CN113817662A - 用于提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于提高微生物法制备3‑羟基丙酸产率的诱导剂，属于生物发酵领域。向培养重组汉逊德巴利酵母的液体培养基中添加质量分数为45‑55％餐厨废弃油脂和0.05‑0.12％维生素B12，构建提高微生物法制备3‑羟基丙酸产率的诱导剂。本发明通过在培养菌株的培养基中添加餐厨废弃油脂和维生素B12，提高菌株对于甘油的同化能力，促进甘油途径转化3‑羟基丙酸的进行，以实现降解餐厨废弃油脂的同时还提高了3‑羟基丙酸的产率。

Description

用于提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及一种用于提高微生物法制备3- 羟基丙酸产率的诱导剂。
背景技术
3-羟基丙酸是乳酸(2-羟基丙酸)的同分异构体，由于羟基位置的不同，其化学性质更加活泼。通过氧化、脱水、酯化反应等可以合成多种重要的化学物质，如丙烯酸、丙二酸，以及生物降解性塑料聚3-羟基丙酸，还可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂。目前，主要采用化学合成和微生物法获取3-羟基丙酸，但是由于化学合成方法使用化学试剂较多，成本高且对人体危害较多，条件要求比较严格，不易控制，并且含量较低。因此，随着微生物法提取3-羟基丙酸的发展，研究人员利用工程大肠杆菌等，以甘油、葡萄糖等碳源进行发酵，但是仍然存在产率低，并且使用的原料比如碳源、氮源等较多，导致成本较高的问题，所以亟需一种提高3-羟基丙酸产率且产本低的生物方法。
餐厨废弃油脂，泛指在生活中存在的各类劣质油，如回收的食用油、反复使用的炸油等，其中，餐厨废弃油脂来源最广的为城市中大型饭店下水道的隔油池，如果长期食用可能对人体造成严重的损害，危害极大。因此，近些年，研究者也在寻求降解餐厨废弃油脂或者提取餐厨废弃油脂中有用成分的方法，但是仍然面临着餐厨废弃油脂难处理或者处理成本高等问题，而目前还没有餐厨废弃油脂用于提高 3-羟基丙酸产率的相关报道，以降解餐厨废弃油脂的同时还能提高3-羟基丙酸的产率，解决现有技术中餐厨废弃油脂难处理以及3-羟基丙酸产率低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂，以解决上述现有技术存在的问题，通过在培养菌株的培养基中添加餐厨废弃油脂，诱导菌株增强对甘油的同化能力，促进甘油途径转化3-羟基丙酸的进行，以实现降解餐厨废弃油脂的同时还提高了3-羟基丙酸的产率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂，向培养重组汉逊德巴利酵母的液体培养基中添加质量分数为45-55％餐厨废弃油脂和0.05-0.12％维生素B12，构建提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂。
优选的是，所述重组汉逊德巴利酵母的制备包括以下步骤：
将3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1导入质粒pET-28a，构建pSE-gpd1，再将3-磷酸甘油酯酶基因hor2连接到pSE-gpd1，构建pSE-gpd1-hor2，然后将其转染大肠杆菌，并在35-37℃摇瓶发酵培养16-20h，得到重组大肠杆菌；
将汉逊德巴利酵母在30-32℃摇瓶发酵培养16-20h，然后将上述两种菌液等体积混合，30-32℃培养25-30min后涂布在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上培养20-25h以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pSE-gpd1-hor2的重组汉逊德巴利酵母。
优选的是，所述液体培养基还包括葡萄糖10-15g/L、酵母浸膏3-5g/L、 (NH4)2SO45-10g/L、KH2PO4 2.0-3.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5-2.3g/L、 FeSO4·7H2O 0.01-0.02g/L。
优选的是，所述诱导剂的pH为4.5-5.0。
本发明还提供利用所述的诱导剂提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的方法，包括以下步骤：
将重组逊德巴利酵母接种液体培养基培养16-20h得到种子液；再将种子液按照体积分数6.8-10％接入新鲜的液体培养基，并在所述液体培养基中添加质量分数为45-55％餐厨废弃油脂和0.05-0.12％维生素B12，扩大培养5-7 天，获取发酵液；其中，所述的餐厨废弃油脂均分为两份，在培养0h和72h时分别加入；
检测所得发酵液中的3-羟基丙酸含量。
优选的是，还包括在发酵72h时补充葡萄糖的步骤，按照葡萄糖：液体发酵培养基为(10.0-23.5)g：1L的配比补充。
优选的是，培养方式采用间歇式转动培养，在0-24h内采用80-120r/min 转动方式培养，之后停止转动20-30min，再继续采用130-160r/min转动方式培养，持续转动至第90h，之后停止转动20-30min，再继续采用 80-120r/min转动方式培养至发酵结束。
优选的是，所述重组汉逊德巴利酵母的出发菌为汉逊德巴利酵母，保藏编号为CGMCC No.11893。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过将甘油途径转化3-羟基丙酸中的两个关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1和3-磷酸甘油酯酶基因hor2转入汉逊德巴利酵母中，构建重组菌株，可以实现其过表达两种关键酶，提高该菌株对于甘油的利用，避免了由于甘油过多抑制其甘油途径中关键酶表达的缺陷。而通过在发酵培养基中添加餐厨废弃油脂和维生素B12，该汉逊德巴利酵母重组菌株由于可以过表达甘油途径中的关键酶，提高了重组菌株对于甘油的同化能力，进而实现了餐厨废弃油脂中甘油、高级脂肪酸等物质的降解，同时还促进了甘油途径转化3-羟基丙酸的能力，提高了3-羟基丙酸的产率。因此，本发明实现了在利用低成本的餐厨废弃油脂替代部分碳源，在实现餐厨废弃油脂的降解的同时，还降低了液体培养基中部分原料尤其是碳源、氮源的用量，降低了成本，并且还提高了甘油途径的转化3-羟基丙酸的能力，提高了3-羟基丙酸的产率，为餐饮业处理餐厨废弃油脂以及工业生产3-羟基丙酸提供了新方向和新途径。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例所用的汉逊德巴利酵母，保藏编号为CGMCC No.11893，由徐州工程学院生物实验室提供；餐厨废弃油脂采集于徐州市某饭店下水道，在使用前先在80℃水浴30min，过滤去除不溶物，备用。
实施例1
重组汉逊德巴利酵母的制备：
根据GenBank中查到的S.cerevisiae的3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1和 3-磷酸甘油酯酶基因hor2设计扩增gpd1基因和hor2基因的寡核苷酸引物：
gpd1基因的引物：
上游引物F1：5’-agaccatggctgctgctgataga-3’；
下游引物R1：5’-cgaccatgggggggaagtatgatatgt-3’。
hor2基因的引物：
上游引物F2：5’-ataccatgggattgactactaaacc-3’；
下游引物R2：5’-cgaccatggtatctgagaattattact-3’。
为了便于连接载体，在上述引物中均添加了NcoI酶切位点，先将3- 磷酸甘油脱氢酶基因gpd1导入质粒pET-28a，扩增，构建pSE-gpd1，再将 3-磷酸甘油酯酶基因hor2连接到pSE-gpd1，扩增，构建pSE-gpd1-hor2。
扩增体系均为：
2×Taq PCR Mix 10μL、dNTP 4μL、上游引物/下游引物各1μL、DNA 模板100ng、DNA聚合酶1.40U，补充ddH2O至25μL。
pSE-gpd1扩增程序为：95℃2min；94℃30s，58℃30s，72℃3min，循环30次；72℃10min。
pSE-gpd1-hor2扩增程序为：95℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃ 3min，循环30次；72℃10min。
扩增产物用1.0％琼脂凝胶电泳进行检测，经扩增得到与预期目的片段相同的产物。
将所得pSE-gpd1-hor2转染感受态大肠杆菌细胞，涂布LB固体培养基，进行初步筛选阳性克隆；为了避免假阳性，对初步筛选的单菌落，用 LB液体培养基(含100ng/mL Amp)在37℃振荡培养16h，取菌液，用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，并以空白载体作为对照，筛选出阳性质粒的重组大肠杆菌。
将筛选出的阳性质粒的重组大肠杆菌在37℃摇瓶发酵培养20h，同时汉逊德巴利酵母在32℃摇瓶发酵培养20h，然后将两种菌液等体积混合，在32℃培养30min后涂布在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上培养 25h以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pSE-gpd1-hor2的重组汉逊德巴利酵母。
实施例2
(1)诱导剂制备：向培养实施例1所制备的重组汉逊德巴利酵母的液体培养基中添加质量体积比45-55％餐厨废弃油脂和0.05-0.12％维生素B12，构建提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂；上述液体培养基包括葡萄糖 10g/L、酵母浸膏3g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 2.0g/L、MgSO4·7H2O 1.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L。
(2)利用上述诱导剂制备3-羟基丙酸的步骤具体包括：
将实施例1制备的重组汉逊德巴利酵母按照接种量3％接种液体培养基培养16h得到种子液；再将种子液按照体积分数6.8％接入新鲜的液体培养基(并添加质量体积比45％餐厨废弃油脂和0.05％维生素B12)，30℃扩大培养5天，具体的：在0-24h内采用80r/min转动方式培养，之后停止转动20min，再继续采用130r/min转动方式培养，持续转动至第90h，之后停止转动 20min，再继续采用80r/min转动方式培养至发酵结束，获取发酵液；间歇性转动发酵可以满足重组汉逊德巴利酵母微氧的需求，并且根据菌种初期生长较慢、对数期生长快且数量大、后期菌种数量大但是代谢能力相对降低的特点，转动速度采用低-高-低的变动形式，再结合中间短时间停止转动的方式，满足菌种不同时期对于氧不同的需求量，以最大效率的利用培养基成分并高效率产生3-羟基丙酸。
用高效液相色谱分离纯化，检测所得发酵液中的3-羟基丙酸和甘油含量。
结果显示：每升发酵液含3-羟基丙酸53.89g；未检测出甘油。
实施例3
(1)诱导剂制备：向培养实施例1所制备的重组汉逊德巴利酵母的液体培养基中添加质量体积比45％餐厨废弃油脂和0.05％维生素B12，构建提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂；上述液体培养基包括葡萄糖12g/L、酵母浸膏4g/L、(NH4)2SO4 7.5g/L、KH2PO42.5g/L、MgSO4·7H2O 2.0g/L、 FeSO4·7H2O 0.015g/L。
(2)利用上述诱导剂制备3-羟基丙酸的步骤具体包括：
将实施例1制备的重组汉逊德巴利酵母按照接种量4％接种液体培养基培养18h得到种子液；再将种子液按照体积比7.3％接入新鲜的液体培养基(并添加质量体积比50％餐厨废弃油脂和0.075％维生素B12)，31℃扩大培养 6天，具体的：在0-24h内采用100r/min转动方式培养，之后停止转动25min，再继续采用145r/min转动方式培养，持续转动至第90h，之后停止转动 25min，再继续采用100r/min转动方式培养至发酵结束，获取发酵液；间歇性转动发酵可以满足重组汉逊德巴利酵母微氧的需求，并且根据菌种初期生长较慢、对数期生长快且数量大、后期菌种数量大但是代谢能力相对降低的特点，转动速度采用低-高-低的变动形式，再结合中间短时间停止转动的方式，满足菌种不同时期对于氧不同的需求量，以最大效率的利用培养基成分并高效率产生3-羟基丙酸。
用高效液相色谱分离纯化，检测所得发酵液中的3-羟基丙酸和甘油含量。
结果显示：每升发酵液含3-羟基丙酸57.33g；未检测出甘油。
实施例4
(1)诱导剂制备：向培养实施例1所制备的重组汉逊德巴利酵母的液体培养基中添加质量体积比55％餐厨废弃油脂和0.12％维生素B12，构建提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂；上述液体培养基包括葡萄糖15g/L、酵母浸膏5g/L、(NH4)2SO4 10g/L、KH2PO43.0g/L、MgSO4·7H2O 2.3g/L、 FeSO4·7H2O 0.02g/L。
(2)利用上述诱导剂制备3-羟基丙酸的步骤具体包括：
将实施例1制备的重组汉逊德巴利酵母按照接种量5％接种液体培养基培养20h得到种子液；再将种子液按照体积比10％接入新鲜的液体培养基(并添加质量体积比55％餐厨废弃油脂和0.12％维生素B12)，32℃扩大培养7 天，具体的：在0-24h内采用120r/min转动方式培养，之后停止转动30min，再继续采用160r/min转动方式培养，持续转动至第90h，之后停止转动 30min，再继续采用120r/min转动方式培养至发酵结束，获取发酵液；间歇性转动发酵可以满足重组汉逊德巴利酵母微氧的需求，并且根据菌种初期生长较慢、对数期生长快且数量大、后期菌种数量大但是代谢能力相对降低的特点，转动速度采用低-高-低的变动形式，再结合中间短时间停止转动的方式，满足菌种不同时期对于氧不同的需求量，以最大效率的利用培养基成分并高效率产生3-羟基丙酸。
用高效液相色谱分离纯化，检测所得发酵液中的3-羟基丙酸和甘油含量。
结果显示：每升发酵液含3-羟基丙酸56.10g；未检测出甘油。
对比例1
与实施例3不同之处在于，用汉逊德巴利酵母替代重组汉逊德巴利酵母，其余均相同。
结果显示：每升发酵液含3-羟基丙酸40.35g；未检测出甘油。
对比例2
与实施例3不同之处在于，餐厨废弃油脂用甘油替换，其余均相同。
结果显示：每升发酵液含3-羟基丙酸35.02g；检测出少量甘油。分析原因，可能由于餐厨废弃油脂中除了甘油，还含有菌种转化所需的能诱导甘油途径关键酶表达的化学成分，所以，用餐厨废弃油脂能够提高3-羟基丙酸的产率。
对比例3
与实施例3不同之处在于，不加维生素B12，其余均相同。
结果显示：每升发酵液含3-羟基丙酸35.02g；检测出少量甘油。分析原因，可能由于维生素B12能够促进脂肪转化成能量，并有助于碳水化合物的分解，所以添加维生素B12，能够满足甘油途径转化所需的能量，并且还能降解餐厨废弃油脂中的高级脂肪酸、脂肪等物质，增加甘油转化，提高3- 羟基丙酸的产率。
对比例4
与实施例3不同之处在于，用100r/min或145r/min替代间歇式转动培养，其余均相同。
结果显示：用100r/min替代时，每升发酵液含3-羟基丙酸38.69g；未检测出甘油。用145r/min替代时，每升发酵液含3-羟基丙酸40.12g；未检测出甘油。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂，其特征在于，向培养重组汉逊德巴利酵母的液体培养基中添加质量分数为45-55％餐厨废弃油脂和0.05-0.12％维生素B12，构建提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的诱导剂。
2.如权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述重组汉逊德巴利酵母的制备包括以下步骤：
将3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1导入质粒pET-28a，构建pSE-gpd1，再将3-磷酸甘油酯酶基因hor2连接到pSE-gpd1，构建pSE-gpd1-hor2，然后将其转染大肠杆菌，并在35-37℃摇瓶发酵培养16-20h，得到重组大肠杆菌；
将汉逊德巴利酵母在30-32℃摇瓶发酵培养16-20h，然后将上述两种菌液等体积混合，30-32℃培养25-30min后涂布在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上培养20-25h以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入pSE-gpd1-hor2的重组汉逊德巴利酵母。
3.如权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述液体培养基还包括葡萄糖10-15g/L、酵母浸膏3-5g/L、(NH4)2SO4 5-10g/L、KH2PO4 2.0-3.0g/L、MgSO4·7H2O1.5-2.3g/L、FeSO4·7H2O 0.01-0.02g/L。
4.如权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂的pH为4.5-5.0。
5.利用权利要求1-4任一项所述的诱导剂提高微生物法制备3-羟基丙酸产率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组汉逊德巴利酵母接种液体培养基培养16-20h得到种子液；再将种子液按照体积分数6.8-10％接入新鲜的液体培养基，并在所述液体培养基中添加质量分数为45-55％餐厨废弃油脂和0.05-0.12％维生素B12，扩大培养5-7天，获取发酵液；其中，所述的餐厨废弃油脂均分为两份，在培养0h和72h时分别加入；
检测所得发酵液中的3-羟基丙酸含量。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括在发酵72h时补充葡萄糖的步骤，按照葡萄糖：液体发酵培养基为(10.0-23.5)g：1L的配比补充。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，培养方式采用间歇式转动培养，在0-24h内采用80-120r/min转动方式培养，之后停止转动20-30min，再继续采用130-160r/min转动方式培养，持续转动至第90h，之后停止转动20-30min，再继续采用80-120r/min转动方式培养至发酵结束。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组汉逊德巴利酵母的出发菌为汉逊德巴利酵母，保藏编号为CGMCC No.11893。
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