CN104718290A

CN104718290A - 木糖异构酶及其用途

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Publication number: CN104718290A
Application number: CN201380045597.5A
Authority: CN
Inventors: 小大卫·尼尔·努恩; 彼得·卢京比尔; 李陵; 亚当·马丁·布尔扎; 约恩·彼得·弗拉施·巴特内克
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-06-17
Also published as: US20160017310A1; WO2014018552A1; DK2877576T3; US20150203835A1; US20140186884A1; EP2877576B1; US10053684B2; CA2879680A1; US9982249B2; EP2877576A1; BR112015001344A2; US9090889B2

Abstract

本公开涉及新的木糖异构酶及其用途，特别是在利用含木糖培养基的发酵过程中的用途。

Description

木糖异构酶及其用途

背景技术

从植物材料例如甘蔗有效、商业化地生产生物燃料需要戊糖例如木糖的发酵。植物材料中的木糖通常来自于木质纤维素，所述木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素构成的基质。木质纤维素通过酸水解或酶反应被分解，产生木糖以及其他单糖例如葡萄糖(Maki等，2009,Int.J.Biol.Sci.5:500-516)。

真菌、特别是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，是将糖发酵成生物燃料例如乙醇的商业上相关的微生物。然而，啤酒糖酵母(S.cerevisiae)并非内源地代谢木糖，其需要允许它将木糖转变成木酮糖的遗传修饰。在乙醇生产中的有用性受限的其他生物体能够代谢木糖(Nevigot,2008,Micobiol.Mol.Biol.Rev.72:379-412)。

在微生物中已鉴定到将木糖代谢成木酮糖的两条途径：木糖还原酶(XR，EC 1.1.1.307)/木糖醇脱氢酶(XDH，EC 1.1.1.9、1.1.1.10和1.1.1.B19)途径，以及木糖异构酶(XI，EC 5.3.1.5)途径。将XR/XDH途径用于木糖代谢引起辅因子失衡(过量的NADH和NADP+)，这限制了该途径用于乙醇生产的潜在产量。另一方面，XI途径在单一步骤中将木糖转变成木酮糖，并且不引起辅因子失衡(Young等，2010,Biotechnol.Biofuels 3:24-36)。

由于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)不具有本源(native)XI，因此希望搜索另一种生物体中的XI以插入到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中，用于生物燃料生产目的。已经发现了数种XI基因，但是共同的问题是在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达后酶活性很低或没有酶活性。来自于梨囊鞭菌属物种(Piromyces sp.)E2的XI是第一种在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中异源表达的且可以观察到酶活性的XI(WO03/062430)。

发明内容

由于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的生理学和商业化生物燃料生产的过程，在商业上有用的XI中除了活性之外还存在其他有价值的特性。在发酵期间，酵母细胞及其环境的pH可以变得更加酸性(Rosa和Sa-Correia，1991，Appl.Environ.Microbiol.57:830-835)。因此，XI在酸性环境中发挥作用的能力是非常合乎需要的。因此，为了在更广泛的商业上相关的条件下生产生物燃料，本领域中对于具有增强的将木糖转变成木酮糖的活性的XI酶，仍存在需求。

本公开涉及新的木糖异构酶。所述木糖异构酶具有木糖发酵所需的特性，例如高活性、对酸性条件(即低于7的pH水平，例如pH 6.5或pH 6)的耐受性或两者。

本公开具有多个方面。一方面，本公开涉及XI多肽。本公开的多肽通常包含与表1的任何XI多肽或其催化结构域或二聚化结构域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，或者由包含与表1的任何核酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、98％、99％或100％的序列同一性的核苷酸序列的核酸序列编码：

在特定实施方式中，本公开的多肽包含：

(1)(a)与SEQ ID NO：78或其催化结构域(SEQ ID NO：78的第2-377位氨基酸)具有至少97％或98％的序列同一性和/或(b)与SEQ ID NO：78或其催化结构域(SEQ ID NO：78的第2-377位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并且还包含(i)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213和/或(ii)SEQ ID NO：214；

(2)(a)与SEQ ID NO：96或其催化结构域(SEQ ID NO：96的第2-377位氨基酸)具有至少95％、97％或98％的序列同一性和/或(b)与SEQ ID NO：96或其催化结构域(SEQ ID NO：96的第2-377位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并且还包含(i)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213和/或(ii)SEQ ID NO：214；

(3)与SEQ ID NO：38或其催化结构域(SEQ ID NO：38的第2-374位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列，并任选地还包含下列序列中的一个、两个、三个、四个或所有五个序列：(i)SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：207；(ii)SEQ ID NO：208；(iii)SEQ ID NO：209；(iv)SEQ IDNO：210；和(iv)SEQ ID NO：211；

(4)与SEQ ID NO：2或其催化结构域(SEQ ID NO：2的第2-374位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列；

(5)与SEQ ID NO：58或其催化结构域(SEQ ID NO：58的第2-376位氨基酸)具有至少93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列；

(6)与SEQ ID NO：42或其催化结构域(SEQ ID NO：42的第2-375位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列，并且任选地还包含下列序列中的一个、两个或所有三个序列：(i)SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：207；(ii)SEQ ID NO：210；和(iii)SEQ ID NO：211；

(7)(a)与SEQ ID NO：84或其催化结构域(SEQ ID NO：84的第2-376位氨基酸)具有至少97％或98％的序列同一性和/或(b)与SEQ ID NO：84或其催化结构域(SEQ ID NO：84的第2-376位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并且还包含(i)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213和/或(ii)SEQ ID NO：214；

(8)(a)与SEQ ID NO：80或其催化结构域(SEQ ID NO：80的第2-377位氨基酸)具有至少97％或98％的序列同一性和/或(b)与SEQ ID NO：80或其催化结构域(SEQ ID NO：80的第2-377位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并且还包含(i)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213和/或(ii)SEQ ID NO：214；

(9)与SEQ ID NO：54或其催化结构域(SEQ ID NO：54的第2-376位氨基酸)具有至少93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列；

(10)与SEQ ID NO：46或其催化结构域(SEQ ID NO：46的第2-376位氨基酸)具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列，并且任选地还包含SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：207；

(11)与SEQ ID NO：16或其催化结构域(SEQ ID NO：16的第2-376位氨基酸)具有至少90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列；

(12)与SEQ ID NO：82或其催化结构域(SEQ ID NO：82的第2-375位氨基酸)具有至少85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列；和/或

(13)与SEQ ID NO：32或其催化结构域(SEQ ID NO：32的第2-377位氨基酸)具有至少90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

本公开的XI可以根据它们的活性来表征。在某些实施方式中，本公开的XI在pH 7.5下具有Genbank登记号169733248指派的根囊鞭菌属物种(Orpinomyces sp.)的XI(“Op-XI”)的至少1.3倍的活性，所述活性使用例如在实施例4、6和7任一实施例中描述的测定法来测定。在某些特定实施方式中，本公开的XI在pH 7.5下具有Op-XI的活性的1.25至3.0倍、1.5至3倍、1.5至2.25倍或1.75至3倍范围内的活性。

本公开的XI也可以根据它们对酸性环境(例如在6.5或6的pH下)的耐受性来表征。在某些实施方式中，本公开的XI在pH 6下具有Op-XI的至少1.9倍的活性，所述活性使用例如在实施例7中描述的测定法来测定。在某些特定实施方式中，本公开的XI在pH 6下具有Op-XI的活性的1.9至4.1倍、2.4至4.1倍、2.4至3.9倍或2.4至4.1倍范围内的活性。

对酸性环境的耐受性也可以被表征为pH 6下的活性与pH 7.5下的活性之比(“pH 6与pH 7.5活性比率”)，所述活性例如使用实施例7的测定法来测量。在某些实施方式中，所述pH 6与pH 7.5活性比率为至少0.5或至少0.6。在各种不同实施方式中，所述pH 6与pH 7.5活性比率为0.5-0.9或0.6-0.9。

另一方面，本公开涉及编码本公开的XI多肽的核酸。在各种不同实施方式中，所述核酸包含与SEQ ID NO：l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173和175中的任一核苷酸序列或任何上述序列的编码XI催化结构域或二聚化结构域的部分具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、98％、99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。

本公开的核酸可以被密码子优化，以例如用于在真核生物体例如酵母或丝状真菌中表达。用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达的示例性的密码子优化的开放阅读框是SEQ ID NO：238(编码SEQ IDNO：54的XI)、SEQ ID NO：239(编码SEQ ID NO：58的XI)、SEQ ID NO：244(编码SEQ ID NO：78的XI)、SEQ ID NO：245(编码SEQ ID NO：96的XI)、SEQ ID NO：246(编码SEQ ID NO：38的XI)、SEQ ID NO：247(编码SEQ ID NO：78的XI)、SEQ ID NO：248(编码SEQ ID NO：96的XI)和SEQ ID NO：249(编码SEQ ID NO：38的XI)。在各种不同实施方式中，本公开提供的核酸包含与SEQ IDNO：238、239、244、245、246、247、248和249中的任一核苷酸序列或任何上述序列的编码XI催化结构域或二聚化结构域的部分具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的序列同一性或具有100％的序列同一性的核苷酸序列。

在其他方面，本公开涉及包含编码XI的核苷酸序列的载体，例如具有与编码XI的核苷酸序列可操作连接的启动子序列和/或复制起点的载体。所述启动子序列可以是在真核细胞中例如在真菌细胞中可操作的启动子序列。在某些实施方式中，所述启动子在酵母(例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae))或丝状真菌中是可操作的。

另一方面，本公开涉及包含编码XI多肽的核酸的重组细胞。具体来说，所述细胞被工程化改造以表达本文中描述的任何XI多肽。所述重组细胞可以是任何物种的细胞，并且优选为真核细胞，例如酵母细胞。适合的酵母属包括糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Klockera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和耶罗维亚酵母属(Yarrowia)。在特定实施方式中，所述重组细胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、博伊丁糖酵母(S.bulderi)、S.barnetti、微小糖酵母(S.exiguus)、葡萄汁糖酵母(S.uvarum)、糖化糖酵母(S.diastaticus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、东方伊萨酵母(I.orientalis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)。适合的丝状真菌属包括曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、支顶孢属(Acremonium)和镰孢属(Fusarium)。在特定实施方式中，所述重组细胞是黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)或米根霉(Rhizopus oryzae)。

所述重组细胞也可以被突变或工程化改造，以包含XI的重组表达之外的修饰，特别是使细胞更适合于在发酵途径中利用木糖的修饰。示例性的其他修饰产生一种、两种、三种、四种、五种或甚至更多种下列表型：(a)木糖向所述细胞内的转运增加；(b)在木糖上的好氧生长速率增加；(c)木酮糖激酶活性增加；(d)通过磷酸戊糖途径进入醣酵解的通量增加；(e)醛糖还原酶活性降低；(f)对降解物阻遏(catabolite repression)的敏感性降低；(g)对生物燃料例如乙醇的耐受性增加；(h)对中间体产生(例如木糖醇)的耐受性增加；(i)温度耐受性增加；(j)有机酸的摩尔渗透压浓度(osmolarity)；和(k)副产物的产生减少。

活性的增加可以通过提高表达水平，例如提高己糖或戊糖(例如木糖)转运蛋白、木酮糖激酶、糖酵解酶或产乙醇酶的表达来实现。表达水平的提高通过过表达内源蛋白或通过表达异源蛋白来实现。

作为本公开的一部分的所述重组细胞的其他修饰是降低所述重组细胞中的基因或途径的活性的修饰。优选地，降低以下一个、两个、三个或更多个基因的表达水平：己糖激酶、MIG-1、MIG-2、XR、醛糖还原酶和XDH。降低基因活性可以通过基因的靶向缺失或破坏(和任选地重新导入在不同启动子控制之下的基因，所述启动子驱动较低表达水平或诱导型表达)来实现。

另一方面，本公开涉及生产发酵产物的方法，所述发酵产物例如为乙醇、丁醇、柴油、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺类抗生素和头孢菌素中的一种或多种。通常，将重组表达本公开的XI的细胞在含木糖培养基例如增补有木质纤维素水解物的培养基中进行培养。所述培养基也可能含有葡萄糖、阿拉伯糖或其他糖，尤其是源自于木质纤维素的那些糖。所述培养基可以具有任何pH，特别是在3.0至9.0之间的pH，优选为4.0至8.0之间、更优选为5.0至8.0之间、甚至更优选为6.0至7.5之间的pH。所述培养可以在任何培养基中进行，其中所述培养是在厌氧或好氧条件下，优选地在厌氧条件下进行上面提到的化合物的生产，并在好氧条件下进行生物质/细胞生产。任选地，所述方法还包括回收由所述重组细胞产生的发酵产物。

附图说明

图1A-1B分别是在基于活性的XI筛选中使用的载体pMEV-ΔxylA(MEV3xylA del)和PCR-BluntII-TOPO-xylA的图谱。

图2示出了用于两步骤的标志物交换方法的实验策略。

图3是用于在酵母菌株啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1Ca(ATCC：MYA1108)中表达XI的载体p426PGK1的图谱。

图4示出了在酵母菌株啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1Ca(ATCC：MYA1108)中表达的所选克隆在含木糖培养基上的生长速率。

图5A-5D分别是载体pYDAB-006、pYDURA01、pYDPt-005和pYDAB-0006的图谱，所述载体都被用于产生工业啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株yBPA130的具有所选XI克隆的单一基因组拷贝的菌株。

图6是用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株yBPB007和yBPB008中进行多XI整合的载体YDAB008-rDNA的图谱。

图7A-7D示出了具有整合在核糖体DNA基因座中的XI克隆的多个拷贝的工业啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株的单糖(包括木糖)利用和乙醇生产。

图8：从糖酵解和磷酸戊糖(“PPP”)途径生产乙醇。不是所有步骤都被示出。例如，甘油醛-3-磷酸通过一系列糖酵解步骤转变成丙酮酸：(1)由甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH1-3)催化的甘油醛-3-磷酸向3-磷酸-D-甘油-磷酸酯的转变；(2)由3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)催化的3-磷酸-D-甘油-磷酸酯向3-磷酸甘油酸的转变；(3)由磷酸甘油酸变位酶(GPM1)催化的3-磷酸甘油酸向2-磷酸甘油酸的转变；(4)由烯醇化酶(ENO1；ENO2)催化的2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的转变；以及(5)由丙酮酸激酶(PYK2；CDC 19)催化的磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转变。其他缩写：DHAP＝磷酸二羟丙酮；GPD＝甘油-3-磷酸酯脱氢酶；RHR2/HOR2＝DL-甘油-3-磷酸酶；XI＝木糖异构酶；GRE＝木糖还原酶/醛糖还原酶；XYL＝木糖醇脱氢酶；XKS＝木酮糖激酶；PDC＝丙酮酸脱羧酶；ADH＝醇脱氢酶；ALD＝醛脱氢酶；HXK＝己糖激酶；PGI＝磷酸葡萄糖异构酶；PFK＝磷酸果糖激酶；FBA＝醛缩酶；TPI＝磷酸丙糖异构酶；ZWF＝葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；SOL＝6-磷酸葡萄糖酸内酯酶；GND＝6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；RPE＝D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；RKI＝核糖-5-磷酸缩酮异构酶；TKL＝转酮酶；TAL＝转醛酶。粗虚线箭头指示尤其是在乙醇生产中可以被减少或消除以提高木糖利用的反应和相应的酶，粗实线箭头指示尤其是在乙醇生产中可以被增加以提高木糖利用的反应和相应的酶。图8中示出的酶由啤酒糖酵母(S.cerevisiae)基因编码。啤酒糖酵母(S.cerevisiae)基因被用于示例目的。其他生物体中的类似酶和修饰也在本公开的范围之内。

具体实施方式

木糖异构酶多肽

“木糖异构酶”或“XI”是催化D-木糖直接异构化成D-木酮糖和/或催化D-木酮糖直接异构化成D-木糖的酶。这类酶也被称为D-木糖酮异构酶。本文中的木糖异构酶可能也能催化D-葡萄糖与D-果糖之间的转变(并且因此可以被称为葡萄糖异构酶)。

“本公开的XI多肽”或“本公开的XI”是具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176中的任一个相关的氨基酸序列的木糖异构酶。在某些实施方式中，本公开的木糖异构酶具有与上述序列或其催化结构域或二聚化结构域具有至少约70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。本公开的木糖异构酶也可以与上述序列之一具有100％的序列同一性。

本公开提供了分离的、合成的或重组的XI多肽，其包含与SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176的多肽，在至少约10个例如至少约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350个残基的区域上，或在所述多肽的整个长度上、在催化结构域的长度上或在二聚化结构域的长度上，具有至少约80％例如至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或完全(100％)的序列同一性的氨基酸序列。

本公开的XI多肽可以由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175具有至少约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％或约90％的序列同一性的核酸序列编码，或者由能够在高严紧条件下与SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175的互补链或其片段杂交的核酸序列编码。本公开的示例性核酸被描述在下面的“木糖异构酶核酸”章节中。

在特定实施方式中，本公开的多肽包含：

适用于确定序列相似性的算法的实例是BLAST算法，其被描述在Altschul等，1990,J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。该算法包括首先通过在质询序列中鉴定当与数据库序列中相同长度的字段对齐时匹配或满足某个具有正值的阈值分值T的长度为W的短字段来鉴定高评分序列对(HSP)。这些最初的邻近字段命中物用作起点，以寻找含有它们的更长的HSP。将所述字段命中物沿着所比较的两个序列中的每个序列在两个方向上扩展，只要累计比对分值能够增加即可。在下述情况下停止字段命中物的延伸：累计比对分值与最高获得值相比下降量X；累计分值变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。作为缺省，BLAST程序使用11的字段长度(W)、50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,1992,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)比对(B)、10的期望值(E)、M'5、N'-4和两条链的比较。

本文中描述的任何氨基酸序列可以与该特定氨基酸序列的每个C-和/或N-端末端侧翼的至少1个例如至少(或多达)2、3、5、10或20个异源氨基酸一起产生或连同所述异源氨基酸来产生，和/或从本公开的XI的C-和/或N-端末端缺失至少1个例如至少(或多达)2、3、5、10或20个氨基酸来产生。

对酸性环境的耐受性也可以被表征为pH 6下的活性与pH 7.5下的活性之比(“pH 6与pH 7.5活性比率”)，所述活性例如使用实施例7的测定法来测量。在某些实施方式中，pH 6与pH 7.5活性比率为至少0.5或至少0.6。在各种不同实施方式中，pH 6与pH 7.5活性比率为0.5-0.9或0.6-0.9。

本公开的木糖异构酶相对于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176的多肽或其上面讨论的部分，可以具有一个或多个(例如多达2、3、5、10或20个)保守氨基酸置换。保守置换可以选自与参比氨基酸具有相似侧链的氨基酸组。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。因此，每种天然存在的氨基酸的示例性保守置换为：ala置换成ser；arg置换成lys；asn置换成gln或his；asp置换成glu；cys置换成ser或ala；gln置换成asn；glu置换成asp；gly置换成pro；his置换成asn或gin；ile置换成leu或val；leu置换成ile或val；lys置换成arg；gln置换成glu；met置换成leu或ile；phe置换成met、leu或tyr；ser置换成thr；thr置换成ser；trp置换成tyr；tyr置换成trp或phe；以及val置换成ile或leu。

本公开还提供了融合蛋白，其至少包括与一个或多个融合区段连接的本公开的XI多肽的一部分(例如片段或结构域)，所述融合区段对于所述XI多肽来说通常是异源的。适合的融合区段包括但不限于可以提供其他所需生物活性或促进XI多肽的纯化(例如通过亲和层析)的区段。融合区段可以连接到XI多肽的氨基或羧基端。融合区段可以对切割敏感。

木糖异构酶核酸

“本公开的XI核酸”是编码本公开的木糖异构酶的核酸。在某些实施方式中，本公开的木糖异构酶核酸由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175中的任一核苷酸序列或与其具有至少约50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列编码。本公开的木糖异构酶核酸也可以与上述序列之一具有100％的序列同一性。

本公开提供了编码本公开的多肽例如在上面“木糖异构酶多肽”章节中描述的多肽的核酸。本公开提供了分离的、合成的或重组的核酸，其包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175的核酸，在至少约10个例如至少约15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950或2000个核苷酸的区域上，具有至少约70％例如至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或完全(100％)的序列同一性的核酸序列。

本公开的核酸还包括分离的、合成的或重组的核酸，其编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176的序列及其子序列(例如保守结构域或催化结构域)及其变体的XI多肽。

为了提高XI多肽被重组表达的可能性，可以对XI核酸进行改造以将其密码子用法优化成所选细胞的密码子用法。数种用于密码子优化的方法在本领域中是已知的。对于在酵母中的表达来说，将核苷酸序列的密码子用法优化成酵母的密码子用法的示例性方法是WO2006/077258和/或WO 2008/000632中所公开的密码子对优化技术。WO2008/000632致力于密码子对优化。密码子对优化是将编码多肽的核苷酸序列在其密码子用法方面、尤其是在所使用的密码子对方面进行改良以获得编码所述多肽的核苷酸序列的提高的表达和/或被编码多肽的提高的生产的方法。密码子对被定义为编码序列中的一组两个连续的三联体(密码子)。也可以使用Boles密码子优化(参见Wiedemann和Boles，2008，Appl.Environ.Microbiol.74:2043-2050的表2)来优化XI在酵母中的表达和活性。或者，可以使用可商购的软件例如GeneDesigner(DNA 2.0)来优化XI序列。优选地，通过调整商业化软件中的设定或者通过手动改变序列以将引入不希望的序列的密码子用例如在目标生物体中高度使用的密码子代替，使密码子优化的序列避免核苷酸重复序列和在克隆XI核酸中利用的限制性位点。用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达的示例性的密码子优化的开放阅读框是SEQ IDNO：238(编码SEQ ID NO：54的XI)、SEQ ID NO：239(编码SEQID NO：58的XI)、SEQ ID NO：244(编码SEQ ID NO：78的XI)、SEQ ID NO：245(编码SEQ ID NO：96的XI)、SEQ ID NO：246(编码SEQ ID NO：38的XI)、SEQ ID NO：247(编码SEQ ID NO：78的XI)、SEQ ID NO：248(编码SEQ ID NO：96的XI)和SEQ ID NO：249(编码SEQ ID NO：38的XI)。在各种不同实施方式中，本公开提供的核酸包含与SEQ ID NO：238、239、244、245、246、247、248和249中的任一核苷酸序列或任何上述序列的编码XI催化结构域或二聚化结构域的部分具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的序列同一性或具有100％的序列同一性的核苷酸序列。

宿主细胞和重组表达

本公开还提供了被XI核酸转化的宿主细胞和被工程化改造以表达XI多肽的重组宿主细胞。XI核酸构建物可以是染色体外的，在质粒上的，所述质粒可以是低拷贝质粒或高拷贝质粒。核酸构建物可以作为游离体被维持，并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色体复制序列。或者，XI核酸可以以一个或多个拷贝整合到细胞的基因组中。在细胞基因组中的整合可以通过非同源重组随机地进行，但优选地，可以通过本领域中公知的同源重组将核酸构建物整合到细胞的基因组中。在某些实施方式中，宿主细胞是细菌或真菌(例如酵母或丝状真菌)。

适合的细菌属的宿主细胞包括但不限于埃希式杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细胞。适合的细菌物种的细胞包括但不限于大肠埃希式杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和变青链霉菌(Streptomyces lividans)的细胞。

适合的酵母属的宿主细胞包括但不限于糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Klockera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、法夫酵母属(Phaffia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和耶罗维亚酵母属(Yarrowia)的细胞。在特定实施方式中，所述重组细胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、白色假丝酵母(C.albicans)、粟酒裂殖糖酵母(S.pombe)、博伊丁糖酵母(S.bulderi)、S.barnetti、微小糖酵母(S.exiguus)、葡萄汁糖酵母(S.uvarum)、糖化糖酵母(S.diastaticus)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、东方伊萨酵母(I.orientalis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、加拿大毕赤酵母(P.canadensis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或红法夫酵母(P.rhodozyma)。适合用于重组XI表达的示例性酵母菌株包括但不限于LallemandLYCC 6391、Lallemand LYCC 6939、Lallemand LYCC 6469(都来自于Lallemand,Inc.,Montreal,Canada)、NRRL YB-1952(ARS(NRRL)Collection，U.S.Department of Agriculture)和BY4741。

适合的丝状真菌宿主细胞包括真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状体。适合的丝状真菌属的细胞包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysoporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、棒囊壳属(Corynascus)、毛壳霉属(Chaetomium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、黑粉菌属(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、显革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、灰侧耳菌属(Pleurotus)、柱霉属(Scytaldium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、孢子丝菌属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)的细胞。在某些情况下，所述重组细胞是木霉属物种(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(Trichoderma reesei))、青霉属物种(Penicillium sp.)、腐质霉属物种(Humicola sp.)(例如特异腐质霉(Humicola insolens))、曲霉属物种(Aspergillus sp.)(例如黑曲霉(Aspergillus niger))、金孢子菌属物种(Chrysosporium sp.)、镰孢属物种(Fusarium sp.)或肉座菌属物种(Hypocrea sp.)。适合的细胞也可以包括这些丝状真菌属的各种无性型和有性型形式的细胞。

适合的丝状真菌物种的细胞包括但不限于泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporiumlucknowense、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、克地镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、Fusariumvenenatum、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、中间脉孢菌(Neurospora intermedia)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、变灰白青霉(Penicillium canescens)、离生青霉(Penicillium solitum)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiate)、刺芹灰侧耳菌(Pleurotus eryngii)、黄色踝节菌(Talaromycesflavus)、土生草根霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁氏木霉(Trichoderma koningii)、长柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)的细胞。

为了重组表达，通常将XI核酸可操作连接到能够提供或协助XI序列的转录和/或翻译的一个或多个核酸序列，例如在将要表达XI的生物体中可操作的启动子。所述启动子可以是同源或异源的，并且可以是组成型或诱导型的。

XI多肽优选地被表达在细胞溶质中，并因此缺少线粒体或过氧化物酶体靶向信号。

当希望在丝状真菌宿主中重组表达时，启动子可以是真菌启动子(包括但不限于丝状真菌启动子)、在植物细胞中可操作的启动子、在哺乳动物中可操作的启动子。

正如在2011年10月31日提交的其内容整体并入本文的美国临时申请号61/553,901中所述，在哺乳动物细胞中具有组成性活性的启动子(其可以源自于哺乳动物基因组或哺乳动物病毒的基因组)能够在丝状真菌例如里氏木霉(Trichoderma reesei)中引发高的表达水平。示例性的启动子是巨细胞病毒(“CMV”)启动子。

正如在2011年10月31日提交的其内容整体并入本文的美国临时申请号61/553,897中所述，在植物细胞中具有组成性活性的启动子(其可以源自于植物基因组或植物病毒的基因组)能够在丝状真菌例如里氏木霉(Trichoderma reesei)中引发高的表达水平。示例性的启动子是花椰菜花叶病毒(“CaMV”)35S启动子或鸭跖草黄斑驳病毒(“CoYMV”)启动子。

当通常与哺乳动物或哺乳动物病毒启动子相关的关联性5’UTR序列(即始于转录起始位点并止于起始密码子之前的一个核苷酸(nt)的序列)被真菌的5’UTR序列替换时，哺乳动物、哺乳动物病毒、植物和植物病毒启动子可以驱动特别高的表达。

5’UTR的来源可以变化，只要它在丝状真菌细胞中是可操作的即可。在各种不同实施方式中，5’UTR可以源自于酵母基因或丝状真菌基因。5’UTR可以来自于同一物种、表达盒中的一个其他元件(例如启动子或XI编码序列)或来自于不同物种。5’UTR可以来自于与打算在其中操作表达构建物的丝状真菌细胞相同的物种。在示例性实施方式中，5’UTR包含与来自于里氏木霉(T.reesei)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)的5’UTR的片段相对应的序列。在特定实施方式中，5’UTR不天然与CMV启动子相关。

可以使用的其他启动子的实例包括但不限于纤维素酶启动子、木聚糖酶启动子、1818启动子(以前通过对木霉(Trichoderm)进行EST作图而被鉴定为高表达蛋白)。例如，适合情况下，启动子可以是纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶启动子。特别适合的启动子可以是例如里氏木霉(T.reesei)的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶启动子。启动子的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、pki1、gpd1、xyn1或xyn2启动子。

对于在酵母中的重组表达来说，适用于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的启动子包括MFα1启动子、半乳糖诱导型启动子(例如GAL1、GAL7和GAL10启动子)、糖酵解酶启动子(包括TPI和PGK启动子)、TDH3启动子、TEF1启动子、TRP1启动子、CYCI启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、ADH1启动子和HSP启动子。也可以使用在生长或生产的不同阶段(例如繁殖期或营养期)有活性的启动子(参见例如Puig等，1996,Biotechnology Letters 18(8):887-892；Puig和Pérez-Ortín，2000,Systematic and Applied Microbiology 23(2):300-303；Simon等，2001,Cell 106:697-708；Wittenberg和Reed，2005,Oncogene24:2746-2755)。在毕赤酵母属物种(Pichia sp.)中适合的启动子是AOXI(甲醇利用)启动子。

工程化改造的宿主细胞可以在视情况而定改良的常规营养培养基中进行培养，以用于激活启动子、选择转化体或扩增编码XI多肽的核酸序列。培养条件例如温度、pH等是被选择用于表达的宿主细胞先前所使用的培养条件，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。正如所指出的，对于包括细菌和真菌来源的细胞在内的许多细胞的培养和生产来说，有许多参考文献可用。总的来说，细胞培养基如Atlas和Parks在1993年主编的《微生物培养基手册》(The Handbook ofMicrobiological Media,CRC Press,Boca Raton,FL)中所述，所述文献通过参考并入本文。对于在丝状真菌细胞中的重组表达来说，将细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基中进行培养，例如在下述文献中所描述的：Pourquie等，1988，《纤维素降解的生物化学和遗传学》(Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation)，Aubert等主编，Academic Press，pp.71-86；和Ilmen等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:1298-1306。培养条件也是标准的，例如，将培养物在30℃下在培养摇床或发酵罐中温育，直至获得所需XI表达水平。给定丝状真菌的优选培养条件可以在科学文献中找到，和/或来自于所述真菌的来源例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)。在真菌的生长已被建立后，将细胞暴露于有效地引起或允许XI表达的条件。

在XI编码序列在诱导型启动子的控制之下的情形中，以有效诱导XI表达的浓度向培养基加入诱导试剂例如糖、金属盐或抗生素。

除了XI多肽的重组表达之外，本公开的宿主细胞还可以包含提高细胞在发酵过程中利用作为底物的木糖的能力的一种或多种遗传修饰。示例性的其他修饰产生一种、两种、三种、四种、五种或甚至更多种下列表型：(a)木糖向所述细胞内的转运增加；(b)在木糖上的好氧生长速率增加；(c)木酮糖激酶活性增加；(d)通过磷酸戊糖途径进入醣酵解的通量增加；(e)醛糖还原酶活性的调节；(f)对降解物阻遏的敏感性降低；(g)对生物燃料例如乙醇的耐受性增加；(h)对中间体产生(例如木糖醇)的耐受性增加；(i)温度耐受性增加；(j)有机酸的摩尔渗透压浓度；和(k)副产物的产生减少。

正如下面说明的，引起一种或多种上述表型的修饰可以是提高或降低内源蛋白的表达(例如至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20倍)的结果，或者是引入异源多肽的表达的结果。为避免疑问，“降低”或“减少”基因表达涵盖消除表达。降低(或减少)内源蛋白的表达可以通过使细胞中基因的一个或多个(或所有)内源拷贝失活来实现。基因可以通过使所述基因的至少一部分缺失或通过破坏所述基因来失活。这可以通过使某些或所有基因编码序列或调控序列缺失来实现，所述调控序列的缺失引起细胞中基因表达的降低。下文中描述了增加木糖利用或发酵产物得率的修饰的实例。

提高木糖的转运：可以直接或间接地提高木糖的转运。例如，重组细胞可以包括引起木糖转运蛋白表达的一种或多种遗传修饰。示例性的转运蛋白包括但不限于分别来自于中间型假丝酵母(Candidaintermedia)、具柄毕赤酵母(Pichia stipitis)(现在重新命名为Scheffersomyces stipitis；所述术语在本文中可互换使用)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的GXF1、SUT1和At6g59250(Runquist等，2010,Biotechnol.Biofuels 3:5)，以及HXT4、HXT5、HXT7、GAL2、AGT1和GXF2(参见例如Matsushika等，2009,Appl.Microbiol.Biotechnol.84:37-53)。其他转运蛋白包括：来自于具柄毕赤酵母(P.stipitis)的PsAraT、SUT2-4和XUT1-5；来自于中间型假丝酵母(Candidaintermedia)的GXS1；来自于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的XylHP和DEHA0D02167；以及来自于解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)的YALI0C06424(参见例如Young等，2011,Appl.Environ.Microbiol.77:3311-3319)。也可以通过低亲和性己糖转运蛋白的(过)表达来提高木糖的转运，所述低亲和性己糖转运蛋白能够在葡萄糖水平低(例如0.2-1.0g/l)之后非选择性地将糖(包括木糖)转运到细胞内；并包括来自于禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)的CgHXT1-CgHXT5。上述修饰可以单个地进行，或者可以两个、三个或更多个修饰组合地进行。

提高木酮糖激酶活性：木酮糖激酶活性可以通过木酮糖激酶例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的木酮糖激酶(XKS1；糖酵母属(Saccharomyces)基因组数据库(“SGD”)登记号YGR194C)的过表达来提高，尤其是在所述重组细胞是酵母细胞的情况下。在一种实施方式中，将啤酒糖酵母(S.cerevisiae)细胞工程化改造，以包含至少2个额外拷贝的木酮糖激酶，所述木酮糖激酶在强组成型启动子例如TDH3、TEF1或PGK1控制之下。在另一种实施方式中，内源木酮糖激酶的过表达被工程化改造。通过使用本领域技术人员已知的蛋白质工程技术，这种木酮糖激酶具有改善的动力学活性。

增加通过磷酸戊糖途径的通量：这可以通过提高磷酸戊糖途径中的一个或多个基因例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的转醛酶TAL1(SGD登记号YLR354C)、转酮酶TKL1(SGD登记号YPR074C)、核酮糖5-磷酸差向异构酶RPE1(SGD登记号YJL121C)和核糖-5-磷酸酮异构酶RKI1(SGD登记号YOR095C)和/或增加糖酵解通量的一个或多个基因例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的丙酮酸激酶PYK1/CDC19(SGD登记号YAL038W)、丙酮酸脱羧酶PDC1(SGD登记号YLR044C)、丙酮酸脱羧酶PDC5(SGD登记号YLR134W)、丙酮酸脱羧酶PDC6(SGD登记号YGR087C)、醇脱氢酶ADH1-5(分别为SGD登记号YOL086C、YMR303C、YMR083W、YGL256W和YBR145W)和己糖激酶HXK1-2(分别为SGD登记号YFR053C和YGL253W)的表达来实现。在一种实施方式中，酵母细胞具有在强组成型启动子(例如PGK1、TDH3、TEF1)控制之下的来自于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的TAL1、TKL1、RPE1和RKI1各一个额外的拷贝；并且还可以包括对糖酵解通量(例如增加诸如PYK1、PDC1、PDC5、PDC6、ADH1-5基因的拷贝)以及葡萄糖-6-磷酸和己糖激酶的改进。上述修饰可以单个地进行，或者可以两个、三个或更多个修饰组合地进行。

调节醛糖还原酶活性：重组细胞可以包括提高或降低(非特异性)醛糖还原酶(有时被称为醛-酮还原酶)活性的一种或多种遗传修饰。醛糖还原酶活性可以通过降低编码醛糖还原酶例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的GRE3(SGD登记号YHR104W)的基因的表达或使所述基因失活的一种或多种遗传修饰来降低。

在某些实施方式中，GRE3表达被降低。在一种情况下，重组细胞是其中GRE3基因被缺失的酵母细胞。GRE3的缺失使木糖醇产率降低49％并使生物质产量降低31％，但是使乙醇产率提高19％(Traff-Bjerre等，2004,Yeast 21:141-150)。在另一种情况下，重组细胞是GRE3的表达降低的酵母细胞。已显示，降低GRE3表达引起副产物(即木糖醇)的形成减少两倍以及相伴的乙醇产率提高(Traff等，2001,Appl.Environ.Microbiol.67:5668-5674)。

在另一种实施方式中，重组细胞是其中GRE3被过表达的细胞(任选地但不必定是酵母细胞)。在分析啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中GRE3过表达的效应以调查对木糖利用的影响的研究中，注意到木糖消耗增加约30％以及乙醇产量增加约120％(Traff-Bjerre等，2004,Yeast 21:141-150)。

降低木糖还原酶活性：重组细胞可以包括降低木糖还原酶活性的一种或多种遗传修饰。木糖还原酶活性可以通过降低编码木糖还原酶的基因的表达或使所述基因失活的一种或多种遗传修饰来降低。

降低对降解物阻遏的敏感性：葡萄糖和其他糖例如半乳糖或麦芽糖能够在Crabtree阳性酵母例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中引起碳降解物阻遏。在一项研究中，发现木糖在乙醇存在下使能够利用木糖的工程化啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株的各种不同酶的去阻遏降低至少10倍。木糖还减少半乳糖激酶和转化酶的去阻遏(Belinchon&Gancedo,2003,Arch.Microbiol.180:293-297)。在某些实施方式中，为了降低降解物敏感性，酵母可以包括降低GRR1(SGD登记号YJR090C)、指派有SGD登记号YLR042C的基因、GAT1(SGD登记号YKR067W)中的一个或多个基因的表达的一种或多种遗传修饰，和/或降低SNF1(SGD登记号YDR477W)、SNF4(SGD登记号YGL115W)、MIG1(SGD登记号YGL035C)和CRE1(SGD登记号YJL127C)中的一个或多个基因的表达的一种或多种遗传修饰。在其他实施方式中，酵母可以包括引起磷酸戊糖途径的酶的过表达的一种或多种遗传修饰。在其他实施方式中，酵母可以包括降低己糖/葡萄糖激酶的表达的一种或多种遗传修饰。在又一种实施方式中，酵母可以包括调节一种或多种GATA因子例如GAT1、DAL80(SGD登记号YKR034W)、GZF3(SGD登记号YJL110C)和GLN3(SGD登记号YER040W)的活性的一种或多种遗传修饰。上述修饰可以单个地进行，或者可以两个、三个或更多个修饰组合地进行。

提高对生物燃料(例如乙醇)、途径中间体(例如木糖醇)、有机酸和温度的耐受性：为了从木质纤维素生物质高效生产生物乙醇，提高细胞对生物质预处理期间释放出的有毒化合物的耐受性是有用的。在一项研究中，将编码PHO13(SGD登记号YDL236W)这种具有碱性磷酸酶活性的蛋白的基因破坏。这导致在三种主要抑制剂(即乙酸、甲酸和糠醛)存在下从木糖生产的乙醇提高。此外，该突变体在90mM糠醛存在下的乙醇比生产率提高了四倍(Fujitomi等，2012,Biores.Tech.,111:161-166)。因此，在一种实施方式中，酵母具有降低PHO13表达的一种或多种遗传修饰。在其他实施方式中，使酵母、细菌和真菌细胞在选择性条件下进化，以鉴定可以抵抗更高温度、更高中间体水平、更高有机酸水平和/或更高生物燃料(例如乙醇)水平的菌株。在其他实施方式中，酵母被工程化改造以降低FPS1(SGD登记号YLL043W)的表达，过表达不饱和脂质和麦角固醇生物合成途径，降低PHO13和/或SSK2(SGD登记号YNR031C)的表达，通过提高或降低表达来调节全局转录因子cAMP受体蛋白，提高MSN2(SGD登记号YMR037C)、RCN1(SGD登记号YKL159C)、RSA3(SGD登记号YLR221C)、CDC19和/或ADH1的表达，或提高Rice ASR1的表达。上述修饰可以单个地进行，或者可以两个、三个或更多个修饰组合地进行。

降低副产物的产生：甘油是C6乙醇生产中的主要副产物。为了提高酵母对木糖的利用，需要减少甘油。可以通过使编码介导甘油输出的FPS1通道蛋白的基因和编码甘油-3-磷酸酯脱氢酶的GPD2(SGD登记号YOL059W)缺失，任选地与GLT1(SGD登记号YDL171C)和GLN1(SGD登记号YPR035W)的过表达一起，来降低甘油的生产。在一项研究中，FPS1和GPD2在一株啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株中被敲除，并且在另一株菌株中被分别编码谷氨酸合酶和谷氨酰胺合成酶的GLT1和GLN1的过表达代替。当在微好氧条件下生长时，这些菌株分别显示出13.17％和6.66％的乙醇产率提高。相反，发现甘油、乙酸和丙酮酸都降低，其中甘油分别降低37.4％和41.7％(Zhang和Chen，2008,Chinese J.Chem.Eng.16:620-625)。

甘油的生产也可以通过使NADH依赖性的甘油-3-磷酸酯脱氢酶1(GPD1；SGD登记号YDL022W)和/或NADPH依赖性的谷氨酸脱氢酶1(GDH1；SGD登记号YOR375C)缺失来降低。GPD1或GDH1的单独缺失降低甘油生产，并且双缺失导致与野生型啤酒糖酵母(S.cerevisiae)相比甘油生产降低46.4％(Kim等，2012，Bioproc.Biosys.Eng.35:49-54)。出于渗透调节的原因，缺失FPS1可以降低甘油的生产。

降低乙酸盐的生产也可以提高木糖利用。缺失ALD6(SGD登记号YPL061W)可以降低乙酸盐的生产。

也可以缺失ADH2以减少或消除从乙醇形成乙醛，并因此提高乙醇产率。

上述减少副产物形成的修饰可以单个地进行，或者可以两个、三个或更多个修饰组合地进行。

除了乙醇生产之外，本公开的表达XI的重组细胞也可以适合于生产非乙醇类发酵产物。这样的非乙醇类发酵产物在原则上包括可以通过真核微生物例如酵母或丝状真菌生产的任何大宗(bulk)或精细化学品。这样的发酵产物可以是例如丁醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺类抗生素或头孢菌素。本公开的用于生产非乙醇类发酵产物的优选的修饰的宿主细胞是含有引起醇脱氢酶活性降低的遗传修饰的宿主细胞。

表达本公开的XI多肽的细胞可以在分批、补料分批或连续发酵条件下生长。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定，并且在发酵期间不进行人为改变。分批系统的一种变型是补料分批发酵，其中随着发酵的进行，底物以增量的方式添加。当降解物阻遏可能抑制细胞代谢时以及在希望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。分批和补料分批发酵在本领域中是常用且公知的。连续发酵是一种开放系统，其中向生物反应器连续添加确定的发酵培养基，并在同时移除等量的调制过的培养基用于加工。连续发酵通常将培养物维持在恒定的高密度下，在所述高密度下细胞主要处于对数期生长。连续发酵系统力求维持稳态生长条件。用于为连续发酵过程调节营养物和生长因子的方法以及用于使产物形成速率最大化的技术在工业微生物学领域中是公知的。

发酵方法

另一方面，本公开涉及将表达XI的重组细胞用于包含木糖源的碳源的发酵的发酵过程。因此，在某些实施方式中，本公开提供了通过下述步骤生产发酵产物的方法：(a)用上文中定义的表达XI的重组细胞在细胞将木糖发酵成发酵产物的条件下使含有木糖源的培养基发酵，以及任选地(b)回收所述发酵产物。在某些实施方式中，发酵产物是醇(例如乙醇、丁醇等)、脂肪醇(例如C8-C20脂肪醇)、脂肪酸(例如C8-C20脂肪酸)、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙二醇、衣康酸、乙烯、甘油和β-内酰胺类抗生素例如青霉素G或青霉素V及其发酵衍生物，以及头孢菌素。发酵过程可以是好氧或厌氧发酵过程。

除了木糖源之外，发酵培养基中的碳源还可以包含葡萄糖源。木糖源或葡萄糖源可以是木糖或葡萄糖本身，或者可以是包含木糖或葡萄糖单元的任何糖类寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等。大多数微生物具有碳降解物阻遏，其引起源自于木质纤维素的混合糖的顺序消耗，降低了总过程的效能。为了提高发酵效率，已经开发了能够同时消耗混合糖(例如葡萄糖和木糖)的微生物，例如通过使它们对葡萄糖阻遏具有更低敏感性来实现(参见例如Kim等，2010,Appl.Microbiol.Biotechnol.88:1077-85和Ho等，1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:163-92)。这样的细胞可用于重组XI表达和本公开的发酵方法中。

发酵过程优选地在对于表达XI的重组细胞来说最佳的温度下运行。因此，对于大多数酵母或真菌宿主细胞来说，发酵过程在低于38℃的温度下进行，除非使用耐温突变菌株，在后一种情况下温度可以更高。对于大多数酵母或丝状真菌宿主细胞来说，发酵过程在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度下适当地进行。任选地，所述温度高于20℃、22℃或25℃。

示例性的方法是生产乙醇的方法，其中所述方法包括下列步骤：(a)用如上定义的转化的宿主细胞使含有木糖源的培养基发酵，由此宿主细胞将木糖发酵成乙醇；以及任选地(b)回收乙醇。发酵培养基还可以包含葡萄糖源，其也被发酵成乙醇。木糖源可以是从生物质或农业废物生产的糖。许多用于生产单糖例如从木质纤维素产生的葡萄糖的方法是公知的，并且适合在本文中使用。简单来说，纤维素水解材料可以被酶法、化学法和/或物理法水解成含有葡萄糖和木糖的级分。或者，本公开的表达XI的重组细胞可以被一个或多个编码有效水解复杂底物例如木质纤维素的酶的基因进一步转化，所述酶包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、过氧化物酶、漆酶、几丁质酶、蛋白酶和果胶酶。然后可以将本公开的重组细胞在葡萄糖和木糖存在下，在厌氧下发酵。在重组细胞是酵母细胞的情况下，可以使用例如由Wyman(1994,Biores.Technol.50:3-16)以及Olsson和Hahn-Hagerdal(1996,Enzyme Microb.Technol.18:312–331)所描述的发酵技术和条件。在发酵完成后，乙醇可以被回收并任选地被纯化或蒸馏。含有木质素的固体残留物可以被废弃或作为燃料燃烧。

发酵过程可以在好氧和厌氧条件下运行。在某些实施方式中，所述过程在微好氧或限氧条件下进行。发酵可以在(生物)反应器内以分批、补料分批或连续方式进行。

实施例

材料和方法

酵母培养

除非对特定实施例另有陈述，否则酵母转化体在含有约2％葡萄糖的SC-ura培养基中，在30℃下生长约24小时。所述培养基含有约20g琼脂、约134g BD Difco^TM的无氨基酸酵母氮基料(BD,Franklin Lakes,New Jersey)和约2g SC氨基酸混合物，所述氨基酸混合物除非另有注明(量列于括号中)，否则含有约85mg下列氨基酸：L-腺嘌呤(21.0)，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，谷氨酰胺，L-谷氨酸，甘氨酸，L-组氨酸，肌醇，L-异亮氨酸，L-亮氨酸(173.4)，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，对氨基苯甲酸(8.6)，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸。

木糖异构酶活性

使用基于Kersters-Hilderson等，1986,Enzyme Microb.Technol.9:145-148的方法的方法来测定细胞裂解物中的XI活性，其中将由XI催化的木糖向木酮糖的酶转化与经由山梨糖醇脱氢酶(SDH)进行的产物(木酮糖)向木糖醇的酶转化相偶联。SDH活性需要NADH氧化成NAD⁺。NADH的氧化速率与SDH将D-木酮糖转化成D-木糖醇的速率成正比，并通过340nm处吸光度的降低来测量。通过这种测定法测量到的一个酶活单位是在测定条件下每分钟NADH减少1微摩尔。所有反应、溶液、板和分光光度计在使用前均被平衡到约35℃。在刚刚制备后的新鲜裂解物上或在制备后立即冷冻在-20℃的裂解物上进行测定。使用BioTek的Synergy H1Hybrid Reader型号的分光光度计和96孔板(Corning，型号#3598)进行测定。所有分光光度计读取在340nm处进行。在每次测定时使用0至约0.6mM范围内的浓度产生NADH的标准曲线。

用于pH 7.5下的实验的反应缓冲液是约100mM Tris–HCl(pH7.5)。测定混合物如下制备：向反应缓冲液添加约10mM MgCl₂、0.15mM NADH和0.05mg/ml SDH(Roche，目录号50-720-3313)。对于也在pH 6下测量活性的实验来说，将缓冲液改变成约100mM磷酸钠，pH 6。然后如下制备用于整个实验的测定混合物：约10mM MgCl₂，1.2mM NADH和0.02mg/ml SDH。

使用反应缓冲液作为稀释剂来进行任何样品稀释。通过将约90μl测定混合物等分到板的每个孔中来建立反应。向孔加入约10μl的每种XI样品。通过添加约100μl底物溶液(约1M D-木糖)来起始反应。将反应混合并立即使用动力学测定模式读取约10分钟。体积活性(VA)单位以每ml向反应添加的裂解物每分钟的毫吸光度(mA)单位(mA/min/ml)为单位。从样品的VA中减去阴性对照孔(未添加酶)的背景VA速率。通过用XI样品的VA除以对使用同一宿主和表达载体表达的对照(根囊鞭菌属(Orpinomyces)的木糖异构酶，NCBI：169733248(Op-XI))所观察到的VA来确定与阳性对照(FIOPC)相比的提高倍率。在某些表征中，使用NADH标准曲线的斜率将VA(mA/min)转变成微摩尔-NADH/min(或单位)。如果进行蛋白质定量，则计算比活性(SA)，其中SA的单位为微摩尔NADH⁺/min/mg或U/mg裂解物蛋白。列出的所有活性(VA或SA)考虑到了任何稀释、添加的裂解物体积和所测定的裂解物的蛋白质浓度。

实施例2：木糖异构酶的基于活性的发现筛选

用于基于活性的发现(“ABD”)筛选的文库是离体噬菌粒的形式。如美国专利6,280,926中所述来构建这些文库。这些文库的来源是从死亡食草动物的前肠收集的环境瘤胃样品。

构建了大肠埃希式杆菌筛选菌株以从环境文库鉴定编码木糖异构酶活性的基因。具体来说，将大肠埃希式杆菌菌株SEL700用含有大肠埃希式杆菌recA基因的pBR322衍生质粒pJC859(Kokjohn等，1987,J.Bacteriol.169:1499-1508)互补，以产生野生型recA表型，所述SEL700是recA^-、λ噬菌体抗性并含有F’质粒的MG1655衍生株。

然后使用两步骤的标志物交换程序，使内源xylA木糖异构酶基因的整个编码序列缺失。简单来说，使用具有编码卡那霉素抗性和sacB果聚糖蔗糖酶的pir依赖性复制子(ori6RK)的质粒pMEV3作为构建xylA缺失质粒的载体。使用引物，通过重叠延伸PCR产生含有xylA基因的侧翼区(xylA的5’的0.7kb序列和3’的0.9kb序列)并含有BsaI限制性位点的DNA片段，将其连接到使用BbsI消化的pMEV3，并通过电穿孔转化到大肠埃希式杆菌中。通过测序来验证克隆，产生质粒pMEV3-ΔxylA(图1A)。

然后将pMEV3-ΔxylA质粒转化到大肠埃希式杆菌菌株SEL700(MG1655Δ^r,Δ(recA-srl)306,srl-301::Tn10-84(Tets),[F'proAB,lacI^q,ZΔM15,Tn10(Tet^r)]pJC859)中。通过在含有卡那霉素(最终浓度约50μg/ml)的LB琼脂板上铺板来选择单交换事件。在证实pMEV3-ΔxylA整合到染色体上之后，通过在含有蔗糖的LB琼脂培养基上生长来选择二次交换事件(图2)。通过使用xylA基因侧翼的引物进行的PCR表征以证实基因缺失并通过在改良的MacConkey培养基(ABD media)上生长两者来筛选表现出对卡那霉素的抗性和在蔗糖上生长的能力的菌落，所述改良的MacConkey培养基包含：MacConkey琼脂基料(Difco^TM#281810)(每升的粗略配方：明胶的胰消化物(17.0g)，蛋白胨(肉和酪蛋白)(3.0g)，3号胆汁盐(1.5g)，氯化钠(5.0g)，琼脂(13.5g)，中性红(0.03g)，结晶紫(1.0g)，木糖(30.0g)和卡那霉素(50mg)。ABD培养基含有中性红，中性红是一种在<6.8的pH下变为红色的pH指示剂。缺少xylA的突变体的菌落在这种培养基上表现为白色，而具有恢复的木糖代谢能力的菌落表现为红色，因为木糖发酵成木酮糖而降低了这些菌落周围的培养基的pH。

在使xylA成功缺失后，通过下列方法将得到的菌株用pJC859矫正：将xylA缺失菌株在含有终浓度为约20μg/ml的四环素的LB培养基中，在37℃左右生长约24小时。第二天，将细胞在LB四环素(在相同浓度下)培养基中传代培养(1：100稀释)并在大约三种不同温度(30、37和42℃)下温育。将细胞以与上述相同的方式继续传代约2天。将得到的培养物的稀释液铺在LB板上，以分离单菌落。将菌落平板复制在含有和不含羧苄青霉素(终浓度为约100μg/ml)的LB琼脂板上。羧苄青霉素抗性菌落被认为仍含有载体pJC859，而羧苄青霉素敏感菌落被pJC859矫正，恢复了菌株SEL700的recA基因型。该菌株SEL700ΔxylA被用于ABD筛选。

ABD筛选方法通过下述步骤来验证：使用标准程序，通过从大肠埃希式杆菌K12PCR扩增xylA基因并克隆到PCR-BluntII TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,California)中，产生阳性对照菌株。然后将该载体(PCR-BluntII-TOPO-xylA，图1B)转化到筛选菌株(SEL700ΔxylA)中。通过转化体在ABD培养基上的生长和指示木糖利用的红色晕圈的出现，来验证木糖表型的互补。

通过用离体的噬菌粒文库感染菌株SEL700ΔxylA来筛选文库的XI活性。将感染的细胞铺板到ABD培养基上，并且只有具有红色“晕圈”(指示木糖发酵)的菌落被继续推进。将阳性菌落纯化至单菌落，并在ABD培养基上重新生长以证实表型。

实施例2：木糖异构酶的基于序列的发现

用于基于序列的发现(“SBD”)的文库是基因组DNA(gDNA)提取物的形式。如美国专利号6,280,926中所述来构建这些文库。这些文库的来源是从死亡食草动物的肠收集的样品。

XI基因通常存在于保守基因簇中(Dodd等，2011,MolecularMicrobiol.79:292-304)。为了从宏基因组样品获得全长XI基因序列，设计了分别在数个类杆菌属(Bacteroides)物种中发现的保守DNA序列(通常为木酮糖激酶和木糖通透酶)的上游和下游两个方向上的引物。这些侧翼DNA序列从公共数据库获得。从11种不同的动物瘤胃样品提取样品基因组DNA。左侧共有引物具有序列5’-GCIGCICARGARGGNATYGTVTT-3’(SEQ ID NO：177)(该引物编码氨基酸基序AAQEGIV(F)(SEQ ID NO：178))。右侧共有引物具有序列5’-GCDATYTCNGCRATRTACATSGG-3’(SEQ ID NO：179)(该序列编码氨基酸基序PMYIAEIA(SEQ ID NO：180))。使用touchdown循环条件和热启动Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,California)来进行PCR反应。将预期大小的PCR产物纯化并亚克隆到pCR4-TOPO载体系统(Invitrogen,Carlsbad,California)中。将来自于基于TOPO的PCR文库的阳性克隆转化到TOP10(Invitrogen,Carlsbad,California)中，并将转化体在含有卡那霉素(终浓度为约25μg/ml)的LB琼脂板上生长。挑取抗性菌落并各自接种到96孔深孔板的2列中，每个孔含有约1.2ml LB卡那霉素(终浓度为25μg/ml)培养基。将培养物在约30℃下生长过夜。第二天，纯化质粒并对插入序列进行测序。序列分析揭示出多个全长XI基因。通过鉴定最长蛋白编码区的起始和终止密码子，随后基于与已发表的木糖异构酶DNA序列的同源性进行人工淘选(manual curation)，来完成推测的ORF的鉴定。

实施例3：XI序列分析

对来自于ABD和SBD筛选两者的质粒进行纯化，并使用ABI3730xl DNA分析仪和ABIv3.1循环测序化学对载体插入序列进行测序。通过鉴定最长蛋白编码区的起始和终止密码子，随后基于与已发表的木糖异构酶DNA序列的同源性进行人工淘选(manualcuration)，来完成推测的ORF的鉴定。鉴定到的XI ORF列于下面的表2中，其指示了从ABD或SBD文库确定的每个XI的序列和源生物体分类，以及它们的指派的序列标识符。推测的催化结构域(基于与其他XI的序列比对)带有下划线。

实施例4：XI酶活性的定量

将在ABD和SBD筛选中鉴定到的克隆(参见表2)亚克隆到载体p426PGK1(图3)中，所述载体是p426GPD(ATCC登记号87361)的改良形式，其中将GPD启动子用来自于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(ATCC登记号204501)gDNA的PGK1启动子替换。然后将所述克隆转化到酵母菌株MYA11008中。

如材料和方法中所述来生长细胞。将细胞沉淀物重新悬浮在约300μl裂解缓冲液中：粗略浓度(50mM NaH₂PO₄(pH 8.0)，300mMNaCl，10mM咪唑(Sigma，#I5513)，向其加入约2μl/mlβ-巯基乙醇(BME)和蛋白酶抑制剂混合物片(Roche，11836170001(约10ml细胞提取物1片)。向已经预先等分有约0.5ml酸洗过的玻璃珠(425-600μm)的2ml螺旋盖微量离心管加入细胞悬液。使用幅度设定为约6的FastPrep-24(MP Biomedicals,Solon,OH)将细胞裂解约3个约1分钟的重复。在重复之间将细胞在冰上激冷约5分钟。将样品在4℃下以约10,000x g离心约10分钟。将回收的上清液用于XI酶活性测定法中。如材料和方法中所述来进行XI酶活性测定。结果被示出在表3中。

实施例5：含有XI克隆的酵母在木糖上的生长

将来自于实施例3的一小组XI基因在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)CEN.PK2-1Ca(ATCC:MYA1108)中表达，并对其提供在木糖上生长的能力的能力进行测定。这种测定如下进行：将菌落在SC-ura+2％葡萄糖的琼脂板上分离，并接种到SC–ura 2％甘油和SC–ura 2％木糖两种培养基的约3ml“预培养物”中，在约30℃和约220rpm下温育过夜。通过离心(约100x g，5分钟)收获细胞，舍弃上清液，洗涤两次，并重悬浮在约1ml的SC–ura 2％木糖中。将细胞接种到含有SC–ura、2％木糖的Biolector板中，并将接种物归一化到约OD₆₀₀0.2和0.4的两种不同的起始光密度。使用可透气密封物覆盖板，并在BioLector微量发酵装置(m2p-labs，型号G-BL100)中，在约30℃、800rpm和90％湿度下温育约4天。按照制造商的推荐，从Biolector获取60-100小时的生长读数。结果被示出在图4中。

实施例6：在厌氧条件下的乙醇生产

测定一小组在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株CEN.PK2-1Ca(ATCC：MYA1108)中表达XI的酵母克隆将木糖发酵成乙醇(EtOH)的能力。简单来说，将单菌落接种到增补有约0.1％葡萄糖和约3％木糖的约25ml SC–ura培养基中。将培养物在微好氧条件下，在约30℃和约200rpm下温育。在约0、24、48、72h收获样品，并通过HPLC标准测定法测定乙醇浓度。计算乙醇生产率并以每小时每升的EtOH克数为单位列出，并产生与对照Op-XI的生产率相比的FIOPC。结果被示出在表4中。

实施例7：pH对XI活性的影响

如材料和方法中所述制备来自于表达p426PGK1载体中的XI基因候选者的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株CEN.PK2-1Ca(ATCC：MYA1108)的提取物，并在pH 7.5和pH 6.0下测定XI活性。通过用pH 6下的VA除以pH 7.5下的VA并乘以100来计算列出的活性百分率。结果被列出在表5中。

实施例8：所选XI克隆的K _m

使用在材料和方法中描述的XI活性测定法并将木糖浓度在约40-600mM之间变化，测定在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1Ca(ATCC：MYA1108)中在p426PGK1载体上表达的一小组XI克隆在pH6下的K_m和V_max。使用Hanes作图来计算示出的结果，所述Hanes作图将Michaelis-Menten方程(v＝V_max[S]/(K_m+[S]))重排成：([S]/v＝K_m/V_max+[S]/V_max)，其中将[S]/v对[S]作图，产生直线，并且其中y截距＝K_m/V_max，斜率＝1/V_max，并且x截距＝-K_m。结果被列于表6中。

实施例9：从单个基因组整合基因座表达的XI活性的定量

使用常规克隆方法构建了被命名为pYDAB006的载体(图5A)，用于整合到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)基因组中的基因座YER131.5内(YER131W与YER132C之间)。通过标准PCR技术从pBluescriptII SK(+)(Agilent Technologies,Inc.Santa Clara,California)产生在每个末端带有PacI位点的载体骨架，其只含有pUC复制起点和作为可选择标志物的编码氨苄青霉素抗性蛋白的bla基因。通过标准PCR技术从酵母的基因组DNA扩增被命名为YER131.5-A和YER 131.5-B的两个300碱基对的区段，并使用重叠PCR技术与多克隆位点(MCS 1：5’-GGCGCGCCTCTAGAAAGCTTACGCGTGAGCTCCCTGCAGGGATATCGGTACCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：181))相连。在重叠PCR中使用的PCR引物被示出在下面的表7中：

然后将重叠PCR产物与载体骨架连接，产生质粒pYDAB006。

使用与pYDAB006相似的方法构建被命名为pYDURA01的载体(图5B)，用于产生酵母的可选择和可回收标志物。通过标准PCR技术从酵母的基因组DNA扩增URA3表达盒。通过标准PCR技术从yBPA317的基因组DNA扩增URA3盒两侧的200个碱基对的指纹序列(被命名为R88：TGCGTGTGCCGCGAGTCCACGTCTACTCGCGAACCGAGTGCAGGCGGGTCTTCGGCCAGGACGGCCGTGCGTGACCCCGGCCGCCAGACGAAACGGACCGCGCTCGCCAGACGCTACCCAGCCCGTTCATGCCGGCCGCGAGCCGACCTGTCTCGGTCGCTTCGACGCACGCGCGGTCCTTTCGGGTACTCGCCTAAGAC(SEQ ID NO：188))，所述yBPA317是二倍体菌株，其具有基因型MATa/MATα；URA3/ura3；YDL074.5::P(TDH3)-CBT1-T(CYC1)-R88YLR388.5::P(TDH3)-StBGL-T(CYC1)-R88/YLR388.5::P(TDH3)-StBGL-T(CYC1)-R88。在扩增中使用的引物如下面的表8中所述：

通过克隆到被命名为pYDPt005的载体(图5C)中，产生用于XI基因的表达盒。使用与pYDAB006相似的方法来产生pYDPt005。它在多克隆位点(MCS 2：5’-ACTAGTGGATCGTCGAC-3’(SEQ ID NO：195)，其中单下划线是SpeI位点，双下划线是XhoI位点，波浪下划线是PmeI位点)侧翼含有TDH3启动子和PGK1终止子。从啤酒糖酵母(S.cerevisiae)基因组DNA扩增所述启动子和终止子；在扩增期间将AscI位点添加到TDH3启动子的5’末端，同时将Kpn1位点添加到PGK1终止子的3’末端。扩增中使用的引物被描述在表9中。

将根囊鞭菌属物种(Orpinomyces sp.)的XI基因(NCBI：169733248)克隆到该载体中SpeI和XhoI位点之间。然后使用AscI、KpnI和NotI位点将根囊鞭菌属物种(Orpinomyces sp.)的XI表达盒和R88-Ura-R88片段克隆到载体pYDAB006中；得到的质粒被命名为pYDABF006(图5D)。随后，通过用SpeI和PmeI消化pYDABF0006并连接到已从p426PGK1-XI构建物扩增的编码适合的XI序列的DNA片段，将pYDABF0006中的根囊鞭菌属物种(Orpinomyces sp.)的XI基因用表2的一小组XI基因替换。在扩增期间，在紧靠XI基因的起始密码子之前添加SpeI位点和随后的Kozak样序列(6个连续的腺嘌呤)，同时向XI基因的3’末端添加Pme1位点。

通过PacI消化提取XI基因整合盒，并用于使用标准技术转化酵母菌株yBPA130。选择在SC-Ura(合成的完全培养基，不含尿嘧啶)琼脂板上生长的转化体。使用表10中示出的引物，通过PCR来证实转化体中XI盒的整合位置和存在。

然后将证实的克隆在液体YPD中生长约18小时以允许URA3标志物环化脱出，并选择在SC+5-FOA琼脂板上生长的克隆。通过PCR来证实URA3标志物的不存在。

将含有证实的XI表达盒的菌株接种到约3ml改良的YP培养基(YP+0.1％葡萄糖+3.0％木糖)中，并在约30℃和约220rpm下温育过夜。将这些过夜培养物在约25ml相同培养基中传代培养至约OD₆₀₀＝0.2。将样品在约30℃和约220rpm下温育过夜。当OD₆₀₀在约3至4之间时，收获培养物。通过以约4000rpm离心约5分钟来收集沉淀物。舍弃上清液，将沉淀物用约25ml蒸馏的去离子水洗涤，并在相同条件下再次离心。舍弃上清液，将沉淀物在约-20℃下冷冻，直至进行裂解和表征。

将细胞沉淀物融化，并在2ml微量离心管中称出约200mg每种沉淀物样品。向每个样品加入约50μl无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche Part#11873580001)，所述混合物的浓度为制造商的方案中陈述的浓度的5倍。向每个样品加入约0.5ml Y-PER可透析酵母蛋白提取试剂(Thermo Scientific Part#78999)(YP+)。将样品在旋转式混合器上在约25℃下温育约4小时。在以约10,000x g离心约10分钟后收集样品上清液，用于表征。

使用作为Bradford方法(Bradford)的改良形式的Bio-Rad蛋白质测定染料试剂浓缩物(Bio-Rad，目录号500-0006，Hercules CA)测量上面制备的XI样品提取物的总蛋白浓度。

已知酵母的生理pH范围在约pH 6至约pH 7.5的范围内(Pena,Ramirez等，1995,J.Bacteriology 4:1017-1022)。使用在材料和方法中所描述的pH 7.5下的测定条件和为pH 6.0修改的测定条件来完成在酵母生理pH下XI活性的排序。评估了20种XI当从整合在酵母YER131.5基因座中的单一拷贝表达时的比活性。结果被列于表11中。

实施例10：耐酸XI中的序列基序的鉴定

所提出的木糖异构酶的机制可以概述如下：(i)木糖结合于木糖异构酶，使得O3和O4被金属离子I配位；(ii)酶催化的开环(开环基团的身份仍是进一步研究的对象；开环可能是整个异构化过程中的限速步骤)；(iii)链延伸(糖以线性延伸形式结合)，其中O2和O4现在与金属离子I配位；(iv)O2变得去质子化，引起金属离子II从位置1迁移到相邻的位置2，其中它将糖的O1和O2与金属离子I配位在一起；(v)通过由两种金属离子提供的亲电催化所促进的氢化物迁移产生经由阴离子过渡态进行的异构化；(vi)由金属离子II返回到位置1引起过渡态瓦解；(vii)链收缩到假环状位置，其中金属离子I的配体从O2/O4变回到O3/O4；(viii)酶催化的环闭合；(ix)木酮糖从木糖异构酶上解离(Lavie等，1994,Biochemistry 33(18),5469-5480)。

鉴定到的许多XI含有XI特有的两个特征序列之一或两者：[LI]EPKP.{2}P(SEQ ID NO：204)和[FL]HD[^K]D[LIV].[PD].[GDE](SEQ ID NO：205)。鉴定了性能靠前的厚壁菌门(Firmicutes)和普氏菌属(Prevotella)的XI中存在的其他序列基序。所述基序位于包括与D-木糖和/或金属离子直接接触的残基的活性位点附近。所述基序被示出在下面的表12中：

实施例11：木糖异构酶的体内评估

对单倍体啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株yBPA130(MATa::ura3)和yBPA136(MATα::ura3)进行遗传修饰，以提高发酵期间的C5木糖利用。所述修饰包括下列修饰：通过插入内源转醛酶基因TAL1(SEQID NO：215)和木酮糖激酶基因XKS1(SEQ ID NO：216)的表达盒，来破坏本源的葡萄糖可阻遏的醇脱氢酶II基因ADH2。通过插入本源转酮酶-1基因TKL1(SEQ ID NO：217)，来破坏编码对对硝基苯基磷酸酯基因特异性的本源碱性磷酸酶的PHO13。通过插入本源D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶基因RPE1(SEQ ID NO：218)和核糖-5-磷酸缩酮异构酶基因RKI1(SEQ ID NO：219)，来破坏本源的醛糖还原酶基因GRE3。还将本源半乳糖通透酶基因GAL2(SEQ ID NO：220)的一个表达盒整合到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株中，产生单倍体菌株pBPB007(MATa::ura3)和pBPB008(MATα::ura3)。pBPB007和pBPB008的基因型为adh2::TAL1-XKS1，pho13::TKL1-XKS1，gre3::RPE1-RKI1和YLR388.5::GAL2。序列被示出在下面的表13中：

使用常规克隆方法构建了被命名为pYDAB008rDNA的载体(图6)，用于将木糖异构酶整合到啤酒糖酵母(S.cerevisiae)基因组的核糖体DNA基因座中。这种载体可以提供基因的高拷贝数整合，并引起蛋白的高水平表达。所述载体源自于pBluescript II SK(+)(AgilentTechnologies,Inc.,Santa Clara,California)。使用特异性引物序列扩增pUC复制起点和作为用于克隆的可选择标志物的编码氨苄青霉素抗性的bla基因。通过PCR扩增，从酵母基因组DNA扩增741个碱基对的区段R1区、253个碱基对的R3区和874个碱基对的R2区。通过使用重叠PCR进行组装将SEQ ID NO：181的多克隆位点(5’-GGCGCGCCTCTAGAAAGCTTACGCGTGAGCTCCCTGCAGGGATATCGGTACCGCGGCCGC-3’)插入到R1与R3/R2区之间。表14中示出了上述反应中使用的所有引物。然后将重叠PCR产物在一个反应中连接，并产生被命名为pYDAB008rDNA的rDNA整合质粒(图6)。

将pYDABF 0015(包含SEQ ID NO：244的Boles密码子优化的核酸的质粒，所述核酸编码SEQ ID NO：78的木糖异构酶)和pYDABF-0026(包含SEQ ID NO：245的Boles密码子优化的核酸的质粒，所述核酸编码SEQ ID NO：96的木糖异构酶)(两者均被描述在实施例10中)用Asc I和Kpn I限制性酶(New England Biolabs Inc.,MA,USA)消化，并将编码XI的插入片段连接到上面描述的pYDAB008rDNA整合载体(图6)中。得到的质粒被命名为pYDABF-0033(SEQID NO：78)和pYDABF-0036(SEQ ID NO：96)。此外，将从Genewiz(Genewiz Inc.,NJ,USA)订购的编码SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：58的木糖异构酶的Boles密码子优化的核酸(分别为SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：239)用Asc I和Kpn I限制性酶(New England BiolabsInc.,MA,USA)消化，并连接到pYDAB008rDNA整合载体(图6)中。

所述密码子优化的序列被示出在下面的表15中：

得到的质粒被命名为pYDABF-0033(SEQ ID NO：78)和pYDABF-0036(SEQ ID NO：96)、pYDABF-0231(SEQ ID NO：54)和pYDABF-0232(SEQ ID NO：58)。

通过Pac I限制性酶消化(New England Biolabs Inc.,MA,USA)将rDNA整合盒线性化，并使用DNA柱纯化试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA,USA)进行纯化。使用在前面的实施例中描述的标准流程，将整合盒转化到修饰的单倍体啤酒糖酵母(S.cerevisiae)菌株pBPB007(MATa::ura3)和pBPB008(MATα::ura3)中。将转化体在SC-木糖(SC完全培养基+2％木糖)琼脂板上铺板，在约30℃下温育约2-3天。然后使用表16中示出的引物组(SEQ ID NO：228、229、230、231)，通过菌落PCR分析检查在SC-木糖琼脂板上生长的菌落，以证实基因组中存在木糖异构酶。

证实的单倍体菌株是BD31328(MATa)、BD31336(MATα)、BD31526(MATa)和BD31527(MATα)、BD34364(MATa)和BD34365(MATα)、BD34366(MATa)和BD34367(MATα)。通过在YPXylose(YP+2％木糖)琼脂板上在约30℃下常规平板交配约2天，产生二倍体菌株BD31378(表达SEQ ID NO：96的木糖异构酶)、BD31365(表达SEQ ID NO：78的木糖异构酶)、BD34369(表达SEQ ID NO：54的木糖异构酶)和BD34377(表达SEQ ID NO：58的木糖异构酶)。使用特异性引物进行菌落PCR以检查交配类型(示出在表17中)，并挑取具有MATa和MATα的单菌落作为二倍体菌株BD 31378(SEQ IDNO：96)、BD31365(SEQ ID NO：78)、BD34369(SEQ ID NO：54)和BD34377(SEQ ID NO：58)。

通过常规转化流程将编码URA3序列的线性片段(SEQ ID NO：237；TTAATTAAGTTAATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGAATAAGTTTTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATAAAGCTTTTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTTTTTTTTGATTCCGGTTTCCTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAACAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTAGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATACAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGACATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAGCAGGCGGCAGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAGAATTGTCATGCAAGGGCTCCCTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAGACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGTGGGTTTAGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTATAGAACCGTGGATGATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGAAGAGGACTATTTGCAAAGGGAAGGGATGCTAAGGTAGAGGGTGAACGTTACAGAAAAGCAGGCTGGGAAGCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAAAAACTGTATTATAAGTAAATGCATGTATACTAAACTCACAAATTAGAGCTTCAATTTAATTATATCAGTTATTACCCGGGAATCTCGGTCGTAATGATTTTTATAATGACGAAAAAAAAAAAATTGGAAAGAAAAAGCTTCATGGCCTTTATAAAAAGGAACCATCCAATACCTCGCCAGAACCAAGTAACAGTATTTTACGGTTAATTAA)转化到BD 31378(SEQ ID NO：96)、BD31365(SEQ ID NO：78)、BD34369(SEQ ID NO：54)和BD34377(SEQ ID NO：58)中，并将转化体铺在SCXylose-URA(合成的完全培养基，不含尿嘧啶)上进行选择。使用表17中示出的引物(SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：236)，通过PCR对菌落进行检查。证实的菌株是BD31446(SEQ ID NO：78)、BD31448(SEQ ID NO：96)、BD34373(SEQ ID NO：54)和BD34378(SEQ ID NO：58)。

下面的表18示出了得到的酵母菌株的基因型：

实施例12：表达不同木糖异构酶的酵母菌株的发酵性能

使用DasGip发酵系统(Eppendorf,Inc.)评估两株不同的表达XI的酵母菌株的发酵性能。DasGip发酵罐允许封闭控制搅拌、pH和温度，确保发酵期间环境的一致性。使用DasGip发酵罐测试表达XI基因的酵母菌株在水解物(Hz)(用镁碱中和)作为主要碳源上的性能。在发酵开始之前，对菌株进行由下面描述的两个步骤构成的繁殖测试。

种子1：将约1ml菌株甘油储用物接种到250ml bellco带挡板摇瓶(Bellco,Inc.)中的约100ml含有约2％葡萄糖和约1％木糖的YP(酵母提取物，蛋白胨)培养基中。将菌株在约30℃和约200rpm搅拌下培养至少18小时，直至完全饱和。通过测量600nm波长处的吸光度来评估光密度。

种子2：将约20ml饱和的种子1(参见上一段)接种到含有约2.1L pH 6.0的基本培养基(1％v/v接种)的3L Bioflo装置(New Brunswick,Inc.)中。培养以补料分批方式，在约30℃下以约2L/min的恒定空气流速进行。搅拌增加范围(rpm)是在从约5小时的已发酵时间(elapsedfermentation time)(EFT)开始的约15小时内约200-626rpm。补料情况是在20小时内约0-4.8ml/min。基本培养基含(每1L)：约20％中和的水解物(Hz)，约20g/L蔗糖(来自于甘蔗汁)，约35ml营养物混合物(表19)，约1ml维生素混合物(表20)，约0.4ml消泡剂1410(Dow Corning,Inc.)和水。补料培养基含(每1L)：约20％中和的水解物(Hz)，约110g/L蔗糖(来自于甘蔗汁)，约35ml营养物混合物，约1ml维生素混合物，约0.4ml消泡剂1410(Dow Corning,Inc.)和水。

DasGip发酵：使用DasGip系统，在含有脱毒水解物和蔗糖的工业相关培养基中，在小规模发酵中对菌株进行测试。如上所述对菌株进行繁殖；使用下面的方案进行DasGip接种：

根据最终光密度评估种子2的细胞干重。使用细胞干重与光密度(600nm)的相关性来估算发酵所需的种子2培养物的体积。目标接种水平为约7％v/v，约1.5g/L的细胞干重。通过离心(约5000rpm 10min)收获近似体积的种子2培养物以沉淀细胞，并重悬浮在约17.5mlPBS中。使用重悬浮的细胞溶液来接种含有约250ml脱毒水解物和营养物溶液的500ml DasGip装置(约3.5ml/100ml培养基)。在约32℃、pH 6.3和约200rpm下进行发酵。发酵持续时间为约92小时，并定期取样。通过DasGip装置的顶盖中的端口，使用25ml steriological移液器来进行取样。取出约3ml培养物，通过离心(约5000rpm 10min)收获以沉淀细胞，并将上清液送去分析。使用标准分析技术例如高压液相色谱(HPLC)测定培养基中糖和乙醇的浓度。酵母菌株BD31378(表达SEQ ID NO：96的木糖异构酶)和BD31365(表达SEQ ID NO：78的木糖异构酶)的发酵性能分别被显示在图7A和图7B中。

血清瓶发酵：使用血清瓶发酵系统评估BD34373(SEQ ID NO：54)和BD34378(SEQ ID NO：58)的发酵性能。用新的WheatonThin-Flng Lyp塞子(VWR Inc.,PA,USA)包裹各个125mL厌氧培养瓶(VWR Inc.,PA,USA)，允许封闭控制搅拌、pH和温度，以确保发酵期间环境的一致性。使用血清瓶发酵来测试表达XI基因的酵母菌株在清洁糖培养基(参见表21(下面)，增补有营养物(上面的表19)和维生素(上面的表20))的培养基上的性能。

将酵母细胞接种到500ml bellco带挡板摇瓶(Bellco,Inc.)中的约200ml含有约0.5％葡萄糖和约3％木糖的YP(酵母提取物，蛋白胨)培养基中。将菌株在约30℃和约200rpm搅拌下培养至少18小时，直至完全饱和。通过测量600nm波长处的吸光度来评估光密度。目标接种水平为约1.5g/L的细胞干重。通过离心(约3500rpm 10min)收获近似体积的种子培养物以沉淀细胞，并重悬浮在约20ml培养基中。使用重悬浮的细胞溶液接种含有约90ml发酵培养基的150ml血清瓶。将压热灭菌的塞子置于血清瓶中，然后使用密封卷边机(Bellco Inc.,USA)将血清瓶用铝密封物(Bellco Inc.,USA)夹紧。剥去铝密封盖，然后插入针头(Fisher,USA)。在约35℃、pH 5.5、约200rpm下进行发酵。发酵持续时间为约44小时。酵母菌株BD34373(SEQ ID NO：54)的发酵性能被示出在图7C中，BD34378(SEQ ID NO：58)的发酵性能被示出在图7D中。

实施例13：由密码子优化和非密码子优化的开放阅读框编码的XI的活性的比较

使用两种方法对SEQ ID NO：38、78和96的XI的编码序列进行密码子优化：Boles密码子优化方法和DNA 2.0Gene Designer软件。密码子优化的序列被显示在下面的表22中：

基本上如实施例12中所述合成密码子优化的DNA序列并将其合并到表达盒中。产生包括被整合在酵母YER131.5基因座中的各个XI开放阅读框的单一拷贝的酵母菌株。将被证实含有XI表达盒的菌株接种到约3ml改良的YP培养基(YP+0.1％葡萄糖+3.0％木糖)中，并在约30℃和约220rpm下温育过夜。将这些过夜培养物在约25ml相同培养基中传代培养至约OD₆₀₀＝0.2。将样品在约30℃和约220rpm下温育过夜。当OD₆₀₀在约3至4之间时，收获培养物。通过以约4000rpm离心约5分钟来收集沉淀物。舍弃上清液，将沉淀物用约25ml蒸馏的去离子水洗涤，并在相同条件下再次离心。舍弃上清液，将沉淀物在约-20℃下冷冻，直至进行裂解和表征。

使用作为Bradford方法(Bradford)的改良形式的Bio-Rad蛋白质测定染料试剂浓缩物(Bio-Rad，目录号500-0006，Hercules CA)测量上面制备的XI样品提取物的总蛋白浓度。在这种测定法中，在设定到595nm的分光光度计上获取光密度读数，并将标准曲线作图为线性回归线。

使用在“木糖异构酶活性”章节中所描述的pH 7.5下的测定条件，测定XI活性。密码子优化的XI的比活性被示出在表23中。

由于这些比活性数据是在总细胞蛋白量的基础上确定的，因此对于任何给定XI来说，比活性的任何变化都是由表达水平造成的。这些数据证实，Boles密码子优化方法提高了细菌XI在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中的表达能力。

实施例14：本公开的XI与根囊鞭菌属物种(Orpinomyces sp.)的XI 的活性比较

将本公开的示例性XI的比活性与已知XI即指派为Genbank登记号169733248的根囊鞭菌属物种(Orpinomyces sp.)的XI的比活性进行比较。基本上如实施例12中所述将XI合并到表达盒中。产生包括被整合在酵母YER131.5基因座中的各个XI开放阅读框的单一拷贝的酵母菌株。使用与实施例12中所使用的方法相似的方法，在pH 7.5下测量各个克隆的活性，区别在于总蛋白浓度是基于450nm和595nm处的光密度读数，其中标准曲线被作图为参数拟合。结果被示出在下面的表24中。

尽管已经示出并描述了各种不同的具体实施方式，但应该认识到，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出各种改变。

Claims

1.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：78的第2-377位氨基酸具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

2.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：78的第2-377位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并包含下述氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO：214的氨基酸序列。

3.权利要求2的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：78的第2-377位氨基酸具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

4.权利要求1至3任一项的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：78具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

5.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：96的第2-377位氨基酸具有至少95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

6.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：96的第2-377位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并且还包含(a)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213和/或(b)SEQID NO：214的氨基酸序列。

7.权利要求6的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：96的第2-377位氨基酸具有至少95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

8.权利要求5至7任一项的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：96具有至少95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

9.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：38的第2-374位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

10.权利要求9的重组多肽，其包含下列序列中的一个、两个、三个、四个或所有五个序列：(i)SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：207；(ii)SEQ ID NO：208；(iii)SEQ ID NO：209；(iv)SEQ IDNO：210；和(iv)SEQ ID NO：211。

11.权利要求9或10的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：38具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

12.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：2的第2-374位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

13.权利要求12的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

14.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：58的第2-376位氨基酸具有至少93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

15.权利要求14的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：58具有至少93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

16.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：42的第2-375位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

17.权利要求16的重组多肽，其包含下列氨基酸序列中的一个、两个或所有三个序列：(a)SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：207的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：210的氨基酸序列；和(c)SEQ ID NO：211的氨基酸序列。

18.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：84的第2-376位氨基酸具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

19.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：84的第2-376位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并包含(i)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213的氨基酸序列和/或(ii)SEQ ID NO：214的氨基酸序列。

20.权利要求19的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：84的第2-376位氨基酸具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

21.权利要求18至20任一项的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：84具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

22.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：80的第2-377位氨基酸具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

23.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：80的第2-377位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％或95％的序列同一性的氨基酸序列，并包含(a)SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：213的氨基酸序列和/或(b)SEQ ID NO：214的氨基酸序列。

24.权利要求22的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：80的第2-377位氨基酸具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

25.权利要求22至24任一项的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：80具有至少97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

26.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：54的第2-376位氨基酸具有至少93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

27.权利要求26的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：54具有至少93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

28.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：46的第2-376位氨基酸具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

29.权利要求28的重组多肽，其包含SEQ ID NO：206或SEQ IDNO：207的氨基酸序列。

30.权利要求28或29的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：46具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

31.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：16的第2-376位氨基酸具有至少90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

32.权利要求31的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：16具有至少90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

33.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：82的第2-375位氨基酸具有至少85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

34.权利要求33的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：82具有至少85％、90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

35.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO：32的第2-377位氨基酸具有至少90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

36.权利要求35的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：32具有至少90％、93％、95％、97％或98％的序列同一性的氨基酸序列。

37.一种多肽，其包含的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176或其催化结构域或二聚化结构域具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的序列同一性或具有100％的序列同一性的核苷酸序列。

38.一种核酸，其编码权利要求1至37任一项的多肽。

39.权利要求38的核酸，其被密码子优化以用于在真核细胞中表达。

40.权利要求39的核酸，其被密码子优化以用于在酵母中表达。

41.权利要求40的核酸，其包含与SEQ ID NO：238、239、244、245、246、247、248和249中任一个的核苷酸序列或其至少编码木糖异构酶催化结构域或二聚化结构域的部分具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的序列同一性或具有100％的序列同一性的核苷酸序列。

42.权利要求39的核酸，其被密码子优化以用于在丝状真菌中表达。

43.一种核酸，其包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173和175中任一个的核苷酸序列或其编码木糖异构酶催化结构域或二聚化结构域的部分具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％的序列同一性或具有100％的序列同一性的核苷酸序列。

44.权利要求43的核酸，其与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173和175中任一个的所述核苷酸序列或其各自编码木糖异构酶催化结构域或二聚化结构域的所述部分具有低于100％的序列同一性。

45.权利要求43或44的核酸，其被密码子优化以用于在真核细胞中表达。

46.权利要求45的核酸，其被密码子优化以用于在酵母中表达。

47.权利要求46的核酸，其包含SEQ ID NO：238、239、244、245、246、247、248和249中任一个的核苷酸序列或其至少编码木糖异构酶催化结构域或二聚化结构域的部分。

48.权利要求45的核酸，其被密码子优化以用于在丝状真菌中表达。

49.一种载体，其包含权利要求38至48任一项的核酸。

50.权利要求49的载体，其还包含复制起点。

51.权利要求49或50的载体，其还包含与所述核苷酸序列可操作连接的启动子序列。

52.权利要求51的载体，其中所述启动子序列在酵母中是可操作的。

53.权利要求51的载体，其中所述启动子序列在丝状真菌中是可操作的。

54.一种重组细胞，其被工程化改造以表达权利要求1至36任一项的多肽。

55.权利要求54的重组细胞，其是真核细胞。

56.权利要求54的重组细胞，其是酵母细胞。

57.权利要求56的重组细胞，其是糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Klockera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)或耶罗维亚酵母属(Yarrowia)的酵母细胞。

58.权利要求57的重组细胞，其中所述酵母细胞属于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、博伊丁糖酵母(S.bulderi)、S.barnetti、微小糖酵母(S.exiguus)、葡萄汁糖酵母(S.uvarum)、糖化糖酵母(S.diastaticus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K.fragili)或东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)物种。

59.权利要求58的重组细胞，其是啤酒糖酵母细胞。

60.权利要求59的重组细胞，其包含引起至少一种、任两种、任三种、任四种或所有下列表型的一个或多个遗传修饰：

(a)木糖向所述细胞内的转运增加；

(b)木酮糖激酶活性增加；

(c)在木糖上的好氧生长速率增加；

(d)通过磷酸戊糖途径进入醣酵解的通量增加；

(e)醛糖还原酶活性降低；

(f)对降解物阻遏的敏感性降低；

(g)对乙醇、中间体、摩尔渗透压浓度或有机酸的耐受性增加；和

(h)副产物的产生减少。

61.权利要求60的重组细胞，其中一个或多个遗传修饰引起以下一种或多种蛋白的表达水平提高：己糖或戊糖转运蛋白、木酮糖激酶、来自于磷酸戊糖途径的酶、糖酵解酶和产乙醇酶。

62.权利要求61的重组细胞，其中表达水平的提高通过在所述重组细胞内过表达内源基因或表达异源基因来实现。

63.权利要求60的重组细胞，其中一个或多个遗传修饰引起以下一种或多种基因的表达水平降低：己糖激酶基因、MIGI基因和MIG2基因。

64.权利要求60的重组细胞，其被工程化改造以表达木糖还原酶(XR)、木糖激酶(XK)和木糖醇脱氢酶(XD)途径。

65.权利要求56的重组细胞，其中所述核酸被可操作连接于对降解物阻遏不敏感的启动子。

66.权利要求65的重组细胞，其中所述启动子是TDH3启动子、PGK1启动子、TEF1启动子或ADH1启动子。

67.权利要求54的重组细胞，其是丝状真菌细胞。

68.权利要求67的重组细胞，其中所述丝状真菌细胞属于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、支顶孢属(Acremonium)或镰孢属(Fusarium)。

69.权利要求67的重组细胞，其中所述丝状真菌细胞属于黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)或米根霉(Rhizopus oryzae)物种。

70.一种宿主细胞，其被权利要求49至53任一项的载体转化。

71.权利要求70的宿主细胞，其是原核细胞。

72.权利要求71的宿主细胞，其是细菌细胞。

73.权利要求70的宿主细胞，其是真核细胞。

74.一种生产发酵产物的方法，所述方法包括在表达所述发酵产物的条件下将权利要求54至69任一项的重组细胞在含有木糖的培养基中进行培养。

75.权利要求74的方法，其中所述培养基中的木糖由木质纤维素水解物提供。

76.权利要求74或75的方法，其中所述发酵产物是乙醇。

77.权利要求74或75的方法，其中所述发酵产物是丁醇、柴油、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺类抗生素或头孢菌素。

78.权利要求77的方法，其中所述重组细胞包含引起醇脱氢酶活性降低的遗传修饰。

79.权利要求77或78的方法，其中所述重组细胞表达向所述细胞赋予生产所述发酵产物的能力的一种或多种酶。

80.权利要求74至79任一项的方法，其中所述培养基还包含葡萄糖。

81.权利要求74至79任一项的方法，其中将所述重组细胞在厌氧条件下进行培养。

82.权利要求74至81任一项的方法，其还包括回收所述发酵产物。