发明内容
本发明的目的在于提供一种通过生物发酵法生产高浓度L-丙氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌XZ-A26,该菌株保藏号为CGMCC No.4036,其具有将糖类原料发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力,其是通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC 8739染色体的乳酸脱氢酶处,再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因,然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌(如附图1)。
本发明的另一个目的是提供上述菌株的构建方法,其包括下述步骤:
(1)L-丙氨酸脱氢酶基因的整合:将大肠杆菌ATCC 8739的乳酸脱氢酶基因ldhA扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上,得质粒pXZ-A01;将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A01的DNA扩增片段上,得到质粒pXZ-A02;将质粒pXZ-A02的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC 8739,筛选卡那霉素抗性的菌落,得菌株XZ-A01;将扩增的L-丙氨酸脱氢酶基因连接至质粒pXZ-A01的DNA片段,得到质粒pXZ-A03;然后将质粒pXZ-A03的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A01,培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落,得菌株XZ-A02;
(2)依次敲除上述所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因;
丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除:将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上,得质粒pXZ-A04;将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A04的DNA扩增片段上,得到质粒pXZ-A05;将质粒pXZ-A05的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株XZ-A02,筛选卡那霉素抗性的菌落,得菌株XZ-A03;将质粒pXZ-A04的DNA扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒pXZ-A06;然后将质粒pXZ-A06的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A03,培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落,得菌株XZ-A04;
乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除:按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法,分别以所得菌株XZ-A04、XZ-A06、XZ-A08和XZ-A10为起始原料,进行乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除,分别得到菌株XZ-A06、XZ-A08、XZ-A10和XZ-A12;
(3)在发酵罐中连续传代培养步骤(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ-A26。
对大肠杆菌ATCC 8739的代谢网络进行系统分析,设计出高效合成L-丙氨酸的策略。为了使细胞能够积累L-丙氨酸,需要进行三个方面的改造(如附图1):首先,需要引入L-丙氨酸脱氢酶基因。L-丙氨酸脱氢酶能够将丙酮酸转化为L-丙氨酸,同时消耗一个NADH。其次,需要敲除丙酮酸竞争途径基因。由于丙酮酸在大肠杆菌中是一个关键的中间代谢节点,因此需要将丙酮酸天然代谢途径失活,从而使代谢流全部转入L-丙氨酸的合成。这些竞争途径包括乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因。第三,需要敲除L-丙氨酸降解途径基因。L-丙氨酸在大肠杆菌中能够被丙氨酸消旋酶转化为D-丙氨酸,这会大大降低L-丙氨酸的手性纯度。因此需要敲除丙氨酸消旋酶,避免D-丙氨酸的积累。
L-丙氨酸工程菌株的构建:
根据上述的设计方案,在大肠杆菌ATCC 8739的染色体上进行基因的敲除和整合。
首先,将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC 8739染色体的乳酸脱氢酶处,得到大肠杆菌XZ-A02。本发明所用到的序列如核苷酸序列表。
通过PCR扩增的方法,从嗜热脂肪地芽孢杆菌的基因组DNA中扩增出L-丙氨酸脱氢酶基因。所用引物为alaD-F/alaD-R(序列1和2)。为了使L-丙氨酸脱氢酶基因能够在工程菌中高效、稳定地表达,将其整合至大肠杆菌ATCC 8739染色体的乳酸脱氢酶处。基因整合采用两步同源重组的方法(如附图2)。第一步,使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因(ldhA),扩增产物包含乳酸脱氢酶编码基因及其上下游各500个碱基,并将其克隆到pEASY-T1克隆载体(北京全式金生物技术有限公司)上,得到质粒pXZ-A01。第二步,以pXZ-A01质粒DNA为模板,使用引物ldhA-1/ldhA-2(序列5和6)扩增出一段DNA片段,扩增产物包含pEASY-T1载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游的500个左右碱基。第三步,将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物,得到质粒pXZ-A02。第四步,以pXZ-A02质粒DNA为模板,使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增出DNA片段I,用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒转化至大肠杆菌ATCC 8739,然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC 8739,筛选卡那霉素抗性的菌落。经过PCR验证,挑选一个正确的单菌落,将其命名为XZ-A01。第五步,将L-丙氨酸脱氢酶基因连接至第二步的PCR扩增产物,得到质粒pXZ-A03。第六步,以pXZ-A03质粒DNA为模板,使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增出DNA片段II,用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒转化至XZ-A01,然后将DNA片段II电转至带有pKD46的XZ-A01,将其转移至含有10%蔗糖的LB液体培养基,培养24小时后在含有6%蔗糖的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证,挑选一个正确的单菌落,将其命名为XZ-A02。本发明的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒及构建如下表1。
表1:本发明的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒
随后,在XZ-A02中依次敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因,使L-丙氨酸脱氢酶成为唯一能够利用丙酮酸和消耗NADH的代谢途径。基因敲除的方法和基因整合类似,也采用两步同源重组的方法。区别在于第五步,若要进行基因敲除,将第二步PCR扩增的产物进行磷酸化处理,自连得到的质粒用于第二步同源重组。在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除,得到菌株XZ-A04。所用引物为pflB-up/pflB-down(序列7和8)、pflB-1/pflB-2(序列9和10)。在XZ-A04中进行乙醇脱氢酶基因的敲除,得到菌株XZ-A06。所用引物为adhE-up/adhE-down(序列11和12)、adhE-1/adhE-2(序列13和14)。在XZ-A06中进行乙酸激酶基因的敲除,得到菌株XZ-A08。所用引物为ackA-up/pta-down(序列15和16)、ackA-1/pta-2(序列17和18)。在XZ-A08中进行富马酸还原酶基因的敲除,得到菌株XZ-A10。所用引物为frdB-up/frdC-down(序列19和20)、frdB-1/frdC-2(序列21和22)。在XZ-A10中进行丙氨酸消旋酶基因的敲除,避免L-丙氨酸被转化为D-丙氨酸,得到菌株XZ-A12。所用引物为dadX-up/dadX-down(序列23和24)、dadX-1/dadX-2(序列25和26)。
L-丙氨酸工程菌株的优化:
L-丙氨酸工程菌XZ-A12的生长和L-丙氨酸生产相耦联(如附图3)。采用代谢进化的方法,在发酵罐中连续传代培养L-丙氨酸工程菌,逐步提高工程菌的生长速度、L-丙氨酸的生产速率和产量。经过300代优化,构建出高产L-丙氨酸的工程菌XZ-A26。
本发明还有一个目的是应用大肠杆菌XZ-A26菌株(该菌株保藏号为CGMCC No.4036菌株)发酵生产L-丙氨酸,其采用厌氧培养条件,培养温度为30-42℃,控制pH在6.5-7.5,在培养基中培养保藏号为CGMCCNo.4036的XZ-A26菌株,分离提取L-丙氨酸。
种子培养基和发酵培养基组成为:糖类原料20-150g/L,氮源1-5g/L,NaH2PO41-5g/L,Na2HPO41-5g/L,MgSO4·7H2O 0.3-1g/L,CaCl22H2O 0.05-0.1g/L,微量无机盐1-5ml/L,
所述糖类原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖,及木薯、玉米、甜菜、木质纤维素的水解物和糖浆中的一种或多种;氮源为无机含氮化合物,包括氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种;微量无机盐包括可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸盐中的一种或多种。
本发明通过代谢工程的方法,构建出能发酵生产高浓度L-丙氨酸的大肠杆菌XZ-A26菌株,其属大肠埃希氏菌(Escherichia coli),该菌株于2010年7月26日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)”,其保藏号为CGMCC No.4036。利用该XZ-A26菌株发酵生产L-丙氨酸的产量高达115g/L,适合工业化生产L-丙氨酸。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步的说明,并不构成对本发明实质内容的限制。
实施例1
(XZ-A26菌株的构建)
(1)通过PCR扩增的方法,从嗜热脂肪地芽孢杆菌(来源于合肥百迈生物技术有限公司)的基因组DNA中扩增出L-丙氨酸脱氢酶基因。所用引物为alaD-F/alaD-R(序列1/序列2)。扩增体系为:StratagenePfuUltra 10Xbuffer 5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul,总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环);95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(30个循环);72℃延伸10分钟(1个循环)。
基因整合采用两次同源重组的方法(如附图2)。第一步,使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因(ldhA),扩增体系为:Stratagene PfuUltra 10Xbuffer 5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul,总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环);95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(30个循环);72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物包含乳酸脱氢酶编码基因及其上下游各500个碱基,并将其克隆到pEASY-T1克隆载体(来源于北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系为:1ul PCR扩增产物、1ul pEASY-T1克隆载体、3ul蒸馏水,总体积为5ul。轻轻混合、室温反应5分钟后加入50ul Trans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司),冰浴20分钟。42℃热激30秒,立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基,200转,37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上,过夜培养后,挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。选取一个正确的质粒,命名为pXZ-A01。第二步,以pXZ-A01质粒DNA为模板,使用引物ldhA-1/ldhA-2(序列5/序列6)扩增出一段DNA片段,扩增体系为:Stratagene PfuUltra 10Xbuffer5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul,总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环);95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸5分钟(30个循环);72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物包含pEASY-T1载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游的500个左右碱基。第三步,将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。pBM001质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)经过SmaI和SfoI双酶切,琼脂糖凝胶电泳回收,获得含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段。连接体系为10ng的第二步PCR扩增产物,30ng Km-sacB DNA片段,2ul 10XT4 ligation buffer(NEB公司),1ul T4 ligase(NEB公司,400,000cohesive end units/ml),补充蒸馏水至20ul。室温连接2小时,取5ul加入50ul Trans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司),冰浴20分钟。42℃热激30秒,立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基,200转,37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上,过夜培养后,挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。选取一个正确的质粒,命名为pXZ-A02。第四步,以pXZ-A02质粒DNA为模板,使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增出DNA片段I,扩增体系为:Stratagene PfuUltra 10Xbuffer 5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul,总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环);95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸4分钟(30个循环);72℃延伸10分钟(1个循环)。DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因上游500个碱基、Km-sacB DNA片段、乳酸脱氢酶编码基因下游500个碱基。将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC 8739,然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC 8739。电转条件为:首先准备带有pKD46的大肠杆菌ATCC 8739的电转化感受态细胞;将50ul感受态细胞置于冰上,加入50ngDNA片段I,冰上放置2分钟,转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪,电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中,吹打5次后转移至试管中,200转,37℃孵育2小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上,过夜培养后,挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落,将其命名为XZ-A01。第五步,将L-丙氨酸脱氢酶基因连接至第二步的PCR扩增产物,得到质粒pXZ-A03。第六步,以pXZ-A03质粒DNA为模板,使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3/序列4)扩增出DNA片段II。DNA片段II包含乳酸脱氢酶编码基因上游500个碱基、乳酸脱氢酶编码基因下游500个碱基。DNA片段II用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-A01,然后将DNA片段II电转至带有pKD46的XZ-A01,电转条件为:首先准备带有pKD46的XZ-A01的电转化感受态细胞;将50ul感受态细胞置于冰上,加入50ngDNA片段II,冰上放置2分钟,转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪,电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中,吹打5次后转移至试管中,200转,37℃孵育2小时。将其转移至含有10%蔗糖的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基),培养24小时后在含有6%蔗糖的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证,挑选一个正确的单菌落,将其命名为XZ-A02。
(2)依次敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因,使L-丙氨酸脱氢酶成为唯一能够利用丙酮酸和消耗NADH的代谢途径。基因敲除的方法和基因整合类似,也采用两步同源重组的方法(如附图2)。区别在于第五步,若要进行基因敲除,将第二步PCR扩增的产物进行磷酸化处理,自连得到的质粒用于第二步同源重组。具体步骤如下:第二步PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(EasyPure PCR Purification Kit,来源于北京全式金生物技术有限公司);取30ng纯化后的PCR扩增产物,加入2ul 10XT4 ligationBuffer(NEB公司)、1ul T4 Polynucleotide kinase(NEB公司),补充蒸馏水至20ul,37℃反应30分钟;加入1ul T4 ligase(NEB公司,400,000cohesive end units/ml),室温反应2小时;取5ul加入50ulTrans1-T1感受态细胞中(来源于北京全式金生物技术有限公司),冰浴20分钟。42℃热激30秒,立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基,200转,37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上,过夜培养后,挑选5个单菌落提取质粒DNA进行验证。
在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除(操作步骤同上):将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因扩增并克隆到pEASY-T1克隆载体上,得质粒pXZ-A04;将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ-A04的DNA扩增片段上,得到质粒pXZ-A05;将质粒pXZ-A05的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的菌株XZ-A02,筛选卡那霉素抗性的菌落,得菌株XZ-A03;将质粒pXZ-A04的DNA扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒pXZ-A06;然后将质粒pXZ-A06的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-A03,培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落,得菌株XZ-A04;其中,丙酮酸甲酸裂解酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A05的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A06的DNA扩增引物为:pflB-up/pflB-down(序列7/序列8),质粒pXZ-A04的DNA扩增引物为:pflB-1/pflB-2(序列9/序列10)。
在XZ-A04中进行乙醇脱氢酶基因的敲除,方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除,得到菌株XZ-A06,其中,所用乙醇脱氢酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A08的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A09的DNA扩增引物为:adhE-up/adhE-down(序列11/序列12),质粒pXZ-A07的DNA扩增引物为:adhE-1/adhE-2(序列13/序列14)。
在XZ-A06中进行乙酸激酶基因的敲除,方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除,得到菌株XZ-A08。乙酸激酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A11的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A12的DNA扩增引物为:ackA-up/pta-down(序列15/序列16),质粒pXZ-A10的DNA扩增引物为:ackA-1/pta-2(序列17/序列18)。
在XZ-A08中进行富马酸还原酶基因的敲除,方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除,得到菌株XZ-A10。富马酸还原酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A14的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A15的DNA扩增引物为:frdB-up/frdC-down(序列19/序列20),质粒pXZ-A13的DNA扩增引物为:frdB-1/frdC-2(序列21/序列22)。
在XZ-A10中进行丙氨酸消旋酶基因的敲除,方法同在XZ-A02中进行丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除,避免L-丙氨酸被转化为D-丙氨酸,得到菌株XZ-A12。丙氨酸消旋酶基因的扩增引物、质粒pXZ-A17的DNA扩增引物以及质粒pXZ-A18的DNA扩增引物为:dadX-up/dadX-down(序列23/序列24),质粒pXZ-A16的DNA扩增引物为:dadX-1/dadX-2(序列25/序列26)。
(3)发酵培养基组成为:葡萄糖120g/L,氯化铵5g/L,NaH2PO45g/L,Na2HPO4 5g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,CaCl2 2H2O 0.1g/L,微量无机盐5ml/L,培养基pH6.5。微量无机盐组成为:FeCl3·6H2O 1.5mg,CoCl2·6H2O 0.1mg,CuCl2·2H2O 0.1mg,ZnCl2 0.1mg,Na2MoO4·2H2O0.1mg,MnCl2·4H2O2 0.2mg,蒸馏水定容至1L,过滤除菌。
500ml发酵罐发酵培养基体积为300ml,121℃灭菌15min,冷却后接入XZ-A12,接种量为0.1%(V/V),发酵温度为30℃,搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5。在发酵罐中连续传代培养工程菌,每24h将发酵罐中的菌液按1∶1000的比例转接到一个新的发酵罐中。经过300代转接,得到菌株XZ-A26。
实施例2
(以XZ-A12菌株生产L-丙氨酸)
种子培养基和发酵培养基组成为:葡萄糖100g/L,氯化铵5g/L,NaH2PO4 5g/L,Na2HPO4 5g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,CaCl2 2H2O 0.1g/L,微量无机盐5ml/L,培养基pH6.5。微量无机盐组成为:FeCl3·6H2O1.5mg,CoCl2·6H2O 0.1mg,CuCl2·2H2O 0.1mg,ZnCl2 0.1mg,Na2MoO4·2H2O 0.1mg,MnCl2·4H2O2 0.2mg,蒸馏水定容至1L,过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml,121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A12,培养温度为30℃,摇床转速为50r/min,培养18h,用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L,121℃灭菌15min。接种量为0.1%(V/V),发酵温度为30℃,搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5,发酵时间为48h。
分析方法:使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))。发酵液中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的AminexHPX-87H糖分析柱。
结果:发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量:L-丙氨酸为6g/L,乳酸、乙酸、乙醇以及丁二酸含量均低于0.1g/L。
实施例3
(以XZ-A26菌株生产L-丙氨酸)
种子培养基和发酵培养基组成为:葡萄糖100g/L,氯化铵4g/L,NaH2PO45g/L,Na2HPO45g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,CaCl2 2H2O 0.1g/L,微量无机盐4ml/L,培养基pH6.5。微量无机盐组成为:FeCl3·6H2O1.5mg,CoCl2·6H2O 0.1mg,CuCl2·2H2O 0.1mg,ZnCl2 0.1mg,Na2MoO4·2H2O 0.1mg,MnCl2·4H2O 20.2mg,蒸馏水定容至1L,过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml,121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A26,培养温度为30℃,摇床转速为50r/min,培养18h,用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L,121℃灭菌15min。接种量为0.1%(V/V),发酵温度为30℃,搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5,发酵时间为48h。
分析方法:使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))。发酵液中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的AminexHPX-87H糖分析柱。
结果:发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量:L-丙氨酸为95g/L,乳酸含量低于0.1g/L、乙酸含量低于0.1g/L、乙醇含量低于0.1g/L、丁二酸含量低于0.1g/L。
实施例4
(以XZ-A26菌株生产L-丙氨酸)
种子培养基和发酵培养基组成为:葡萄糖120g/L,氯化铵5g/L,NaH2PO4 5g/L,Na2HPO4 5g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,CaCl2 2H2O 0.1g/L,微量无机盐5ml/L,培养基pH6.5。微量无机盐组成为:FeCl3·6H2O1.5mg,CoCl2·6H2O 0.1mg,CuCl2·2H2O 0.1mg,ZnCl2 0.1mg,Na2MoO4·2H2O 0.1mg,MnCl2·4H2O2 0.2mg,蒸馏水定容至1L,过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml,121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A26,培养温度为30℃,摇床转速为50r/min,培养18h,用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L,121℃灭菌15min。接种量为0.1%(V/V),发酵温度为30℃,搅拌转速为100rpm。发酵过程采用氨水控制pH在6.5,发酵时间为48h。HPLC分析发酵液中L-丙氨酸和有机酸含量:L-丙氨酸为115g/L,乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸含量均低于0.1g/L。
核苷酸或氨基酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>安徽华恒生物工程有限公司
<120>一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用
<130>
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
ggaaaaagga ggaaaaagtg atgaagatcg gcatt 35
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>2
gaaggagttg atcattgttt aacgagagag g 31
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>3
gataacggag atcgggaatg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>4
ctttggctgt cagttcacca 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>5
tctggaaaaa ggcgaaacct 20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>6
tttgtgctat aaacggcgag t 21
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>7
tgtccgagct taatgaaaag tt 22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>8
cgagtaataa cgtcctgctg ct 22
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>9
aaacgggtaa caccccagac 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>10
cggagtgtaa acgtcgaaca 20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>11
catgctaatg tagccaccaa a 21
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>12
ttgcaccacc atccagataa 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>13
tccggctaaa gctgagaaaa 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>14
gtgcgttaag ttcagcgaca 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>15
cgggacaacg ttcaaaacat 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>16
attgcccatc ttcttgttgg 20
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>17
aactaccgca gttcagaacc a 21
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>18
tctgaacacc ggtaacacca 20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>19
tgcagaaaac catcgacaag 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>20
caccaatcag cgtgacaact 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>21
gccaccatcg taatcctgtt 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>22
atagcgcacc acctcaattt 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>23
aggctactcg ctgaccattc 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>24
ggttgtcggt gaccaggtag 20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>25
tgggctatga gttgatgtgc 20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>26
ctgtatcgga cgggtcatct 20