CN102965291B

CN102965291B - 一种酿酒酵母菌株及在共发酵葡萄糖和木糖产乙醇的用途

Info

Publication number: CN102965291B
Application number: CN201210507118.4A
Authority: CN
Inventors: 元英进; 査健; 胡梦龙; 申明华
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2032-11-29
Also published as: CN102965291A

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母菌株及在共发酵葡萄糖和木糖产乙醇上的用途，酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）命名为SyBE003，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6633，其具有共发酵葡萄糖和木糖产乙醇的能力。本发明的酿酒酵母菌株能够有效的共利用葡萄糖和木糖发酵产生乙醇。对葡萄糖和木糖的利用率都达到了100%，乙醇产率达到理论得率的80%，副产物木糖醇的产率在2%以下，能够高效地转化五六碳糖为乙醇，是优良的利用纤维素水解液的菌株。

Description

一种酿酒酵母菌株及在共发酵葡萄糖和木糖产乙醇的用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够共发酵葡萄糖和木糖的酿酒酵母菌株及用途。

背景技术

我国对能源需求与日俱增，但是如石油等化石资源紧缺越来越严重，极大地制约了我国国民经济的快速健康发展，同时化石资源的燃烧对生态环境造成了严重的破坏。寻求可替代或部分替代化石资源的可再生、清洁能源是我国科技工作者面临的重大科研攻坚挑战。

燃料乙醇被认为是最有前景的清洁生物能源之一。但是发展以粮食为原料的燃料乙醇与保障粮食供应和安全的国家基本政策相悖，在我国的特殊国情下是不可行的。发展以纤维素为原料的纤维素乙醇是实现燃料乙醇工业化最有前景的发展思路和策略。木质纤维素是世界上最为丰富的生物质资源，纤维素乙醇是以木质纤维素（农作物秸秆、林业加工废料等）为原料，可变废为宝，而不与人争粮，是一举两得的方法。

现有的酿酒酵母是传统的乙醇发酵生产菌株，乙醇耐受力强、产量高、对纤维素水解液中抑制物的抗性强。它可以高效地将木质纤维素水解产物中的六碳糖发酵成乙醇，然而，却不能发酵木糖生产乙醇。木质纤维素水解液原料中木糖约占30%，是含量仅次于葡萄糖的单糖，木糖的有效利用是生物质资源成功转化的关键。在酿酒酵母中表达木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径或木糖异构酶途径是构建代谢木糖的重组酿酒酵母的两种选择，但是在木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径中由于木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的辅因子偏好性不同，导致产生很多的副产物木糖醇，降低了乙醇的产率。而在木糖异构酶途径中，木糖是一步直接转化为酵母可代谢的中间产物，中间不涉及辅因子偏好性的问题，因而整个过程中木糖转化为乙醇的得率很高，从而木糖异构酶途径相比于木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径有很强的优势。但是，木糖异构酶途径也有自身的问题：木糖的代谢速率很缓慢，影响了过程中乙醇的产率和经济性。实现木糖异构酶途径在酵母中有效表达，同时优化酵母自身的代谢网络，实现木糖代谢途径的优化、强化，实现木糖的高效利用，从而实现纤维素原料的充分、高效转化，是实现纤维素乙醇产业化的一个关键技术问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种具有共发酵葡萄糖和木糖产乙醇能力的酿酒酵母菌株。

本发明的第二个目的是提供一种酿酒酵母菌株在共发酵葡萄糖和木糖产乙醇上的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）命名为SyBE003，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6633，其具有共发酵葡萄糖和木糖产乙醇的能力。

上述一种酿酒酵母菌株在共发酵葡萄糖和木糖产乙醇上的用途。

本发明的优点：

本发明的酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）命名为SyBE003，保藏编号为CGMCCNo.6633，能够有效的共利用葡萄糖和木糖发酵产生乙醇。对葡萄糖和木糖的利用率都达到了100%，乙醇产率达到理论得率的80%，副产物木糖醇的产率在2%以下，能够高效地转化五六碳糖为乙醇，是优良的利用纤维素水解液的菌株。

本发明的酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）命名为SyBE003，已于2012年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.6633。地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1是含有木糖异构酶基因编码框的质粒pRS425-XylA图谱。

图2是含有木酮糖激酶基因编码框的质粒YIplac211-XKS1图谱。

图3是含有核糖磷酸异构酶基因编码框和转酮酶基因编码框的质粒pRS-RKI1-TKL1图谱。

图4是含有戊糖磷酸差向异构酶基因编码框和转醛酶基因编码框的质粒pAUR-RPE1-TAL1图谱。

图5是菌株SyBE003与出发重组菌株SyBE002在含有20g/L葡萄糖和20g/L木糖的发酵培养基中的发酵比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明做任何限制。

实施例1

菌株SyBE003的构建与筛选

出发菌株：出发菌株L2612，是美国威斯康星大学麦迪逊分校的Thomas Jeffries教授赠予，基因型是MAT alpha,leu2,ura3,trp1。是亮氨酸、尿嘧啶和色氨酸缺陷。

培养基

筛选培养基A：合成氮源YNB 6.7g/L，混合氨基酸粉末2g/L（具体配方参考[美]D.C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南），亮氨酸100mg/L，色氨酸100mg/L，葡萄糖20g/L。

筛选培养基B：合成氮源YNB 6.7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸100mg/L，葡萄糖20g/L。

筛选培养基C：合成氮源YNB 6.7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。

筛选培养基D：合成氮源YNB 6.7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，短梗霉素A 0.5mg/L，葡萄糖20g/L。

驯化培养基：合成氮源YNB 6.7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，木糖50g/L。

固体培养基中，添加20g/L的琼脂。

重组菌株SyBE003的构建

以菌株L2612基因组为模板，克隆出启动子TDH1p、TDH3p、PGK1p，木酮糖激酶基因XKS1，戊糖磷酸差向异构酶基因RPE1，核糖磷酸异构酶基因RKI1，转酮酶基因TKL1，转醛酶基因TAL1，终止子PGK1t。

通过融合PCR技术构建木糖异构酶基因表达盒TDH3p-XylA-PGK1t，其中基因XylA是通过人工合成、密码子经过优化的，将其连接在酵母复制型质粒pRS425（购于ATCC）上，形成载体pRS425-XylA（图1）。利用融合PCR技术构建木酮糖激酶基因表达盒TDH1p-XKS1-PGK1t，连接在载体YIplac211（购于ATCC）上，构建载体YIplac211-XKS1（图2）；利用融合PCR技术构建戊糖磷酸差向异构酶基因表达盒TDH1p-RPE1-PGK1t，转醛酶基因表达盒PGK1p-TAL1-PGK1t，核糖磷酸异构酶基因表达盒PGK1p-RKI1-PGK1t，转酮酶基因表达盒TDH3p-TKL1-PGK1t。将基因表达盒GK1p-RKI1-PGK1t和TDH3p-TKL1-PGK1t连接到载体pRS304（购于ATCC）上，形成质粒pRS-RKI1-TKL1（图3）。将基因表达盒TDH1p-RPE1-PGK1t和基因表达盒PGK1p-TAL1-PGK1t依次连接到载体pAUR101（大连宝生物公司购买），构建载体pAUR-RPE1-TAL1（图4）。

基因XylA的核苷梭序列用SEQ ID NO：1所示。

将质粒YIplac211-XKS1用限制性内切酶ApaI线性化，通过醋酸锂法转化菌株L2612，在筛选培养基A上筛选获得重组菌株。并在此重组菌株的基础上，用醋酸锂法转化质粒pRS425-XylA，在筛选培养基B上获得转化菌株。用限制性内切酶EcoRI线性化质粒pRS304-RKI1-TKL1，用醋酸锂法转化上一步得到的重组菌株，在筛选培养基C上筛选获得重组菌株。并在此菌株的基础上，进一步转化用StuI线性化的质粒pAUR-RPE1-TAL1，在筛选培养基D上得到出发重组菌株SyBE002。

将菌株SyBE002以初始OD₆₀₀=0.2接种到50mL驯化培养基中，30℃、200转/分有氧培养3天。测量培养物的OD₆₀₀，并转接到新鲜的驯化培养基中，初始OD₆₀₀保持0.2不变，重复培养10次后菌液的OD₆₀₀保持不变，继续重复培养10次。取少量的菌液，稀释后在驯化培养基的固体平板上涂布培养，获得单菌落菌株。从其中选取菌落尺寸最大的20个菌落，接种到含有2mL液体筛选培养基C的15mL试管中，在30℃、200转/分的条件下培养2天。取100μL菌液转接到3mL发酵培养基A中，在30℃、200转/分的条件下无氧培养。用带有一排气针的橡胶塞封试管口。无氧培养24小时后，测量菌液的OD₆₀₀、残留木糖量和代谢产物乙醇、木糖醇、甘油的含量。从20株单菌落中获得了一株残余木糖最少的菌株SyBE003。

分析方法：

菌体浓度以722型分光光度计测定其在600nm处吸光值（OD₆₀₀）表征。木糖、乙醇、木糖醇、甘油的浓度用高效液相色谱（Waters1515）测定，色谱柱为Aminex HPX-87H，柱温：65℃，检测器：Waters示差检测器2421，检测器温度是40℃。流动相为5mM硫酸溶液，流速0.6mL/min，进样量为10μL。

实施例2

比较在葡萄糖/木糖培养基（含量各为20g/L）上菌株SyBE003与出发重组菌株SyBE002的发酵性能

1、试验材料：菌株SyBE003与出发菌株SyBE002。

2、试验方法：

种子培养基：合成氮源YNB 6.7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。

发酵培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L，葡萄糖20g/L。

从新鲜的斜面上接一环SyBE003与SyBE002菌落分别接种于50mL种子培养基中，在30℃、200转/分培养24小时。以初始菌体浓度OD₆₀₀=2.0接种到100mL发酵培养基中，在30℃、150转/分条件下培养，发酵48小时。检测菌体浓度、葡萄糖、木糖浓度和产物乙醇、木糖醇、甘油的浓度。

3、分析方法：

同实施例1。

4、试验结果：

由图5所示，12小时后，SyBE003利用了100%的葡萄糖和47%的木糖，而SyBE002利用了100%的葡萄糖和17%的木糖。24小时后，96%的木糖被SyBE003消耗，而只有17%的木糖被SyBE002消耗。SyBE003的最终乙醇产量达到17.99g/L，比SyBE002的最终乙醇产量只达到10.67g/L,前者比后者高出68%。SyBE003的最终生物量达到8.22（OD₆₀₀），比SyBE002的最终生物量（OD₆₀₀=6.99）多17%。

Claims

1.一种酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）命名为SyBE003，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6633，其具有共发酵葡萄糖和木糖产乙醇的能力。

2.权利要求1的一种酿酒酵母菌株在共发酵葡萄糖和木糖产乙醇上的用途。