CN105624051B - 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法，该构建方法包括获得融合子，得到DNA片段P TEF1 ‑ERG25‑URA3，将DNA片段P TEF1 ‑ERG25‑URA3导入到菌株1的TRP1基因的上游片段内部，在MM(‑Umix)平板上筛选得到菌株2；得到敲除了URA3标记的菌株3；再获得色氨酸缺陷型菌株4；最后质粒酶切后导入菌株5，再平板筛选转化子获得菌株6，再将菌株7进行驯化筛单菌后得到菌株SEB5。该方法获得的木糖发酵酵母菌株能够有效利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产，提高木质纤维素生物质的利用率，并且能够进一步提高乙醇的产率。

Description

基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法
技术领域
本发明涉及一种酵母菌株，具体地，涉及一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法。
背景技术
木质纤维素类材料是一种可持续的能源，能减少人们对石油类燃料的需求，并且不会与粮食和动物饲料的生产相竞争。木质纤维素类生物质由纤维素、半纤维素和木质素组成，水解后产生寡糖，主要是葡萄糖和木糖。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇生产的常用菌株，具有生物安全性和较强的乙醇耐受性。目前，天然的酿酒酵母虽然对葡萄糖有着较高的乙醇转化效率，却不能有效利用木糖，而造成木质纤维素生物质水解后的木糖的浪费。如果能够利用木糖发酵生产乙醇，能够使得乙醇产量增加25%左右。如何构建能够利用木糖的酿酒酵母菌株，提高利用木质纤维素类生物质生产乙醇的经济可行性成为有效利用资源的战略问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法，该菌株能够有效利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产，提高木质纤维素生物质的利用率，并且能够进一步提高乙醇的产率。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：
一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae SEB5），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11325。菌株SEB5即为木糖发酵酵母菌株。
基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株的构建方法，第一步，将酿酒酵母SEB1和IR-2分别进行产孢子培养得到SEB1孢子和IR-2孢子，将SEB1孢子和IR-2孢子分别经营养缺陷型筛选方法得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2和赖氨酸缺陷型的菌株IL-1；SEB1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11321，IR-2菌株：分离自印度尼西亚发酵食品中，具有乙醇生产能力，有絮凝性，来源记载在下述文献中：Hiroshi K, Yoshio S, Toshio M, Harumi K, Yorikazu S. 1985. Continuousethanol fermentation with cell recycling using flocculating yeast. J.Ferment. Technol. 63:159-165；该文献翻译后的名称为：使用絮凝性酵母进行带细胞循环的连续乙醇发酵；上述IR-2生物材料从日本产业技术综合研究所（National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology, AIST）获得。
第二步，菌株SIV-2和菌株 IL-1分别经原生质体融合方法、筛选后获得融合子RHZ-1；
第一步的操作步骤可以为：将SEB1和IR-2分别进行产孢子培养，培养所得的子囊经酵母裂解酶处理分别得到SEB1孢子和IR-2孢子，将SEB1孢子和IR-2孢子分别经EMS处理，超声分散后分别涂到YPD平板培养，然后分别影印至最小营养平板，从处理SEB1孢子路线中筛选得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2，从处理IR-2孢子路线中得到赖氨酸缺陷型的菌株 IL-1，YPD平板的成分为2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白胨，2%琼脂，最小营养平板的成分为2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，
第二步的操作步骤可以为：将菌株 SIV-2和菌株 IL-1分别经酵母裂解酶处理得原生质体A和原生质体B，将原生质体A和原生质体B在30%的PEG6000中混匀处理15分钟，涂到再生平板和选择平板上，在选择平板上生长的菌落筛选获得利用25%糖蜜发酵产乙醇最快和乙醇浓度最高的融合子RHZ-1，选择平板的成分为2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，再生平板的成分为2%葡萄糖，0.5%酵母粉，1%多聚蛋白胨，4.5%氯化钾，2%琼脂；
第三步，将融合子RHZ-1经紫外诱变涂至含尿嘧啶的5-FOA平板，获得尿嘧啶缺陷型的菌株1；
第四步，使用引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株1的基因组DNA中PCR扩增获得TRP1基因的上游片段347 bp，使用引物TRP1PTEF1-F和ERG25 rev从质粒PET01中PCR扩增获得2060 bp的 P TEF1 -ERG25片段，使用引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中PCR扩增获得1137 bp的URA3片段，将得到的 P TEF1 -ERG25片段和URA3片段通过融合PCR获得3504bp的 DNA片段P TEF1 -ERG25-URA3；
其中引物TRP1-437F的基因序列如SEQ ID NO：1，TRP1-93R的基因序列如SEQ IDNO：2，TRP1PTEF1-F的基因序列如SEQ ID NO：3，ERG25 rev的基因序列如SEQ ID NO：4，ERG-TRP1URA3的基因序列如SEQ ID NO：5，TRP1URA3R-2的基因序列如SEQ ID NO：6；
第五步，将200 ng DNA片段P TEF1 -ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因的上游片段内部，在MM(-Umix)平板上筛选，得到菌株2；
第六步，将菌株2涂至5-FOA平板，得到敲除了URA3标记的菌株3；
第七步，使菌株3在产孢子培养基上生长一周形成孢子，将孢子洗涤后再经酵母裂解酶和超声处理涂至酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，获得纯合子双倍体的单菌落，将单菌落在MM(-Tmix)平板上筛选，获得不能在该平板上生长的色氨酸缺陷型的菌株4；
第八步，将质粒pRS404和质粒pBlue-BGL1c分别由内切酶NotⅠ酶切后连接得到质粒pIWBGL1（参见附录文献2），，用内切酶SspI在菌株4的P TDH3 内部酶切后，将质粒pIWBGL1（参见附录文献2）用醋酸锂法导入菌株4的PTDH3区域，以不含色氨酸的平板筛选转化子，进行PCR确认后，获得菌株5；将内切酶PstⅠ在菌株5的URA3内部酶切后，将质粒pIUX1X2XK（参见附录文献3）用醋酸锂法导入菌株5的URA3区域，以不含尿嘧啶的平板筛选转化子，进行PCR确认后，获得菌株6。
第九步，菌株6在产孢子培养基上培养分离单孢子后得到纯合子菌株7；将纯合子菌体在以木糖作为唯一碳源的培养基中进行驯化，驯化过程将经活化离心分散处理的菌株7分别接种到2%YPX和2%YNBX两种培养基中连续培养传代，起始OD660为0.1，培养温度为35℃，转速为200 rmp，2%YPX组成：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和20 g/L木糖；2%YNBX组成：6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、20 g/L木糖，每隔10代保存驯化过程中的菌体，分别得到2%YPX培养体系过程中的第11代、第19代和第24代群落YPX-11、YPX-19、YPX24，以及2%YNBX的第10代和第26代群落YNB10和YNB26；
第十步，稀释驯化得到的YPX-11、YPX-24和YNB-26菌体，并将其涂布至2%YPX或2%YNBX平板上，30°C培养形成单菌落，挑取大的单菌落和菌株7进行批次发酵比较，即接种至2%YPX或2%YNBX培养基中，筛选出乙醇产量高的菌株，再将乙醇产量高的菌株们和菌株7再次进行批次发酵比较，接种至4% YPX培养基中发酵，筛选获得乙醇产量高的菌株SEB5，即木糖发酵酵母菌株。
菌株7的活化离心分散处理具体为在YPD平板上活化菌株7，培养温度为30℃，时间为24 h；然后接种到5%YPD液体培养基中预培养16 h，培养温度为35℃；9000 g离心3 min收集菌株7的菌体，用灭菌水洗涤；用0.0 5mM EDTA 分散菌体，其中5%YPD组成：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和50 g/L葡萄糖。
第十步中挑取大的单菌落和菌株7进行批次发酵具体为：将大的单菌落及菌株7分别经过活化离心分散处理收集菌体后，以起始OD660为0.1接种至2%YPX或2%YNBX培养基中发酵24或48 h。活化离心分散处理方法如上述的菌株7的活化离心分散处理方法。
第十步中乙醇产量高的菌株们和菌株7再次进行批次发酵具体为：将乙醇产量高的菌株们和菌株7分别经过活化离心分散处理收集菌体后，以起始OD660为0.1接种至4%YPX培养基中发酵48 h。活化离心分散处理方法如上述的菌株7的活化离心分散处理方法。
菌株2、菌株3和菌株4均需使用引物TRP1-437F和TRP1+717R进行PCR验证，其中TRP1+717R的基因序列如SEQ ID NO：7。
基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae SEB5）在利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产的应用。
综上，本发明的有益效果是：
本发明获得的木糖发酵酵母菌株能够有效利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产，提高木质纤维素生物质的利用率，并且能够进一步提高乙醇的产率，在48小时发酵时间内，木糖发酵酵母菌株SEB5产乙醇最高可达12.91 g/L，木糖利用率达到了0.952 g/L/h。
本发明中涉及保藏的微生物的保藏信息如下：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年9月6日；保藏编号：CGMCC11321、CGMCC11325；分类命名：Saccharomyces cerevisiae。
附图说明
图1为菌株7和驯化所得菌体的发酵性能比较；
图2为菌株7驯化前后菌株的发酵性能比较。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
将SEB1和IR-2分别进行产孢子培养（0.5%醋酸锂，2%琼脂），培养所得的子囊经酵母裂解酶处理分别得到SEB1孢子和IR-2孢子，将SEB1孢子和IR-2孢子分别经EMS处理，超声分散后分别涂到YPD平板培养，然后分别影印至最小营养平板，从SEB1中筛选得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2，从IR-2得到赖氨酸缺陷型的菌株IL-1，YPD平板的成分为2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白胨，2%琼脂，最小营养平板的成分为2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，SEB1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11321，其中， IR-2在附录文献1中被公开。
第二步，菌株SIV-2和菌株 IL-1分别经酵母裂解酶处理得原生质体A和原生质体B，将原生质体A和原生质体B在30%的PEG6000中混匀处理15分钟，涂到再生平板和选择平板上，在选择平板上生长的菌落筛选获得利用25%糖蜜发酵产乙醇最快和乙醇浓度最高的融合子RHZ-1，选择平板的成分为2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，再生平板的成分为2%葡萄糖，0.5%酵母粉，1%多聚蛋白胨，4.5%氯化钾，2%琼脂；
第三步，将融合子RHZ-1经紫外诱变涂至含尿嘧啶的5-FOA平板，获得尿
嘧啶缺陷型的菌株1；
第四步，使用引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株1的基因组DNA中PCR扩增获得TRP1基因的上游片段347 bp，使用引物TRP1PTEF1-F和ERG25 rev从质粒PET01中PCR扩增获得2060 bp的 P TEF1 -ERG25片段，使用引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中PCR扩增获得1137 bp的URA3片段，将得到的 P TEF1 -ERG25片段和URA3片段通过融合PCR获得3504bp的 DNA片段P TEF1 -ERG25-URA3；
其中引物TRP1-437F的基因序列如SEQ ID NO：1， TRP1-93R的基因序列如SEQ IDNO：2，TRP1PTEF1-F的基因序列如SEQ ID NO：3， ERG25 rev的基因序列如SEQ ID NO：4，ERG-TRP1URA3的基因序列如SEQ ID NO：5，TRP1URA3R-2的基因序列如SEQ ID NO：6；
引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株4的基因组DNA中PCR扩增TRP1基因的上游片段(347 bp)的扩增参数：
引物TRP1PTEF1-F和ERG25 rev从质粒PET01中PCR扩增获得P TEF1 -ERG25片段（2060bp）的扩增参数；
引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中PCR扩增获得URA3片段（1137bp）的扩增参数：
融合PCR获得DNA片段PTEF1-ERG25-URA3（3504bp）的扩增参数：
其中质粒PET01的构建方法为：使用引物ERG25 fwd（基因序列如SEQ ID NO：8）和ERG25rev（基因序列如SEQ ID NO：4）从菌株1的基因组DNA中PCR扩增得到ERG25片段，插入到商业质粒pT7-Blue(Novagen)的NcoⅠ和HindⅢ位点，得到质粒pT7-Blue-ERG 01。使用引物TEF1promoter fwd（基因序列如SEQ ID NO：9）和TEF1promoter rev（基因序列如SEQ IDNO：10）从基因组DNA中PCR扩增得到pTEF片段，插入到商业质粒pT7-Blue(Novagen)的NcoⅠ和HindⅢ位点，得到质粒pT7-Blue-PTEF101，再用内切酶HindⅢ和NcoⅠ将质粒pT7-Blue-ERG 01和pT7-Blue-PTEF101处理后进行连接得到质粒PET01。
第五步，将200 ng DNA片段P TEF1 -ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因的上游片段内部，在MM(-Umix)平板上筛选，得到菌株2；
第六步，将菌株2涂至5-FOA平板，得到敲除了URA3标记的菌株3；
第七步，使菌株3在产孢子培养基上生长一周形成孢子，收集孢子并用磷酸缓冲液（0.1M, pH7.5）洗涤，在30℃下经酵母裂解酶处理2小时，并超声处理3分钟后，稀释104倍后涂至酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，获得114个单菌落。由于融合子是同宗配合型菌株，所获单菌落都是纯合子双倍体。挑取其中24个单菌落在MM(-Tmix)平板上筛选，获得不能在该平板上生长的色氨酸缺陷型菌株4。
MM(-Umix)平板的组成：
MM（-Umix): 1.7 g/L无氨基酸酵母氮源、5.0 g/L 硫酸铵、20 g/L 葡萄糖、0.025g/L硫酸腺嘌呤、0.1 g/L色氨酸、0.1 g/L组氨酸、0.1 g/L甲硫氨酸、0.2 g/L亮氨酸、0.1g/L赖氨酸。
MM(-T mix)平板的组成：
MM（-Tmix): 1.7 g/L无氨基酸酵母氮源、5.0 g/L 硫酸铵、20 g/L 葡萄糖、0.025g/L硫酸腺嘌呤、0.1 g/L尿嘧啶、0.1 g/L组氨酸、0.1 g/L甲硫氨酸、0.2 g/L亮氨酸、0.1g/L赖氨酸。
第八步，将质粒pRS404和质粒pBlue-BGL1c分别由内切酶NotⅠ酶切后连接得到质粒pIWBGL1，用内切酶SspI在菌株4的P TDH3 内部酶切后，将质粒pIWBGL1（参见附录文献2）用醋酸锂法导入菌株4的PTDH3区域，以不含色氨酸的平板筛选转化子，用引物BGL1-27F,AGG215F, BGL1-1503R进行PCR确认后，获得菌株5；将内切酶PstⅠ在菌株5的URA3内部酶切后，将质粒pIUX1X2XK（参见附录文献3）用醋酸锂法导入菌株5的URA3区域，以不含尿嘧啶的平板筛选转化子，用引物XYL-1F, XYL1-3839R, XYL2-6177R, XKS1-8867R, XYL-13096R进行PCR确认后，获得菌株6。
第九步，菌株6在产孢子培养基上培养分离单孢子后得到纯合子菌株7；将纯合子菌体在以木糖作为唯一碳源的培养基中进行驯化，驯化过程将经活化离心分散处理的菌株7分别接种到2%YPX和2%YNBX两种培养基中连续培养传代，起始OD660为0.1，培养温度为35℃，转速为200rmp，2%YPX：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和20 g/L木糖；2%YNBX：6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、20 g/L木糖，每隔10代保存驯化过程中的菌体，分别得到2%YPX培养体系过程中的第11代、第19代和第24代群落YPX-11、YPX-19、YPX24，以及2%YNBX的第10代和第26代群落YNB10和YNB26；
第十步，稀释驯化得到的YPX-11、YPX-24和YNB-26菌体，并将其涂布至2%YPX或2%YNBX平板上，30°C培养形成单菌落，挑取大的单菌落和菌株7进行批次发酵比较，即接种至2%YPX或2%YNBX培养基中，筛选出乙醇产量高的菌株们，再将乙醇产量高的菌株们和菌株7再次进行批次发酵比较，接种至4% YPX中得到乙醇产量高的菌株SEB5。
菌株7的活化离心分散处理具体为在YPD平板上活化菌株7，培养温度为30℃，时间为24 h；然后接种到5%YPD液体培养基中预培养16 h，培养温度为35℃；9000 g离心3 min收集菌株7菌体，用灭菌水洗涤；用0.05 mM EDTA 分散菌体，其中5%YPD组成：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和50 g/L葡萄糖。
第十步中挑取大的单菌落和菌株7进行批次发酵具体为：将大的单菌落及菌株7分别经过活化离心分散处理收集菌体后，以起始OD660为0.1接种至2%YPX或2%YNBX培养基中发酵24或48 h。
第十步中乙醇产量高的菌株们和菌株7再次进行批次发酵具体为：将乙醇产量高的菌株们和菌株7分别经过活化离心分散处理收集菌体后，以起始OD660为0.1接种至4%YPX培养基中发酵48 h。
将菌株7和驯化过程中保存的菌体经活化和预培养以后，起始OD660 为0.1接种至含有100 ml 4% YPX的三角瓶中，在温度为35°C、转速为200 rmp的条件下发酵48 h，并于8h、24 h和48 h采样，测量细胞生长、木糖消耗和乙醇及木糖醇生成量，可以看出驯化过程对木糖发酵性能的提升作用，如图1所示。
将SEB5与驯化前的菌株7以及试管预筛选出的乙醇产量较高的菌株8~11，一起在4%YPX培养基中进行批次发酵，发酵条件同前。SEB5及相关菌株的发酵性能如图2所示。从图2中可以明显的看到SEB5的发酵性能最好。
株6的产孢子培养基为：20 g/L醋酸甲, 2 g/L酵母粉, 0.5 g/L葡萄糖, pH为5.5。SEB1和IR-2的产孢子培养基为0.5%醋酸锂，2%琼脂。
引物BGL1-27F的基因序列如SEQ ID NO：11, AGG215F基因序列如SEQ ID NO：12,BGL1-1503R基因序列如SEQ ID NO：13，XYL-1F基因序列如SEQ ID NO：14, XYL1-3839R基因序列如SEQ ID NO：15, XYL2-6177R基因序列如SEQ ID NO：16, XKS1-8867R基因序列如SEQID NO：17, XYL-13096R基因序列如SEQ ID NO：18。
菌株2、菌株3和菌株4均需使用引物TRP1-437F和TRP1+717R进行PCR验证，其中TRP1+717R的基因序列如SEQ ID NO：7。
实施例2：
如前述的构建方法得到的菌株SEB5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11325。
如菌株SEB5的应用方法，利用木糖生产乙醇。
以起始OD660为0.1接种，温度为35°C、转速为200 rmp，在2%或4%YPX培养基中发酵48 h，其中，4 %YPX：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉和20 g/L木糖。
菌株SEB5产乙醇最高12.91 g/L（并未在图2中显示），木糖利用率达到了0.952 g/L/h（菌株7产乙醇量5.80 g/L，木糖利用率为0.403 L/h）。
如上所述，可较好的实现本发明。
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一．1137bp URA3片段的基因序列SEQ ID NO：19
cggtgacgttaccgtagttttgatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaagagattcggtaatctccgagcagaaggaagaacgaaggaaggagcacagacttagattggtatatatacgcatatgtggtgttgaagaaacatgaaattgcccagtattcttaacccaactgcacagaacaaaaacctgcaggaaacgaagataaatcatgtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaaggaattactggagttagttgaagcattaggtcccaaaatttgtttactaaaaacacatgtggatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgctaaaggcattatccgccaagtacaattttttactcttcgaagacagaaaatttgctgacattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcagaatgggcagacattacgaatgcacacggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcggaagaagtaacaaaggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgtcatgcaagggctccctagctactggagaatatactaagggtactgttgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggctttattgctcaaagagacatgggtggaagagatgaaggttacgattggttgattatgacacccggtgtgggtttagatgacaagggagacgcattgggtcaacagtatagaaccgtggatgatgtggtctctacaggatctgacattattattgttggaagaggactatttgcaaagggaagggatgctaaggtagagggtgaacgttacagaaaagcaggctgggaagcatatttgagaagatgcggccagcaaaactaaaaaactgtattataagtaaatgcatgtatactaaactcacaaattagagcttcaatttaattatatcagttattacccaatgttggtgatgcgcttagattaaatggcgttattggtg
二．3504bpP TEF1 -ERG25-URA3的基因系列如SEQ ID NO：20
attccttatggcatgtctggcgatgataaaacttttcaaacggcagccccgatctaaaagagctgacagggaaatggtcagaaaaagaaacgtgcacccgcccgtctggacgcgccgctcacccgcacggcagagaccaatcagtaaaaatcaacggttaacgacattactatatatataatataggaagcatttaatagaacagcatcgtaatatatgtgtactttgcagttatgacgccagatggcagtagtggaagatattctttattgaaaaatagcttgtcaccttacgtacaatcttgatccggagcttttctttttttgccgattaagaattcggtcgaatggctgataatagcgtataaacaatgcatactttgtacgttcaaaatgcaatgcagtagatatatttatgcatattacatataatacatatcacataggaagcaacaggcgcgttggacttttaattttcgaggaccgcgaatccttacatcacacccaatcccccacaagtgatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaatttcccctctttcttcctctagggtggcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaaaattttttttttgatttttttctctttcgatgacctcccattgatatttaagttaataaatggtcttcaatttctcaagtttcagtttcgtttttcttgttctattacaactttttttacttcttgctcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaagttttaattacaccatggagaaatactgggccgcatggtacagttacatgaacaatgatgttttggccaccggtctaatgttctttttattgcatgaatttatgtatttctttagatgtttgccatggttcatcatcgaccaaattccatactttagaagatggaagttacaaccaactaagattccaagtgctaaggaacaactatactgtttgaaatccgttcttctatctcatttcttggtcgaggccatccctatctggaccttccacccaatgtgtgaaaaattaggtattactgtcgaagttccattcccatctttgaaaacaatggctctagaaattggtctattcttcgtcttggaagatacatggcattactgggctcaccgtctattccactacggtgtcttctacaagtacattcacaagcaacatcacagatacgctgctccattcggtctttctgctgaatatgctcatcctgctgaaactttgtctttgggttttggtaccgttggtatgccaattctttacgtcatgtacactggtaaattacacttgttcactctatgtgtatggatcaccctaagattattccaagctgttgactctcattctggttatgacttcccatggtccttgaacaagatcatgccattctgggctggcgctgaacaccacgatttgcatcatcactacttcattggtaactacgcttcctctttcagatggtgggattactgtctagacactgaatctggtccagaagctaaggcctccagagaagaaaaaatgaagaagagagctgaaaacaatgctcaaaagaagactaactaagagaagaaacatacttcaagaaaaaaaaagaaaaacaacaaaaaaaacgtataaaatgaaataaatttcgaaccgctttttttcctttttttttttttactttgtttgacctcccctaactctttctttttaccttcacaattgtttattttaatatatgatttttaaattaattcaggttaattctaaaaactatactgcaatcttttaaatatatgtatacacgttcattaccacgtatacatatacatatatatatatatatatactatttatgataaatttttaacaagcaaacccattattaaatgctataaataaaagacagcttctttctaattattattcaaacttaaaaactacatatacaaaaactacaaaaatctttcaaccgacccatcttctggcagatctgaataatctaatccatggaccgtatccaccccactcttcgtatttgccctctggataccaggaattggcctccaatctgcaaactctttcaggatgtggcatcatggcaagcactctaccatttggtgacttgataccggcaataccattggtcgacccattggggttgaaggggaacctttcggtgacgttaccgtagttttgatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaagagattcggtaatctccgagcagaaggaagaacgaaggaaggagcacagacttagattggtatatatacgcatatgtggtgttgaagaaacatgaaattgcccagtattcttaacccaactgcacagaacaaaaacctgcaggaaacgaagataaatcatgtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaaggaattactggagttagttgaagcattaggtcccaaaatttgtttactaaaaacacatgtggatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgctaaaggcattatccgccaagtacaattttttactcttcgaagacagaaaatttgctgacattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcagaatgggcagacattacgaatgcacacggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcggaagaagtaacaaaggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgtcatgcaagggctccctagctactggagaatatactaagggtactgttgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggctttattgctcaaagagacatgggtggaagagatgaaggttacgattggttgattatgacacccggtgtgggtttagatgacaagggagacgcattgggtcaacagtatagaaccgtggatgatgtggtctctacaggatctgacattattattgttggaagaggactatttgcaaagggaagggatgctaaggtagagggtgaacgttacagaaaagcaggctgggaagcatatttgagaagatgcggccagcaaaactaaaaaactgtattataagtaaatgcatgtatactaaactcacaaattagagcttcaatttaattatatcagttattacccaatgttggtgatgcgcttagattaaatggcgttattggtg
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法
<130> 2015
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attccttatg gcatgtctgg cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcgaccgaa ttcttaatcg gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gccgattaag aattcggtcg aatggctgat aatagcgtat aa 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aactacggta acgtcaccg 19
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cggtgacgtt accgtagttt tgatgtaagc ggaggtgtgg agacaaatgg tgtaaaagag 60
attcggtaat ctccga 76
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caccaataac gccatttaat ctaagcgcat caccaacatt gggtaataac tgatataatt 60
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<400> 7
gtgtgatggc ttggcatggc ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tccatggaga aatactgggc 20
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<400> 9
tggctgataa tagcgtataa 20
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ctctttaccc atggtgtaat 20
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cgatgtcaac gttggaagaa 20
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<400> 12
gggtaatgaa acgagcggta 20
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<213> 人工序列
<400> 13
aatagccgag caagctcaaa 20
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<400> 14
tgcgaggcat atttatggtg 20
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tgtcagcgaa atcttgttcg 20
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gctctgacca agtcgtaggc 20
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<400> 17
tgtgagcttg cgtttgaatc 20
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<213> 人工序列
<400> 18
ttacttggtt ctggcgaggt 20
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<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cggtgacgtt accgtagttt tgatgtaagc ggaggtgtgg agacaaatgg tgtaaaagag 60
attcggtaat ctccgagcag aaggaagaac gaaggaagga gcacagactt agattggtat 120
atatacgcat atgtggtgtt gaagaaacat gaaattgccc agtattctta acccaactgc 180
acagaacaaa aacctgcagg aaacgaagat aaatcatgtc gaaagctaca tataaggaac 240
gtgctgctac tcatcctagt cctgttgctg ccaagctatt taatatcatg cacgaaaagc 300
aaacaaactt gtgtgcttca ttggatgttc gtaccaccaa ggaattactg gagttagttg 360
aagcattagg tcccaaaatt tgtttactaa aaacacatgt ggatatcttg actgattttt 420
ccatggaggg cacagttaag ccgctaaagg cattatccgc caagtacaat tttttactct 480
tcgaagacag aaaatttgct gacattggta atacagtcaa attgcagtac tctgcgggtg 540
tatacagaat agcagaatgg gcagacatta cgaatgcaca cggtgtggtg ggcccaggta 600
ttgttagcgg tttgaagcag gcggcggaag aagtaacaaa ggaacctaga ggccttttga 660
tgttagcaga attgtcatgc aagggctccc tagctactgg agaatatact aagggtactg 720
ttgacattgc gaagagcgac aaagattttg ttatcggctt tattgctcaa agagacatgg 780
gtggaagaga tgaaggttac gattggttga ttatgacacc cggtgtgggt ttagatgaca 840
agggagacgc attgggtcaa cagtatagaa ccgtggatga tgtggtctct acaggatctg 900
acattattat tgttggaaga ggactatttg caaagggaag ggatgctaag gtagagggtg 960
aacgttacag aaaagcaggc tgggaagcat atttgagaag atgcggccag caaaactaaa 1020
aaactgtatt ataagtaaat gcatgtatac taaactcaca aattagagct tcaatttaat 1080
tatatcagtt attacccaat gttggtgatg cgcttagatt aaatggcgtt attggtg 1137
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
attccttatg gcatgtctgg cgatgataaa acttttcaaa cggcagcccc gatctaaaag 60
agctgacagg gaaatggtca gaaaaagaaa cgtgcacccg cccgtctgga cgcgccgctc 120
acccgcacgg cagagaccaa tcagtaaaaa tcaacggtta acgacattac tatatatata 180
atataggaag catttaatag aacagcatcg taatatatgt gtactttgca gttatgacgc 240
cagatggcag tagtggaaga tattctttat tgaaaaatag cttgtcacct tacgtacaat 300
cttgatccgg agcttttctt tttttgccga ttaagaattc ggtcgaatgg ctgataatag 360
cgtataaaca atgcatactt tgtacgttca aaatgcaatg cagtagatat atttatgcat 420
attacatata atacatatca cataggaagc aacaggcgcg ttggactttt aattttcgag 480
gaccgcgaat ccttacatca cacccaatcc cccacaagtg atcccccaca caccatagct 540
tcaaaatgtt tctactcctt ttttactctt ccagattttc tcggactccg cgcatcgccg 600
taccacttca aaacacccaa gcacagcata ctaaatttcc cctctttctt cctctagggt 660
ggcgttaatt acccgtacta aaggtttgga aaagaaaaaa gagaccgcct cgtttctttt 720
tcttcgtcga aaaaggcaat aaaaattttt atcacgtttc tttttcttga aaaatttttt 780
ttttgatttt tttctctttc gatgacctcc cattgatatt taagttaata aatggtcttc 840
aatttctcaa gtttcagttt cgtttttctt gttctattac aacttttttt acttcttgct 900
cattagaaag aaagcatagc aatctaatct aagttttaat tacaccatgg agaaatactg 960
ggccgcatgg tacagttaca tgaacaatga tgttttggcc accggtctaa tgttcttttt 1020
attgcatgaa tttatgtatt tctttagatg tttgccatgg ttcatcatcg accaaattcc 1080
atactttaga agatggaagt tacaaccaac taagattcca agtgctaagg aacaactata 1140
ctgtttgaaa tccgttcttc tatctcattt cttggtcgag gccatcccta tctggacctt 1200
ccacccaatg tgtgaaaaat taggtattac tgtcgaagtt ccattcccat ctttgaaaac 1260
aatggctcta gaaattggtc tattcttcgt cttggaagat acatggcatt actgggctca 1320
ccgtctattc cactacggtg tcttctacaa gtacattcac aagcaacatc acagatacgc 1380
tgctccattc ggtctttctg ctgaatatgc tcatcctgct gaaactttgt ctttgggttt 1440
tggtaccgtt ggtatgccaa ttctttacgt catgtacact ggtaaattac acttgttcac 1500
tctatgtgta tggatcaccc taagattatt ccaagctgtt gactctcatt ctggttatga 1560
cttcccatgg tccttgaaca agatcatgcc attctgggct ggcgctgaac accacgattt 1620
gcatcatcac tacttcattg gtaactacgc ttcctctttc agatggtggg attactgtct 1680
agacactgaa tctggtccag aagctaaggc ctccagagaa gaaaaaatga agaagagagc 1740
tgaaaacaat gctcaaaaga agactaacta agagaagaaa catacttcaa gaaaaaaaaa 1800
gaaaaacaac aaaaaaaacg tataaaatga aataaatttc gaaccgcttt ttttcctttt 1860
ttttttttta ctttgtttga cctcccctaa ctctttcttt ttaccttcac aattgtttat 1920
tttaatatat gatttttaaa ttaattcagg ttaattctaa aaactatact gcaatctttt 1980
aaatatatgt atacacgttc attaccacgt atacatatac atatatatat atatatatac 2040
tatttatgat aaatttttaa caagcaaacc cattattaaa tgctataaat aaaagacagc 2100
ttctttctaa ttattattca aacttaaaaa ctacatatac aaaaactaca aaaatctttc 2160
aaccgaccca tcttctggca gatctgaata atctaatcca tggaccgtat ccaccccact 2220
cttcgtattt gccctctgga taccaggaat tggcctccaa tctgcaaact ctttcaggat 2280
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acccattggg gttgaagggg aacctttcgg tgacgttacc gtagttttga tgtaagcgga 2400
ggtgtggaga caaatggtgt aaaagagatt cggtaatctc cgagcagaag gaagaacgaa 2460
ggaaggagca cagacttaga ttggtatata tacgcatatg tggtgttgaa gaaacatgaa 2520
attgcccagt attcttaacc caactgcaca gaacaaaaac ctgcaggaaa cgaagataaa 2580
tcatgtcgaa agctacatat aaggaacgtg ctgctactca tcctagtcct gttgctgcca 2640
agctatttaa tatcatgcac gaaaagcaaa caaacttgtg tgcttcattg gatgttcgta 2700
ccaccaagga attactggag ttagttgaag cattaggtcc caaaatttgt ttactaaaaa 2760
cacatgtgga tatcttgact gatttttcca tggagggcac agttaagccg ctaaaggcat 2820
tatccgccaa gtacaatttt ttactcttcg aagacagaaa atttgctgac attggtaata 2880
cagtcaaatt gcagtactct gcgggtgtat acagaatagc agaatgggca gacattacga 2940
atgcacacgg tgtggtgggc ccaggtattg ttagcggttt gaagcaggcg gcggaagaag 3000
taacaaagga acctagaggc cttttgatgt tagcagaatt gtcatgcaag ggctccctag 3060
ctactggaga atatactaag ggtactgttg acattgcgaa gagcgacaaa gattttgtta 3120
tcggctttat tgctcaaaga gacatgggtg gaagagatga aggttacgat tggttgatta 3180
tgacacccgg tgtgggttta gatgacaagg gagacgcatt gggtcaacag tatagaaccg 3240
tggatgatgt ggtctctaca ggatctgaca ttattattgt tggaagagga ctatttgcaa 3300
agggaaggga tgctaaggta gagggtgaac gttacagaaa agcaggctgg gaagcatatt 3360
tgagaagatg cggccagcaa aactaaaaaa ctgtattata agtaaatgca tgtatactaa 3420
actcacaaat tagagcttca atttaattat atcagttatt acccaatgtt ggtgatgcgc 3480
ttagattaaa tggcgttatt ggtg 3504

Claims (2)

1.一种基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）SEB5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.11325。
2.如权利要求1所述的基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）SEB5在利用木质纤维素类生物质中的木糖进行乙醇的生产的应用。
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Co-fermentation of cellobiose and xylose Co-fermentation of cellobiose and xylose using beta-glucosidase displaying diploid industrial yeast strain OC-2;Satoshi Saitoh,et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20101231;第87卷;第1975-1982页 *
Ethanol fermentation from lignocellulosic hydrolysate by a recombinant xylose- and cellooligosaccharide-assimilating yeast strain;Satoshi Katahira，et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20061231;第72卷;第1136-1143页 *
提高木糖代谢能力的酿酒酵母Y5-X3的初步构建;张洁宁，等;《可再生能源》;20120430;第30卷(第4期);第47-51页 *

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