CN104561132B - 一种抑制剂存在下混菌生产乙醇的方法 - Google Patents

一种抑制剂存在下混菌生产乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物质新能源技术领域，公开了一种在抑制剂存在的条件下混菌发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：(1)将秸秆进行预处理，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；(2)向底物中加入纤维素酶和水，调节pH，酶解；(3)先向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母进行第一发酵，然后接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母进行第二发酵，发酵完成后进行固液分离，得到富含乙醇的发酵液体。本发明所述方法使得预处理后的秸秆不经过任何脱毒的过程即可进入下一步的发酵过程，在抑制剂的存在下显著改善木糖的利用，实现葡萄糖和木糖的共同利用提高乙醇产量。

Description

一种抑制剂存在下混菌生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及生物质新能源技术领域，具体涉及一种抑制剂存在下混菌生产乙醇的方法，尤其涉及一种抑制剂存在下改善木糖利用、实现葡萄糖和木糖共利用的生产乙醇的方法。
背景技术
目前，地球上原油的可探明储量没有增加而产量已接近了极限，人类正面临着能源与石油危机的严峻挑战。许多国家开始制定或调整能源政策，把生物能源的研究和开发摆在了重要的位置。在可再生能源中，乙醇作为安全、洁净的燃料及汽油添加剂目前己经备受关注。在乙醇生产、使用的整个循环过程中可保持温室气体CO2的平衡。传统的乙醇发酵工业主要以玉米、小麦等粮食淀粉或甘蔗汁为原料，但其原料成本高达总成本的40％。而中国地少人多的国情现状，也决定了基于粮食为原料的乙醇大规模生产必将导致“与人畜争粮，与粮食争地”的不利局面。木质纤维原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。我国的木质纤维原料也非常丰富，每年仅农作物秸秆就有7亿多吨，加上数量巨大的林业纤维废料和工业纤维废渣，每年可利用的木质纤维原料总量可达20亿吨以上。近年来，木质纤维素乙醇技术虽然取得了长足的进步，但成本依然很高而无法进行商业应用。
木质生物资源的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中，纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源。由己糖通过酿酒酵母发酵生成乙醇是很成熟的工艺，当采用纤维素酶水解木质生物资源制造乙醇时，纤维素酶必须接触吸附到纤维素底物上才能使反应进行，因此，纤维素对纤维素酶的可及性是决定水解速度的关键因素。木质素的存在阻碍了纤维素对酶的可及性，并且，纤维素的结晶区、木质生物资源的表面状态、木质生物资源的多组分结构、木素对纤维素的保护作用以及纤维素被半纤维素覆盖等结构与化学成分的因素致使木质生物资源难以水解。因此，必须对原料进行预处理，将纤维素、半纤维素和木质素进行分离，打破纤维素的结晶结构，提高纤维素对酶的可及性，使纤维素酶渗透进纤维素，从而有效地酶解纤维素。但是预处理过程会产生大量糠醛或苯酚等对后续的发酵过程产生抑制作用的副产物，严重影响发酵菌株的发酵效果。
此外，木糖是生物质原料木质纤维素的主要成分，占木质纤维素原料的17％～31％。然而木糖是一种戊糖，而普通产乙醇微生物无法利用五碳糖。在抑制剂的存在下木糖利用途径作为一种基因重组获得的途径更容易受到影响。
发明内容
本发明的目的是针对现有预处理过程产生大量抑制剂会严重影响发酵菌株的发酵效果，在抑制剂的存在下木糖利用途径作为一种基因重组获得的途径更容易受到影响等问题提出了一种抑制剂存在下发酵生产乙醇的方法，该方法可以使预处理后的秸秆不经过任何脱毒的过程即可进入下一步的发酵过程，并能够显著改善木糖的利用，实现葡萄糖和木糖的共同利用。
本发明的技术方案概述如下：
一种抑制剂存在下混菌生产乙醇的方法，包括如下步骤：
(1)将秸秆进行预处理，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；
(2)向底物中加入纤维素酶和水，调节pH，酶解；
(3)先向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母进行第一发酵，然后接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母进行第二发酵，发酵完成后进行固液分离，得到富含乙醇的发酵液体。
其中，在一些实施方案中，步骤(1)所述预处理为将秸秆浸于稀硫酸。
在一些优选实施方案中，步骤(1)所述预处理为按质量比为1:2-1:10的比例将秸秆浸于质量分数为1.0％-2.5％稀硫酸中，在170℃-200℃，进行浸泡预处理3min-6min，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物，干燥。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(2)所述底物、纤维素水解酶和水的比例为40g-50g:15FPU-20FPU:50g-60g。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(2)所述酶解的pH值为4.5-5.5。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(2)所述酶解的温度为50℃。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(2)所述酶解的酶解时间为12h-48h。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母的接种密度为2.5g/L-7.5g/L。在一些实施例中，所述接种密度为2.5g/L。在一些实施例中，所述接种密度为7.5g/L。在一些实施例中，所述接种密度为5.0g/L。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述保藏编号为CGMCC6634的酿酒酵母的接种密度为2.5g/L-7.5g/L。在一些实施例中，所述接种密度为7.5g/L。在一些实施例中，所述接种密度为5.0g/L。在一些实施例中，所述接种密度为6.5g/L。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母和所述保藏编号为CGMCC 6634的酿酒酵母的接种密度相同。如可以均为2.5g/L、5.0g/L或7.5g/L。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母和所述保藏编号为CGMCC 6634的酿酒酵母的接种密度不同。
在一些实施例中，本发明所述方法步骤(3)所述保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母和的接种密度为7.5g/L，所述保藏编号为CGMCC 6634的酿酒酵母的接种密度为5.0g/L。
在一些实施例中，本发明所述方法步骤(3)所述保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母和的接种密度为5.0g/L，所述保藏编号为CGMCC 6634的酿酒酵母的接种密度为6.5g/L。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述第一发酵的发酵时间为0h-8h。
在一些优选实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述第一发酵的发酵时间为0h。即同时接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母和所述保藏编号为CGMCC 6634的酿酒酵母。
在一些优选实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述第一发酵的发酵时间为0.5h-8h。即先接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，发酵一段时间后再接种所述保藏编号为CGMCC 6634的酿酒酵母。在一些实施例中，所述第一发酵的发酵时间为2h。在一些实施例中，所述第一发酵的发酵时间为4h。在一些实施例中，所述第一发酵的发酵时间为6h。在一些实施例中，所述第一发酵的发酵时间为8h。
在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述第二发酵的发酵时间为72h-144h。在一些实施例中，所述第二发酵的发酵时间为72h。在一些实施例中，所述第二发酵的发酵时间为144h。在一些实施例中，所述第二发酵的发酵时间为96h。在一些实施例中，所述第二发酵的发酵时间为120h。在一些实施方案中，本发明所述方法步骤(3)所述第一发酵和第二发酵的温度为30℃-34℃。
本领域技术人员可以理解本发明所述方法中的秸秆可以为任何一种富含木质纤维的作物秸秆。在一些实施方案中所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆或水稻秸秆。
由上述技术方案可知，本发明所述抑制剂存在下发酵生产乙醇的方法包括如下步骤：(1)将秸秆进行预处理，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；(2)向底物中加入纤维素酶和水，调节pH，酶解；(3)先向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCCNo.2757的酿酒酵母进行第一发酵，然后接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母进行第二发酵，发酵完成后进行固液分离，得到富含乙醇的发酵液体。本发明所述方法使得预处理后的秸秆不经过任何脱毒的过程即可进入下一步的发酵过程，在抑制剂的存在下显著改善木糖的利用，实现葡萄糖和木糖的共同利用提高乙醇产量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述。其中如无特殊说明，本发明使用的两种酿酒酵母均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，建议的分类名为：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，并已存活。保藏地址均为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，电话010-64807355。其中一株酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae YYJ003其保藏编号为CGMCC No.2757。另一株酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae SyBE005，其保藏编号为CGMCC No.6634。
实施例1：
一种抑制剂存在下混菌发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：
(1)将玉米秸秆按质量比为1:5的比例浸于质量分数为2.0％稀硫酸中，在185℃，进行浸泡预处理4min，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；
(2)将底物、纤维素水解酶和水按比例为50g:15FPU:50g混合，调节pH至4.5，进行酶解，酶解48h；
(3)分两组进行实验：
第一组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为2.5g/L，发酵温度34℃，发酵72h，得到富含乙醇的发酵液体；第二组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为2.5g/L。在发酵开始0h后，向混合液中接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母，接种浓度为7.5g/L，发酵温度34℃，发酵72h，得到富含乙醇的发酵液体；
其中第一组发酵实验得到最终乙醇浓度为36.4g/L，最终剩余木糖浓度为28.9g/L。第二组发酵实验得到最终乙醇浓度为45.8g/L，最终剩余木糖浓度为10.9g/L。
实施例2：
一种抑制剂存在下混菌发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：
(1)将小麦秸秆按质量比为1:2的比例浸于质量分数为2.5％稀硫酸中，在170℃，进行浸泡预处理3min，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；
(2)将底物、纤维素水解酶和水按比例为50g:20FPU:50g混合，调节pH至4.5，进行酶解，酶解12h；
(3)分两组进行实验：
第一组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为7.5g/L，发酵温度30℃，发酵144h，得到富含乙醇的发酵液体；第二组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为7.5g/L，发酵温度30℃，在发酵开始8h后，向混合液中接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母，接种浓度为5.0g/L，发酵温度30℃，发酵144h，得到富含乙醇的发酵液体；
其中第一组发酵实验得到最终乙醇浓度为36.8g/L，最终剩余木糖浓度为30.9g/L。第二组发酵实验得到最终乙醇浓度为42.3g/L，最终剩余木糖浓度为18.4g/L。
实施例3：
一种抑制剂存在下混菌发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：
(1)将水稻秸秆按质量比为1:7的比例浸于质量分数为1.5％稀硫酸中，在190℃，进行浸泡预处理5min，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；
(2)将底物、纤维素水解酶和水按比例为45g:18FPU:55g混合，调节pH至4.8，进行酶解，酶解48h；
(3)分两组进行实验：
第一组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为5.0g/L，发酵温度33℃，发酵96h，得到富含乙醇的发酵液体；第二组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为5.0g/L，发酵温度33℃，在发酵开始4h后，向混合液中接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母，接种浓度为6.5g/L，发酵温度33℃，发酵96h，得到富含乙醇的发酵液体；
其中第一组发酵实验得到最终乙醇浓度为35.8g/L，最终剩余木糖浓度为31.4g/L。第二组发酵实验得到最终乙醇浓度为44.6g/L，最终剩余木糖浓度为14.7g/L。
实施例4：
一种抑制剂存在下混菌发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：
(1)将高粱秸秆按质量比为1:10的比例浸于质量分数为1.0％稀硫酸中，在200℃，进行浸泡预处理6min，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；
(2)将底物、纤维素水解酶和水按比例为40g:15FPU:60g混合，调节pH至5.5，进行酶解，酶解48h；
(3)分两组进行实验：
第一组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为7.5g/L，发酵温度30℃，发酵120h，得到富含乙醇的发酵液体；第二组：
向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母，接种浓度为5.0g/L，发酵温度30℃，在发酵开始6h后，向混合液中接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母，接种浓度为5.0g/L，发酵温度34℃，发酵120h，得到富含乙醇的发酵液体；
其中第一组发酵实验得到最终乙醇浓度为35.6g/L，最终剩余木糖浓度为29.7g/L。第二组发酵实验得到最终乙醇浓度为40.9g/L，最终剩余木糖浓度为16.6g/L。

Claims (10)

1.一种抑制剂存在下混菌生产乙醇的方法，包括如下步骤：
(1)将秸秆进行预处理，得到固液混合物，分离，得到预处理后的底物；
(2)向底物中加入纤维素酶和水，调节pH，酶解；
(3)先向步骤(2)获得的混合液接种保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母进行第一发酵，然后接种保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母进行第二发酵，发酵完成后进行固液分离，得到富含乙醇的发酵液体。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)所述预处理为将秸秆浸于稀硫酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(2)所述底物、纤维素水解酶和水的比例为40g-50g:15FPU-20FPU:50g-60g。
4.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(2)所述酶解的pH值为4.5-5.5，酶解温度为50℃，酶解时间为12h-48h。
5.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(3)所述保藏编号为CGMCC No.2757的酿酒酵母的接种密度为2.5g/L-7.5g/L。
6.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(3)所述第一发酵的发酵时间为0h-8h。
7.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(3)所述保藏编号为CGMCC No.6634的酿酒酵母的接种密度为2.5g/L-7.5g/L。
8.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(3)所述第二发酵的发酵时间为72h-144h。
9.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(3)所述第一发酵和第二发酵的温度为30℃-34℃。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是所述秸秆为玉米秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆或水稻秸秆。
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