CN101967457A

CN101967457A - 利用秸秆生产2,3-丁二醇菌种筛选及发酵方法

Info

Publication number: CN101967457A
Application number: CN 201010279434
Authority: CN
Inventors: 陈洪章; 彭小伟
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2030-09-10
Also published as: CN101967457B

Abstract

本发明属于菌种的分离筛选及秸秆资源的高值利用领域，特别涉及产2，3-丁二醇同时能产纤维素酶菌种的筛选方法和以秸秆为原料直接发酵生产2，3-丁二醇的方法。本发明首先提供从活性污泥中筛选产2，3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的方法，经过筛选得到产2，3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的菌株YB-4，2010年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.4005。同时提供了利用该菌株发酵秸秆生产2，3-丁二醇的方法：该菌株在以汽爆秸杆为碳源，酵母膏为氮源的发酵培养基中30-37℃培养4-7d后，2，3-丁二醇的产量为秸秆干重的8％-12％(2，3-丁二醇/秸秆干重，W/W)。本发明为以秸秆原料生产2，3-丁二醇，不需要添加纤维素酶，大幅度降低了生产成本。

Description

利用秸秆生产2,3-丁二醇菌种筛选及发酵方法

技术领域

本发明属于优良菌种分离筛选及秸秆高值化利用领域，特别涉及产2，3-丁二醇同时能产纤维素酶菌种的筛选方法和以秸秆为原料直接发酵生产2，3-丁二醇的方法。

背景技术

2，3-丁二醇是一种无色无味的手性化合物，有三种立体异构体：右旋(dextro-)、左旋(levo-)和中间(meso-)异构体形式。2.3-丁二醇分子量90.12kDa，沸点较高(180-184℃)，凝固点较低(-60℃)。作为一种极具价值的液体燃料，其燃烧值为27，198J g^-1，可与甲醇(22，081J g^-1)和乙醇(29，005J g^-1)相媲美。它通过脱水、脱氢及水合反应等可生成甲乙酮、丁二酮、丁烯和丁二烯等。

作为化工中间体，2，3-丁二醇可以用来制备重要的工业有机溶剂甲乙酮；经脱水后可转化为具有高燃烧值的丁二酮，后者在在燃料添加剂方面具有广泛用途；它也可生成在合成橡胶上广泛应用的2-丁烯和1，3-丁二烯等橡胶单体；酯化形式的2，3-丁二醇是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品、洗液等；通过催化脱氢得到的二乙酰化形式的2，3-丁二醇可以用做具有高价值香料的食品添加剂；2，3-丁二醇自身可以作为单体用来合成高分子化合物；左旋形式的2，3-丁二醇由于其较低的凝固点可用做抗冻剂；另外通过缩合、聚合等反应，它也可生成别的化合物，如：苯乙烯，辛烷和2，3-丁二醇二乙酸酯等等。作为添加剂，它可广泛应用于油墨、化妆品、洗液、防冻剂、熏蒸剂、软化剂、增塑剂、炸药和药物的手性载体等等。在材料和纺织生产加工行业分别用来生产聚丁烯对苯二酸酯树脂、γ-丁内酯和斯潘德克斯弹性纤维等等。由于它如此广泛的用途，国际市场上的需求在不断高涨。特别是环境上的考虑，它作为液体燃料添加剂更加引起了世界范围内的重视。

目前化学法生产2，3-丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温、高压下水解得到的。同生物法相比，化学法不仅成本高，而且过程烦琐，不易操作，所以一直很难实现大规模工业化生产，其用途也没有得到充分的开发。用生物法来制备2，3-丁二醇既符合绿色化工的要求，又可以克服化学法生产的困难，同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石资源为原料的石油炼制向以可再生生物质资源为原料的生物炼制转型，用微生物发酵法生产2，3-丁二醇，并对其衍生物进行开发应用逐渐引起了人们的关注。

许多种碳水化合物都能用于微生物(尤其细菌)发酵2，3-丁二醇，其中最常用的底物是葡萄糖和D-木糖、L-木糖、D-核糖、D-阿拉伯糖等多种五碳糖。葡萄糖、木糖、乳糖和果糖等作底物发酵2，3-丁二醇的研究已经发展到了接近乙醇研究的水平，可以满足工业化需要。然而，当这些糖类作底物时，价格都很昂贵，是造成2，3-丁二醇生产成本过高的重要因素之一。因此，寻找成本低廉的碳水化合物作为发酵基质是降低2，3-丁二醇生产成本的重要因素之一。

中国每年可产生7亿吨秸秆，它主要含有纤维素、半纤维素和木质素三种组分，被认为是最廉价且可行的能够用微生物转化成工业产品的原料。用廉价而丰富的秸秆为主要原料生产2，3-丁二醇，可能降低生产成本同时扩大生产规模满足2，3-丁二醇的市场需求。然而利用木质纤维素发酵化学品产业化的障碍之一是纤维素酶的成本过高，一般占总生产成本的50％左右，为了克服纤维素酶成本高的难题，本发明筛选能分泌纤维素酶同时能产生2，3-丁二醇的菌株，利用该菌株以秸秆为原料，在不添加纤维素酶的条件下发酵2，3-丁二醇，为2，3-丁二醇的廉价生产提供有效的途径。

发明内容

【本发明的目的】本发明的目的是筛选能产2，3-丁二醇同时能产纤维素酶的菌株，利用筛选到的菌株以廉价的秸秆为原料发酵生产2，3-丁二醇，发酵过程不需要添加纤维素酶，大幅度降低发酵成本，为2，3-丁二醇的生产提供有效的途径。

【本发明的技术方案】本发明首先提供从活性污泥中筛选产2，3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的方法，经过筛选得到产2，3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的菌株YB-4，2010年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.4005，鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.。同时提供了利用该菌株发酵秸秆生产2，3-丁二醇的方法：该菌株在以汽爆秸杆为碳源，酵母膏为氮源的发酵培养基中30-37℃培养4-7d后，2，3-丁二醇的产量为秸秆干重的8％-12％(2，3-丁二醇/秸秆干重，W/W)。

【本发明的特点】本发明的特点首先是建立了筛选适宜于利用秸秆发酵2，3-丁二醇菌株的方法，从活性污泥中筛选到能大量产生2，3-丁二醇并能产生纤维素酶和木聚糖酶的菌株，得到2，3-丁二醇高产菌株YB-4，鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.，2010年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.4005，其次建立了该菌种发酵秸秆生产2，3-丁二醇的方法。为秸秆转化2，3-丁二醇提供了优良的菌株和实用的生产方法。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

从活性污泥样中取3ml，放入盛有100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡20min后于90℃的水浴中保持20min。然后用无菌水进行梯度稀释(10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7)后，每个取0.2ml，涂布到以微晶纤维素为唯一碳源培养基上，于37℃培养箱内培养40-48h，挑取单菌落在刚果红微晶纤维素培养基(g L^-1：KH₂PO₄ 0.5，MgSO₄ 0.25，微晶纤维素粉1.88，刚果红0.2，琼脂20，明胶2.0，pH 7.0)上划线培养48h后，挑取生长明显的菌落，经纯化后即得具有纤维素酶分泌能力的细菌菌种。

实施例2

通过甲基红实验(M.R.实验)和乙酰甲基甲醇实验(V.P.实验)初步判断产2，3-丁二醇的菌株：将从实施例1中分离到的细菌菌株接种于胨水培养基(g L^-1：蛋白胨3；葡萄糖5；NaCl 5；pH自然)中，置于35℃培养48h后，取样观察：取1ml培养液于一支试管中，滴加一滴甲基红试剂摇匀后，若菌株代谢产酸则发酵液呈鲜/桔红色，表示甲基红实验阳性，若菌株代谢未产酸，发酵液近中性则呈黄色，表示甲基红实验阴性。

另取2ml培养液于另一试管中，加入0.7-0.8ml浓度为40％KOH溶液和0.7ml浓度为6％的α-萘酚酒精溶液强烈震荡后，在3min内观察：若发酵液中有2，3-丁二醇，尤其具有乙酰甲基甲醇(3-羟基丁酮)时，则溶液会出现橙红色或玫瑰紫色，即V.P.试验阳性，反之，若溶液4h后仍无红色，即为实验阴性，若出现红色，仍为试验阳性。

通过甲基红实验(M.R.实验)和乙酰甲基甲醇实验(V.P.实验)，筛选出26株试验呈阳性，即能产生2，3-丁二醇同时能分泌纤维素酶的菌株。

实施例3

以秸秆为碳源，从实施例2中筛选的菌株中筛选优良的能产生2，3-丁二醇同时能分泌纤维素酶的菌株，100ml三角瓶中装25ml以汽爆秸秆为碳源的培养基(g L^-1：蛋白胨3；葡萄糖20；NaCl 5；pH自然)。开始发酵前，挑取2环不同菌种接入培养基中，放在35℃、100-150r/min条件下震荡培养。培养过程中定时取样，以检测发酵液中2，3-丁二醇产生情况。筛选出2，3-丁二醇产量最高的菌株YB-4，2010年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.4005。

实施例4

利用实施例3筛选的菌株YB-4以汽爆秸秆为碳源发酵2，3-丁二醇，500ml三角瓶中装100ml水，蛋白胨2g；汽爆条件为1.5MPa、保压时间为5min的汽爆玉米秸秆7g；NaCl1g；pH 6.0，灭菌后接入YB-4种子液3ml，在35℃和转速140r/min震荡培养120h，2，3-丁二醇产率为8.1g/g汽爆秸秆。

实施例5

利用实施例3筛选的菌株YB-4以汽爆秸秆为碳源发酵2，3-丁二醇，500ml三角瓶中装100ml水，酵母膏1g；硫酸铵1g，汽爆条件为1.5MPa、保压时间为3min的汽爆小麦秸秆6g；NaCl 1g；pH 6.5，灭菌后接入YB-4种子液4ml，在35℃和转速150r/min震荡培养110h，2，3-丁二醇产率为9.3g/g汽爆秸秆。

实施例6

利用实施例3筛选的菌株YB-4以汽爆秸秆为碳源发酵2，3-丁二醇，500ml三角瓶中装100ml水，酵母膏2g；硫酸铵1g，汽爆条件为1.5MPa、保压时间为3min的汽爆小麦秸秆20g；NaCl 1g；pH 6.0，灭菌后接灭菌后接入YB-4种子液5ml，在37℃进行压力脉动固态发酵112h，2，3-丁二醇产率为12.0g/g汽爆秸秆。

Claims

1.一种同时能产纤维素酶和2，3-丁二醇的菌株，名称为YB-4，鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.，2010年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.4005。

2.利用权利要求1所述的菌株在不外加纤维素酶条件下，直接利用秸秆发酵生产2，3-丁二醇。