CN109266565B - L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用 - Google Patents

L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109266565B
CN109266565B CN201811079846.3A CN201811079846A CN109266565B CN 109266565 B CN109266565 B CN 109266565B CN 201811079846 A CN201811079846 A CN 201811079846A CN 109266565 B CN109266565 B CN 109266565B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
strain
lactic acid
substrate
kluyveromyces marxianus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811079846.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109266565A (zh
Inventor
洪泂
孔昕
王冬梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Science and Technology of China USTC
Original Assignee
University of Science and Technology of China USTC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Science and Technology of China USTC filed Critical University of Science and Technology of China USTC
Priority to CN201811079846.3A priority Critical patent/CN109266565B/zh
Publication of CN109266565A publication Critical patent/CN109266565A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109266565B publication Critical patent/CN109266565B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01009—D-Xylulose reductase (1.1.1.9), i.e. xylitol dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01307—D-Xylose reductase (1.1.1.307)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/05—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a quinone or similar compound as acceptor (1.1.5)
    • C12Y101/05003—Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (1.1.5.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01011—6-Phosphofructokinase (2.7.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及L‑乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用。本发明提供一种L‑乳酸生产酵母工程菌株，所述酵母工程菌株为重组表达疟原虫(Plasmodium falciparum)L‑乳酸脱氢酶基因PfLDH和/或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L‑乳酸脱氢酶基因BmLDH的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)工程菌株，例如保藏号为CGMCC No.16192的工程菌株。本发明还提供构建所述工程菌株的方法，所述工程菌株用于L‑乳酸生产的用途和通过所述工程菌株生产L‑乳酸的方法。本发明的工程菌株能够在较高温度(例如42℃)下，高效共利用葡萄糖和木糖发酵，大量快速生产高光学纯度的L‑乳酸，还可以快速高效利用玉米芯为代表的木质纤维素发酵生产L‑乳酸，为首个能利用木质纤维素类物质产乳酸的工程酵母。

Description

L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用
技术领域
本发明涉及到生物技术领域。具体地，本发明涉及生产L-乳酸的工程改造的耐热性马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的构建方法以及用途。本发明还涉及能直接利用玉米芯残渣作为碳源发酵生产L-乳酸的耐热工程酵母菌株的构建方法以及用途。
背景技术
作为木质纤维素中的一种，中国每年有约2千万吨玉米芯产生，目前，其中很大一部分都用来生产寡聚木糖，剩余的残渣部分(CCR)则主要含有葡萄糖和少量木糖(Bai etal.，2016；Samanta et al.，2012)。CCR属于工业废弃物，会造成环境污染，而它获得的成本很低。这意味着找到行之有效的方法来利用CCR，会极大的降低成本和减少环境污染(Zhanget al.，2015c)。
乳酸作为一种重要的工业产物，在化妆品工业、制药工业、食品工业等行业都具有非常广泛且重要的应用(Castillo Martinez et al.，2013；Miller et al.，2011)。与化学法相比，生物法发酵生产L-乳酸条件温和，也不会造成环境污染(Miller et al.，2011)。若能将用于发酵的原料由纯糖换成工业废料，则在这些优势的基础上还能降低成本，节约资源。
耐热的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)作为公认的安全微生物(GRAS)，用于发酵有以下几个优点：1、安全，可以用于食品工业；2、高温发酵，这一般会使得发酵速率更快，且在发酵工艺上减少了冷却成本，同时减少了污染的风险(Zhang et al.，2016)；3、底物谱很广泛，可利用葡萄糖、木糖、半乳糖、菊糖等等(Pentjuss et al.，2017)；4、本身可产生多种酶，如果胶酶，β-D-半乳糖苷酶和菊糖酶等，使得它可以直接利用多种原料(Fonseca et al.，2008)。一般酵母都会比细菌对酸有更强的耐受性，用于生产乳酸更有优势(Hause et al.，2003)。基于这种种优势，克鲁维菌属被认为未来很有望作为乳酸生产的重要菌株(Pentjuss et al.，2017)。所以利用马克斯克鲁维酵母发展成乳酸生产菌株具有非常重要的应用价值。
已经有一些关于利用酵母发酵生产乳酸的研究，Ilmen等用毕赤酵母在30℃条件下发酵47g/L葡萄糖和50g/L木糖产生了58g/L的L-乳酸，产率0.62g/g(Ilmen et al.，2007)。还有许多利用酵母来进行发酵生产乳酸的研究，但他们基本都在30℃条件下进行；且大多是以纯糖作为碳源。没有利用木质纤维素作为唯一碳源来进行发酵(Vera Novy，2017；Turner et al.，2015；Tamakawa et al.，2012；Ikushima et al.，2009)。
因此，本领域仍然需要对酵母发酵生产乳酸进行深入研究，以满足降低成本，节约资源，减少环境污染等需求。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供一种L-乳酸生产酵母工程菌株，所述酵母工程菌株为重组表达疟原虫(Plasmodium falciparum)L-乳酸脱氢酶基因PfLDH和/或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L-乳酸脱氢酶基因BmLDH的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)工程菌株。在一些实施方案中，所述酵母工程菌株优选为重组表达疟原虫(Plasmodium falciparum)L-乳酸脱氢酶基因PfLDH和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)L-乳酸脱氢酶基因BmLDH二者的工程菌株。
在一些实施方案中，进一步敲除所述酵母工程菌株的D-乳酸脱氢酶基因KmDLD1和/或进一步重组表达下述基因之一或二者：马克斯克鲁维酵母果糖-6-磷酸激酶基因KmPFK和酿酒酵母的乳酸转运蛋白基因ScJEN1。
在一些实施方案中，所述酵母工程菌株的丙酮酸脱羧酶基因KmPDC1和/或甘油-3磷酸脱氢酶基因KmGPD1被敲除。
在一些实施方案中，所述酵母工程菌株的木糖还原酶基因KmXYL1和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2被敲除，并重组表达粗糙脉孢霉木糖还原酶基因NcXYL1和树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。在一些实施方案中，所述酵母工程菌株包括敲除和/或重组表达本文表2中YZB058菌株的一种或多种基因，例如敲除KmXYL1，KmXYL2，KmPDC1，和KmGPD1中的一种或多种，和/或重组表达PsXYL2-ARS，KmXYL3，ScGAL2-N376F，KmMTH1-ΔT，KmGLN1，KmTAL1，KmTKL1，KmRPE1，KmRKI1中的一种或多种。在一些实施方案中，所述酵母工程菌株包括敲除KmURA3，KmLEU2，和KmTRP1中的一种或多种。
在一些实施方案中，本发明提供一种L-乳酸生产酵母工程菌株，其于2018年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCCNo.16192。
在一些实施方案中，本发明提供一种构建所述的L-乳酸生产酵母工程菌株的方法，所述方法包括重组表达和/或敲除本文描述的基因，从而获得L-乳酸生产酵母工程菌株。
在一些实施方案中，本发明的方法可以通过野生型马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或工程改造的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)为出发菌株构建所述L-乳酸生产酵母工程菌株。在一些实施方案中，所述工程改造的菌株优选为已经敲除和/或重组表达了本文所述的基因中的一个或多个的工程改造菌株，例如马克斯克鲁维酵母YZB058。
在一些实施方案中，通过表达质粒重组表达所述基因。重组表达基因的方法是本领域广泛已知的。在一些实施方案中，可以使用马克斯克鲁维酵母来源的启动子例如KmPGK启动子、KmTEF1启动子、KmURA3启动子KmADH启动子、酿酒酵母来源的启动子例如PGK启动子、TEF1启动子、GAL1启动子、TDH3启动子、ADH启动子、及其他酵母源启动子构建重组表达载体，在宿主如马克斯克鲁维酵母中重组表达目的基因。
在一些实施方案中，本发明提供所述L-乳酸生产酵母工程菌株用于L-乳酸生产的用途。如本文中描述的，本发明的L-乳酸生产酵母工程菌株可以在高于30℃至高达47℃的温度进行，例如31℃以上，32℃以上，33℃以上，34℃以上，35℃以上，36℃以上，37℃以上，38℃以上，39℃以上，40℃以上，41℃以上，42℃以上，43℃以上，44℃以上，45℃以上，46℃以上，直至高达47℃或任何其间的温度生产L-乳酸。在一些实施方案中，用于L-乳酸生产的底物可以是例如含木质纤维素、葡萄糖、木糖、半乳糖和菊糖中的任意一种或多种的底物，优选的，所述底物可以是含木质纤维素作为唯一碳源的底物，例如植物残渣，如玉米芯残渣。已经发现以木质纤维素为底物生产乳酸时，马克斯克鲁维酵母具有更明显的优势，这是因为利用木质纤维素需要纤维素酶的消化，而纤维素酶的最适催化温度较高，在高温下进行同步糖化发酵(SSCF)的效率会明显提高(Zhang et al.，2013)。在一些实施方案中，在一些实施方案中，用于L-乳酸生产的底物可以是未经处理的底物或经处理的底物，例如经碱处理的底物，经热水水解的底物，经水解酶如菊粉酶、纤维素酶等处理的底物，与其他菌株如Aspergillus niger和Lactobacillus sp.共培养的底物，未补充或补充营养素如玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、大豆粕粉、棉籽粕粉、乳清等。在一些实施方案中，酵母工程菌株可以用于通过分批发酵或补料分批发酵生产L-乳酸。
在一些实施方案中，本发明提供一种生产L-乳酸的方法，所述方法包括将底物与本发明的L-乳酸生产酵母工程菌株接触以生产L-乳酸。在一些实施方案中，可以通过将所述酵母工程菌株与底物一起发酵来生产乳酸。在一些实施方案中，可以通过将底物和酵母工程菌株在酵母培养基中共培养来生产L-乳酸。在一些实施方案中，本发明的方法可以在高于30℃至高达47℃的温度进行，例如31℃以上，32℃以上，33℃以上，34℃以上，35℃以上，36℃以上，37℃以上，38℃以上，39℃以上，40℃以上，41℃以上，42℃以上，43℃以上，44℃以上，45℃以上，46℃以上，直至高达47℃或任何其间的温度进行。在一些实施方案中，所述底物可以是例如含木质纤维素、葡萄糖、木糖、半乳糖和菊糖中的任意一种或多种的底物，优选的，所述底物可以是含木质纤维素作为唯一碳源的底物，例如植物残渣，如玉米芯残渣。已经发现以木质纤维素为底物生产乳酸时，马克斯克鲁维酵母具有更明显的优势，这是因为利用木质纤维素需要纤维素酶的消化，而纤维素酶的最适催化温度较高，在高温下进行同步糖化发酵(SSCF)的效率会明显提高(Zhang et al.，2013)。在一些实施方案中，所述底物可以是未经处理的底物或经处理的底物，例如经碱处理的底物，经热水水解的底物，经水解酶如菊粉酶、纤维素酶等处理的底物，与其他菌株如Aspergillus niger和Lactobacillus sp.共培养的底物，未补充或补充营养素如玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、大豆粕粉、棉籽粕粉、乳清等。在一些实施方案中，本发明的方法可以通过分批发酵或补料分批发酵进行。
本发明的酵母工程菌株如异源表达L-乳酸脱氢酶基因尤其是疟原虫(Plasmodiumfalciparum)L-乳酸脱氢酶基因和/或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L-乳酸脱氢酶基因和任选地进一步敲除和/或重组表达本文描述的基因的酵母工程菌株具有有利的效果，例如能够提高L-乳酸产量、生产速率和/或产率，能够在较高温度例如42℃下高效发酵，大量快速生产高光学纯度的L-乳酸，能够利用含木质纤维素的底物为唯一碳源进行发酵生产乳酸。在一些实施方案中，本发明的酵母工程菌株与对照菌株(如其它酵母菌株或未重组表达所述基因的菌株)相比具有提高的L-乳酸的产量、生产速率和/或产率。在一些实施方案中，本发明的酵母工程菌株与对照菌株(如其它酵母菌株或未重组表达所述基因中的一种或多种的马克斯克鲁维酵母菌株)相比能够提高L-乳酸产量、生产速率和/或产率10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍)。在一些实施方案中，本发明的酵母工程菌株与对照菌株(如其它酵母菌株或未重组表达所述基因中的一种或多种的马克斯克鲁维酵母菌株)相比能够利用含木质纤维素的底物为唯一碳源进行发酵生产乳酸。在一些实施方案中，本发明的酵母工程菌株与对照菌株(如其它酵母菌株或未重组表达所述基因中的一种或多种的马克斯克鲁维酵母菌株)相比能够在较高温度例如在高于30℃至高达47℃的温度进行，例如31℃以上，32℃以上，33℃以上，34℃以上，35℃以上，36℃以上，37℃以上，38℃以上，39℃以上，40℃以上，41℃以上，42℃以上，43℃以上，44℃以上，45℃以上，46℃以上，直至高达47℃或任何其间的温度高效发酵，大量快速生产高光学纯度的L-乳酸。
本发明中L-乳酸脱氢酶基因和/或相关通路基因使得马克斯克鲁维酵母可以共利用葡萄糖和木糖大量生产L-乳酸。本发明改造菌株还可以利用含木质纤维素底物如玉米芯残渣作为唯一碳源进行发酵生产乳酸。因此，本发明的菌株在玉米芯残渣等生物质的工业利用上具备显著优势。
附图说明
图1.本发明中菌株的构建过程；
图2.本发明中构建的质粒图；
A.质粒pKX004；B.质粒pKX005；C.质粒pKX007；D.质粒pKX008；E.质粒pZJ055；F.质粒pKX010；G.质粒pKX022；H.质粒pKX018；I.质粒pKX055；
图3.本发明中构建的L-乳酸脱氢酶菌株利用80g/L葡萄糖和20g/L木糖在42℃条件下发酵生产L-乳酸的结果。A.菌株YKX012；B.菌株YKX013；C.菌株YKX014；D.菌株YKX016；E.菌株YKX017；F.菌株YKX019；
图4.本发明中以YKX019为基础进一步改造的菌株利用80g/L葡萄糖和20g/L木糖在42℃条件下发酵生产L-乳酸的结果。A.菌株YKX029；
B.菌株YKX049；C.菌株YKX055；D.菌株YKX071；
图5.本发明构建的菌株YKX071利用玉米芯残渣生产L-乳酸的结果。
保藏说明
本发明的能共利用葡萄糖和木糖和能够利用含木质纤维素底物如玉米芯残渣作为唯一碳源生产乳酸的耐热工程酵母菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YKX071已经于2018年8月1日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号分别为CGMCC No.16192。
具体实施方式
本发明成功获得高效表达疟原虫(Plasmodium falciparum)来源的L-乳酸脱氢酶基因或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的L-乳酸脱氢酶基因的马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株，并使其获得高效生产L-乳酸的能力。本发明的工程菌株可以表达上述两种乳酸脱氢酶基因，和表达马克斯克鲁维酵母果糖-6-磷酸激酶基因(KmPFK)，酿酒酵母的乳酸转运蛋白基因(ScJEN1)，敲除D-乳酸脱氢酶基因(KmDLD1)，能够在较高温度(例如42℃)下，高效共利用葡萄糖和木糖发酵，大量快速生产高光学纯度的L-乳酸。本发明酵母菌株还可以在例如42℃的条件下，快速高效的利用玉米芯为代表的木质纤维素发酵生产L-乳酸，产量和发酵速率都超过已报道的酵母菌株，为首个能利用木质纤维素类物质产乳酸的工程酵母。
在一些实施方案中，本发明构建了在较高温度下能够同时利用葡萄糖和木糖发酵的高效生产L-乳酸的马克斯克鲁维酵母菌株，其可以例如通过在马克斯克鲁维酵母中高效表达疟原虫和巨大芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因，马克斯克鲁维酵母的磷酸果糖激酶基因和酿酒酵母的乳酸转运蛋白基因，敲除马克斯克鲁维酵母的D-乳酸脱氢酶基因获得。在一些实施方案中，本发明在马克斯克鲁维酵母中过表达了人源、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸乳球菌、米根霉以及疟原虫的L-乳酸脱氢酶基因(PfLDH)，获得可以高产L-乳酸的工程菌株。在一些实施方案中，本发明将其中的D-乳酸脱氢酶基因(KmDLD1)敲除，之后再过表达巨大芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因(BmLDH)、酿酒酵母的乳酸转运蛋白基因(ScJEN1)和马克斯克鲁维酵母的磷酸果糖激酶基因(KmPFK)，构建了能以玉米芯残渣为底物同时利用葡萄糖和木糖大量生产L-乳酸的耐热工程酵母菌株。构建过程见图1。在一些实施方案中，本发明用于玉米芯残渣为代表的木质纤维素生物质发酵生产L-乳酸的应用菌株为YKX071。在一些实施方案中，本发明的菌株可直接对葡萄糖木糖共利用发酵生产L-乳酸。在一些实施方案中，本发明的菌株可以在高温下利用处理后的玉米芯水解液高产L-乳酸。上述耐热工程菌株YKX071已于2018年8月1日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，右边：100101)，其对应的保藏号分别为CGMCC No.16192(YKX071)(图1)。
在一些实施方案中，本发明提供一种能高效利用玉米芯残渣发酵的耐热工程酵母菌株，所述菌株可以通过下述方法得到：以敲除了丙酮酸脱羧酶基因和甘油-3磷酸脱氢酶基因的马克斯克鲁维酵母菌株(YZB058，CGMCC12755)作为宿主，并将疟原虫的L-乳酸脱氢酶基因，巨大芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因，获得能够高效利用葡萄糖和木糖生产L-乳酸的耐热工程酵母菌株。如本领域技术人员容易理解的，本领域技术人员也可以从野生型马克斯克鲁维酵母菌株先构建YZB058(参见表2和中国专利申请号201610836051.7的描述)，然后进一步构建本发明的酵母工程菌株。在一些实施方案中，可以进一步重组表达或敲除下游能够提高乳酸发酵的基因(如本文其它部分详述)。本发明获得的菌株能够以玉米芯残渣在42℃温度下发酵产生L-乳酸，此菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16192。
在一些实施方案中，本领域技术人员能够基于本文描述和本领域技术知识选择适当的载体，例如所述的耐热工程酵母菌株中L-乳酸脱氢酶和各种下游基因的重组表达的出发载体可以为pZJ042(Zhang et a1.，2015b)。
在一些实施方案中，本领域技术人员能够基于本文描述和本领域技术知识构建适当的质粒。例如，本发明中的各种质粒可以如下构建(表1)：
(1)为获得枯草芽孢杆菌(WB800N)、巨大芽孢杆菌(NBRC 15308)、乳酸乳球菌(CGMCC 1.1936)、米根霉(NBRC 4785)来源的L-乳酸脱氢酶(BsLDH(GenBank：AIY91587.1)、BmLDH(GenBank：OAD48763.1)、LlLDH(GenBank：CAL97714.1)、RoLDH(GenBank：AAF74436.1))，分别以它们的基因组为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物BsLDH--EcoRI-F(SEQ ID No.1)和BsLDH-NotI-R(SEQ ID No.2)，BmLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.3)和BmLDH-NotI-R(SEQ ID No.4)，LlLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.5)和LlLDH-NotI-R(SEQ ID No.6)，RoLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.7)和RoLDH-NotI-R(SEQ ID No.8)，进行PCR扩增，得到BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH的基因ORF的DNA片段。将BsLDH、BmLDH、LlLDH和pZJ042(Zhang et al.，2015b)载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，将RoLDH和pZJ042载体分别利用Not I进行单酶切，载体做去磷酸化，连接，从而获得包含BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH基因的表达质粒，命名pKX004、pKX005、pKX007、pKX008(即PKmPGK控制的BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH表达质粒)(图2A、B、C、D)。
(2)人源和疟原虫的L-乳酸脱氢酶(HsLDH(GenBank：MH682187)、PfLDH(GenBank：MH682186)基因分别由上海生工生物工程有限公司和无锡青兰生物科技有限公司分别合成并优化了密码子，合成的基因已插入到pUC57中。使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物HsLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.9)和HsLDH-NotI-R(SEQ ID No.10)，PfLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.11)和PfLDH-NotI-R(SEQ ID No.12)，分别进行PCR扩增，得到HsLDH和PfLDH的基因ORF的DNA片段。将HsLDH、PfLDH和pZJ042载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，连接，从而获得包含HsLDH、PfLDH基因的质粒，命名pZJ055、pKX010(即PKmPGK控制的HsLDH、PfLDH表达质粒)(图2E、F)。
(3)为获得马克斯克鲁维酵母的假定的D-乳酸脱氢酶(GenBank：BAP72413.1)的敲除框，以马克斯克鲁维酵母YZB58基因组为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物KmDLD1-F(SEQ ID No.13)和KmDLD1-R(SEQ ID No.14)，进行PCR扩增，得到基因KmDLD1。然后将基因KmDLD1插入pGEM-T-Easy载体，从而得到pKX021载体。以pKX021为模板，使用PrimeSTAR H S DNA聚合酶(大连宝生物)和引物T-KmDLD1-F(SEQ ID No.15)和T-KmDLD1-R(SEQ ID No.16)，进行PCR扩增，得到线性pKX021载体。再以YEUGAP为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物ScURA3-SmaI-F(SEQ ID No.17)和ScURA3-SmaI-R(SEQ ID No.18)，进行PCR扩增，得到ScURA3完整表达框(GenBank：AM697670.1(from2061 to 3158))。利用Sma I对ScURA3完整基因进行酶切，与得到的线性pKX021载体连接，从而获得质粒pKX022(图2G)。
(4)为获得酿酒酵母(ATCC 208352)的乳酸转运蛋白ScJEN1(GenBank：CAA82062.1)、马克斯克鲁维酵母YZB58的6-磷酸果糖激酶KmPFK(GenBank：BAP69515.1)的基因，分别以它们的基因组为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物ScJEN1-EcoRI-F(SEQ ID No.19)和ScJEN1-NotI-R(SEQ ID No.20)，KmPFK-NotI-F(SEQ IDNo.21)和KmPFK-NotI-R(SEQ ID No.22)，分别进行PCR扩增，得到基因ScJEN1和KmPFK的基因ORF的DNA片段。然后将ScJEN1基因和pZJ042载体分别利用EcoR I和Not I进行双酶切，将KmPFK和pZJ042载体分别利用Not I进行单酶切，载体做去磷酸化，连接，从而获得包含ScJEN1和KmPFK基因的质粒，命名pKX018、pKX055(即PKmPGK控制的ScJEN1、KmPFK表达质粒)(图2H、I)。
在一些实施方案中，用于构建所述的耐热工程酵母菌株的出发菌株为马克斯克鲁维酵母YZB058(CGMCC12755)，通过敲除其中的XYL1基因(木糖还原酶基因)和XYL2基因(木糖醇脱氢酶基因)，并重组表达粗糙脉孢霉的NcXYL1基因(木糖还原酶基因)和树干毕赤酵母的PsXYL2-ARS基因(木糖醇脱氢酶突变基因)重构木糖利用途径，过表达磷酸戊糖途径相关酶基因以防止葡萄糖抑制作用，再敲除PDC1基因(丙酮酸脱羧酶基因)和GPD1基因(甘油-3磷酸脱氢酶基因)，获得的丙酮酸积累的菌株。本领域技术人员能够基于本文描述和本领域技术知识适当地在马克斯克鲁维酵母中敲除和/或引入异源表达的目的基因。
在一些实施方案中，本发明所述的耐热工程酵母菌株表达的L-乳酸脱氢酶基因分别为疟原虫(Plasmodium falciparum)L-乳酸还原酶基因(PfLDH)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L-乳酸脱氢酶基因(BmLDH)。
在一些实施方案中，本发明所述的耐热工程酵母菌株中除了转入疟原虫和巨大芽孢杆菌的L-乳酸还原酶基因外，还重组表达下游的基因。
本领域技术人员能够基于本文描述和本领域技术知识适当地构建所述酵母工程菌株。例如可以通过下述方法构建所述的耐热工程酵母菌株(表2)：
以pMD18T-ΔScURA3(Zhang et al.，2015a)质粒为模板，以引物ScURA3-F(SEQ IDNo.23)和ScURA3-R(SEQ ID No.24)进行PCR扩增获得ScURA3敲除框，将ScURA3敲除片段转化入出发菌株YZB058中，敲除YZB058菌株内的ScURA3基因，获得菌株YKX001。
将含有马克斯克鲁维酵母来源的启动子(PKmPGK)控制的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸乳球菌、米根霉、人源、疟原虫的L-乳酸脱氢酶基因(BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH、HsLDH、PfLDH)的载体pKX004、pKX005、pKX007、pKX008、pZJ055、pKX010转化进YKX001中，命名为YKX013、YKX014、YKX016、YKX017、YKX012、YKX019。
然后将由pKX010质粒带入的ScURA3从YKX019中再次敲除后获得菌株YKX021。再将含有pKX022中的KmDLD1-T-ScURA3基因片段转入YKX021，从而敲除YKX021菌株内的KmDLD1，命名为YKX029。
然后将由pKX022质粒带入的ScURA3从YKX029中再次敲除后获得菌株YKX041。再将含有(由马克斯克鲁维酵母来源的启动子(PKmPGK)控制的)巨大芽孢杆菌L-乳酸脱氢酶基因(BmLDH)的质粒pKX005转入YKX041，从而获得菌株YKX049。
然后将由pKX005质粒带入的ScURA3从YKX049中再次敲除后获得菌株YKX054。再将含有(由马克斯克鲁维酵母来源的启动子(PKmPGK)控制的)酿酒酵母基因乳酸转运蛋白基因(ScJEN1)的质粒pKX018，转化进YKX054中，所得到的转化菌株命名为YKX055。
然后将由pKX018质粒带入的ScURA3从YKX055中再次敲除后获得菌株YKX056。再将含有(由马克斯克鲁维酵母来源的启动子(PKmPGK)控制的)马克斯克鲁维酵母果糖-6-磷酸激酶基因(KmPFK)的质粒pKX055转入YKX056，得到菌株YKX071。
在一些实施方案中，本发明涉及菌株YKX013、YKX014、YKX016、YKX017、YKX012、YKX019、YKX029、YKX049、YKX055、YKX071用于共利用葡萄糖和木糖生产L-乳酸的用途和方法。
在一些实施方案中，本发明涉及菌株YKX071直接利用玉米芯残渣生产L-乳酸的用途和方法。
优点和积极效果
本发明在马克斯克鲁维酵母中高效异源表达的L-乳酸脱氢酶，使得马克斯克鲁维酵母工程菌株在较高温度如42℃条件下共利用葡萄糖和木糖生产L-乳酸。本发明进一步对下游通路的基因进行工程改造，获得的菌株YKX071能够在高温条件下，很好的利用木质纤维素玉米芯残渣生产L-乳酸。这是首个能够利用木质纤维素类生物质-玉米芯残渣生产乳酸的酵母菌株。
本发明过表达疟原虫(Plasmodium falciparum)的LDH，使得构建的工程菌株在42℃时利用80g/L葡萄糖和20g/L木糖，生产50.00g/L L-乳酸，生产速率为1.04g/L/h(图3F)。本发明的最终菌株YKX071，在42℃摇瓶培养条件下，能在30小时利用80g/L葡萄糖和20g/L木糖，生产60.42g/L的L-乳酸，生产速率高达2.01g/L/h，产率为0.45g/g(图4D)。当使用木质纤维素作为唯一碳源进行发酵时，180g/L的玉米芯残渣被利用，通过同时糖化共利用生产101.17g/L的L-乳酸，生产速率为1.10g/L/h，产率为0.56g/g玉米芯残渣(图5)。
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
试剂和菌株：本发明中的所有实际均是市场购买的试剂级以上的试剂。其中，葡萄糖，木糖，酵母基本氮源，尿嘧啶，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，Solution I连接酶以购自于大连宝生物公司，pGEM-T-Easy载体购自Promega公司。大肠杆菌Escherichia coli XL10-gold菌株(美国加利福利亚Stratagene公司)及DH5α菌株作为DNA操作时使用的宿主菌，包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。葡萄糖合成培养基(葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶20mg/ml)主要用于转化。YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L细菌蛋白胨，20g/L葡萄糖)用于酵母前培养。
实施例1.菌株的制备：
1.本发明中的各种质粒载体的构建：
1)枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸乳球菌、米根霉来源的L-乳酸脱氢酶的基因表达质粒pKX004、pKX005、pKX007、pKX008的构建
从枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸乳球菌、米根霉各自的基因组扩增出BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH。分别插入到pZJ042载体的EcoR I和Not I位点，构建包含BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH的质粒pKX004、pKX005、pKX007、pKX008(图2)。
具体操作步骤如下：
(1)以上述各种菌的基因组为模板，以引物对BsLDH--EcoRI-F(SEQ ID No.1)和BsLDH-NotI-R(SEQ ID No.2)，BmLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.3)和BmLDH-NotI-R(SEQ IDNo.4)，LlLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.5)和LlLDH-NotI-R(SEQ ID No.6)，RoLDH-EcoRI-F(SEQID No.7)和RoLDH-NotI-R(SEQ ID No.8)，为引物对各自LDH进行PCR，得到基因LDH。
(2)以提取马克斯克鲁维酵母的基因组DNA的方法为例，其余基因组提取方法按上述说明进行更换，具体步骤为：
①取冻存菌划线，37℃培养箱培养24小时。
②挑取单克隆，接种于5ml液体培养基中，37℃摇床，250rpm培养过夜。
③12000rpm，离心1分钟，弃上清，收集菌体。
④取500μl无菌水重悬菌体，转移至1.5ml离心管中，12000rpm，离心1分钟，弃上清，收集菌体。
⑤加入200μl裂解缓冲液(EDTA(1mM)，TritonX-100(2％(w/v))，NaCl(100mM)，SDS(1％(w/v))，Tris-Cl(10mM，pH 8.0))重悬菌体。
⑥向其中加入0.3g玻璃珠(425-600nm，sigma，美国)和200μl酚氯仿溶液(25∶24∶1，pH 8.0)，高速涡旋震荡3分钟。
⑦再加入200μl 1x TE缓冲液(1mM EDTA，10mM Tris-Cl，pH 8.0)，快速轻微震荡30秒。
⑧12000rpm离心5分钟，将上层的水相转移至新的1.5ml离心管中，向其中加入1ml冰冷的无水乙醇，颠倒混匀。
⑨4℃，12000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用400μl 1x TE缓冲液重悬。
⑩向其中加入2μl 2ng/ml的RNA酶A(中国上海，生工生物)，37℃温浴5分钟。
Figure BDA0001799705040000131
加入40μl 3M醋酸钠(pH 5.2)和1ml冰冷的无水乙醇，颠倒混匀。
Figure BDA0001799705040000132
4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用1ml冰冷的75％乙醇清洗，再次离心去上清。
Figure BDA0001799705040000133
沉淀于室温下干燥10分钟，用40-100μl 1x TE缓冲液重悬，即为提取的酵母基因组DNA。
LDH的PCR体系：以枯草芽孢杆菌的L乳酸脱氢酶为例，其余基因组和引物按对应基因进行更换。
Figure BDA0001799705040000141
PCR程序：
Figure BDA0001799705040000142
(3)将PCR扩增得到的产物各种LDH与载体pZJ042分别利用EcoR I和Not I进行双酶切或Not I进行单酶切，载体去磷酸化，连接，获得包含LDH基因的质粒，命名为pKX004、pKX005、pKX007、pKX008。
①LDH酶切体系(构建RoLDH的表达载体pKX008时，只用Not I单酶切)：
Figure BDA0001799705040000143
37℃过夜
②pZJ042载体酶切体系(构建RoLDH的表达载体pKX008时，只用Not I单酶切)：
Figure BDA0001799705040000151
37℃过夜，再向其中加入10μl Fast AP，37℃，1小时
③LDH和pZJ042载体的连接体系：
Figure BDA0001799705040000152
16℃，过夜
④将获得的插入了BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH的pZJ042质粒，分别命名为pKX004、pKX005、pKX007、pKX008(图2)。
2)人源和疟原虫的L-乳酸脱氢酶的基因表达载体的构建
首先由上海生工生物工程有限公司和无锡青兰生物科技有限公司分别合成并优化人源和疟原虫的基因，插入到pUC57中。接下来与巨大芽孢杆菌等的L-乳酸脱氢酶基因扩增的方法相同，仅将模板换成含有人源或疟原虫的基因(HsLDH和PfLDH)DNA的质粒。它们对应的DNA为人源HsLDH、疟原虫PfLDH。对应的引物为引物对HsLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.9)和HsLDH-NotI-R(SEQ ID No.10)，PfLDH-EcoRI-F(SEQ ID No.11)和PfLDH-NotI-R(SEQ IDNo.12)。扩增产物插入到pZJ042载体的EcoR I和Not I位点，构建包含HsLDH、PfLDH的质粒pZJ055、pKX010(图2)。
具体操作步骤与构建pKX004等质粒相同。
3).pKX022质粒的构建：
以马克斯克鲁维酵母YZB058基因组为模板，PCR获得KmDLD1基因。然后将基因插入到pGEM-T-Easy载体，得到pKX021质粒。以pKX021质粒为模板，进行PCR扩增，得到线性pKX021载体。再以YEUGAP为模板，扩增得到ScURA3完整表达框(GenBank：AM697670.1(from2061to 3158))，用Sma I对其进行酶切，与得到的线性pKX021载体连接，从而获得质粒pKX022(图2)。
具有操作如下：
(1)基因组提取方法和1)(2)中相同。
(2)以马克斯克鲁维酵母YZB058基因组为模板，使用PrimeSTARHS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物KmDLD1-F(SEQ ID No.13)和KmDLD1-R(SEQ ID No.14)进行PCR扩增，获得KmDLD1基因。然后将KmDLD1基因插入到pGEM-T-Easy载体，从而获得pKX021载体。
①KmDLD1的PCR扩增体系与L-乳酸脱氢酶的扩增体系和条件一致。：
②得到KmDLD1后，在DNA末端分别加碱基“A”，再插入pGEM-T-Easy载体中。
加A体系：
Figure BDA0001799705040000161
TA克隆连接体系：
Figure BDA0001799705040000162
Figure BDA0001799705040000171
16℃，1小时
③连接获得的质粒即为pKX021.
(3)以pKX021为模板，以PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物T-KmDLD1-F(SEQ ID No.15)和T-KmDLD1-R(SEQ ID No.16)进行PCR，获得线性pKX021质粒；以yEUGAP作为模板，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物ScURA3-SmaI-F(SEQ IDNo.17)和ScURA3-SmaI-R(SEQ ID No.18)，PCR扩增获得ScURA3的完整表达框。再将获得的ScURA3完整表达框用Sma I进行酶切，与线性pKX021质粒进行连接，获得质粒pKX022。
①线性pKX021质粒的扩增：
以pKX021质粒为模板，以T-KmDLD1-F(SEQ ID No.15)和T-KmDLD1-R(SEQ IDNo.16为引物，其他条件和L-乳酸脱氢酶基因的PCR反应体系和条件一致，但72℃延伸时间为4分钟。
②ScURA3完整表达框的扩增：
以yEUGAP质粒为模板，以ScURA3-SmaI-F(SEQ ID No.17)和ScURA3-SmaI-R(SEQID No.18)为引物，其他PCR反应体系和条件与L-乳酸脱氢酶基因的PCR反应体系和条件一致。
③ScURA3完整表达框的酶切体系：
Figure BDA0001799705040000172
30℃，过夜
④线性pKX021质粒与ScURA3完整表达框的连接体系：
Figure BDA0001799705040000181
16℃，温浴1小时
⑤将获得的含有ScURA3完整表达框的KmDLD1敲除质粒，命名为pKX022。
4).ScJEN1、KmPFK基因的表达质粒载体的构建：
以酿酒酵母(ATCC 208352)、马克斯克鲁维酵母YZB058基因组DNA分别为模板，以引物对ScJEN1-EcoRI-F(SEQ ID No.19)和ScJEN1-NotI-R(SEQ ID No.20)，KmPFK-NotI-F(SEQ ID No.21)和KmPFK-NotI-R(SEQ ID No.22)为引物进行PCR扩增，得到基因ScJEN1、KmPFK的DNA片段。PCR反应体系和条件与L-乳酸脱氢酶基因DNA扩增条件一致。将ScJEN1、KmPFK分别插入到pZJ042载体的EcoR I和Not I位点，构建包含ScJEN1、KmPFK的质粒pKX018、pKX055(图2)。构建过程与构建L-乳酸脱氢酶基因表达载体的过程相同。获得包含ScJEN1、KmPFK基因的质粒，分别命名为pKX018、pKX055。
2.共利用葡萄糖和木糖高效发酵的马克斯克鲁维酵母菌株的构建：
以马克斯克鲁维酵母YZB058作为出发菌(具体可参见(Zhang et al.，2017))，将上述乳酸脱氢酶的表达载体通过下面方法转入此菌株，获得最高乳酸生产菌后，再进一步进行工程改造。。
1)马克斯克鲁维酵母的化学转化的步骤：
i.将待改造菌株在YPD平板上划线，在37℃培养箱培养24小时。
ii.从划线平板上挑取单克隆接种与5ml液体YPD培养基，37℃摇床，250rpm培养过夜。
iii.取500μl过夜培养的菌液，接入5ml新鲜的YPD培养基中，37℃摇床，250rpm培养4小时。
iv.将菌液5000rpm离心3分钟，弃上清，收集菌体。
v.配制1ml的转化缓冲液：50％PEG4000 800μl
i.4M醋酸锂 50μl
ii.1M DTT 50μl
iii.ddH2O 100μl
vi.吸取150μl的转化缓冲液重悬菌体，并转移至1.5ml离心管中，5000rpm，迅速离心5秒，弃上清。
vii吸取100μl的转化缓冲液再次重悬菌体，向其中加入5μl的线性化质粒，混匀。
viii.混合液置于47℃水浴锅中，水浴热激15分钟。
ix.取出混合液，向其中加入100μl SD液体培养基，涡旋震荡30秒。
x.将混合液均匀涂布于筛选用的合成培养基上，37℃培养箱中，倒置培养3-4天。
xi.将平板上的单克隆划线于新的同种平板上，二次筛选。
xii.挑取划线生长的单克隆，于液体YPD培养基中培养，菌落PCR验证转化结果。
2)构建本发明中各马克斯克鲁维酵母表达菌株(表2)的具体过程：
以pMD18T-ScURA3敲除质粒为模板进行PCR，扩增获得ScURA3敲除框片段，将ScURA3敲除框按上述方法转化到出发菌株YZB058中，将YZB058菌株中的ScURA3基因通过同源重组敲除，使其失去自主合成尿嘧啶的能力。在含有5’-FOA和尿嘧啶的合成培养基(配方：6.7g/L酵母基本氮源，20g/L葡萄糖，2mg/ml尿嘧啶，15g/L琼脂)平板上进行筛选，获得ScURA3缺陷菌株，命名为YKX001。
用Sma I酶切质粒pKX004、pKX005、pKX007、pKX008、pZJ055、pKX010质粒。将酶切产物按上述方法分别转化至YKX001中，使菌株获得ScURA3基因，恢复合成尿嘧啶的能力，以此进行筛选，获得含有BsLDH、BmLDH、LlLDH、RoLDH、HsLDH、PfLDH基因的菌株。在没有尿嘧啶的合成培养基平板上进行筛选(配方：6.7g/L酵母基本氮源，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂)，获得的阳性克隆命名为YKX013、YKX014、YKX016、YKX017、YKX012、YKX019。
再将菌株YKX019中的ScURA3，按YZB058中ScURA3敲除的同样方法获得ScURA3缺陷菌株，命名为YKX021。
以pKX022质粒为模板进行PCR，扩增获得KmDLD1-T-ScURA3敲除框。将KmDLD1-T-ScURA3敲除框转化入YKX021中，通过同源重组敲除菌株内的KmDLD1基因，同时使菌株恢复ScURA3基因的功能。在合成培养基平板上进行筛选，获得的阳性克隆命名为YKX029。
再将菌株YKX029中的ScURA3，按YZB058中ScURA3敲除的同样方法敲除ScURA3基因再次获得ScURA3缺陷菌株，命名为YKX041。
用Sma I酶切pKX005质粒。将酶切产物转化至YKX041中，在无尿嘧啶的合成培养基上进行筛选，获得表达BmLDH基因的菌株命名为YKX049。
再将菌株YKX049中的ScURA3，按YZB058中ScURA3敲除的同样方法敲除ScUR43基因再次获得ScURA3缺陷菌株，命名为YKX054。
用Sma I酶切pKX018质粒。将酶切产物转化至YKX054中，在无尿嘧啶的合成培养基上进行筛选，获得表达ScJEN1基因的菌株命名为YKX055。
再将菌株YKX055中的ScURA3，按YZB058中ScURA3敲除的同样方法敲除ScURA3基因再次获得ScURA3缺陷菌株，命名为YKX056。
用Sma I酶切pKX055质粒。将酶切产物转化至YKX056中，在无尿嘧啶的合成培养基上进行筛选，获得表达KmPFK基因的菌株。在合成培养基平板上进行筛选，获得的阳性克隆命名为YKX071。
3)菌落PCR鉴定转化的阳性酵母菌株
在合成培养基上筛选到的克隆需通过菌落PCR鉴定确认目的基因也进入了细胞中。过程如下：将获得的单克隆菌体挑取部分至PCR反应体系中，通过PCR鉴定基因型(以表达PfLDH基因的YKX019为例，其他的基因引物不同)。
YKX019中的PfLDH基因的菌落PCR体系：
Figure BDA0001799705040000211
用牙签挑取少量酵母细胞到反应液中。
菌落PCR反应程序：
Figure BDA0001799705040000212
其他基因转化的阳性酵母菌株的基因鉴定方法同上，通过菌落PCR验证。如上所述，通过特异性引物PCR扩增，获得对应基因长度的条带的菌株，就是阳性克隆，即可用于下一步实验。
实施例2.含有不同基因的工程菌株在高温下发酵的情况
该实施例用于比较本发明中构建的含有不同基因的菌株共利用葡萄糖和木糖生产L-乳酸的效果。结果表明所有工程基因中，菌株YKX071共利用葡萄糖和木糖生产L-乳酸的效果最好。
1.在YPD固体培养基平板上复苏所有冻存菌株：YKX013、YKX014、YKX016、YKX017、YKX012、YKX019，YKX029，YKX049，YKX055，YKX071。37℃培养箱倒置培养24小时。
2.分别挑取单克隆，接种于5ml YPD液体培养基。37℃摇床，250rpm培养过夜。
3. 250ml锥形瓶中配置30瓶30ml YPDX液体培养基。YPDX配方：10g/L酵母提取物，20g/L细菌蛋白胨，80g/L葡萄糖，20g/L木糖。灭菌待用。
4.所有菌种分别转接于30ml YPDX液体培养基中，使初始OD600均为1，各3个平行，在42℃摇床，250rpm培养。
5.在0小时，6小时，12小时，18小时，24小时，30小时，36小时，42小时，48小时，54小时，63小时分别取样，并在12000rpm离心10分钟，取上清通过HPLC检测分析(图3)。
6.从图3、4可知，在42℃，葡萄糖和木糖共同作为碳源的YP培养基的培养条件下，PfLDH转入菌的L-乳酸产量最高，BmLDH转入菌次之，其余L-乳酸脱氢酶转入菌效果明显不如前两者；以表达PfLDH基因的YKX019菌株为基础，敲除KmDLD1基因，过表达ScJEN1、BmLDH和KmPFK基因的菌株YKX071共利用葡萄糖木糖生产了60.42g/L L-乳酸，速率2.01g/L/h，效果最好。
实施例3.YKX071菌株对玉米芯的利用情况
该实施例用于验证最终菌株YKX071能否以碱处理后的玉米芯残渣作为唯一碳源发酵生产L-乳酸。
1.在YPD固体培养基平板上复苏冻存菌株YKX071，37℃培养箱倒置培养24小时。
2.挑取单克隆，接种于50ml YPD液体培养基。37℃摇床，250rpm培养过夜。
3.配置500ml发酵培养基，装与1L发酵罐中。配方：10g/L酵母提取物，20g/L细菌蛋白胨，180g/L碱处理玉米芯残渣。灭菌待用。
4.将菌种转接于500ml发酵培养基中，使初始OD600为1，同时按15FPU/g玉米芯残渣的比例加入纤维素酶，42℃，250rpm，通氧量0.5vvm条件下发酵培养。
5.隔段时间取样，并在12000rpm离心10分钟，取上清通过HPLC检测分析(图5)。
6.从图5可知，在发酵罐培养条件下，YKX071能够以碱处理后的玉米芯残渣作为唯一碳源发酵生产101.17g/L L-乳酸。
Figure BDA0001799705040000231
Figure BDA0001799705040000241
Figure BDA0001799705040000251
Figure BDA0001799705040000261
参考文献：
Bae，J.H.，Kim，H.J.，Kim，M.J.，Sung，B.H.，Jeon，J.H.，Kim，H.S.，Jin，Y.S.，Kweon，D.H.，Sohn，J.H.2018.Direct fermentation of Jerusalem artichoke tuberpowder for production of l-lactic acid and d-lactic acid by metabolicallyengineered Kluyveromyces marxianus.J Biotechnol，266，27-33.
Baek，S.-H.，Kwon，E.Y.，Kim，S.-Y.，Hahn，J.-S.2016a.GSF2 deletionincreases lactic acid production by alleviating glucose repression inSaccharomyces cerevisiae.5cientific Reports，6(1).
Baek，S.H.，Kwon，E.Y.，Kim，Y.H.，Hahn，J.S.2016b.Metabolic engineering andadaptive evolution for efficient prod uction of D-lactic acid inSaccharomyces cerevisiae.Appl MicrobiolBiotechnol，100(6)，2737-48.
Bai，Z.，Gao，Z.，Sun，J.，Wu，B.，He，B.2016.D-Lactic acid production bySporolactobacillus inulinus YBS1-5with simultaneous utilization of cottonseedmeal and corncob residue.Bioresour Technol，207，346-52.
Castillo Martinez，F.A.，Balciunas，E.M.，Salgado，J.M.，Domínguez González，J.M.，Converti，A.，Oliveira，R.P.d.S.2013.Lactic acid properties，applications and production：Areview.Trends Food Sci.Technol.，30(1)，70-83.
Fonseca，G.G.，Heinzle，E.，Wittmann，C.，Gombert，A.K.2008.The yeastKluyveromyces marxianus and its biotechnological potential.Appl MicrobiolBiotechnol，79(3)，339-54.
Hause，B.，Rajgarhia，V.，Suomihen，P.2003.Methods and materials for theproduction of L-lactic acid in yeast
Hong，J.，Wang，Y.，Kumagai，H.，Tamaki，H.2007.Construction ofthermotolerant yeast expressing thermostable cellulase genes.Journal ofBiotechnology，130(2)，114-123.
Ikushima，S.，Fujii，T.，Kobayashi，O.，Yoshida，S.，Yoshida，A.2009.GeneticEngineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-LacticAcid.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，73(8)，1818-1824.
Ilmen，M.，Koivuranta，K.，Ruohonen，L.，Suominen，P.，Penttila，M.2007.Efficient production of L-lactic acid from xylose by Pichia stipitis.Appl.Environ.Microbiol.，73(1)，117-23.
lshida，N.，Saitoh，S.，Ohnishi，T.，Tokuhiro，K.，Nagamori，E.，Kitamoto，K.，Takahashi，H.2006a.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae forefficient production of pure L-(+)-lactic acid.Applied Biochemisfry andBiotechno/ogy，131(1-3)，795-807.
Ishida，N.，Saitoh，S.，Onishi，T.，Tokuhiro，K.，Nagamori，E.，Kitamoto，K.，Takahashi，H.2006b.The effect of pyruvate decarboxylase gene knockout inSaccharomycescerevisiae on L-lactic acid production.Bioscience Biotechnologyand Biochemistry，70(5)，1148-1153.
Ishida，N.，Suzuki，T.，Tokuhiro，K.，Nagamori，E.，Onishi，T.，Saitoh，S.，Kitamoto，K.，Takahashi，H.2006c.D-lactic acid production by metabolicallyengineered Saccharomyces cerevisiae.Journal of Bioscience and Bioengineering，101(2)，172-177.
Ju Young Lee，C.D.K.，SeungHyun Lee，Young Kyoung Park，Kwang MyungCho.2015.Engineering Cellular Redox Balance in Saccharomyces cerevisiae forImproved Production of L-Lactic Acid.Biotechnology and Bioengineering，112(4)，751-758.
Marjallmén1，K.K.，Laura Ruohonen，Vineet Rajgarhia，Pirkko Suominen andMerja
Figure BDA0001799705040000281
.2013.Production of L-lactic acid by the yeast Candida sonorensisexpressingHeterologous bacterial and fungal lactate dehydrogenases.MicrobialCell Factories，12(53).
Miller，C.，Fosmer，A.，Rush，B.，McMullin，T.，Beacom，D.，Suominen，P.2011.Industrial Production of Lactic Acid.Bio-Based Chemicals，179-188.
Pentjuss，A.，Stalidzans，E.，Liepins，J.，Kokina，A.，Martynova，J.，Zikmanis，P.，Mozga，l.，Scherbaka，R.，Hartman，H.，Poolman，M.G.，Fell，D.A.，Vigants，A.2017.Model-based biotechnological potential analysis of Kluyveromycesmarxianus central metabolism.J lnd Microbiol Biotechnol，44(8)，1177-1190.
Samanta，A.K.，Senani，S.，Kolte，A.P.，Sridhar，M.，Sampath，K.T.，Jayapal，N.，Devi，A.2012.Production and in vitro evaluation of xylooligosaccharidesgenerated from corn cobs.Food and Bioproducts Processing，90(3)，466-474.
Song，J.Y.，Park，J.S.，Kang，C.D.，Cho，H.Y.，Yang，D.，Lee，S.，Cho，K.M.2016.Introduction of a bacterial acetyl-CoA synthesis pathway improveslactic acid production inSaccharomyces cerevisiae.Metab Eng，35，38-45.
Tamakawa，H.，Ikushima，S.，Yoshida，S.2012.Efficient production of L-lactic acid from xylose by a recombinant Candida utilis strain.J BiosciBioeng，113(1)，73-5.
Tokuhiro，K.，lshida，N.，Nagamori，E.，Saitoh，S.，Onishi，T.，Kondo，A.，Takahashi，H.2009.Double mutation of the PDC1 and ADH1 genes improves lactateproduction in the yeast Saccharomyces cerevisiae expressing the bovinelactate dehydrogenase gene.Applied Microbiology and Biotechnology，82(5)，883-890.
Turner，T.L.，Zhang，G.C.，Kim，S.，Subramaniam，V.，Steffen，D.，Skory，C.D.，Jang，J.Y.，Yu，B.J.，Jin，Y.S.2015.Lactic acid production from xylose byengineered Saccharomyces cerevisiae without PDC or ADH deletion.AppliedMicrobiology and Biotechnology，99(19)，8023-8033.
Turner，T.L.，Zhang，G.C.，Oh，E.J.，Subramaniam，V.，Adiputra，A.，Subramaniam，V.，Skory，C.D.，Jang，J.Y.，Yu，B.J.，Park，l.，Jin，Y.S.2016.Lactic acidproduction from cellobiose and xylose by engineered Saccharomycescerevisiae.Biotechnol.Bioeng.，113(5)，1075-1083.
Vera Novy，B.B.，Gerdt
Figure BDA0001799705040000282
uller，Bernd Nidetzky.2017.Toward“Homolactic”Fermentation of Glucose and Xylose by Engineered SaccharomycescerevisiaeHarboring a Kinetically Efficient L-Lactate Dehydrogenase Withinpdcl-pdc5 Deletion Background.Biotechnology and Bioengineering，114(1).
Yamada，R.，Wakita，K.，Mitsui，R.，Ogino，H.2017.Enhanced d-lactic acidproduction by recombinant Saccharomyces cerevisiae following optimization ofthe global metabolic pathway.Biotechnol Bioeng.
Zhang，B.，Li，L.，Zhang，J.，Gao，X.，Wang，D.，Hong，J.2013.lmproving ethanoland xylitol fermentation at elevated temperature through substitution ofxylose reductase in Kluyveromyces marxianus.J lnd Microbiol Biotechnol，40(3-4)，305-16.
Zhang，B.，Zhang，J.，Wang，D.，Han，R.，Ding，R.，Gao，X.，Sun，L.，Hong，J.2016.Simultaneous fermentation of glucose and xylose at elevatedtemperatures co-produces ethanol and xylitol through overexpression of axylose-specific transporter in engineered Kluyveromycesmarxianus.Bioresour.Technol.，216，227-237.
Zhang，B.，Zhu，Y.，Zhang，J.，Wang，D.，Sun，L.，Hong，J.2017.EngineeredKluyveromyces marxianus for pyruvate production at elevated temperature withsimultaneous consumption of xylose and glucose.Bioresour Technol，224，553-562.
Zhang，J.，Zhang，B.，Wang，D.，Gao，X.，Hong，J.2015a.lmproving xylitolproduction at elevated temperature with engineered Kluyveromyces marxianusthrough over-expressing transporters.Bioresour Technol，175，642-5.
Zhang，J.，Zhang，B.，Wang，D.M.，Gao，X.L.，Hong，J.2014.Xylitol productionatHigh temperature by engineered Kluyveromyces marxianus.BioresourceTechnology，152，192-201.
Zhang，J.，Zhang，B.，Wang，D.M.，Gao，X.L.，Sun，L.H.，Hong，J.2015b.Rapidethanol production at elevated temperatures by engineered thermotolerantKluyveromyces marxianus via the NADP(H)-preferring xylose reductase-xylitoldehydrogenase pathway.Metabolic Engineering，31，140-152.
Zhang，L.，Li，X.，Yong，Q.，Yang，S.-T.，Ouyang，J.，Yu，S.2015c.Simultaneoussaccharification and fermentation of xvlo-oligosaccharides manufacturingwaste residue for l-lactic acid production by Rhizopus oryzae.BiochemicalEngineering Journal，94，92-99.

Claims (20)

1.一种L-乳酸生产酵母工程菌株，所述酵母工程菌株为重组表达疟原虫(Plasmodiumfalciparum)L-乳酸脱氢酶基因PfLDH的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)工程菌株，其中所述酵母工程菌株的D-乳酸脱氢酶基因KmDLD1被敲除，所述酵母工程菌株进一步重组表达下述基因二者：马克斯克鲁维酵母果糖-6-磷酸激酶基因KmPFK和酿酒酵母的乳酸转运蛋白基因ScJEN1，其中所述酵母工程菌株的丙酮酸脱羧酶基因KmPDC1和甘油-3磷酸脱氢酶基因KmGPD1被敲除，其中所述酵母工程菌株的木糖还原酶基因KmXYL1和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2被敲除，并重组表达粗糙脉孢霉木糖还原酶基因NcXYL1和树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS。
2.一种L-乳酸生产酵母工程菌株，其于2018年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.16192。
3.一种构建权利要求1或2所述的L-乳酸生产酵母工程菌株的方法，所述方法包括在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)工程菌株中重组表达疟原虫(Plasmodiumfalciparum)L-乳酸脱氢酶基因PfLDH，敲除D-乳酸脱氢酶基因KmDLD1，进一步重组表达下述基因二者：马克斯克鲁维酵母果糖-6-磷酸激酶基因KmPFK和酿酒酵母的乳酸转运蛋白基因ScJEN1，敲除丙酮酸脱羧酶基因KmPDC1和甘油-3磷酸脱氢酶基因KmGPD1，敲除木糖还原酶基因KmXYL1和木糖醇脱氢酶基因KmXYL2，并重组表达粗糙脉孢霉木糖还原酶基因NcXYL1和树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶突变基因PsXYL2-ARS，从而获得L-乳酸生产酵母工程菌株。
4.权利要求3所述的方法，其中以野生型马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)或工程改造的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)为出发菌株构建所述L-乳酸生产酵母工程菌株。
5.权利要求4所述的方法，其中工程改造的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)为马克斯克鲁维酵母YZB058。
6.权利要求3-5中任一项所述的方法，其中通过表达质粒重组表达所述基因。
7.权利要求6所述的方法，其中使用马克斯克鲁维酵母来源的启动子通过表达质粒重组表达所述基因。
8.权利要求7所述的方法，其中使用马克斯克鲁维酵母来源的KmPGK启动子、KmTEF1启动子、KmURA3启动子、KmADH启动子通过表达质粒重组表达所述基因。
9.权利要求6所述的方法，其中使用酿酒酵母来源的启动子通过表达质粒重组表达所述基因。
10.权利要求9所述的方法，其中使用酿酒酵母来源的PGK启动子、TEF1启动子、GAL1启动子、TDH3启动子、ADH启动子通过表达质粒重组表达所述基因。
11.权利要求1或2所述的L-乳酸生产酵母工程菌株用于L-乳酸生产的用途。
12.一种生产L-乳酸的方法，所述方法包括将底物与权利要求1或2所述的L-乳酸生产酵母工程菌株接触以生产L-乳酸。
13.权利要求12所述的方法，其中所述方法还具备下述一种或多种特征：1)所述方法在高于30℃并且在47℃以下的温度进行，2)所述底物是含木质纤维素、葡萄糖、木糖、半乳糖和菊糖中的一种或多种的底物，3)所述底物为未经处理的底物或为经处理的底物，和4)所述方法通过分批发酵或补料分批发酵进行。
14.权利要求12所述的方法，其中所述方法在31℃至47℃的温度进行。
15.权利要求12所述的方法，其中所述底物是含木质纤维素作为唯一碳源的底物。
16.权利要求12所述的方法，其中所述底物为经碱处理的底物，经热水水解的底物，经水解酶处理的底物，与Aspergillus niger和Lactobacillus sp.共培养的底物，或未补充或补充营养素的底物。
17.权利要求12所述的方法，其中所述底物为植物残渣。
18.权利要求17所述的方法，其中所述底物为玉米芯残渣。
19.权利要求16所述的方法，其中所述底物为经菊粉酶或纤维素酶处理的底物。
20.权利要求16所述的方法，其中所述底物为补充玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、大豆粕粉、棉籽粕粉、或乳清的底物。
CN201811079846.3A 2018-09-14 2018-09-14 L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用 Active CN109266565B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811079846.3A CN109266565B (zh) 2018-09-14 2018-09-14 L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811079846.3A CN109266565B (zh) 2018-09-14 2018-09-14 L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109266565A CN109266565A (zh) 2019-01-25
CN109266565B true CN109266565B (zh) 2022-05-13

Family

ID=65189514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811079846.3A Active CN109266565B (zh) 2018-09-14 2018-09-14 L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109266565B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111440733A (zh) * 2020-02-07 2020-07-24 天津大学 产松油醇的重组酿酒酵母及构建方法及应用
CN113430127B (zh) * 2021-07-07 2024-01-12 江南大学 一种产l-乳酸的重组菌及其应用
CN117264791B (zh) * 2023-03-19 2024-06-18 复旦大学 高效表达外源蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104164375A (zh) * 2014-08-04 2014-11-26 中国科学技术大学 乙醇高温高产工程菌株的构建及应用
CN106318879A (zh) * 2016-09-20 2017-01-11 中国科学技术大学 丙酮酸高温高产工程菌株及其应用
CN108004274A (zh) * 2018-01-19 2018-05-08 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104164375A (zh) * 2014-08-04 2014-11-26 中国科学技术大学 乙醇高温高产工程菌株的构建及应用
CN106318879A (zh) * 2016-09-20 2017-01-11 中国科学技术大学 丙酮酸高温高产工程菌株及其应用
CN108004274A (zh) * 2018-01-19 2018-05-08 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 一种酿酒酵母发酵生产丙烯酸的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Douglas C. Pecota等.Sequential gene integration for the engineering of Kluyveromyces marxianus.《Journal of Biotechnology》.2007,第127卷 *
Lactic acid production in Saccharomyces cerevisiae is modulated by expression of the monocarboxylate transporters Jen1 and Ady2;António Pacheco等;《FEMS Yeast Research》;20120531;第 12卷(第 3期);摘要 *
Sequential gene integration for the engineering of Kluyveromyces marxianus;Douglas C. Pecota等;《Journal of Biotechnology》;20071231;第127卷;摘要，材料和方法 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109266565A (zh) 2019-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kong et al. Efficient L-lactic acid production from corncob residue using metabolically engineered thermo-tolerant yeast
CN106978360B (zh) 一株高产纤维素酶里氏木霉重组菌株及其应用
JP6087854B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
CN109266565B (zh) L-乳酸生产的耐热酵母工程菌株的构建及应用
AU2017383475B2 (en) Genetically engineered candida utilis capable of degrading and utilizing kitchen waste and construction method therefor
CN104718290A (zh) 木糖异构酶及其用途
CN107384815B (zh) 一株酿酒酵母菌株及其在综合利用木糖母液和木糖渣产木糖醇中的应用
Li et al. Ethanol production from inulin and unsterilized meal of Jerusalem artichoke tubers by Saccharomyces sp. W0 expressing the endo-inulinase gene from Arthrobacter sp.
CN104164375A (zh) 乙醇高温高产工程菌株的构建及应用
CN108913610B (zh) 共利用葡萄糖和木糖产生木糖醇的工程菌株的构建及应用
JP2010239925A (ja) キシロースを利用して有用物質を生産する方法
Xie et al. Saccharomycopsis fibuligera in liquor production: A review
US8323952B2 (en) Alcoholic xylose fermentation at high temperatures by the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha
Tolieng et al. Diversity of yeasts and their ethanol production at high temperature
Chang et al. A thermo-and toxin-tolerant kefir yeast for biorefinery and biofuel production
CN105368730B (zh) 一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法
Yuan et al. Improved ethanol production in Jerusalem artichoke tubers by overexpression of inulinase gene in Kluyveromyces marxianus
CN105624051B (zh) 基于进化工程构建的木糖发酵酵母菌株及构建方法
CN101463328A (zh) 一株利用木糖发酵产乙醇的代谢工程酵母菌
CN111088177B (zh) 高温好氧条件下产甘油的耐热酵母工程菌的构建及其应用
JP5813977B2 (ja) Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
CN106318879B (zh) 丙酮酸高温高产工程菌株及其应用
CN105062907B (zh) 木糖醇和乙醇同时高温高产工程菌株的构建及应用
CN111662832A (zh) 一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株的构建方法和应用
CN109609540B (zh) 重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant