CN103898089B - 一种高产l‑丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法 - Google Patents

一种高产l‑丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产L‑丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法。本发明提供了一种构建重组菌的方法，为突变出发菌中的lon基因和clpA基因，得到重组菌；所述突变出发菌中的lon基因为将所述出发菌中的lon基因核苷酸序列自5’末端第1310位的C突变为A；所述突变出发菌中的clpA基因为将所述出发菌中的clpA基因核苷酸序列自5’末端第1895位的T突变为G。本发明的实验证明，本发明通过将大肠杆菌工程菌XZ‑A26中的lon基因和clpA基因进行突变，得到的重组菌XZ‑A47，不仅能够提高L‑丙氨酸产量，而且还可以在自来水配置的发酵培养基中高产L‑丙氨酸，采用自来水配置可以节约成本。

Description

一种高产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及其构建方法。
背景技术
L-丙氨酸作为人体非必需氨基酸，在生物体内由甘氨酸的氨基转移至丙酮酸而成。L-丙氨酸是一种白色结晶或结晶性粉末，带有甜味，易溶于水，在食品及医药工业领域具有广泛的用途。在食品工业领域，L-丙氨酸可提高食品的营养价值，加入L-丙氨酸后能够明显提高食品及饮料中蛋白质利用率。L-丙氨酸能够改善人工合成甜味剂的味感，使其如同天然甜味剂。另外，L-丙氨酸还能够改善有机酸的酸味，使其更接近自然味道。在医药领域，L-丙氨酸常被用作氨基酸类营养药，同时L-丙氨酸也是制造维生素B6、合成泛酸钙和其他有机化合物的重要原料。
目前，L-丙氨酸的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成法主要有丙酸氯化氨化法、α-溴丙酸氯化法和氰醇法。这些方法都需要石油基原材料，如丙酸、α-溴丙酸、乙醛和氢氰酸等，因此成本受困于原油价格。随着石油价格的提升，成本会越来越高。另外，这些方法都是经过复杂的化学催化完成的，污染重，分离提取成本高，不适合可持续发展的需要。
生物法生产L-丙氨酸目前主要是以L-天冬氨酸为原料，在天冬氨酸-β-脱羧酶的催化下进行脱羧反应生产L-丙氨酸。该方法是目前国内L-丙氨酸生产厂家主要使用的生产技术。但是由于该方法中的原材料天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本依旧依赖于石油价格。随着石油资源的匮乏和价格的提升，顺酐资源的紧张和价格上涨将导致天冬氨酸的供给存在巨大的隐患，从而会影响到L-丙氨酸的生产及成本。
随着合成生物学和代谢工程的发展，近年来使用微生物发酵法生产L-丙氨酸的研究越来越受到重视。微生物发酵法能够实现以葡萄糖等糖类为原料生产L-丙氨酸。葡萄糖属于可再生的生物质资源，可以通过广泛存在于自然界中的木质纤维素降解获得。因此，使用其作为原材料，能够使L-丙氨酸的生产成本保持在稳定的水平，具有长远的经济优势。目前，已经有多株能够生产L-丙氨酸的菌株的报道。Smith等构建了一株E.coli ALS929(pTrc99A-alaD)菌株，其中在质粒中表达的丙氨酸脱氢酶AlaD能够将胞内生成的丙酮酸转化为L-丙氨酸，该菌株经过48小时发酵后，能够生产88g/L的L-丙氨酸。Lee等构建了一株E.coli ALA887(pTrc99A-alaD)菌株，发酵生产时能够在27小时内生产32g/L的L-丙氨酸。在这些菌株中，丙氨酸脱氢酶是生产L-丙氨酸的关键步骤，在报道的菌株中，编码该蛋白的基因一般是通过高拷贝质粒进行表达的。在进行菌株培养基发酵过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传。这些因素将导致发酵过程工艺复杂并提高L-丙氨酸生产的成本。因此，随着合成生物学和代谢工程的发展，构建遗传稳定的L-丙氨酸生产菌株并经过微生物发酵法生产L-丙氨酸将是未来的发展趋势。
目前菌株发酵生产L-丙氨酸使用的都是由蒸馏水配置的培养基，蒸馏水在工业生产中提高了生产的成本。开发能够直接使用自来水配置的培养基进行发酵生产L-丙氨酸的菌株并用于生产，将极大的降低L-丙氨酸的生产成本。但是相对于蒸馏水，自来水中存在大量的离子并且浓度较高。为了获得能够直接使用自来水配置的培养基进行发酵的菌株，需要提高菌株对高离子浓度的耐受力。
发明内容
本发明的一个目的是提供构建重组菌A的方法。
本发明提供的构建重组菌A（XZ-A43）的方法，包括如下步骤：将出发菌染色体上的lon蛋白编码基因替换为lon*蛋白的编码基因，得到的重组菌A；
所述lon*蛋白的氨基酸序列为将所述lon蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D。
上述方法中，所述lon*蛋白为由序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸编码的蛋白。
上述方法中，所述lon*蛋白编码基因为将所述lon蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因。
上述方法中，所述lon*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；
所述将出发菌染色体上的lon蛋白编码基因替换为lon*蛋白编码基因具体为将含有所述lon*蛋白编码基因的DNA片段Ⅱ同源重组到所述出发菌中；
所述DNA片段Ⅱ的核苷酸序列尤其具体为序列表中序列2。
上述方法中，所述出发菌为通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌；
所述出发菌具体为大肠杆菌XZ-A26CGMCC No.4036。
上述同源重组具体通过两步进行：
1）将DNA片段I导入带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A26中，进行第一次同源重组，得到中间菌XZ-A42；
2）将DNA片段Ⅱ导入所述中间菌XZ-A42中，进行第二次同源重组，得到重组菌XZ-A43（重组菌A）。
由上述的方法制备的重组菌A也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种构建重组菌B（XZ-A47）的方法。
本发明提供的构建重组菌B的方法，包括如下步骤：将上述的出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因，且将所述出发菌染色体上的clpA蛋白编码基因突变为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B；
所述lon*蛋白的氨基酸序列为将所述lon蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D；
所述clpA*蛋白的氨基酸序列为将所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位异亮氨酸I突变为丝氨酸S。
上述方法中，所述clpA*蛋白为由序列表中序列4自5’末端第1-2272位核苷酸编码的蛋白。
上述方法包括如下步骤：先所述出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因，得到重组菌A，再将所述重组菌A染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B；上述方法中，所述lon*蛋白编码基因为将所述lon蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因；
所述clpA*蛋白编码基因为将所述clpA蛋白编码基因核苷酸序列第1895位的碱基为T突变为G得到的基因；
所述lon*蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；
所述clpA*蛋白编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸；
上述方法包括如下步骤：
所述将出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因为将含有所述lon*蛋白编码基因的DNA片段Ⅲ同源重组到所述出发菌中；
所述将所述中间菌染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因为将含有所述clpA*蛋白编码基因的DNA片段Ⅳ同源重组到所述重组菌A中；
所述DNA片段Ⅲ的核苷酸序列具体为序列表中序列3；
所述DNA片段Ⅳ的核苷酸序列具体为序列表中序列4。
上述方法具体通过两步同源重组进行：
1）将DNA片段Ⅲ导入带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A43中，进行第一次同源重组，得到中间菌XZ-A46；
2）将DNA片段Ⅳ导入所述中间菌XZ-A46中，进行第二次同源重组，得到重组菌XZ-A47（重组菌B）。
由上述的方法制备的重组菌B也是本发明保护的范围。
上述的重组菌A或上述的重组菌B在产生和/或提高L-丙氨酸中的应用也是本发明保护的范围；
所述产生和/或提高L-丙氨酸具体为将所述重组菌A或所述重组菌B在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵生成。
或一种产生L-丙氨酸的方法，包括如下步骤：在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵重组菌A或所述重组菌B，收集发酵产物，即得到L-丙氨酸。
本发明的实验证明，本发明构建了两种重组菌，一种为将大肠杆菌工程菌XZ-A26中的lon基因进行突变，得到的重组菌XZ-A43，另一种为将大肠杆菌工程菌XZ-A26中的lon基因和clpA基因进行突变，得到的重组菌XZ-A47；这两种重组菌不仅能够提高L-丙氨酸产量，而且还可以在自来水配置的发酵培养基中高产L-丙氨酸，采用自来水配置可以节约成本。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大肠杆菌工程菌XZ-A26CGMCC No.4036，于2010年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC NO.4036，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。该菌株能够在无机盐培养基中发酵生产L-丙氨酸。
下述实施例中的自来水取自首创自来水公司山海关分公司（硬度：2-3mmol/L、pH=6.5-7.5、电导率：400-600μs/cm、氯化物100-250mg/L、硫酸盐100-250mg/L）。
下述实施例中的蒸馏水（硬度0、pH=7.0-8.0、电导率：5μs/cm）
实施例1、用自来水配置的培养基筛选产L-丙氨酸且耐自来水菌株
1、对比蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌工程菌XZ-A26发酵生产L-丙氨酸的影响
大肠杆菌工程菌XZ-A26CGMCC No.4036（具体特征见表1），能够在蒸馏水配置的无机盐培养基中发酵葡萄糖生产L-丙氨酸。然而，由于工业发酵中使用蒸馏水成本太高，因此希望能直接使用自来水配置培养基。
因此，对比了蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌工程菌XZ-A26发酵生产L-丙氨酸的影响。
表1生产L-丙氨酸的重组大肠杆菌
具体步骤如下：
种子培养基：将如下溶质溶解在溶剂蒸馏水中，得到种子培养基：
葡萄糖120g/L，氯化铵5g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl22H2O0.1g/L，微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。
微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O1.5mg，CoCl2·6H2O0.1mg，CuCl2·2H2O0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O0.1mg，MnCl2·4H2O0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
发酵培养基I的组成为：同种子培养基。
发酵培养基II的组成为：同种子培养基，只是用自来水替代蒸馏水作为溶剂。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A26，在30℃，摇床转速为50rpm，培养18h，用于发酵培养基接种。
3L发酵罐中发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1%（V/V）。发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm，发酵48h。中和剂为氨水，使发酵罐的pH控制在6.5。
分析方法：使用安捷伦（Agilent-1200）高效液相色谱对发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度采用伯乐（Biorad）公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱。L-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐（Daciel）公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱（Chiralpak MA(+)）。
结果见表2，菌株XZ-A26在蒸馏水配置的发酵培养基I中发酵48小时，L-丙氨酸产量达到115g/L。在自来水配置的发酵培养基II中发酵48小时，L-丙氨酸产量达80g/L，产量降低了30%。
表2重组大肠杆菌发酵生产L-丙氨酸
a使用3L的发酵罐，发酵培养基为2.4L。使用的中和剂为氨水，使发酵罐的pH控制在6.5。
b以XZ-A26菌株在自来水配置的发酵培养基II中L-丙氨酸产量定义为100%。
2、采用适应进化提高工程菌耐受自来水的能力
采用适应进化技术，在自来水配置的培养基中连续传代工程菌XZ-A26，以提高其耐受自来水的能力。
进化代谢所使用的发酵培养基同上述1中所述发酵培养基II的成分相同。进化代谢过程使用500ml的发酵罐，发酵培养基II的体积为250ml，121℃灭菌15min，冷却后接入XZ-A26，接种量为0.1%（V/V）。发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程中使用氨水为中和剂，使发酵罐的pH控制在6.5。在发酵罐中连续传代培养工程菌，每24小时将发酵罐中的菌液按照1:1000的比例转接到一个新的发酵罐中。经过820代转接，最终获得菌株XZ-A41（表1）。
使用同上述1中所述的方法，在用自来水配置的发酵培养基II中发酵获得的工程菌XZ-A41，48小时后L-丙氨酸产量达114g/L，和在蒸馏水配置的培养基中发酵产量基本一样（表2）。
上述结果表明，工程菌XZ-A41不仅可以高产L-丙氨酸，而且耐受自来水。因此，为了研究其耐受性是否是由基因突变引起的，对其基因组进行测序。
3、工程菌XZ-A41的基因组测序
(1)发酵培养与基因组制备
挑取工程菌株XZ-A41的单克隆接种到4ml的LB液体培养基中，在培养温度为37℃，转速为250rpm的条件下震荡培养过夜，设定三个平行。将培养好的三个平行中的细胞混匀并收集细胞，使用Genomic DNA Purification Kit(promega)抽提细菌基因组DNA。DNA浓度的检测通过Qubit Fluorometer和琼脂糖凝胶电泳定量完成。
(2)基因组重测序
基因组重测序由深圳华大基因科技有限公司完成。采用全基因组鸟枪法，构建Paired-End片段库进行测序，整体测序深度在100倍以上，期望数据量为500Mbp。测序采用的技术方法和路线为：DNA样品制备――上机测序――数据处理—生物信息分析。序列分析的参考序列为E.coliATCC8739的基因组序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010468.1）。
结果：对工程菌XZ-A41基因组重测序结果进行分析发现，clpA基因（编码ATP依赖型分子伴侣蛋白ClpA，GenBank No.ADT74495.1）的核苷酸序列第1895位的T突变为G，其对应的氨基酸第632位的I突变成S，将该基因命名为clpA*，编码的蛋白为clpA*。
另外，发现lon基因（编码ATP依赖型蛋白酶La，GenBank No.AFH10177.1）核苷酸序列第1310位的C突变为A，其对应的氨基酸序列第437位的A突变成D。将该基因命名为lon*，编码的蛋白为lon*。
因此，认为耐自来水性可能是由于clpA基因和lon基因突变引起的，下一步对出发菌的这两个基因进行突变，从而获得耐自来水菌株。
实施例2、lon基因突变获得产L-丙氨酸且耐自来水菌株XZ-A43
为了验证lon基因突变（C1310A）对工程菌株耐受自来水能力的影响，将lon*通过两步同源重组的方法引入XZ-A26，获得XZ-A43（表1）。具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒（Tan et al.,Appl Environ Microbiol.2013,79:4838-4844；公众可从安徽华恒生物科技股份有限公司获得；）DNA为模板，使用引物XZ-lon*cat-up/XZ-lon*sacB-down扩增出2719bp的DNA片段I（序列1）。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
DNA片段I包含编码ATP依赖型蛋白酶La的lon基因上游同源臂50个碱基（序列1自5’末端第1-50位核苷酸）、cat-sacB DNA片段（序列1自5’末端第51-2669位核苷酸）及编码ATP依赖型蛋白酶La的lon基因下游同源臂50个碱基（序列1自5’末端第2670-2719位核苷酸）。
将DNA片段I用于第一次同源重组，首先将pKD46质粒（来源于合肥百迈生物技术有限公司）通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌工程菌株XZ-A26，得到带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A26，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A26。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌工程菌株XZ-A26的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser（Bio-Rad公司）电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-lon*-up/XZ-lon*-down进行验证，正确的菌落扩增产物为3419bp的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A42。
第二步，以实施例1得到的工程菌株XZ-A41的基因组DNA为模板，使用引物XZ-lon*-up/XZ-lon*-down进行PCR扩增，获得2355bp的DNA片段II（其核苷酸序列为序列表中的序列2），DNA片段II用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-A42，得到带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A42，然后将DNA片段II电转化至带有pKD46质粒的XZ-A42。
DNA片段II包含lon*基因，lon*基因的核苷酸序列为序列2自5’末端第1-2355位核苷酸，lon*基因为lon基因的第1310位C突变为A，lon*基因编码的蛋白为将lon基因编码的蛋白的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌工程菌株XZ-A42的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser（Bio-Rad公司）电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基（250ml烧瓶中装50ml培养基），培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-lon*-up/XZ-lon*-down，正确的菌落扩增产物为2355bp的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A43。
lon*整合所用引物见表3。
使用同实施例1中所述的方法，在用自来水配置的发酵培养基II中发酵获得的工程菌XZ-A43，48小时后L-丙氨酸产量达106g/L，相对出发菌株XZ-A26提高了33%。
表3本发明中所使用的引物
实施例3、clpA基因和lon基因突变获得产L-丙氨酸且耐自来水菌株XZ-A47
将clpA*（T1895G）通过两步同源重组的方法引入实施例2获得的重组菌XZ-A43，获得XZ-A47（表1）。具体步骤如下：
第一步，以pXZ-CS质粒DNA为模板，使用引物XZ-clpA*cat-up/XZ-clpA*sacB-down扩增出2719bp的DNA片段Ⅲ（序列3）。
DNA片段Ⅲ包含clpA基因上游同源臂50个碱基（序列3自5’末端第1-50位核苷酸）、cat-sacB DNA片段（序列3自5’末端第51-2669位核苷酸）及clpA基因下游同源臂50个碱基（序列3自5’末端第2670-2719位核苷酸）。
首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至实施例2获得的重组菌XZ-A43，得到带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A43；然后将DNA片段Ⅲ电转至带有pKD46的大肠杆菌工程菌株XZ-A43，得到重组菌。
将重组菌用引物XZ-clpA*-up/XZ-clpA*-down进行PCR验证，正确的菌落扩增产物为3419bp的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A46。
第二步，以实施例1得到的工程菌株XZ-A41的基因组DNA为模板，使用引物XZ-clpA*-up/XZ-clpA*-down进行PCR扩增，获得2272bp的DNA片段Ⅳ（序列4），DNA片段Ⅳ用于第二次同源重组。
DNA片段Ⅳ包含clpA*基因，clpA*基因的核苷酸序列为序列4自5’末端第1-2272位，clpA*基因为clpA基因的第1895位T突变为G，clpA*基因编码的蛋白为将clpA基因编码的蛋白的第632位异亮氨酸I突变为丝氨酸S。
首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-A46，得到带有pKD46质粒的XZ-A46；然后将DNA片段Ⅳ电转化至带有pKD46质粒的XZ-A46，得到重组菌。
将重组菌用引物XZ-clpA*-up/XZ-clpA*-down进行PCR验证，正确的菌落扩增产物为2272bp的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A47。
上述所用引物序列见表3。
使用同实施例I中所述的方法，在用自来水配置的发酵培养基II中发酵获得的工程菌XZ-A47，48小时后L-丙氨酸产量达114g/L，相对菌株XZ-A26提高了43%（表2）。
实施例4、对比蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌工程菌XZ-A43和XZ-A47发酵生产L-丙氨酸的影响
1、对比蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌工程菌XZ-A43发酵生产L-丙氨酸的影响
使用同实施例1中所述方法，分别在用蒸馏水和自来水配置的发酵培养基中发酵XZ-A43菌株。
结果发现，经过48h的发酵后，XZ-A43菌株在蒸馏水配置的发酵培养基I中能够生产114g/L的L-丙氨酸，而在使用自来水配置的培养基II中发酵时能够生产106g/L的L-丙氨酸。XZ-A43菌株和XZ-A26相比，在使用自来水配置的培养基II中发酵时，L-丙氨酸产量提高了32.5%。
2、对比蒸馏水和自来水配置的培养基对大肠杆菌工程菌XZ-A47发酵生产L-丙氨酸的影响
使用同实施例1中所述方法，分别在用蒸馏水和自来水配置的发酵培养基中发酵XZ-A47菌株。结果发现，经过48h的发酵后，XZ-A47菌株在蒸馏水配置的发酵培养基I中能够生产114g/L的L-丙氨酸，而在使用自来水配置的培养基II中发酵时能够生产114g/L的L-丙氨酸。XZ-A47菌株和XZ-A26相比，在使用自来水配置的培养基II中发酵时，L-丙氨酸产量提高了42.5%。

Claims (11)

1.一种构建重组菌A的方法，包括如下步骤：将出发菌染色体上的lon蛋白编码基因替换为lon*蛋白的编码基因，得到的重组菌A；
所述lon*蛋白的氨基酸序列为将所述lon蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D；所述lon*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸；
所述出发菌为大肠杆菌XZ-A26CGMCC No.4036。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述lon*蛋白编码基因为将所述lon蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述将出发菌染色体上的lon蛋白编码基因替换为lon*蛋白编码基因具体为将含有所述lon*蛋白编码基因的DNA片段Ⅱ同源重组到所述出发菌中；
所述DNA片段Ⅱ的核苷酸序列为序列表中序列2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述出发菌为通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的重组菌A。
6.一种构建重组菌B的方法，包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述的方法中所述的出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因，且将所述出发菌染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B；
所述lon*蛋白的氨基酸序列为将所述lon蛋白氨基酸序列的第437位丙氨酸A突变为天冬氨酸D；
所述clpA*蛋白的氨基酸序列为将所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位异亮氨酸I突变为丝氨酸S；
所述clpA*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第1-2272位核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：先所述出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因，得到重组菌A，再将所述重组菌A染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌B；
所述lon*蛋白编码基因为将所述lon蛋白编码基因核苷酸序列第1310位的碱基为C突变为A得到的基因；
所述clpA*蛋白编码基因为将所述clpA蛋白编码基因核苷酸序列第1895位的碱基为T突变为G得到的基因；
所述lon*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2355位核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
所述将出发菌染色体上的lon编码蛋白基因替换为lon*蛋白的编码基因为将含有所述lon*蛋白编码基因的DNA片段Ⅲ同源重组到所述出发菌中；
所述将重组菌A染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因为将含有所述clpA*蛋白编码基因的DNA片段Ⅳ同源重组到所述重组菌A中；
所述DNA片段Ⅲ的核苷酸序列具体为序列表中序列3；
所述DNA片段Ⅳ的核苷酸序列具体为序列表中序列4。
9.由权利要求6-8中任一所述的方法制备的重组菌B。
10.权利要求5所述的重组菌A或权利要求9所述的重组菌B在产生和/或提高L-丙氨酸中的应用；
所述产生和/或提高L-丙氨酸具体为将所述重组菌A或所述重组菌B在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵生成。
11.一种产生L-丙氨酸的方法，包括如下步骤：在自来水作为溶剂配制的发酵培养基中发酵权利要求5所述的重组菌A或权利要求9所述的重组菌B，收集发酵产物，即得到L-丙氨酸。
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