CN107541483A - 生产左旋多巴大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生产左旋多巴的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株T002，其通过上调3‑脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达而增强3‑脱氢莽草酸脱氢酶酶活，进而可生产左旋多巴。该菌株可以利用葡萄糖无机盐培养基发酵生产左旋多巴，降低了培养基成本，从而降低了左旋多巴的生产成本。且上述重组菌株不含质粒，遗传性稳定。

Description

生产左旋多巴大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产左旋多巴重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

左旋多巴(L-DOPA)又名3-羟基-L-酪氨酸，是一种在医药卫生、保健美容等诸方面有显著功效的氨基酸衍生物。自1908年以来，世界各国将其广泛应用于临床。目前左旋多巴是治疗震颤麻痹最有效的药物。它通过血脑屏障进入脑组织，发挥作用。适用于原发性震颤麻痹症及非药原性震颤麻痹综合征。同时它对强直、运动障碍、流涎、动脉危象等均有疗效。左旋多巴是由酪氨酸形成儿茶酚胺的中间产物，即多巴胺的前体。被吸收入血的L-多巴约95％被外围组织中多巴脱羧酶脱羧，形成儿茶酚胺，不易通过血脑屏障，反而引起许多不良反应。仅有1％的L-多巴进入脑循环，到达中枢神经系统，转变为儿茶酚胺发挥治疗作用。

L-DOPA及复方左旋多巴(如美多芭)治疗常见老年病帕金森氏病己有40多年的历史，至今仍是治疗帕金森病最有效的药物，且耐受性好，不但能改善运动迟缓，缓解主要症状，而且能延长帕金森病患者的寿命。据统计，普通人群帕金森病的发病率为 0.1％，60岁以上老人的发病率为1％，80岁以上的发病率为2％。随着人口老龄化速度的加快，对L-DOPA的需求将迅速增加。左旋多巴2007年在世界畅销药中排名100。

目前，左旋多巴的制备方法主要有化学合成、植物提取、生物酶催化以及生物发酵。工业化化学合成生产左旋多巴多以香草醛和乙内酰脲为原料，经过8步的反应制得。尽管目前商品化左旋多巴主要通过不对称法合成，但化学合成过程中需要大量的金属催化物，并且过程繁杂，产物的转化效率和旋光活性均较低，而且存在着成本高、环境污染严重等众多问题。所以开发新的合成方法和思路是今后研究的重点和方向。

天然植物中存在左旋多巴。1913年生物化学家Guggenheim从蚕豆中提取得到左旋多巴。之后在很多植物中均发现存在左旋多巴，如猫豆、藜豆等，其中猫豆中的左旋多巴含量最高达到6％～9％，是提取左旋多巴最主要的原料。通过改良提取技术高从猫豆中提取左旋多巴的得率明显提高，从1.5％提高到3.4％，纯度达到99.9％。虽然从植物中直接提取左旋多巴是目前的一种方法，但是由于受到原料来源的限制，并且提取步骤繁杂，产量小，远不能满足市场需求。

生物酶转化法主要以L-酪氨酸或酚类物质为底物，通过来源于微生物的酶体外制取左旋多巴。目前已报道2种酶可以催化多巴的生成。一种是酪氨酸酚解酶(Tyrosinephenol lyase，TPL)(EC4.1.99.2)，其可催化邻苯二酚、丙酮酸和氨水生成左旋多巴，催化反应过程中需要磷酸吡哆醛(胺)为辅酶、钾离子和氨离子为辅因子。该生物催化体系中，当邻苯二酚及丙酮酸的浓度较高时会对TPL产生抑制作用甚至不可逆失活。虽然在发酵体系中加入一些硼酸根离子可以减轻邻苯二酚对酶的抑制作用，但该催化体系仍然存在着一些缺点，例如：反应时间长、转化效率不高、分离成本高、原料比较昂贵等。另一种是酪氨酸酶(Tyrosinase)，其可以酪氨酸直接作为底物，催化合成左旋多巴。申请公告号为CN104726513的中国发明专利公开了一种酶法制备左旋多巴的方法，其在缓冲溶液中加入酪氨酸和菌体细胞，在18～30℃，pH5.0～6.0 条件下进行酶促反应，将酪氨酸转化为左旋多巴。左旋多巴浓度可达27g/L，酪氨酸摩尔转化率可达99％以上，且条件温和，对映体选择性高，无消旋作用发生。但是生物酶法由于需要昂贵的原材料，使得生产成本高，难以适应工业化生产应用。

生物发酵法是以低成本的葡萄糖等为原料，通过微生物菌种发酵生产左旋多巴。Nakagawa等报道了在大肠杆菌中表达Streptomyces castaneoglobisporus的酪氨酸酶 基因可以以葡萄糖为原料生产293mg/L的左旋多巴(Nakagawa A,Minami H,Kim JS,Koyanagi T,Katayama T,Sato F,Kumagai H.A bacterial platform for fermentativeproduction of plant alkaloids.Nat Commun.2011,2:326.)。Munoz等通过改造 大肠杆菌代谢通路合成左旋多巴(Mu oz AJ,Hernández-Chávez G,de Anda R,Mart ínez A,Bolívar F,Gosset G.Metabolic engineering of Escherichia coli for improving L-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)synthesis from glucose.J Ind MicrobiolBiotechnol.2011,38(11):1845-52.)。他们首先敲除葡萄糖磷酸转移 酶基因和过表达转酮醇酶基因，增加磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖的积累，为酪 氨基酸合成提供足够前体，结果显示L-酪氨酸比生产速率提高3倍。敲除酪氨酸合成 代谢中的抑制因子基因，L-酪氨酸比生产速率提高1.9倍。解除酪氨酸的反馈抑制， 将代谢通量由磷酸烯醇式丙酮酸引向合成L-酪氨酸。2016年，中山大学的Tao Wei等 发表文章中称，发酵72h，左旋多巴的产量可达到8.5g/L(Wei T,Cheng BY,Liu JZ. Genome engineering Escherichia coli forL-DOPA overproduction from glucose. Sci Rep.2016,6:30080.)，这是目前报道的发酵法生产左旋多巴最高的产量。但是 该产量仍然不能够满足市场需求，左旋多巴的产量亟待提高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了生产左旋多巴的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株或由其传代而产生的菌株，该菌株生产左旋多巴的产率高，成本低，且遗传性稳定。

本发明一方面提供生产左旋多巴的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株T002，其通过调控3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达而改变3-脱氢莽草酸脱氢酶酶活。

示例性地，重组菌株T002通过上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达而增强3-脱氢莽草酸脱氢酶酶活，进而提高左旋多巴的产量。

示例性地，所述重组菌株T002是通过上调大肠杆菌重组菌株WJ060中的3-脱氢莽草酸酶的表达而制得的，所述重组菌株WJ060的保藏编号为CGMCC No.14602，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2017年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。

示例性地，重组菌株T002通过敲除和/或替换调控元件P1而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达；其中调控元件P1位于aroE起始密码子上游，其序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，重组菌株T002通过替换调控元件P1而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达；

示例性地，重组菌株T002通过用调控元件P2和/或P3和/或P4替换调控元件P1 而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达；

优选地，重组菌株T002通过在aroE起始密码子上游插入调控元件P2和/或P3和 /或P4而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达；

优选地，在aroE起始密码子ATG上游插入调控元件P2和/或P3和/或P4；

示例性地，所述调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2所示；调控元件P3的序列如 SEQID NO:3所示；调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，在aroE起始密码子ATG上游插入调控元件P4。

在本发明的一个具体实施例中，aroE的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG或GTG，其可与调控元件P2和/或P3和/或P4组合共同调控aroE的表达，上调3-脱氢莽草酸脱氢酶的酶活，进而提高左旋多巴的产量。

本发明还提供了一种培养基或发酵液，该培养基或发酵液包含上述重组菌株T002或由其传代而产生的菌株。

示例性地，所述发酵液为上述重组菌株T002或由其传代而产生的菌株发酵后的发酵液。

本发明还提供重组菌株T002的构建方法，其包括如下步骤：

通过同源重组方法，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子上游插入调控元件P2和/或P3和/或P4；优选地，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子ATG上游插入调控元件P2和/或P3和/或P4；

示例性地，调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2所示；调控元件P3的序列如SEQ IDNO:3所示；调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子ATG上游插入调控元件P4。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株T002用起始密码子ATG替换原始起始密码子TTG来调控aroE的表达。其可与调控元件P4共同调控上调aroE的表达，进而提高左旋多巴的产量。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株T002的构建方法，具体包括如下步骤：

S21：设计引物21，以含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)的质粒为模板进行PCR扩增，得到扩增产物aroE1；扩增产物aroE1 包含cat-sacB盒以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基序列和aroE起始密码子开始的40个碱基序列，并且aroE起始密码子的TTG被替换成ATG；

S22：将扩增产物aroE1导入含有pKD46的大肠杆菌WJ060后进行同源重组形成大肠杆菌aroE11(含有pKD46)，实现在aroE起始密码子前插入cat-sacB盒；

S23：设计引物23，以人工合成的调控元件P4的DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物aroE22；扩增产物aroE22包含调控元件P4以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基序列和aroE起始密码子开始的40个碱基序列，并且aroE起始密码子的TTG被替换成ATG；

S24：将扩增产物aroE22导入大肠杆菌aroE11进行同源重组，得到大肠杆菌aroE22，实现在aroE起始密码子前调控元件P4并且，并且aroE起始密码子的TTG被替换成ATG；

S25：去掉大肠杆菌aroE33中的pKD46质粒得到大肠杆菌T002。

优选地，在上述步骤S22与步骤S23之间增加步骤S223：设计引物22，DNA测序验证大肠杆菌aroE11；

和/或在上述步骤S24与步骤S25之间增加步骤S245:设计引物24，DNA测序验证大肠杆菌aroE22。

示例性地，引物21的序列为：

aroE1-up：GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATAG

TGACGGAAGATCACTTC

aroE1-down：CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCA

ATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物22的序列为：

2-aroE-1-up：TTCAGAAATCCGCGATGCCCTGA

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

示例性地，引物23的序列为：

aroE-P4-s：GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATA

TATCTCTGGCGGTGTTG

aroE-P4A-a：CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCA

TAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

示例性地，引物24的序列为：

w-promoter-s：TTATCTCTGGCGGTGTTG

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

示例性地，在本发明的具体实施例，步骤S21中并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)即可。

示例性地，cat-sacB盒的序列如SEQ ID NO:5所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

示例性地，步骤S22中，扩增产物aroE1通过电转化法导入含有pKD46的重组菌株WJ060。

示例性地，通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至重组菌株WJ060构建含有pKD46质粒的重组菌株WJ060。

示例性地，步骤S24中，扩增产物aroE22通过电转化法导入含有大肠杆菌aroE11中。

本发明还提供上述重组菌株T002或由其传代而产生的重组菌在生产左旋多巴中的应用。

本发明还提供上述重组菌株T002或由其传代而产生的重组菌株发酵生产左旋多巴的方法。

示例性地，将重组菌株T002与重组菌株WJ060以任意比例组合后进行发酵生产左旋多巴。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株T002发酵生产左旋多巴的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株T002接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，有氧发酵培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-100g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供了另外一种生产左旋多巴的大肠杆菌重组菌株T004，其以重组菌株WJ060或上述重组菌株T002为出发菌株进行构建。

示例性地，重组菌株T004以上述重组菌株T002为出发菌株进行构建。

重组菌株T004通过调控酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达而改变酪氨酸羟化酶的酶活，进而提高左旋多巴的产量。

优选地，重组菌株T004通过上调酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达而改变酪氨酸羟化酶的酶活。

示例性地，重组菌株T004通过在酪氨酸羟化酶基因hpaBC起始密码子上游插入调控元件而上调酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达；

优选地，重组菌株T004通过在hpaBC起始密码子ATG上游插入调控元件；

示例性地，所述调控元件为P1和/或P3和/或P4；

示例性地，所述调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；调控元件P3的序列如 SEQID NO:3所示；调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，在hpaBC起始密码子ATG上游插入调控元件P4。

示例性地，重组菌株T004的保藏号为CGMCC No.14247，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2017年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。

本发明还提供上述重组菌株T004的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，插入调控元件P1和/或P3和/或P4。

优选地，在酪氨酸羟化酶hpaBC起始密码子上游起始密码子上游插入调控元件P1和/或P3和/或P4。

示例性地，在酪氨酸羟化酶hpaBC起始密码子ATG上游起始密码子上游插入调控元件P1和/或P3和/或P4。

示例性地，调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述调控元件P3的序列如 SEQID NO:3所示；所述调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，在酪氨酸羟化酶hpaBC起始密码子ATG上游插入调控元件P4。

在本发明的一个具体实施方式中，以重组菌株T002为出发菌株，重组菌株T004 的构建方法具体包括如下步骤：

S41：设计引t41，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB (cat-sacB盒)的质粒为模板进行PCR扩增，得到扩增产物hpaBC1。扩增产物hpaBC1 包含cat-sacB盒以及两端分别是hpaBC1起始密码子上游40个碱基和hpaBC1起始密码子开始的40个碱基；

S42：将扩增产物hpaBC1导入含有pKD46的大肠杆菌T002进行同源重组得到大肠杆菌hpaBC1，实现在hpaBC1起始密码子前插入cat-sacB盒；

S43：设计引物t43，以人工合成的调控元件P4的DNA为模板进行扩增，得到扩增产物hpaBC2，扩增产物hpaBC2包含调控元件P4以及两端分别是hpaBC起始密码子上游40个碱基和hpaBC起始密码子开始的40个碱基；

S44：将扩增产物hpaBC2导入大肠杆菌hpaBC1进行同源重组得到大肠杆菌hpaBC2，实现在hpaBC起始密码子前插入调控元件P4；

S485：去掉大肠杆菌hpaBC2中的pKD46质粒得到重组大肠杆菌T004。

上述重组大肠杆菌T004的构建过程中，可任选地，对每一步获得的重组大肠杆菌(例如，大肠杆菌hpaBC1、大肠杆菌hpaBC2)进行DNA测序验证。

示例性地，引物t41的序列为：

hpaBC-up：AACTATGAACATTGTCGATCAACAAACTTTTCGCGATGCG

GTGACGGAAGATCACTTC

hpaBC-down：TCCGTGGTGATGATATTGACCGCCGCGCCCATGCAGGACA

ATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物t43的序列为：

hpaBC1-P4-up：AACTATGAACATTGTCGATCAACAAACTTTTCGCGAT

GCGTTATCTCTGGCGGTGTTG

hpaBC1-P4-down：

TCCGTGGTGATGATATTGACCGCCGCGCCCATGCAGGACATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

示例性地，在本发明的具体实施例中，并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)即可。

示例性地，cat-sacB盒的序列如SEQ ID NO:5所示，调控元件P1的序列如SEQ IDNO:1所示；调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示；调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4 所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

本发明还提供上述重组菌株T004或由其传代而产生的重组菌在生产左旋多巴中的应用。

本发明还提供上述重组菌株T004或由其传代而产生的重组菌发酵生产左旋多巴的方法。

示例性地，将重组菌株WJ060、上述重组菌株T002、上述重组菌株T004组成的组，以任意的单菌株，或任意的两种菌株以任意比例组合，或三种菌株以任意比例组合进行发酵。

本发明还提供重组菌株T004或由其传代而产生菌株的培养物或其加工物，例如发酵液，培养基，冻干粉以及重组菌株T004与其他菌株混合培养的发酵液、培养基、冻干粉等。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株T004发酵生产左旋多巴的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株T004接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，有氧发酵培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-100g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供包含重组菌株WJ060、上述重组菌株T002、重组菌株T004组成的组，或由其传代而产生的菌株的培养物或其加工物。

本发明提供了生产左旋多巴的大肠杆菌重组菌株：重组菌株T002和重组菌株T004，其在有氧条件下，均可以利用葡萄糖无机盐培养基发酵生产左旋多巴，降低了培养基成本，从而降低了左旋多巴的生产成本。且上述重组菌株均不含质粒，遗传性稳定。

附图说明

图1大肠杆菌中左旋多巴的生物合成途径(Glucose：葡萄糖；E4P：赤藓糖-4- 磷酸；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；PYR：丙酮酸；DAHP：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸；DHS：3-脱氢莽草酸；Shikimate：莽草酸；Tyrosine：酪氨酸；L-dopa：左旋多巴；PykAF:丙酮酸激酶；TktA:转酮醇酶；GalP：半乳糖MFS转运蛋白；Glk：葡萄糖激酶；PtsI：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I；Pgi：葡萄糖-6-磷酸异构酶； AroF:3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶；AroE:3-脱氢莽草酸脱氢酶；HpaBC：酪氨酸羟化酶)；

图2为本发明实施例中含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的质粒pEASY-cat-sacB结构示意图；

图3为本发明实施例中大肠杆菌重组菌株T002、T004、和WJ060发酵生产左旋多巴的比较结果图；

图4为本发明实施例中大肠杆菌重组菌株T004大规模发酵生产左旋多巴过程图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请中的关于各种酶的简称，例如：aroE即可以代表3-脱氢酶莽草酸脱氢酶的基因，也可代表3-脱氢酶莽草酸脱氢酶，具体所代表的含义依据上下文理解。

另外，本发明提供的重组菌株T004，并不必须以WJ060为出发菌株，也可以其他的可以生产3-脱氢酶莽草酸的大肠杆菌为出发菌株，通过基因重组，对3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)、酪氨酸羟化酶(hpaBC)等的表达进行改造，以及插入调控元件，改变各个酶起始密码子等方式进行构建。也可以大肠杆菌DSM1576为出发菌株，通过对3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroF)、转酮醇酶(tktA)、半乳糖MFS转运蛋白(galP)、葡萄糖激酶(glk)、磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶(Phosphoenolpyruvate sugar phosphotransferase system,PTS system)、丙酮酸激酶、磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、酪氨酸羟化酶(hpaBC)等的表达进行改造，以及插入调控元件，改变各个酶起始密码子等方式进行构建。

例如，以大肠杆菌DSM1576为出发菌株，通过基因重组，先下调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达或不表达，将3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF 中第443位的碱基C突变为T，上调转酮醇酶(tktA)的表达，上调半乳糖MFS转运蛋白(galP)的表达，上调葡萄糖激酶(glk)的表达，下调磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)的表达或不表达，下调丙酮酸激酶(pykA和/或pykF)的表达或不表达，下调磷酸葡萄糖异构酶(pgi)的表达或不表达，再上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达，上调酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达，依据各酶的表达需要(上调/下调)合成相应的调控元件，并将其插入相应酶的起始密码子上；且可选择地，改变相应酶的起始密码子序列等进行构建。

或者通过基因重组，直接上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达，将3-脱氧 -D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF中第443位的碱基C突变为T，上调转酮醇酶(tktA)的表达，上调半乳糖MFS转运蛋白(galP)的表达，上调葡萄糖激酶(glk) 的表达，下调磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)的表达或不表达，下调丙酮酸激酶(pykA和/或pykF)的表达或不表达，下调磷酸葡萄糖异构酶(pgi)的表达或不表达，上调酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达，依据各酶的表达需要(上调/下调)合成相应的调控元件，并将其插入相应酶的起始密码子上；且可选择地，改变相应酶的起始密码子序列等进行构建。

下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1大肠杆菌重组菌株T002的构建

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:5所示)的质粒pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物21 aroE1-up/aroE1-down扩增第一步同源重组的片段aroE1。引物21的序列为：

aroE1-up(正向引物)：

GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATAGTGACGGAAGATCACTTC

aroE1-down(反向引物)：

CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCAATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L) 2μL、100％DMSO 1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。

扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、 72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroE1产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基和aroE 起始密码子开始的40个碱基。

将获得的aroE1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌重组菌株WJ060(保藏编号为CGMCC No.14602，于2017年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)后进行同源重组，实现在aroE起始密码子前插入cat-sacB 盒。具体过程如下：

通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌WJ060；将aroE1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌WJ060。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌DSM1576的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroE1片段，冰上放置2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2 小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR 扩增及DNA测序引物22为：

2-aroE-1-up：TTCAGAAATCCGCGATGCCCTGA

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroE11(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P4(如SEQ ID NO:4所示)的DNA为模板，使用引物23 aroE-P4-s/aroE-P4A-a扩增第二步同源重组的片段aroE22。引物23序列为：

aroE-P4-s(正向引物)：

GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATATATCTCTGGCGGTGTTG

aroE-P4A-a(反向引物)：

CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L) 2μL、100％DMSO 1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。

扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、 72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroE2产物包含调控元件P1以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基和aroE起始密码子开始的40个碱基。

获得的aroE22这个扩增产物导入大肠杆菌aroE11后进行第二步同源重组，实现在aroE起始密码子前插入调控元件P4并且，并且起始密码子的TTG被替换成ATG。

第二步同源重组是将aroE22片段电转至大肠杆菌aroE11。电转条件为：首先准备大肠杆菌aroE11的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroE2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37℃、200rpm 转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株aroE22。

去掉重组菌株aroE22中的pKD46质粒。pKD46质粒是温敏型的，其通过提高生长温度到37℃，传代培养即可去除。也可采用常规的质粒去除方法，例如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、紫外线处理等。本实施例采用提高生长温度去除pKD46质粒。

取300μL重组菌株aroE22菌液(不含pKD46质粒)转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR 扩增及DNA测序引物24为：

w-promoter-s：TTATCTCTGGCGGTGTTG

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌T002，用于左旋多巴生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例2大肠杆菌重组菌株T004的构建

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:5所示)的质粒pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物t41 hpaBC-up/hpaBC-down扩增第一步同源重组的片段hpaBC1。引物t41序列为：

hpaBC-up(正向引物)：

AACTATGAACATTGTCGATCAACAAACTTTTCGCGATGCGGTGACGGAAGATCACTTC

hpaBC-down(反向引物)：

TCCGTGGTGATGATATTGACCGCCGCGCCCATGCAGGACAATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L) 2μL、100％DMSO 1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。

扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、 72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的hpaBC1产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是hpaBC起始密码子上游40个碱基和hpaBC起始密码子开始的40个碱基。

将获得的hpaBC1这个扩增产物导入含有pKD46的大肠杆菌T002后进行同源重组，实现在hpaBC起始密码子前插入cat-sacB盒。首选通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌T002，然后将hpaBC1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌T002。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌T002的电转化感受态细胞；将50L感受态细胞置于冰上，加入50-100ng hpaBC1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad 电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL 试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物t42为：

hpaBC-1-up(正向引物)：CTGATTAATATCGGCTATGG

hpaBC-T-down(反向引物)：CAAAAAGGTTTGAAAGCGGC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌hpaBC1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P4(如SEQ ID NO:4所示)DNA为模板，使用引物t43 hpaBC-P4-up/hpaBC1-P4-down扩增第二步同源重组的片段hpaBC2。引物t43序列为：

hpaBC1-P4-up(正向引物)：

AACTATGAACATTGTCGATCAACAAACTTTTCGCGATGCGTTATCTCTGGCGGTGTTG

hpaBC1-P4-down(反向引物)：

TCCGTGGTGATGATATTGACCGCCGCGCCCATGCAGGACATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L) 2μL、100％DMSO 1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。

扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、 72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的hpaBC2产物包含调控元件P4以及两端分别是hpaBC起始密码子上游40个碱基和hpaBC起始密码子开始的40个碱基。

将获得的hpaBC2这个扩增产物导入大肠杆菌hpaBC1后进行第二步同源重组，实现在hpaBC起始密码子前插入调控元件P4。

第二步同源重组是将hpaBC2片段电转至大肠杆菌hpaBC1。电转条件为：首先准备大肠杆菌hpaBC1的电转化感受态细胞；将50L感受态细胞置于冰上，加入50-100ng hpaBC2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37℃、200rpm 转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌hpaBC2。

将大肠杆菌hpaBC2去掉pKD46质粒。

取300μL大肠杆菌hpaBC2(不含pKD46质粒)菌液转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR 扩增及DNA测序引物t44为：

w-promoter-s(正向引物)：TTATCTCTGGCGGTGTTG

hpaBC-T-down(反向引物)：CAAAAAGGTTTGAAAGCGGC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌T004，用于左旋多巴的生产测试。

该大肠杆菌重组菌株T004已于2017年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.14247。

实施例3大肠杆菌重组菌株WJ060、重组菌株T002和重组菌株T004发酵生产左旋多巴

本发明中所提及种子培养基或发酵培养基中的各成分及各成分的含量、发酵温度、发酵体系的pH值、发酵时间、接种量均可依据需要进行相应的调整。例如：

起始葡萄糖含量为20g/L-100g/L，具体地可为20g/L或30g/L或40g/L或50g/L或60g/L或 70g/L或80g/L或90g/L或100g/L等(发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/L)；

酵母提取物的含量为0-5g/L，具体可为0g/L或1g/L或2g/L或3g/L或4g/L或5g/L等；

胰蛋白胨的含量为0-10g/L，具体可为0g/L或1g/L或2g/L或3g/L或4g/L或5g/L或6g/L或 7g/L或8g/L或9g/L或10g/L等；

NaCl的含量为0g/L-10g/L，具体可为0g/L或1g/L或2g/L或3g/L或4g/L或5g/L或6g/L或 7g/L或8g/L或9g/L或10g/L等；

柠檬酸的含量为1g/L-5g/L，具体可为1g/L或2g/L或3g/L或5g/L等；

KH₂PO₄的含量为2.5g/L-10g/L，具体可为2.5g/L或5g/L或7.5g/L或10g/L等；

K₂HPO₄·3H₂O的含量为2.5g/L-10g/L，具体可为2.5g/L或5g/L或6.5g/L或10g/L等；

(NH₄)₂HPO₄的含量为0.8g/L-4.4g/L，具体可为0.8g/L或1.2g/L或1.6g/L或2.0g/L或 3.5g/L或4.4g/L等；

MgSO₄·7H₂O的含量为1g/L-4g/L，具体可为1g/L或2g/L或3g/L或4g/L等；

FeCl₃·6H₂O的含量为0.05mg/L-0.20mg/L，具体可为0.05mg/L或0.10mg/L或0.16mg/L或 0.20mg/L等；

CaCl₂的含量为3mg/L-15mg/L，具体可为3mg/L或7mg/L或10mg/L或11mg/L或13mg/L或 15mg/L等；

Thiamine HCl的含量为1mg/L-5mg/L，具体可为1mg/L或2mg/L或3mg/L或4mg/L或5mg/L 等；

ZnCl₂的含量为0.01mg/L-0.03mg/L，具体可为0.01mg/L或0.02mg/L0.03mg/L等；

CoCl₂·6H₂O的含量为1mg/L-6mg/L，具体可为1mg/L或2mg/L或4mg/L或6mg/L等；

CuSO₄·5H₂O的含量为0.2mg/L-1mg/L，具体可为0.2mg/L或0.4mg/L或0.6mg/L或0.8mg/L或 1mg/L等；

发酵的温度为25℃-42℃，具体可为25℃或30℃或37℃或40℃或42℃等；

发酵的体系的pH值为6.0-8.0，具体可为6.0或7.0或8.0等；

发酵的时间为24小时-96小时，具体可为24小时或36小时或48小时或60小时或72小时或 84小时或96小时等；

接种量的体积百分比为0.05％-15％，具体可为或0.05％或2％或5％或10％或15％等。

下面示例性地介绍发酵过程。

种子培养基为含0.5％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

摇瓶发酵培养基为NBS培养基，由以下成分组成：

葡萄糖20g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 6.5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 3.5g/L，MgSO₄0.120g/L， CaCl₂ 11mg/L，Thiamine HCl(盐酸硫胺素)5mg/L，FeCl₃·6H₂O 0.16mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.2mg/L， CuSO₄·5H₂O 0.015mg/L，Na₂MoO4·2H₂O 0.02mg/L，ZnCl₂ 0.02mg/L，H₃BO₃ 0.005mg/L。

大肠杆菌重组菌株T002、T004和WJ060发酵生产左旋多巴，包括如下步骤：

(1)种子培养：15mL试管中种子培养基为3mL，121℃灭菌15分钟。冷却后分别将重组菌株T002、T004和WJ060单菌落接种到3mL种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养：取200μL上述种子菌液，接种于含有10mL发酵培养基的100mL灭菌锥形瓶中，37℃，250rpm摇床培养24小时，得到发酵液。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行分析测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Bio-Rad)公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱(300mm×7.8mm，9μm)；流动相为5mM硫酸，流速0.6mL/min，柱温63℃，检测波长210nm。左旋多巴标准品购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为PHR1271-500MG。

结果：大肠杆菌重组菌株T002、T004和WJ060发酵24小时后，发酵液中的左旋多巴浓度如图3所示。根据图3结果表明，经过改造以后的重组菌株T002和T004，都能够生产左旋多巴。大肠杆菌重组菌株T004可以生产2.8g/L的左旋多巴。

实施例4重组菌株T004扩大发酵生产左旋多巴

一级种子培养基为含0.5％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

二级种子培养基为含2％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：

葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

初始发酵罐培养基由以下成分组成：

大量元素：起始葡萄糖20g/L、柠檬酸2g/L、KH₂PO₄7.5g/L、(NH₄)₂SO₄1.6g/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L；和

微量元素：FeSO₄·7H₂O 75mg/L、MnSO₄·H₂O 4.5mg/L、Na₂SO₄20mg/L、ZnSO₄6mg/L、CoCl₂·6H₂O 4mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.6mg/L。

大肠杆菌重组菌株T004扩大发酵生产左旋多巴，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：15mL试管中一级种子培养基为3mL，121℃灭菌15分钟。冷却后将基因工程大肠杆菌T004单菌落接种到3mL种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于二级种子培养基接种。

(2)二级种子培养：1L摇瓶中二级种子培养基为200mL，121℃灭菌15分钟。冷却后将2mL一级种子培养液接种到200mL二级种子培养基，在37℃，250rpm摇床培养24小时，用于发酵罐培养基接种。

(3)发酵罐补料发酵生产：取200mL上述二级种子菌液，接种于装有2L初始发酵罐培养基的5L Biotech-5BG发酵罐中(上海保兴生物设备工程有限公司)，在37℃，pH6.5(通过浓氨水调控pH)，溶氧20％的条件下发酵。发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/L 以下时，开始用浓度为500g/L的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/L。定时取样分析发酵生产情况。

分析方法：与实施例3中的分析方法相同。

结果：大肠杆菌重组菌株T004扩大发酵结果如图4所示。根据图4结果表明，补料发酵条件下发酵72h后，发酵液中积累的左旋多巴达到最高浓度，为57g/L，糖酸摩尔转化率为15％，此时，发酵液中另外还有1.8g/L酪氨酸积累，基本没有乙酸等其他发酵副产物的积累，葡萄糖被完全转化。

本实施例提供的保藏号为CGMCC NO.14247的大肠杆菌重组菌株T004是一种新型的可用于生产左旋多巴的微生物菌株。该菌株不含有质粒，遗传稳定性高；发酵过程简单，发酵时间短，生产的左旋多巴的产率高，可达57g/L，远远超过目前左旋多巴产量最高的生物酶转化法(27g/L)。且本实施例提供的重组菌株T004在发酵过程中，葡萄糖的含量只需控制在1g/L以下，大大降低了左旋多巴的生产成本，且发酵结束时，葡萄糖被完全转化，发酵液中基本没有乙酸等副产物的积累，其在大规模工业生产中具有很大的发展潜力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 生产左旋多巴大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用

<130> 2017

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P1

<400> 1

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cttttggtgc 60

gtcagtcagt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P2

<400> 2

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc tgaggtggct 60

tattattcgt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 3

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P3

<400> 3

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc actggctcgt 60

aatttattgt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 4

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P4

<400> 4

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cgtattgtta 60

gcatgtacgt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 5

<211> 2932

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cat-SacB

<400> 5

gtgacggaag atcacttcgc agaataaata aatcctggtg tccctgttga taccgggaag 60

ccctgggcca acttttggcg aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt 120

caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga 180

gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa 240

tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag 300

accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt 360

tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga attccgtatg 420

gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc 480

catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag 540

tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct 600

aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt 660

tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa 720

tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt 780

tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg 840

cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc tggtgctacg 900

cctgaataag tgataataag cggatgaatg gcagaaattc gaaagcaaat tcgacccggt 960

cgtcggttca gggcagggtc gttaaatagc cgctagatct aagtaaatcg cgcgggtttg 1020

ttactgataa agcaggcaag acctaaaatg tgtaaagggc aaagtgtata ctttggcgtc 1080

accccttaca tattttaggt ctttttttat tgtgcgtaac taacttgcca tcttcaaaca 1140

ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac agtacataaa aaaggagaca tgaacgatga 1200

acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag tattaacctt tactaccgca ctgctggcag 1260

gaggcgcaac tcaagcgttt gcgaaagaaa cgaaccaaaa gccatataag gaaacatacg 1320

gcatttccca tattacacgc catgatatgc tgcaaatccc tgaacagcaa aaaaatgaaa 1380

aatatcaagt tcctgaattc gattcgtcca caattaaaaa tatctcttct gcaaaaggcc 1440

tggacgtttg ggacagctgg ccattacaaa acgctgacgg cactgtcgca aactatcacg 1500

gctaccacat cgtctttgca ttagccggag atcctaaaaa tgcggatgac acatcgattt 1560

acatgttcta tcaaaaagtc ggcgaaactt ctattgacag ctggaaaaac gctggccgcg 1620

tctttaaaga cagcgacaaa ttcgatgcaa atgattctat cctaaaagac caaacacaag 1680

aatggtcagg ttcagccaca tttacatctg acggaaaaat ccgtttattc tacactgatt 1740

tctccggtaa acattacggc aaacaaacac tgacaactgc acaagttaac gtatcagcat 1800

cagacagctc tttgaacatc aacggtgtag aggattataa atcaatcttt gacggtgacg 1860

gaaaaacgta tcaaaatgta cagcagttca tcgatgaagg caactacagc tcaggcgaca 1920

accatacgct gagagatcct cactacgtag aagataaagg ccacaaatac ttagtatttg 1980

aagcaaacac tggaactgaa gatggctacc aaggcgaaga atctttattt aacaaagcat 2040

actatggcaa aagcacatca ttcttccgtc aagaaagtca aaaacttctg caaagcgata 2100

aaaaacgcac ggctgagtta gcaaacggcg ctctcggtat gattgagcta aacgatgatt 2160

acacactgaa aaaagtgatg aaaccgctga ttgcatctaa cacagtaaca gatgaaattg 2220

aacgcgcgaa cgtctttaaa atgaacggca aatggtacct gttcactgac tcccgcggat 2280

caaaaatgac gattgacggc attacgtcta acgatattta catgcttggt tatgtttcta 2340

attctttaac tggcccatac aagccgctga acaaaactgg ccttgtgtta aaaatggatc 2400

ttgatcctaa cgatgtaacc tttacttact cacacttcgc tgtacctcaa gcgaaaggaa 2460

acaatgtcgt gattacaagc tatatgacaa acagaggatt ctacgcagac aaacaatcaa 2520

cgtttgcgcc aagcttcctg ctgaacatca aaggcaagaa aacatctgtt gtcaaagaca 2580

gcatccttga acaaggacaa ttaacagtta acaaataaaa acgcaaaaga aaatgccgat 2640

attgactacc ggaagcagtg tgaccgtgtg cttctcaaat gcctgattca ggctgtctat 2700

gtgtgactgt tgagctgtaa caagttgtct caggtgttca atttcatgtt ctagttgctt 2760

tgttttactg gtttcacctg ttctattagg tgttacatgc tgttcatctg ttacattgtc 2820

gatctgttca tggtgaacag ctttaaatgc accaaaaact cgtaaaagct ctgatgtatc 2880

tatctttttt acaccgtttt catctgtgca tatggacagt tttccctttg at 2932

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物21 aroE1-up

<400> 6

gatgccctga cgggtgaact gtttcgacag gggtaacata gtgacggaag atcacttc 58

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物21 aroE1-down

<400> 7

ctgtgggcta tcggattacc aaaaacagca taggtttcca atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物22 2-aroE-1-up

<400> 8

ttcagaaatc cgcgatgccc tga 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物22 2-aroE-T-down

<400> 9

cagttgcata ccattcacga gag 23

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物23 aroE-P4-s

<400> 10

gatgccctga cgggtgaact gtttcgacag gggtaacata tatctctggc ggtgttg 57

<210> 11

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物23 aroE-P4A-a

<400> 11

ctgtgggcta tcggattacc aaaaacagca taggtttcca tagctgtttc ctggtttaaa 60

c 61

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物24 w-promoter-s

<400> 12

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物24 2-aroE-T-down

<400> 13

cagttgcata ccattcacga gag 23

<210> 14

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t41 hpaBC-up

<400> 14

aactatgaac attgtcgatc aacaaacttt tcgcgatgcg gtgacggaag atcacttc 58

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t41 hpaBC-down

<400> 15

tccgtggtga tgatattgac cgccgcgccc atgcaggaca atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t42 hpaBC-1-up

<400> 16

ctgattaata tcggctatgg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t42 hpaBC-T-down

<400> 17

caaaaaggtt tgaaagcggc 20

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t43 hpaBC1-P4-up

<400> 18

aactatgaac attgtcgatc aacaaacttt tcgcgatgcg ttatctctgg cggtgttg 58

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t43 hpaBC1-P4-down

<400> 19

tccgtggtga tgatattgac cgccgcgccc atgcaggaca tagctgtttc ctggtttaa 59

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t44 w-promoter-s

<400> 20

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物t44 hpaBC-T-down

<400> 21

caaaaaggtt tgaaagcggc 20

Claims (14)

1.生产左旋多巴的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株T002，其通过上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达而增强3-脱氢莽草酸脱氢酶酶活。

2.如权利要求1所述的重组菌株T002，其是通过上调大肠杆菌重组菌株WJ060中的3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达而制得，其中所述重组菌株WJ060的保藏编号为CGMCCNo.14602。

3.如权利要求2所述的重组菌株T002，其通过敲除和/或替换调控元件P1(P1位于aroE起始密码子上游，其序列如SEQ ID NO:1所示)而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达，优选地，重组菌株T002通过替换调控元件P1而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达；

优选地，重组菌株T002通过调控元件P2和/或P3和/或P4替换调控元件P1而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达；

优选地，重组菌株T002通过在aroE起始密码子上游插入调控元件P2和/或P3和/或P4而上调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达；

优选地，在aroE起始密码子ATG上游插入调控元件P2和/或P3和/或P4；

优选地，所述调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2所示；调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示；调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，在aroE起始密码子ATG上游插入调控元件P4。

4.如权利要求1-3中任一项所述的重组菌株T002，所述aroE的起始密码子TTG替换为密码子ATG。

5.权利要求1-4中任一项所述的重组菌株T002的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子上游插入调控元件P2和/或P3和/或P4；

优选地，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子ATG上游插入调控元件P2和/或P3和/或P4；

优选地，调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2所示；调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示；调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，插入调控元件P4；以及任选地，

用密码子ATG替换原始起始密码子TTG来上调aroE的表达。

6.权利要求1-4中任一项所述的重组菌株T002或由其传代而产生的菌株或权利要求5所构建的重组菌株T002或由其传代而产生的菌株在生产左旋多巴中的应用。

7.发酵生产左旋多巴的方法，包括利用重组菌株T002(优选权利要求1-4中任一项所述的或权利要求5所构建的)进行发酵。

8.生产左旋多巴的大肠杆菌重组菌株T004，其以重组菌株WJ060或权利要求1-4中任一项所述的重组菌株T002或权利要求5所构建的重组菌株T002为出发菌株，优选地，以权利要求1-4中任一项所述的重组菌株T002或权利要求5所构建的重组菌株T002为出发菌株。

9.如权利要求8所述的重组菌株T004，其通过调控酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达而改变酪氨酸羟化酶的酶活；

优选地，重组菌株T004上调酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达；

优选地，其通过在酪氨酸羟化酶基因hpaBC起始密码子上游插入调控元件而上调酪氨酸羟化酶(hpaBC)的表达；

优选地，通过在酪氨酸羟化酶基因hpaBC起始密码子ATG上游插入调控元件；

优选地，所述调控元件为P1和/或P3和/或P4；

优选地，所述调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示；调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，在hpaBC起始密码子ATG上游插入调控元件P4。

10.如权利要求8或9所述的重组菌株T004，其保藏号为CGMCC No.14247。

11.重组菌株T004(权利要求8-10中任一项所述)的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，在酪氨酸羟化酶hpaBC起始密码子上游插入调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在hpaBC起始密码子ATG上游插入调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，所述调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述调控元件P3的序列如SEQ IDNO:3所示；所述调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，在hpaBC起始密码子ATG上游插入调控元件P4。

12.权利要求8-10中任一项所述的重组菌株T004或由其传代而产生的菌株或权利要求11所构建的重组菌株T004或由其传代而产生的菌株在生产左旋多巴中的应用。

13.发酵生产左旋多巴的方法，包括利用重组菌株T004(优选权利要求8-10中任一项所述的或权利要求11所构建的)进行发酵。

14.重组菌株T004，其保藏号为CGMCC No.14247。