180转/分钟的转速培养24小时。将培养液以10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五个稀释度涂布在固体筛选培养基的培养皿中，50℃培养12小时。挑单菌落，扩大培养，以木糖为碳源，通过VP反应进行初筛。根据反应时间和颜色变化筛选出阳性菌株。筛选原理是2,3-丁二醇在碱性条件下氧化为双乙酰，与肌酸或胍类衍生物所合成红色物质，加入α-萘酚、肌酸可以促进反应。然后测定初筛的阳性细菌的2,3-丁二醇产量，挑选其中最高产量的菌株。
上述得到的产量最高的菌株为地衣芽孢杆菌3F-3。
上述筛选培养基配方为：1L蒸馏水中含：50克木糖，10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，115℃条件下灭菌20分钟。固体筛选培养基是在上述配方的基础上加入20克/升的琼脂粉。
上述地衣芽孢杆菌3F-3菌株形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含70克/升NaCl的培养基中生长，可在42～60℃条件下生长。其16S rDNA序列长度为1369bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，与已知的其他地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99～100%的相似性。
上述菌株名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）3F-3，其已于2012年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2012253。
实施例2：制备地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株的细胞液体培养物
挑取固体含糖LB培养基斜面培养的地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株一环，接种在装有灭菌的100mL种子培养基的500mL锥形瓶中，在50℃条件下，置于摇床上以180转/分钟的转速培养12小时，即制得地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株的细胞液体培养物。
上述含糖固体LB培养基每升含有：40克木糖，10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，20克琼脂粉，115℃条件下灭菌20分钟。
上述种子培养基每升含有：木糖50克，酵母粉5克，玉米浆干粉15克，磷酸二氢钾4克，乙酸钠2克，氯化钾1克，硫酸镁0.2克，余量为水；所述种子培养基的pH为6～7，115℃条件下灭菌20分钟。
实施例3：利用地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株以发酵培养基1在5L发酵罐中发酵生产2,3-丁二醇
将通过实施例2的方法获得的地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株的细胞液体培养物，以体积比10%的接种量接种在装有灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，在50℃条件下，发酵罐搅拌转速400转/分钟，通气量为0.5vvm～1.0vvm，DNS法检测木糖含量，当木糖浓度低于20克/升时补加木糖，发酵36小时，可得到浓度为75～92克/升的2,3-丁二醇发酵液。
上述发酵培养基1配方如下：
木糖60克/升，酵母粉10克/升，玉米浆干粉15克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠2克/升，氯化钾2克/升，硫酸镁0.2克。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例4：利用地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株以发酵培养基2在5L发酵罐中发酵生产2,3-丁二醇
将通过实施例2的方法获得的地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株的细胞液体培养物，以体积比10%的接种量接种在装有灭菌的4L发酵培养基的5L发酵罐中，在50℃条件下，发酵罐搅拌转速400转/分钟，通气量为0.5vvm～1.0vvm，DNS法检测总糖含量（葡萄糖和木糖），总糖浓度低于20克/升时补加玉米秸秆水解液，发酵48小时，可得到浓度为65～73克/升的2,3-丁二醇发酵液。
上述发酵培养基2配方如下：
玉米秸秆水解液100ml/升，酵母粉10克/升，玉米浆干粉10克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升，硫酸镁0.2克。115℃条件下灭菌20分钟。
其中玉米秸秆水解液含有葡萄糖400克/升，木糖115克/升，为长春大成新资源集团有限公司提供。
实施例5：利用地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株以发酵培养基3在5L发酵罐中发酵生产2,3-丁二醇
重复实施例3的操作，只是将发酵培养基1改为发酵培养基3，发酵至第36小时2,3-丁二醇的浓度达到61.0g/L。
上述发酵培养基3配方如下：
玉米秸秆水解液120ml/升，玉米浆干粉15克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠6克/升，氯化钾2克/升，硫酸镁0.2克。115℃条件下灭菌20分钟。
其中玉米秸秆水解液为长春大成新资源集团有限公司提供。
实施例6：利用地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M2012253菌株以发酵培养基4在5L发酵罐中发酵生产2,3-丁二醇
重复实施例3的操作，只是将发酵培养基1改为发酵培养基4，发酵至第54小时2,3-丁二醇的浓度达到57.0g/L。
上述发酵培养基4配方如下：
木糖母液80ml/升，玉米浆干粉15克/升，蛋白胨5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠3克/升，氯化钾2克/升，硫酸镁0.2克。115℃条件下灭菌20分钟。
其中，木糖母液中含有葡萄糖90克/升，木糖450克/升，阿拉伯糖146克/升；山东龙力生物科技股份有限公司提供。
Figure IDA0000394166880000011

Claims (2)

1.一株可利用木质纤维素原料发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）3F-3，其已于2012年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2012253。
2.如权利要求1所述的可利用木质纤维素原料的发酵生产2,3-丁二醇嗜热地衣芽孢杆菌，其生物学特征是：形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢；生理生化特征是：VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含70克/升NaCl的培养基中生长，可在42～60oC条件下生长；16S rDNA序列长度为1369bp，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
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