CN101696427A - 用纤维物质生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种用纤维物质生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法。通过碱法预处理、半纤维素酶解工艺,可有效去除原料中的木质素,将45%以上的半纤维素转化为低毒性的木糖液,同时获得高纤维素含量(75%以上)的纤维素残渣。木糖液无需脱毒直接进行2,3-丁二醇发酵(得率≥0.44g 2,3-丁二醇/g木糖),纤维素残渣进行同步糖化乙醇发酵(得率≥0.52g乙醇/g纤维素)。纤维素和半纤维素分别高效转化,可将现行纤维素乙醇企业的原料利用率提高30%以上,有效降低原料成本。木糖发酵生产高附加值的2,3-丁二醇,可提高企业经济效益一倍以上。

Description

用纤维物质生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法
【技术领域】:本发明属于纤维物质生物转化技术领域,特别涉及一种将纤维物质先预处理,后将半纤维素组分水解,将五碳糖水解液与固体纤维素残渣分离,然后将五碳糖水解液和纤维素残渣分别发酵生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法。
【背景技术】:石油资源日益枯竭,现代社会面临着严重的能源和资源危机,通过生物转化方式,利用木质纤维素类可再生物质生产生物燃料和生物基化学品,缓解和解决能源和资源危机转化是国际上的广泛共识。燃料乙醇是世界上生产规模最大、发展最快的生物能源。2,3-丁二醇是重要的化工原料和液体燃料,可广泛应用于化工、燃料、航空航天等多个领域,目前市场售价16000元/吨以上。
就燃料乙醇的生产原料而言,现阶段世界上大多数国家都是以玉米等粮食作物为主,但从长远来看,包括农作物秸秆在内的木质纤维素类物质,是最具前景的燃料乙醇生产原料。地球上每年光合作用的产物高达1500多亿吨,其中绝大部分为木质纤维素类物质,仅我国每年的农林废弃物就有近10亿吨。
木糖发酵问题一直是纤维素燃料乙醇工业化生产的技术瓶颈之一。木质纤维素类物质主要由纤维素(35%~45%)、半纤维素(30%~35%)和木质素(15%~25%)三种成分组成。半纤维素经水解后得到五碳糖和六碳糖的混合糖液,其中木糖是半纤维素中含量最多的糖分,也是整个木质纤维素类物质中含量仅次于葡萄糖的第二大糖分。在现行木质纤维素乙醇技术中,一部分半纤维素在预处理(如酸预处理)阶段被水解,与木质素水解得到的酚类化合物和半纤维素自身产生的乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等抑制物混在一起,多直接作为废水排放,若要进行木糖发酵须经过复杂的脱毒工艺,成本高,且发酵效率低下,无法完成有效利用。剩余的半纤维素在纤维素酶解阶段与纤维素一起水解,得到五碳糖和六碳糖的混合糖液,由于用于葡萄糖酒精发酵的酿酒酵母无法发酵木糖,构建的基因工程菌株木糖发酵性能离真正工业生产尚有差距,且存在葡萄糖阻遏作用等因素的影响,混合糖液中的五碳糖(木糖)部分同样不能有效发酵转化。木糖发酵难题导致现有纤维素乙醇生产技术大多忽略或无奈放弃了木糖发酵,只利用了纤维原料中的纤维素部分,致使原料利用率偏低,基本在30%~35%水平,生产1吨燃料乙醇需6~7吨木质纤维素类原料,这不但增加了生产成本,造成资源浪费,而且加大了含五碳糖废水的处理难度和成本。
【发明内容】:本发明目的是解决现行纤维物质发酵生产燃料乙醇过程中木糖无法有效利用,原料利用率低,综合生产成本高的问题,提供一种将木质纤维素原料中半纤维素和纤维素有效分离、分别发酵生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的新工艺。
本发明总体技术方案流程如图1所示:纤维物质先经碱法预处理工艺,有效去除木质素,破坏木质纤维素的致密结构,为半纤维素和纤维素的酶水解创造条件,而后经木聚糖酶酶解将预处理后原料中的半纤维素组分高效水解,经固液分离得低毒木糖水解液和高纤维素残渣,木糖水解液发酵生产2,3-丁二醇,纤维素残渣经常规法同步糖化发酵生产乙醇。
具体工艺步骤如下:
第一、碱法预处理:纤维物质(农业废弃物玉米芯、玉米秸秆、稻草、麦秆或草等)原料除杂、粉碎至20~40目后,按固液比1∶15~1∶25与反应液充分混合,置于密闭的反应器中,反应温度60℃~80℃,预处理8~13h。其中碱处理反应液中各物质体积质量浓度为氨水1.5%~3.0%、过氧化氢0.4%~0.8%,以及增效剂硅酸钠3%~6%和硫酸镁0.02%~0.1%,硅酸钠和硫酸镁的加入可有效提高木质素的去除率。
第二、木聚糖酶酶解:将第一步预处理后的原料用水洗至中性,按液固质量比10∶1~25∶1将原料投入pH4.5~5.5的木聚糖酶酶解缓冲水溶液中,按90IU~200IU/g原料加入市售木聚糖酶,同时加入各种激活剂,在45℃~55℃下酶解36h~72h,得到木聚糖酶酶解体系。各激活剂在整个反应液中的体积质量浓度分别为:Tween80 0.05%~2.5%、PEG60000.05%~1%、BSA(牛血清蛋白)0.05%~4%和鼠李糖脂(RH)0.001%~1%。
第三、固液分离:将第二步的木聚糖酶酶解体系进行固液分离,液相部分为含有少量葡萄糖的低毒性五碳糖水解液,固相为含有少量木质素和半纤维素的高纤维素残渣。
第四、木糖水解液2,3-丁二醇发酵:将第三步得到的木糖水解液蒸发浓缩,调整初始糖浓度,补充营养物质后,接种肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoniae CICC 10011进行2,3-丁二醇发酵,发酵过程分两次补加浓缩后的木糖水解液。
第五、纤维素残渣同步糖化发酵:向纤维素残渣中添加市售纤维素酶和酒精活性干酵母,补充一定营养物质后进行同步糖化发酵生产燃料乙醇。
本发明的优点和积极效果:
该方法通过预处理和半纤维素酶解工艺,有效去除原料中的木质素,将半纤维素高效转化为低毒性的木糖液(转化率45%以上),同时获得纤维素含量高的(75%以上)纤维素残渣,进而,将木糖液和纤维素残渣分别高效发酵生产2,3-丁二醇和乙醇,有效提高原料利用率和企业经济效益。
本发明提供了一种纤维物质水解发酵生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法,通过将五碳糖和六碳糖分步发酵生成2,3-丁二醇和燃料乙醇,可将现有纤维素乙醇生产技术中的原料利用率提高30以上,将企业经济效益提高1倍以上。改变目前木质纤维素类物质生产燃料乙醇技术因只利用纤维素组分(葡萄糖)而导致的木质纤维素总利用率偏低,生物质资源浪费严重,和工业化生产成本居高不下的现状。
经本发明提供的预处理方法可有效去除原料中的木质素,同时纤维素和半纤维素损失量较小。预处理后残渣经本发明提供的水解方法进行木聚糖酶酶解,可获得较高的木糖得率,毒性化合物生成量少。预处理、木聚糖酶酶解使得纤维素残渣中纤维素含量大大提高,木质素和半纤维素含量很低,为高效率乙醇发酵创造了条件。
【附图说明】:
图1是本发明总体方案流程图;
图2是Na2SiO3浓度对玉米芯各组分的影响曲线图,Hc代表半纤维素;Ce代表纤维素;Li代表木质素;
图3是MgSO4浓度对玉米芯各组分的影响影响曲线图;
图4是激活剂对玉米芯半纤维素酶解的影响影响曲线图。
【具体实施方式】:
实施例1:玉米芯碱法预处理
(1)Na2SiO3浓度对玉米芯各组分的影响
预处理条件:液固比20∶1,时间12h,温度80℃,反应液中氨水3%、H2O2 0.6%、MgSO4 0.05%,考察Na2SiO3浓度(%,W/V)为0、1、2、3、4、5、6时,对玉米芯各组分的影响,结果见图2(具体处理过程见发明内容部分中的工艺步骤,下同)。
从图2可以看出:随着Na2SiO3浓度的增大,半纤维素、纤维素、木质素的保留率都有所下降,但下降幅度较小。而木质素保留率由54.50%下降到了16.79%,去除效果很好。Na2SiO3不仅对H2O2起稳定剂和对反应液的pH起缓冲剂的作用,最重要的是在反应液里和MgSO4一起,与木质素发生反应,达到去除木质素的作用。
(2)MgSO4浓度对玉米芯各组分的影响
预处理条件:液固比20∶1,时间12h,温度80℃,反应液中氨水3%、H2O2 0.6%、Na2SiO35%,考察MgSO4浓度(%,W/V)为0、0.02、0.05、0.15、0.3时对玉米芯各组分的影响,结果见图3。
从图3可以看出:MgSO4浓度在0~0.05%时,随着MgSO4浓度的增大,半纤维素的保留率逐渐增大、纤维素的保留率略有增大、木质素的保留率逐渐降低。当MgSO4浓度到0.05%,各组分保留率基本保持不变。从半纤维素的保留率来看,MgSO4即使存在0.02%就可起到在减少催化降解和保护碳水化合物的作用。综合考虑各组分的变化,MgSO4浓度选择0.05%为好。
(3)正交试验优化预处理条件
在单因素优化的基础上,选取一定区间内对木质素去除影响比较明显的时间、温度、液固比、氨水浓度4个因素作为研究对象,设计L9(34)的正交试验,得到最优组合为即时间为16h,温度为70℃,液固比为23∶1,氨水浓度为2.5%,结合过氧化氢0.6%、硅酸钠5%、硫酸镁0.05%即为最优预处理条件。在此条件下对玉米芯进行预处理,结果见表1。
表1 碱液预处理对玉米芯各组分的影响
Figure G200910071096XD0000041
从表1中可以可出,该方法可有效去除木质素,其去除率达到94.31%。同时纤维素和半纤维素得以有效保留。
实施例2:木聚糖酶酶解
将预处理后原料洗至中性后进行木聚糖酶酶解,着重考察激活剂Tween80、PEG6000、BSA(牛血清白蛋白)、RH(鼠李糖脂)对木聚糖酶酶解效率的影响。激活剂中表面活性剂Tween80、PEG6000、BSA所取浓度为0.25%、0.5%、1%、2.5%、4%,鼠李糖脂(RH)所取浓度为0.02%、0.25%、0.5%、1%、2.5%、4%。
(1)各种激活剂对酶解的影响
Tween80、PEG6000、BSA所取浓度皆为0.25%、0.5%、1%、2.5%、4%,RH所取浓度为0.02%、0.25%、0.5%、1%、2.5%、4%。预处理后的玉米芯的纤维素、半纤维素、木质素的保留率分别为86.14%、52.76%、5.58%。添加各种激活剂对半纤维素酶解得率的影响如图4所示。半纤维素酶解得率指水解为木糖的半纤维素占预处理后原料中所含半纤维素的百分数。
初步酶解(不添加激活剂)半纤维素酶解得率为42.45%,加入各种激活剂后酶解得率都有所增加。但是随着加入的浓度增加,酶解得率又有所下降。Tween80浓度为0.25%时,酶解得率最大为54.77%;浓度为4%时,酶解得率又下降到了47.64%,比不加时分别提高了12.32%、5.19%。PEG6000浓度为0.25%、4%时,酶解得率为53.32%、50.22%,比不加时分别提高了10.87%、7.77%。BSA浓度为0.25%时,酶解得率最大为57.31%;浓度为4%时,酶解得率又下降到了48.39%,比不加时分别提高了14.86%、5.94%。鼠李糖脂(RH)浓度为0.02%时,酶解得率最大为49.94%;浓度为4%时,酶解得率又下降到了43.14%,比不加时分别提高了7.49%、0.69%。
加几种激活剂所得最大酶解得率顺序依次为BSA>Tween80>PEG6000>RH,分别为57.31%>54.77%>53.32%>48.94%。但是都可以减少吸附、增加酶的稳定性。
(2)正交试验优化激活剂添加量及其他酶解条件
设计4因素3水平正交实验,对各种激活剂的添加量进行优化,以获得最佳酶解效果。结果表明,对半纤维素酶解得率影响大小顺序为Tween80>BSA>RH>PEG6000。从酶解的经济性考虑选择Tween800.15%、PEG60000.15%、BSA 0.15%、RH 0.005%。在此试验条件下,经过多次重复试验,其酶解得率可达70.50%,此时半纤维素的转化率可达41.52%。添加混合激活剂与单独的激活剂相比,更能促进酶解反应。激活剂对木质素有亲和性,比木聚糖酶可以优先吸附在木质素上,减少了木聚糖酶的无效吸附,降低了酶与底物的吸附性,使更多的木聚糖酶发生解吸附作用,增加了游离酶与底物的反应,增加了酶的稳定性和活性等,同样对酶解起到了很重要的作用。
结合酶解时间、液固比(底物浓度)、加酶量等因素,获得优化后的酶解条件为:液固比15∶1、木聚糖酶添加量150IU/g原料(干重)、激活剂浓度分别为Tween80 0.15%、PEG6000 0.15%、BSA(牛血清蛋白)0.15%、鼠李糖脂0.005%。酶解温度50℃,酶解时间48h。在此条件下对预处理后原料进行半纤维素酶解,以未经预处理原料在相同条件下做对照。结果见表2。
表2 优化条件下木聚糖酶酶解结果
Figure G200910071096XD0000051
可见在此优化条件下酶解48h,可将预处理后原料中86.62%的半纤维素水解,被水解的半纤维素占到初始原料中半纤维素总量的45.70%,所得水解液中木糖浓度为24.56g·L-1,纤维素未被水解,葡萄糖浓度只有1.88g·L-1。而未经预处理的原料,只能将6.49%的半纤维素酶解,所得木糖浓度只有1.94g·L-1
半纤维素酶解后所得残渣的组分见表3,可见,残渣中半纤维素和木质素含量很低,而纤维素含量达到76.03%,为后续残渣同步糖化发酵获得高浓度乙醇创造了条件。
表3 木糖水解后纤维素残渣的组成
Figure G200910071096XD0000052
实施例3:木糖水解液发酵生产2,3-丁二醇
将所得木糖水解液分别浓缩至木糖浓度60g/L和500g/L。木糖含量60g/L的木糖液用于初始发酵培养基制备,500g/L木糖液用于后续流加。
按6%的接种量转二级种子培养到发酵培养基(装液量80ml)中,置于35℃、120r/min进行摇瓶补料发酵,初糖浓度为60g/L,两次补料(500g/L浓缩水解液),每次补料后木糖总浓度依次为100g/L、130g/L,发酵84h,发酵结果见表4:
表4 木糖2,3-丁二醇发酵结果
Figure G200910071096XD0000053
可见,经本流加发酵工艺,可达到较高的木糖/2,3-丁二醇转化率,达理论转化率87.7%,且2,3-丁二醇浓度达57.0g/L。
实施例4:纤维素残渣同步糖化发酵生产燃料乙醇
(1)取斜面菌种一环,接入一级种子培养基中,置于35℃、摇床转速150r/min条件下培养24h。然后按10%的接种量将一级液体种子接入二级种子培养基,置于35℃、摇床转速150r/min条件下培养24h,得到二级液体种子。
(2)将培养好的酿酒酵母二级种子液按10%的接种量接入含有纤维素残渣的发酵培养基中,进行同步酶解糖化发酵。发酵条件为底物浓度100g/L,温度35℃,硫酸铵含量为0.04g/10g残渣,纤维素酶量为34FPU/g底物,发酵120h,此时乙醇得率为0.522g乙醇/g纤维素。发酵结果见表5:
表5 纤维素残渣同步糖化发酵结果
Figure G200910071096XD0000061
实施例5:不同纤维物质碱法预处理、木聚糖酶酶解后的半纤维素酶解得率
选取玉米秸秆、稻草、麦秆等纤维物质,与玉米芯一起在相同条件(实施例1和实施例2中的优化条件)对其进行碱法预处理和木聚糖酶酶解,考察各种原料的半纤维素水解得率,结果见表6,可见在该预处理、水解条件下,各种原料的半纤维素酶解得率都较高,达45%以上。
表6 纤维素残渣同步糖化发酵结果
Figure G200910071096XD0000062
注:半纤维素转化率(%)指原料中水解生成木糖液的半纤维素占原料中总的半纤维素含量的百分比。

Claims (5)

1.一种用纤维物质生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法,其特征在于该方法通过预处理和木聚糖酶酶解工艺,有效去除原料中的木质素,将半纤维素高效转化为低毒性的木糖水解液,同时获得纤维素含量高的纤维素残渣,进而,将木糖水解液和纤维素残渣分别高效发酵生产2,3-丁二醇和乙醇,有效提高原料利用率,该方法的具体步骤包括:
第一、碱法预处理:纤维物质除杂、粉碎后,按1∶15~1∶25的固液质量比与反应液充分混合,置于密闭反应器中,60℃-80℃下预处理8~13h;
第二、木聚糖酶酶解:将第一步预处理后的原料用水洗至中性,按液固质量比10∶1~25∶1将原料投入pH4.5~5.5的木聚糖酶酶解缓冲水溶液中,按90IU~200IU/g原料加入市售木聚糖酶,同时加入激活剂,在45℃~55℃下酶解36h~72h,得到木聚糖酶酶解体系;
第三、固液分离:将第二步的木聚糖酶酶解体系进行固液分离,分别得到木糖水解液和纤维素残渣;
第四、木糖水解液的2,3-丁二醇发酵:将第三步得到的木糖水解液蒸发浓缩,调整初始糖浓度为60g/L,补充营养物质后,接种肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoniae CICC10011进行补料,分批发酵生产2,3-丁二醇;
第五、纤维素残渣同步糖化发酵:向第三步得到的纤维素残渣中添加市售纤维素酶和酒精活性干酵母,补充营养物质后常规法进行同步糖化发酵生产燃料乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,第一步碱法预处理过程中所述的反应液中含有体积质量浓度为1.5%~3.0%的氨水和0.4%~0.8%的过氧化氢。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,第一步预处理过程中同时向反应液中添加有增效剂:体积质量浓度3%~6%的硅酸钠和0.02%~0.1%的硫酸镁,硅酸钠和硫酸镁的加入有效提高了木质素的去除率。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法,其特征在于,第二步木聚糖酶酶解过程中使用的、能够显著提高木聚糖酶解效率的激活剂及其体积质量浓度分别为:Tween800.05%~2.5%、PEG6000 0.05%~1%、牛血清蛋白BSA 0.05%~4%和鼠李糖脂RH0.001%~1%。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法,其特征在于所述的纤维物质为农业废弃物玉米芯、玉米秸秆、稻草、麦秆或草。
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