CN110607268B - 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法 - Google Patents

一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株高产L‑缬氨酸的基因工程菌，从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′‑焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；并将大肠杆菌的支链氨基酸转氨酶基因ilvE替换为枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因bcd；并将大肠杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC替换为突变体L67E/R68F/K75E的编码基因。本发明还改进了L‑缬氨酸发酵方法，采用双阶段溶氧控制，提高了L‑缬氨酸产率和糖酸转化率。

Description

一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产L-缬氨酸方法
技术领域
本发明涉及微生物领域、基因工程领域和发酵工程领域，具体涉及一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其应用。
背景技术
L-缬氨酸(L-valine)是一种支链氨基酸(Branched chain amino acids,BCAA)，广泛应用于食品、医药、化妆品以及饲料等领域。作为人体的必需氨基酸，它不仅可以促进肌肉形成、强化肝功能、减轻肌肉疲劳，还可以作为免疫抗生素药物合成的中间体，而且还能促进皮肤胶质蛋白合成。近些年，作为一种重要的饲料日粮氨基酸品种，L-缬氨酸需求量持续增加。
L-缬氨酸的合成支路以丙酮酸为直接前体物。丙酮酸经过乙酰羟酸合成酶AHAS、乙酰羟酸异构还原酶AHAIR、二羟酸脱水酶DHAD和支链氨基酸转氨酶TAs催化的四步反应最终生成L-缬氨酸。L-缬氨酸菌株改造主要集中在几个方面：(1)解除终产物对合成限速酶的反馈抑制。由关键前体物丙酮酸合成L-缬氨酸的关键酶是乙酰羟酸合成酶AHAS，AHAS受3种分支链氨基酸，包括L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的反馈抑制。(2)增强还原力NADPH供应。乙酰羟酸异构还原酶AHAIR和支链氨基酸转氨酶TAs催化的反应是以辅酶NADPH为辅酶，因此增强菌株的还原力NADPH供应可提高L-缬氨酸合成效率。(3)增强产物输出。L-缬氨酸输出需要细胞膜上的特异转运蛋白，增加转运蛋白的表达有助于L-缬氨酸积累。
目前L-缬氨酸的生产菌株多为谷氨酸棒杆菌。谷氨酸棒杆菌的基因工程改造较为复杂、周期较长，菌株改进难度大。另外，谷氨酸棒杆菌工业菌株通过质粒过表达关键酶基因来增加L-缬氨酸的代谢通量，但是质粒稳定性低，并且对菌体生长有一定影响，导致发酵周期延长，不利于工业化生产L-缬氨酸。
大肠杆菌是另一种常用的氨基酸生产菌，大肠杆菌具有遗传背景清晰，操作简便等优点。2007年，ParkJH等在大肠杆菌W3110中引入了突变的AHASIII，解除了L-缬氨酸的反馈抑制。随后，过表达了全局调控因子Lrp和转运蛋白YgaZH，构建的菌株可以产生L-缬氨酸7.61g/L。2011年，Park JH等在大肠杆菌亚株W中过表达基因ilvBNmut、ilvCDE、ygaZH和lrp，L-缬氨酸产率达到60.7g/L。谢希贤等整合枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，解除了L-缬氨酸对合成通路的反馈抑制；同时整合大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶的突变基因spoTM，增强了丙酮酸供应，获得的工业菌株VHY03经24h摇瓶发酵生产L-缬氨酸36g/L。上述菌株均采用好氧发酵，呼吸旺盛，过多的丙酮酸通过三羧酸循环代谢变成CO2，造成糖酸转化率偏低，L-缬氨酸生产成本偏高。
发明内容
本发明目的之一是提供一种L-缬氨酸工程菌构建的新思路，解决了L-缬氨酸的合成代谢中辅酶供需不平衡和糖酸转化率偏低的问题，通过定向改造获得了一株高产L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
本发明目的之二是利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产L-缬氨酸，并改进了L-缬氨酸发酵控制工艺，采用双阶段溶氧控制，提高了L-缬氨酸产率和糖酸转化率。
本发明为了实现上述目的而采取的技术方案概述如下：
从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；并将大肠杆菌的支链氨基酸转氨酶基因ilvE替换为枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因bcd；并将大肠杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC替换为具有L67E/R68F/K75E突变的乙酰羟酸异构还原酶突变体基因，构建基因工程菌。
本发明中突变体的标识：
1、ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D，表示第290位和第292位的氨基酸都发生了突变，第290位的精氨酸(R)替换成谷氨酸(E)，并且第292位的赖氨酸(K)替换成天冬氨酸(D)，位置的编号对应于NCBI-Protein ID:NP_391482.2中ppGpp 3′-焦磷酸水解酶的氨基酸序列编号；
2、乙酰羟酸异构还原酶突变体L67E/R68F/K75E，表示第67位的亮氨酸(L)替换成谷氨酸(E)，第68位的精氨酸(R)替换成苯丙氨酸(F)，第75位的赖氨酸(K)替换成谷氨酸(E)，位置编号对应于NCBI-Protein ID:NP_418222.1乙酰羟酸异构还原酶ilvC的氨基酸序列编号。ilvC[L67E，R68F，K75E]则表示了该突变体蛋白的编码基因。
作为本发明一种较佳实施方式，可以通过构建强启动子实现目的基因的强表达。
作为本发明一种较佳实施方式，所述乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合在假基因ydeU位点，并由启动子Ptrc启动。
作为本发明一种较佳实施方式，所述ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D的编码基因spoT整合在假基因yeeP位点，并由启动子Ptrc启动。
作为本发明一种较佳实施方式，所述ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为本发明一种较佳实施方式，所述乙酰羟酸异构还原酶突变体的编码基因ilvC[L67E，R68F，K75E]的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
作为本发明一种较佳实施方式，所述基因工程菌的构建方法采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术，包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌W3110出发，构建启动子Ptrc与乙酰乳酸合酶基因alsS的连接片段Ptrc-alsS，并将其整合在假基因ydeU位点；
(2)构建启动子Ptrc与ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT的连接片段，并将其整合在假基因yeeP位点。
(3)敲除基因组上的乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；
(4)构建启动子Ptrc与亮氨酸脱氢酶基因bcd的连接片段，替换基因组上的ilvE基因；
(5)构建启动子Ptrc与乙酰羟酸异构还原酶突变体基因ilvC[L67E，R68F，K75E]的连接片段，替换基因组上的ilvC基因。
利用上述基因工程菌发酵生产L-缬氨酸的方法，采用双阶段溶氧控制方式，先进行好氧发酵，至发酵中后期再进行厌氧发酵，提高了L-缬氨酸产率和糖酸转化率。
有益效果：
大肠杆菌L-缬氨酸合成的关键酶乙酰乳酸合酶活力不足，且受到产物L-缬氨酸的反馈抑制。本发明研究发现，引入枯草芽孢杆菌中天然的乙酰乳酸合酶效果最好，该酶对高浓度L-缬氨酸不敏感，因此可以显著增强L-缬氨酸合成支路代谢流。丙酮酸是L-缬氨酸的直接前体物，丙酮酸的供应直接决定L-缬氨酸的产率。本发明研究发现，增强ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D的表达，可以调整中心代谢流量，增强丙酮酸胞内含量，从而提高L-缬氨酸合成。胞内的丙酮酸主要的分解代谢是通过丙酮酸脱氢酶作用生产乙酰辅酶A，敲除丙酮酸脱氢酶或者通过突变降低丙酮酸脱氢酶活性，可以减少丙酮酸分解，但会严重影响细胞的生长。通过敲除乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基基因frdA、frdB、frdC、frdD，降低厌氧条件下的副产物(乳酸、甲酸和琥珀酸)积累。
大肠杆菌的L-缬氨酸合成途径中，由ilvC编码的乙酰羟酸异构还原酶AHAIR和ilvE编码的支链氨基酸转氨酶TAs在催化反应时都需要辅酶NADPH的参与，所以辅酶NADPH供应是L-缬氨酸合成的一个重要因素。本发明研究发现，利用枯草芽孢杆菌中的亮氨酸脱氢酶编码基因bcd替换大肠杆菌中的ilvE基因，同时将大肠杆菌中的ilvC基因突变为ilvC[L-67-E，R-68-F，K-75-E]，即可改变这两个酶的辅酶偏好性，使L-缬氨酸在合成时不再利用NADPH转而利用NADH作为辅酶。因此，糖酵解途径中产生的NADH会在L-缬氨酸合成代谢中被氧化为NAD+，可实现辅酶平衡。
L-缬氨酸的合成消耗NADH生成NAD+，则NAD+无需通过呼吸链再生。本发明研究发现利用双阶段溶氧控制的模式进行L-缬氨酸发酵，有利于提高糖酸转化率。在发酵前期进行有氧发酵，此阶段三羧酸循环活跃，菌体正常生长。当菌体累积到一定程度时转为厌氧发酵，此阶段丙酮酸消耗糖酵解产生的NADH，生成L-缬氨酸，保证了细胞正常的糖分解。厌氧条件下，三羧酸循环阻断，菌体生长停滞，可显著减少丙酮酸的消耗，从而提高糖酸转化率。另外，发酵中后期采用厌氧发酵，搅拌转速降低，减少无菌空气使用，可显著降低发酵能耗。
附图说明
图1：Ptrc-alsS整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：ydeU上游同源臂，2：alsS目的片段3：ydeU下游同源臂，4：整合目的片段，5：阴性对照，6：整合后鉴定片段。
图2：Ptrc-spoT整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：yeeP上游同源臂，2：spoT目的片段，3：yeeP下游同源臂，4：重叠片段5：阴性对照6：整合后鉴定片段。
图3：ldhA基因敲除片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：ldhA上游同源臂2：ldhA下游同源臂3：重叠片段4：阳性对照5：阴性对照6：敲除后鉴定片段。
图4：pflB基因敲除片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：pflB上游同源臂2：pflB下游同源臂3：重叠片段4：阴性对照5：敲除后鉴定片段。
图5：frdABCD基因敲除片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：frdABCD上游同源臂2：frdABCD下游同源臂3：重叠片段4：阴性对照5：敲除后鉴定片段。
图6：Ptrc-bcd整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：bcd上游同源臂2：bcd片段3：bcd下游同源臂4：重叠片段5：阴性对照6：敲除后鉴定片段。
图7：Ptrc-ilvC[L67E，R68F，K75E]整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：ilvCM上游同源臂2：ilvCM片段3：ilvCM下游同源臂4：重叠片段5：阴性对照6：敲除后鉴定片段。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：
构建L-缬氨酸高效生产菌株VXR01、VXR02、VXR03，采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli usingCRISPR–Cas9meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)，进行具体方法如下：
1乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合至假基因位点ydeU，构建菌株VXR01
1.1重组DNA片段的制备
将alsS基因整合至ydeU假基因位点。以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，通过PCR扩增得到基因alsS(NCBI-Protein ID:NP_391482.2)；以大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增ydeU上下游同源臂片段(引物UP-ydeU-S、UP-ydeU-A；DN-ydeU-S、DN-ydeU-A)；启动子Ptrc设计在上游同源臂的下游引物和alsS基因的上游引物中。分别以上下游同源臂及目的基因alsS为模板进行重叠PCR得到整合片段Ptrc-alsS(引物Ptrc-alsS-S、Ptrc-alsS-A)。整合片段Ptrc-alsS的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1。PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；30个循环：变性(98℃)10s，退火15s；72℃延伸10min；降温维持(4℃)。利用重叠PCR将上游同源臂UP-ydeU、大肠杆菌Ptrc启动子、目的片段alsS、下游同源臂DN-ydeU连接，PCR扩增及重叠PCR体系如下表所示。
PCR扩增体系：
Figure BDA0002253444560000051
重叠PCR扩增体系：
Figure BDA0002253444560000052
1.2构建gRNA质粒
构建gRNA质粒的目的是为了使Cas9蛋白与tracrRNA的复合体通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。质粒pGRB-ydeU中的靶序列DNA片段通过引物gRNA-ydeU-S和gRNA-ydeU-A的退火制得。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：
退火体系：
Figure BDA0002253444560000053
将含靶序列的DNA片段与线性化载体pGRB同源重组。重组体系如下表。所用重组酶均为
Figure BDA0002253444560000054
Figure BDA0002253444560000061
II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。
重组体系：
Figure BDA0002253444560000062
取全部重组体系均匀加入到100μL DH5α化转感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s后，加入900μL复苏液，37℃复苏1h。8000rmp离心2min，弃部分上清，留100μL左右菌体重悬后，均匀涂布到含氨苄青霉素的平板，37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子，提取质粒，通过酶切鉴定。
1.3质粒和重组DNA片段的电转化
将pGRB-ydeU质粒和供体Ptrc-alsS片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用鉴定引物(ydeU-鉴定-S、ydeU-鉴定-A)进行菌落PCR，筛选阳性重组子。
1.4质粒的消除
gRNA质粒的消除：将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基过夜培养，再用接种环于含奇霉素抗性LB平板上划三区，挑选单菌落分别对点含有氨苄青霉素和奇霉素的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不长，奇霉素抗性平板生长的单菌落。
PREDCas9质粒的消除：将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，再用接种环于无抗性LB平板上划三区，挑选单菌落分别对点含有奇霉素和无抗性的LB平板，挑选奇霉素平板不长，无抗性平板生长的单菌落。
2基因spoT整合至假基因yeeP位点，构建菌株VXR02
2.1突变基因spoT的制备
利用引物设计软件primer5，以大肠杆菌W3110基因组为模板(NCBI-Protein ID:BAE77643)，将突变点设计在第一个片段下游引物中，扩增突变体spoT基因分为两段分别扩增(引物UP-spoT-S、UP-spoT-A；DN-spoT-S、DN-spoT-A)，再以这两个片段为模板进行重叠PCR得到spoT突变基因(引物UP-spoT-S、DN-spoT-A)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.2重组DNA片段的制备
以大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增yeeP上下游同源臂片段(引物UP-yeeP-S、UP-yeeP-A；DN-yeeP-S、DN-yeeP-A)启动子Ptrc设计在上游同源臂的下游引物和spoT基因的上游引物中。再分别以上下游同源臂及目的基因spoT突变基因为模板进行重叠PCR(引物Ptrc-spoT-S、Ptrc-spoT-A)。整合片段Ptrc-spoT的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。PCR扩增及重叠体系与1.1相同。
2.3构建gRNA质粒
质粒pGRB-yeeP中的靶序列DNA片段通过引物gRNA-yeeP-S和gRNA-yeeP-A的退火制得，构建方法与1.2相同。
2.4质粒和重组DNA片段的电转化
将pGRB-yeeP质粒和供体Ptrc-spoT片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。以重叠片段上游同源臂上游引物和下游同源臂下游引物为鉴定引物，进行菌落PCR，筛选阳性重组子。
2.5质粒的消除
方法同1.4所述。
3基因ldhA、pflB、frdABCD的敲除，构建菌株VXR03
3.1重组DNA片段的制备
以大肠杆菌W3110基因组为模板，根据其基因ldhA(NCBI-Protein ID:NP_415898.1)、pflB(NCBI-Protein ID:NP_415423.1)、frdABCD(NCBI-Protein ID:NP_418578.1、NP_418577.1、NP_418576.1、NP_418575.1)的上下游序列分别设计上游同源臂引物(U-ldhA-F、U-ldhA-R；U-pflB-F、U-pflB-R；U-frdABCD-F、U-frdABCD-R)和下游同源臂引物(D-ldhA-F、D-ldhA-R；D-pflB-F、D-pflB-R；D-frdABCD-F、D-frdABCD-R)。再以上下游同源臂为模板进行重叠PCR获得基因ldhA、pflB、frdABCD的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图分别见附图3-5，PCR扩增及重叠体系与1.1相同。
3.2构建gRNA质粒
质粒pGRB-ldhA、pGRB-pflB、pGRB-frdABCD中的靶序列DNA片段通过引物(gRNA-ldhA-F、gRNA-ldhA-R；gRNA-pflB-F、gRNA-pflB-R；gRNA-frdABCD-F、gRNA-frdABCD-R)的退火制得，构建方法与1.2相同。
3.3质粒和重组DNA片段的电转化
将质粒和DNA片段共电转化至感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。将重叠片段上游同源臂上游引物和下游同源臂下游引物当做鉴定引物，用鉴定引物进行菌落PCR，筛选阳性重组子，保菌。
3.4质粒的消除
方法同1.4所述。
4用枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶编码基因bcd替换大肠杆菌中的ilvE基因，构建菌株VXR04
4.1重组DNA片段的制备
以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，通过PCR扩增得到基因bcd(NCBI-Protein ID:NP_390288.1)；以大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增ilvE(NCBI-Protein ID:YP_026247.1)上下游同源臂片段(引物U-ilvE-F、U-ilvE-R；D-ilvE-F、D-ilvE-R)；启动子Ptrc设计在上游同源臂的下游引物和bcd基因的上游引物中。分别以上下游同源臂及目的基因bcd为模板进行重叠PCR得到整合片段Ptrc-bcd(引物Ptrc-bcd-F、Ptrc-bcd-R)。整合片段Ptrc-bcd的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6，PCR扩增及重叠体系与1.1相同。
4.2构建gRNA质粒
质粒pGRB-ilvE中的靶序列DNA片段通过引物gRNA-ilvE-F和gRNA-ilvE-R的退火制得，构建方法与1.2相同。
4.3质粒和重组DNA片段的电转化
将pGRB-ilvE质粒和供体Ptrc-bcd片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用引物(U-ilvE-F、D-ilvE-R)进行菌落PCR，筛选阳性重组子。
4.4质粒的消除
方法同1.4所述。
5.乙酰羟酸异构还原酶突变体基因ilvC[L67E，R68F，K75E]替换原有ilvC基因，构建菌株VXR05
5.1突变体基因ilvC[L67E，R68F，K75E]的制备
利用引物设计软件primer5，以大肠杆菌W3110基因组为模板(NCBI-Protein ID:NP_418222.1)，将突变点设计在第一个片段下游引物和第二个片段的上游引物中，扩增突变体基因分为三段分别扩增(引物1-ilvCM-F、1-ilvCM-R；2-ilvCM-F、2-ilvCM-R；3-ilvCM-F、3-ilvCM-R)，再以这两个片段为模板进行重叠PCR(引物1-ilvCM-F、3-ilvCM-R)得到突变体基因ilvC[L67E，R68F，K75E]，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.2重组DNA片段的制备
以大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增ilvC(NCBI-Protein ID:NP_418222.1)上下游同源臂片段(引物U-ilvC-F、U-ilvC-R；D-ilvC-F、D-ilvC-R)，启动子Ptrc设计在上游同源臂的下游引物和突变体基因的上游引物中。再分别以上下游同源臂及突变体基因为模板进行重叠PCR(引物U-ilvC-F、D-ilvC-R)。整合片段Ptrc-ilvC[L67E，R68F，K75E]的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图7。PCR扩增及重叠体系与1.1相同。
5.3构建gRNA质粒
质粒pGRB-ilvC中的靶序列DNA片段通过引物gRNA-ilvC-F和gRNA-ilvC-R的退火制得，构建方法与1.2相同。
5.4质粒和重组DNA片段的电转化
将pGRB-ilvC质粒和供体Ptrc-ilvC[L67E，R68F，K75E]片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。以重叠片段上游同源臂上游引物和下游同源臂下游引物为鉴定引物，进行菌落PCR，筛选阳性重组子。
5.5质粒的消除
方法同1.4所述。
6.上述菌株构建过程涉及的引物见下表
Figure BDA0002253444560000091
Figure BDA0002253444560000101
实施例2：
菌株VXR02和VXR05摇瓶发酵：
斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代两次；
摇瓶种子培养：用接种环刮取两环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h；
摇瓶好氧发酵：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.7-7.0，补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵周期24h；
好氧-厌氧双阶段发酵：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，37℃，200r/min振荡培养；12-16h后，将菌液转移到30mL的封口瓶中，隔绝空气，37℃，200r/min振荡培养8-12h；总发酵周期24h；
斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂21-25g/L，pH 7.0-7.2；
种子培养基组成为：葡萄糖18g/L，酵母粉1％，蛋白胨0.6％，KH2PO4 0.12％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VB1 1.3mg/L，VH 0.3mg/L，苯酚红20ml/L，消泡剂两滴，初始pH 7.0-7.2；
发酵培养基组成为：葡萄糖18g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO4 2g/L，柠檬酸钠1g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，FeSO4·7H2O 100mg/L，MnSO4·H2O 100mg/L，VB1 0.8mg/L，VH0.3mg/L，苯酚红20mL/L，消泡剂两滴，初始pH 7.0-7.2。
表1摇瓶好氧发酵与好氧-厌氧双阶段发酵的产酸与转化率对比
Figure BDA0002253444560000111
由表1可知，在好氧发酵模式中，菌株VXR05的L-缬氨酸产率和糖酸转化率与菌株VXR02相当。在好氧-厌氧双阶段发酵模式中，菌株VXR02产率显著下降，说明VXR02不能在厌氧条件下积累L-缬氨酸。与菌株VXR02相反，VXR05在双阶段发酵模式中的L-缬氨酸产率比好氧发酵模式中的更高，说明VXR05可在厌氧条件下积累L-缬氨酸。更有益的效果是，双阶段发酵模式下的VXR05糖酸转化率显著增加，比好氧发酵提高了21％。
实施例3：
菌株VXR02和VXR05的5L发酵罐发酵：
好氧发酵：将菌种在斜面上活化两代，按照15-20％接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.7左右，温度维持在35℃，控制溶氧在25-30％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期40h；
好氧-厌氧双阶段发酵：将菌种在斜面上活化两代，按照15-20％接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.7左右，温度维持在35℃，控制溶氧在25-30％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；12-16h后停止通入无菌空气，进行厌氧发酵；总发酵周期40h；
种子培养基组成为：葡萄糖60-90g/L，酵母粉5g/L，K2HPO4 4g/L，(NH4)2SO4 2.5g/L，柠檬酸2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L，FeSO4·7H2O 2.8mg/L，MnSO4 1.2mg/L；
发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉2g/L，K2HPO4 7g/L，(NH4)2SO4 3g/L，柠檬酸2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4 10mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1mg/L，pH 6.5-7.0。
表2发酵罐好氧发酵与好氧-厌氧双阶段发酵参数对比
Figure BDA0002253444560000121
由表2可知，菌株VXR05在5L发酵罐中好氧培养40h，L-缬氨酸产率达到80.2g/L，糖酸转化率30.6％。采用双阶段工艺后，L-缬氨酸产率达到80.8g/L，糖酸转化率提高到40.7％，比好氧发酵提高33％。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动或修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产L-缬氨酸方法
<141> 2019-10-24
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2109
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
ttgtatctgt ttgaaagcct gaatcaactg attcaaacct acctgccgga agaccaaatc 60
aagcgtctgc ggcaggcgta tctcgttgca cgtgatgctc acgaggggca aacacgttca 120
agcggtgaac cctatatcac gcacccggta gcggttgcct gcattctggc cgagatgaaa 180
ctcgactatg aaacgctgat ggcggcgctg ctgcatgacg tgattgaaga tactcccgcc 240
acctaccagg atatggaaca gctttttggt aaaagcgtcg ccgagctggt agagggggtg 300
tcgaaacttg ataaactcaa gttccgcgat aagaaagagg cgcaggccga aaactttcgc 360
aagatgatta tggcgatggt gcaggatatc cgcgtcatcc tcatcaaact tgccgaccgt 420
acccacaaca tgcgcacgct gggctcactt cgcccggaca aacgtcgccg catcgcccgt 480
gaaactctcg aaatttatag cccgctggcg caccgtttag gtatccacca cattaaaacc 540
gaactcgaag agctgggttt tgaggcgctg tatcccaacc gttatcgcgt aatcaaagaa 600
gtggtgaaag ccgcgcgcgg caaccgtaaa gagatgatcc agaagattct ttctgaaatc 660
gaagggcgtt tgcaggaagc gggaataccg tgccgcgtca gtggtcgcga gaagcatctt 720
tattcgattt actgcaaaat ggtgctcaaa gagcagcgtt ttcactcgat catggacatc 780
tacgctttcc gcgtgatcgt caatgattct gacacctgtt atcgcgtgct gggccagatg 840
cacagcctgt acaagccgcg tccgggcgaa gtggatgact atatcgccat tccaaaagcg 900
aacggctatc agtctttgca cacctcgatg atcggcccgc acggtgtgcc ggttgaggtc 960
cagatccgta ccgaagatat ggaccagatg gcggagatgg gtgttgccgc gcactgggct 1020
tataaagagc acggcgaaac cagtactacc gcacaaatcc gcgcccagcg ctggatgcaa 1080
agcctgctgg agctgcaaca gagcgccggt agttcgtttg aatttatcga gagcgttaaa 1140
tccgatctct tcccggatga gatttacgtt ttcacaccgg aagggcgcat tgtcgagctg 1200
cctgccggtg caacgcccgt cgacttcgct tatgcagtgc ataccgatat cggtcatgcc 1260
tgcgtgggcg cacgcgttga ccgccagcct tacccgctgt cgcagccgct taccagcggt 1320
caaaccgttg aaatcattac cgctccgggc gctcgcccga atgccgcttg gctgaacttt 1380
gtcgttagct cgaaagcgcg cgccaaaatt cgtcagttgc tgaaaaacct caagcgtgat 1440
gattctgtaa gcctgggccg tcgtctgctc aaccatgctt tgggtggtag ccgtaagctg 1500
aatgaaatcc cgcaggaaaa tattcagcgc gagctggatc gcatgaagct ggcaacgctt 1560
gacgatctgc tggcagaaat cggacttggt aacgcaatga gcgtggtggt cgcgaaaaat 1620
ctgcaacatg gggacgcctc cattccaccg gcaacccaaa gccacggaca tctgcccatt 1680
aaaggtgccg atggcgtgct gatcaccttt gcgaaatgct gccgccctat tcctggcgac 1740
ccgattatcg cccacgtcag ccccggtaaa ggtctggtga tccaccatga atcctgccgt 1800
aatatccgtg gctaccagaa agagccagag aagtttatgg ctgtggaatg ggataaagag 1860
acggcgcagg agttcatcac cgaaatcaag gtggagatgt tcaatcatca gggtgcgctg 1920
gcaaacctga cggcggcaat taacaccacg acttcgaata ttcaaagttt gaatacggaa 1980
gagaaagatg gtcgcgtcta cagcgccttt attcgtctga ccgctcgtga ccgtgtgcat 2040
ctggcgaata tcatgcgcaa aatccgcgtg atgccagacg tgattaaagt cacccgaaac 2100
cgaaattaa 2109
<210> 2
<211> 1476
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60
cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120
gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180
ctcgatatct cctacgctga gtttaaagaa gcgattgccg aggagcgcgc gtcctggcgt 240
aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300
ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360
ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420
gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480
gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540
aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600
caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660
gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720
gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780
atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840
gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900
cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960
gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020
accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080
atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140
atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200
atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260
aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320
ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380
gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440
atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476

Claims (9)

1.一种高产L-缬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；并将大肠杆菌的支链氨基酸转氨酶基因ilvE替换为枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因bcd；并将大肠杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC替换为具有L67E/R68F/K75E突变的乙酰羟酸异构还原酶突变体基因，构建基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合在假基因ydeU位点，并由启动子Ptrc启动；所述ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D的编码基因spoT整合在假基因yeeP位点，并由启动子Ptrc启动。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰羟酸异构还原酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.权利要求1-4任一项所述基因工程菌用于发酵生产L-缬氨酸的用途。
6.一种利用权利要求1-4任一项所述基因工程菌发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，采用双阶段溶氧控制方式，先进行好氧发酵，至发酵中后期转为厌氧发酵。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将菌种活化后制备种子液，按10-15%接种量接种到装有发酵培养基的三角瓶中，37℃，200 r/min振荡培养；12-16 h后，将菌液转移到30 mL的封口瓶中，隔绝空气，37℃，200 r/min振荡培养8-12 h；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖 18 g/L，酵母粉 1 g/L，蛋白胨 2 g/L，KH2PO4 2 g/L，柠檬酸钠 1 g/L，MgSO4•7H2O 0.7 g/L，FeSO4•7H2O 100 mg/L，MnSO4•H2O 100 mg/L，VB1 0.8mg/L，VH 0.3 mg/L，苯酚红20 mL/L，消泡剂两滴，初始pH 7.0-7.2。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将菌种在斜面上活化两代，按照15-20%接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.7左右，温度维持在35℃，控制溶氧在25-30%；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80%m/v的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5 g/L；12-16 h后停止通入无菌空气，进行厌氧发酵；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖 30 g/L，酵母粉2 g/L，K2HPO4 7 g/L，(NH4)2SO4 3 g/L，柠檬酸 2 g/L，MgSO4•7H2O 1 g/L，FeSO4•7H2O 30 mg/L，MnSO4 10 mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1 mg/L，初始pH 6.5-7.0。
9.一种如权利要求1所述高产L-缬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术，包括如下步骤：
（1）以大肠杆菌W3110出发，构建启动子Ptrc与乙酰乳酸合酶基因alsS的连接片段Ptrc-alsS，并将其整合在假基因ydeU位点；
（2）构建启动子Ptrc与ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT的连接片段，并将其整合在假基因yeeP位点；
（3）敲除基因组上的乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；
（4）构建启动子Ptrc与亮氨酸脱氢酶基因bcd的连接片段，替换基因组上的ilvE基因；
（5）构建启动子Ptrc与具有L67E/R68F/K75E突变的乙酰羟酸异构还原酶突变体基因的连接片段，替换基因组上的ilvC基因。
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Application publication date: 20191224

Assignee: NINGXIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd.

Assignor: TIANJIN University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2022990000468

Denomination of invention: A high-yielding L-valine genetically engineered bacterium and a method for producing L-valine by fermentation

Granted publication date: 20210525

License type: Exclusive License

Record date: 20220809