CN105505804B - 一株高效发酵木糖的突变株及利用其发酵产乙醇的方法 - Google Patents

一株高效发酵木糖的突变株及利用其发酵产乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株经过诱变、筛选获得的可高效发酵木糖产乙醇的Spathaspora passalidarum突变株及利用其进行高固木质纤维素乙醇发酵的方法。所述突变株克服了现有技术中菌株乙醇耐受性低、高固形物发酵难、利用木糖产乙醇能力差的问题，具有较高的温度耐受性、33℃下发酵木糖产乙醇浓度达到44.19g/L，利用木质纤维素水解液进行葡萄糖木糖共发酵，乙醇浓度可达到43.26g/L，高固木质纤维素同步糖化共发酵，乙醇浓度可达到49.92g/L。较现有技术取得了显著的进步。

Description

一株高效发酵木糖的突变株及利用其发酵产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域和纤维物质生物转化技术领域，具体涉及一株经过诱变、筛选获得的可高效发酵木糖产乙醇的Spathaspora passalidarum U1-58突变株及利用U1-58突变株进行高固木质纤维素乙醇发酵的方法。
背景技术：
能源、环保是制约我国经济发展的两座大山，寻找可持续、可再生的清洁能源已成为我国重要的发展战略。乙醇是生物质液体能源的主要存在形式，清洁可再生，是化石燃料的理想替代品。更重要的是，乙醇还可以为一些化工原料如乙烯等提供原料。木质纤维素因其来源广泛、不存在与人争粮等风险被认为是最具有发展潜力的乙醇生产原料。近年来，越来越多的研究者致力于研究以木质纤维素类物质为原料进行乙醇生产。
但以木质纤维素类物质为原料生产乙醇依然存在一些挑战，其中最重要的就是如何提高乙醇的浓度以此来减小生产过程中的能耗。从经济角度来讲，工业上对乙醇浓度的最低要求为4％(w/v)。对于纤维素乙醇来说，提高乙醇浓度最常用的办法就是提高发酵液中的固形物含量。提高固形物含量还可以减少发酵设备的使用，从而降低生产成本等优点。同步糖化发酵是高固形物发酵的基本方法。但高固形物发酵存在搅拌、传热不均匀等难题。为解决这个难题，研究者们提出了分步糖化发酵、预酶解、分批补料等策略。虽然这些措施可以有效地得以实施，但由于木糖发酵的局限性，在这些策略中高浓度的乙醇主要产自纤维素组份，木质纤维素中大部分的半纤维素被浪费。
木质纤维素类物质中含有30％～50％的纤维素和20％～40％的半纤维素，而传统的酿酒酵母只能发酵由纤维素酶解而来的六碳糖(葡萄糖)，无法发酵由半纤维素酶解而来的五碳糖(大部分为木糖)。而天然木糖发酵酵母又存在乙醇耐受性、抑制物耐受性低等缺陷。通过代谢工程改造，可使高效发酵葡萄糖的菌种具有一定的木糖发酵能力，且此方法在纤维素乙醇方面也取得了较好的进展，但在葡萄糖存在的情况下，大多数基因工程菌株的木糖发酵速率仍然比葡萄糖低，若想增加木糖利用率，则需要大大延长发酵时间，发酵时间的延长必然导致发酵效率的降低和成本的增加。所以，我们需要寻找更加适合于木质纤维素发酵产乙醇的菌株。
在木糖发酵酵母中，新型酵母菌株Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907与其他菌株(Pichia pastoris)相比具有较高的乙醇耐受性、温度耐受性、渗透压耐受性等优点。更为重要的是，S.passalidarum在厌氧条件下可进行葡萄糖木糖共发酵。这些特点使得S.passalidarum在木质纤维素-生物乙醇转化方面具有很好的应用潜力。中国专利201410709989.3公布了一株耐高温的Spathaspora passalidarum突变株，该突变株在37℃下摇瓶发酵的乙醇产量达到为16.45g/L，30℃，摇瓶发酵条件下发酵5天，乙醇浓度达到39.04g/L，其温度耐受性提高到41℃，乙醇耐受性提高到12％。但在温度耐受性及发酵木糖产乙醇性能方面仍有待提升。
发明内容：
为了解决上述问题，本发明在Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907的基础上，提供一株高效发酵木糖产乙醇的突变株，以及利用该突变菌株进行高固液比木质纤维素发酵产乙醇的方法。
所述高效发酵木糖产乙醇的突变株，具体为Spathaspora passalidarum U1-58，该菌株已于2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11867。
所述突变株U1-58是以S.passalidarum NRRL Y-27907为出发菌株，通过等离子诱变、平板初筛、发酵复筛，筛选获得的，该突变株在对温度的耐受性、发酵木糖产乙醇的能力、葡萄糖木糖共发酵的能力及高固木质纤维素乙醇发酵的能力等方面较出发菌株均有显著提高。
利用所述的突变株U1-58进行高固液比木质纤维素酶解液发酵产乙醇即利用葡萄糖、木糖共发酵产乙醇的方法，具体步骤如下：
(1)按固液质量比1:4～1:6将木质纤维素原料投入pH4.5～5.5的柠檬酸缓冲溶液中，添加纤维素酶和木聚糖酶，在45℃～55℃、150～180rpm条件下，酶解36h～72h，酶解结束，对酶解体系进行过滤，除去滤渣，得到酶解液；
所述纤维素酶添加量为20～40FPU/g木质纤维素原料，木聚糖酶10000～14000U/g木质纤维素原料；
所述木质纤维素原料为玉米芯、玉米秸秆或甜高粱中的一种；
(2)以步骤(1)得到的酶解液为发酵碳源，添加适量营养物质后得发酵培养基，所述营养物质为：酵母浸粉18～26g/L，K2HPO41.5～3.5g/L，MgSO40.05～0.2g/L；
发酵条件：菌种初始OD6003.0～6.0，温度30～33℃、摇床转速100～150rpm，发酵72～120小时。
利用所述突变株U1-58进行高固木质纤维素同步糖化共发酵产乙醇的方法，具体步骤如下：
将木质纤维素原料、柠檬酸缓冲液、纤维素酶、木聚糖酶、菌种、营养物质同时加入生物反应器中，在温度33～35℃，摇床转速100～150rpm条件下，发酵72～96小时；
所述木质纤维素原料按固液质量比1:4～1:6投入pH4.5～5.5的柠檬酸缓冲溶液中；
所述纤维素酶添加量为10～30FPU/g原料，木聚糖酶8000～12000U/g原料；
所述菌种初始OD6005.0～8.0；
所述营养物质为：NH4Cl 2.87～3.82g/L、KH2PO4 2.5～4.0g/L、MgSO4 0.1～0.3g/L。
有益效果：
1、U1-58突变株的温度耐受性明显优于U1出发菌株，在温度在30℃-41℃之间，U1-58突变株的生长性能与出发菌株相比均有一定程度的提高。
2、U1-58突变株发酵木糖产乙醇性能较U1出发菌株显著提高。该突变菌株在41℃下摇瓶发酵5天，乙醇浓度、糖醇转化率分别达到28.50g/L、0.41，分别较U1出发菌株提高166.31％、21.66％；37℃下，该突变菌株乙醇浓度、糖醇转化率分别达到35.41g/L、0.42，分别较U1出发菌株提高72.05％、21.22％；33℃下，乙醇浓度及糖醇转化率分别达到44.19g/L、0.45，分别较U1出发菌株提高27.06％、14.25％。
3、U1-58突变株进行葡萄糖、木糖共发酵的能力优于U1出发菌株。该突变菌株利用木质纤维素水解液进行葡萄糖木糖共发酵，乙醇浓度可达到43.26g/L，较出发菌株高出38.39％。且在葡萄糖存在条件下，U1-58突变株木糖利用速度和木糖利用率显著提高，木糖利用率可达到97.12％，较出发菌株高出57.37％。
4、U1-58突变株进行高固木质纤维素乙醇发酵的能力优于U1出发菌株。33℃下，利用该突变株和本发明提供的方法，进行高固木质纤维素同步糖化共发酵，乙醇浓度可达到49.92g/L，较U1出发菌株提高23.41％；总糖(纤维素+半纤维素)对乙醇的总转化率为0.42g/g，较U1出发菌株总转化率高出22.71％；纤维素和半纤维素利用率分别达到86.12％、86.86％，较U1出发菌株分别高出4.72％、12.44％。
附图说明：
图1 U1-58突变株与U1出发菌株37℃下木糖发酵结果；
图2 U1-58突变株与U1出发菌株各温度下生长曲线
其中，■代表U1出发菌株；□代表U1-58突变株；
图3 U1-58突变株与U1出发菌株各温度下发酵性能对比；
其中，A为乙醇浓度对比图，B为木糖浓度对比图，C为糖醇转化率对比图；
图4 U1-58突变株与U1出发菌株玉米芯酶解液发酵结果
其中，A为U1出发菌株，B为U1-58突变株；
图5 U1-58突变株与U1出发菌株玉米芯同步糖化共发酵发酵结果。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：U1-58突变菌株诱变筛选
(1)、诱变和初筛以S.passalidarum NRRL Y-27907为出发菌株(以下简称U1菌株)，等离子诱变25s，将诱变后的菌液稀释至适当浓度，涂布于初筛平板上，37℃倒置培养1-2d后挑取长势较好、表面光滑的突变株用于复筛。
初筛平板：木糖50g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，琼脂20g/L，pH自然。
(2)、复筛对(1)中所得的突变菌株进行木糖培养基摇瓶发酵复筛，发酵培养基为：木糖100g/L，酵母浸粉22g/L，K2HPO4 2.5g/L，MgSO4 0.1g/L。
发酵条件为：装液量100mL/250mL，菌株初始OD600 1.0，pH 5.5，温度37℃，转速120rpm，发酵5天。发酵结束后，高效液相色谱测定发酵液中木糖、乙醇的含量，并测定发酵过程中生物量(菌干重g DCW/L)。筛选出发酵性能较好的U1-58突变株。U1-58突变株与U1出发菌株发酵过程中各物质变化情况如图1所示。
如图1可看出，U1-58突变株比出发菌株对木糖的利用速率快，乙醇产量高，同时菌株生长速率稍快。U1-58突变株的最大比生长速率为0.08h-1，较U1出发菌株提高33.33％。U1-58突变株的木糖在84h时基本发酵完全，乙醇浓度达到35.5g/L，较出发菌株高出72.05％；残糖量为7.5g/L，较出发菌株低273.33％；糖醇转化率达到0.42，较出发菌株高出38.82％。其中12h至60h时间段，U1-58突变株乙醇生成速率、木糖消耗速率分别达到达到0.57g/(L·h)、1.48g/(L·h)，分别较U1出发菌株提高67.65％、27.59％.此结果表明，U1-58突变株单位菌体发酵木糖产乙醇性能优于U1出发菌株单位菌体发酵木糖产乙醇性能。
实施例2：不同温度下U1-58突变株与U1出发菌株生长性能的测定
以U1-58突变株和U1出发菌株互为对照，在30℃、33℃、35℃、37℃、39℃和41℃测定菌株的生长曲线。
测定方法：各从斜面挑一环菌到装有50mL YPX液体培养基(20g/L木糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉)的250mL的摇瓶里，30℃，180rpm条件下培养，定时取样，适当稀释，600nm下测定OD值。测定结果如图2所示。
从图2可以明显看出，温度在30℃-41℃之间，虽然随着温度的提高，菌株的生长受到了不同程度的抑制，但仍可明显看出，U1-58突变株的生长性能与出发菌株相比均有一定程度的提高，可见该突变菌株的温度耐受性优于出发菌株。
实施例3：不同温度下U1-58突变株木糖发酵性能的测定
以U1-58突变株和U1出发菌株互为对照，在30℃、33℃、35℃、37℃、39℃和41℃测定菌株的木糖发酵性能。
发酵条件及发酵液中代谢物浓度的测定均同实施例1(2)。以发酵结束发酵液中残余木糖浓度、乙醇浓度以及相应糖醇转化率为指标进行分析，发酵结果如图3所示。
如图3所示，在各温度下U1-58突变株与U1出发菌株相比，乙醇浓度显著提高，残糖浓度明显降低，相应糖醇转化率也有一定程度的增加。在30℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃时，U1-58突变株乙醇浓度与U1出发菌株乙醇浓度相比较，分别提高了13.69％、27.06％、42.29％、72.05％、89.15％、166.31％。可见，U1-58突变菌株的木糖发酵能力在各温度均优于U1出发菌株，且随着温度的升高，U1-58突变株与出发菌株相比，发酵木糖产乙醇能力的差距越来越大，也证实了U1-58突变株的温度耐受性优于U1出发菌株。
实施例4.U1-58突变株玉米芯酶解液发酵
以U1-58突变株和U1出发菌株互为对照，进行玉米芯酶解液发酵。发酵过程中定时取样，用高效液相色谱法测定发酵液中葡萄糖、木糖、甘油、木糖醇和乙醇的浓度。发酵过程中各物质浓度变化，如图4所示。
发酵过程如下：
木质纤维素酶解液的制备：将玉米芯与柠檬酸缓冲液按固液比1:5投料，纤维素酶添加量20FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量12000U/g玉米芯，温度50℃，摇床转速150rpm，酶解48h，抽滤，除去滤渣，得到酶解液。
发酵培养基组成为：木质纤维素酶解液(葡萄糖(73±0.5)g/L，木糖(45±0.5)g/L)，酵母浸粉22g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO40.1g/L。115℃下灭菌20min。
发酵条件：装液量50ml/250ml，初始菌种OD600 5.0，转速120rpm，温度33℃，初始pH5.0，发酵时间为120h。
如图4所示，U1-58突变株在葡萄糖浓度降至50g/L左右开始发酵木糖，而U1出发菌株在葡萄糖浓度降至35g/L左右才开始发酵木糖，说明在葡萄糖存在的条件下，与U1出发菌株相比，U1-58突变株木糖发酵能力显著提高。U1-58突变株的葡萄糖消耗在60h基本发酵完全，而出发菌株的葡萄糖消耗持续至96h，葡萄糖的更快消耗，在一定程度上加快了乙醇的生成速率。对整个发酵过程进行数据分析，分析结果分别见表1。
表1 U1-58突变株与U1出发菌株玉米芯酶解液发酵结果
由表1可知，U1-58突变株酶解液发酵，乙醇浓度、木糖利用率与U1出发菌株相比分别提高38.39％、57.27％；而木糖醇浓度与残余木糖浓度分别降低94.22％与92.58％。以上结果表明U1-58突变株木糖发酵产乙醇的效率较U1出发菌株。结合图4，在发酵12h至60h之间，U1-58突变株乙醇生成速率、葡萄糖消耗速率、木糖消耗速率分别达到0.50g/(L·h)、1.05g/(L·h)、0.41g/(L·h)，分别较U1出发菌株提高72.41％、41.89％、156.25％。此结果表明，葡萄糖/木糖混糖发酵条件下，U1-58突变株的木糖利用效率较U1出发菌株得到了显著提高。
实施例5.U1-58突变株玉米芯酶解液发酵
以U1-58突变株进行玉米芯酶解液发酵。
发酵过程如下：
木质纤维素酶解液的制备：将玉米芯与pH5.0的柠檬酸缓冲液按固液比1:6投料，纤维素酶添加量40FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，温度45℃，摇床转速180rpm，酶解72h，抽滤，除去滤渣，得到酶解液。
发酵培养基组成为：上述酶解液，酵母浸粉26g/L，K2HPO4 3.5g/L，MgSO4 0.05g/L。115℃下灭菌20min。
发酵条件：装液量50ml/250ml，初始菌种OD600 3.0，转速150rpm，温度30℃，初始pH5.0，发酵时间为72h。
发酵结束后，乙醇浓度达到40.38g/L，残余木糖浓度0.58g/L，木糖利用率98.24％.
实施例6.U1-58突变株进行玉米芯同步糖化共发酵
将原料按一定的固液质量比投入反应器中，并向发酵培养基中加入适量营养物质、纤维素酶、木聚糖酶、菌种，进行同步糖化共发酵。以U1-58突变株和U1出发菌株互为对照，利用玉米芯进行同步糖化共发酵产乙醇。发酵结束后取样，用高效液相色谱法测定发酵液中葡萄糖、木糖和乙醇的浓度，结果如图5所示。
发酵培养基组成为：将玉米芯与柠檬酸缓冲液按固液比1:5投料，纤维素酶添加量20FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，加入NH4Cl 3.82g/L，KH2PO4 3.0g/L，MgSO4 0.2g/L。115℃下灭菌20min。
发酵条件：装液量20ml/250ml，菌株初始OD600 5.0，转速120rpm，温度33℃，初始pH4.9，发酵时间为96h。
如图5所示，U1-58突变株与出发菌株相比，乙醇浓度达到49.92g/L，较出发菌株提高23.41％；总糖(纤维素+半纤维素)对乙醇的总转化率为0.42，较出发菌株总转化率提高22.71％；纤维素和半纤维素利用率分别达到86.12％、86.86％，较出发菌株分别高出4.72％、12.44％。由以上可知，U1-58突变株比U1出发菌株更适于木质纤维素类原料物质发酵产乙醇。
实施例7.U1-58突变株进行玉米芯同步糖化共发酵
将原料按一定的固液质量比投入反应器中，并向发酵培养基中加入适量营养物质、纤维素酶、木聚糖酶、菌种，进行同步糖化共发酵。以U1-58突变株利用玉米芯进行同步糖化共发酵产乙醇。发酵结束后取样，用高效液相色谱法测定发酵液中葡萄糖、木糖和乙醇的浓度。
发酵培养基组成为：将玉米芯与柠檬酸缓冲液按固液比1:6投料，纤维素酶添加量20FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，加入NH4Cl 2.87g/L，KH2PO4 3.5g/L，MgSO4 0.1g/L。115℃下灭菌20min。
发酵条件：装液量20ml/250ml，菌株初始OD600 8.0，转速150rpm，温度35℃，初始pH4.9，发酵时间为72h。
发酵结束后，乙醇浓度达到38.34g/L，总糖(纤维素+半纤维素)对乙醇的总转化率为0.39，纤维素和半纤维素利用率分别达到80.65％、82.07％。

Claims (10)

1.一株高效发酵木糖产乙醇的突变株，其特征在于，所述突变株具体为Spathasporapassalidarum U1-58，保藏编号为CGMCC No.11867。
2.利用权利要求1所述突变株进行高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，具体如下：
(1)按固液质量比1:4～1:6将木质纤维素原料投入pH4.5～5.5的柠檬酸缓冲溶液中，添加纤维素酶和木聚糖酶，在45℃～55℃、150～180rpm条件下，酶解36h～72h，酶解结束，对酶解体系进行过滤，除去滤渣，得到酶解液；
(2)以步骤(1)得到的酶解液为发酵碳源，添加其他营养物质后得发酵培养基，
(3)发酵条件：菌种初始OD600 3.0～6.0，温度30～33℃、摇床转速100～150rpm，发酵72～120小时。
3.如权利要求2所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述纤维素酶添加量为20～40FPU/g木质纤维素原料，所述木聚糖酶的添加量为10000～14000U/g木质纤维素原料。
4.如权利要求2所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述营养物质为：酵母浸粉18～26g/L，K2HPO4 1.5～3.5g/L，MgSO4 0.05～0.2g/L。
5.利用权利要求1所述突变株进行高固液比木质纤维素同步糖化共发酵产乙醇的方法，具体如下：
将木质纤维素原料、柠檬酸缓冲液、纤维素酶、木聚糖酶、菌种、营养物质同时加入生物反应器中，在温度33～35℃，摇床转速100～150rpm条件下，发酵72～96小时。
6.如权利要求2所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法或权利要求5所述的高固液比木质纤维素同步糖化共发酵产乙醇的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料为玉米芯、玉米秸秆或甜高粱中的一种。
7.如权利要求5所述的高固液比木质纤维素同步糖化共发酵产乙醇的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料按固液质量比1:4～1:6投入pH4.5～5.5的柠檬酸缓冲溶液中。
8.如权利要求5所述的高固液比木质纤维素酶同步糖化共发酵产乙醇的方法，其特征在于，所述纤维素酶添加量为10～30FPU/g木质纤维素原料，木聚糖酶8000～12000U/g木质纤维素原料。
9.如权利要求5所述的高固液比木质纤维素同步糖化共发酵产乙醇的方法，其特征在于，所述菌种初始OD600 5.0～8.0。
10.如权利要求5所述的高固液比木质纤维素同步糖化共发酵产乙醇的方法，其特征在于，所述营养物质为：NH4Cl 2.87～3.82g/L、KH2PO4 2.5～4.0g/L、MgSO4 0.1～0.3g/L。
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