CN117586977A - 一种支链氨基酸氨基转移酶突变体及其重组微生物与应用 - Google Patents

一种支链氨基酸氨基转移酶突变体及其重组微生物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体公开了一种支链氨基酸氨基转移酶突变体及其重组微生物与应用。本发明的支链氨基酸氨基转移酶突变体，以野生型支链氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列为参考序列，所述支链氨基酸氨基转移酶突变体含有第191位缬氨酸被丝氨酸或苏氨酸取代的突变。含有该突变体的重组微生物在发酵生产缬氨酸时，产量高、副产物少，提高了生产效率。

Description

一种支链氨基酸氨基转移酶突变体及其重组微生物与应用
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体地说，涉及一种支链氨基酸氨基转移酶突变体及其重组微生物与应用。
背景技术
支链氨基酸(branch chain amino acid，BCAA)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其中，L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。L-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中25℃的溶解度为88.5g/L，50℃的溶解度为96.2g/L，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮，等电点为5.96，熔点为315℃。
L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。其中，在医药工业中，L-缬氨酸可作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。在食品工业中，L-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。在饲料工业中，L-缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用。
目前，L-缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受到限制、生产成本高、污染环境等问题，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。但目前L-缬氨酸菌种的发酵性能仍较差，且副产物亮氨酸的含量较高，导致转化率仍较低，较难满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够高效发酵生产支链氨基酸的新方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种支链氨基酸氨基转移酶突变体，其以野生型支链氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列为参考序列，所述支链氨基酸氨基转移酶突变体含有第191位缬氨酸(V)被丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代的突变。
本发明研究发现，当将支链氨基酸氨基转移酶进行特定突变，可使包含该突变体的重组微生物生产L-缬氨酸的能力提升，生产副产物异亮氨酸的能力下降，有利于提升缬氨酸工业化生产的效率。
优选，所述支链氨基酸氨基转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或18所示。
本发明还提供一种DNA分子，以野生型ilvE基因为参考序列，所述DNA分子含有第571-573位碱基由GTC突变为TCC或ACC的突变。
优选，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.14或15所示。
本发明另提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述支链氨基酸氨基转移酶突变体。
优选，所述重组微生物还表达乙酰羟酸合酶突变体、乙酰羟酸异构还原酶突变体和/或二羟酸脱水酶突变体；
所述乙酰羟酸合酶突变体以野生型乙酰羟酸合酶的氨基酸序列为参考序列，含有第25位氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)的突变(如SEQ ID No.4所示)；
所述乙酰羟酸异构还原酶突变体以野生型乙酰羟酸异构还原酶的氨基酸序列为参考序列，含有第90位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)的突变(如SEQ ID No.8所示)；
所述二羟酸脱水酶突变体以野生型二羟酸脱水酶的氨基酸序列为参考序列，含有第237位丙氨酸被赖氨酸(A)、精氨酸(R)、组氨酸(H)或脯氨酸(P)取代的突变。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，发现经过修饰棒杆菌的乙酰羟酸合酶和/或乙酰羟酸异构还原酶和/或二羟酸脱水酶和/或支链氨基酸氨基转移酶，可使得微生物能够高效率地生成缬氨酸，并且降低了副产物异亮氨酸的含量，从而成功创造出了能够高效生产缬氨酸的新微生物。
具体地，优选，本发明提供的棒杆菌，其细胞内由ilvN基因(在NCBI上的参考序列编号为CEY17_RS06890)编码的乙酰羟酸合酶(在NCBI上的参考序列编号为WP_003861429.1)的第25位氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)。ilvN基因编码的乙酰羟酸合酶是支链氨基酸生物合成的第一个酶，也是支链氨基酸生物合成的关键酶，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物)，同时也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羟基丁酸(a-乙酰羟基丁酸是异亮氨酸的前体物)。
本发明的棒杆菌，其细胞内由ilvC基因(在NCBI上的参考序列编号为CEY17_RS06895)编码的乙酰羟酸异构还原酶(在NCBI上的参考序列编号为WP_003854117.1)的第90位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)。ilvC基因编码的乙酰羟酸异构还原酶是支链氨基酸生物合成过程中的一种重要酶，它催化1分子的α-乙酰乳酸或α-乙酰羟丁酸生成1分子的α-二羟基异戊酸或α,β-二羟甲基戊酸(α-二羟基异戊酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物，α,β-二羟甲基戊酸是异亮氨酸的前体物)，同时消化1分子的还原力(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH)产生1分子的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。
本发明的棒杆菌，其细胞内由ilvD基因(在NCBI上的参考序列编号为CEY17_RS06870)编码的二羟酸脱水酶(在NCBI上的参考序列编号为WP_003854128.1)的第237位氨基酸由丙氨酸(A)突变为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)或脯氨酸(P)。
本发明的棒杆菌，其细胞内由ilvE基因(在NCBI上的参考序列编号为CEY17_RS10815)编码的支链氨基酸氨基转移酶(在NCBI上的参考序列编号为WP_003859645.1)的第191位氨基酸由缬氨酸(V)突变为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
优选，本发明的重组微生物的ppc基因被增强，或ppc和gndA被同时增强；
更优选，ppc基因的增强通过在出发菌株的cg1507处引入以Ptac为启动子的ppc基因来实现；
gndA基因的增强通过将gndA基因的原有启动子替换为强启动子Ptac来实现。
进一步优选地，本发明继续对上述产缬氨酸棒杆菌的ppc和/或gndA基因进行修饰，获得了缬氨酸产量的进一步提升的工程菌。其中，ppc、gndA基因在NCBI上的参考序列编号分别为CEY17_RS08480、CEY17_RS07800。
本发明中重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、黄色短杆菌(Breviabacteriumflavum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。优选，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌。
上述突变位点可应用于谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌或大肠杆菌，但不限于谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌或大肠杆菌，也可应用于如枯草芽孢杆菌等，用于产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸或其衍生物。
本发明另提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产L-缬氨酸及其衍生物中的应用；
(2)在用于生产L-缬氨酸及其衍生物的微生物遗传育种中的应用；
(3)在提高发酵生产L-缬氨酸及其衍生物产量上的应用；
(4)在发酵生产L-缬氨酸及其衍生物时，降低副产物异亮氨酸生成中的应用。
本发明还提供一种L-缬氨酸的生产方法，其包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物如上所述。
本发明的有益效果至少在于：
本发明通过对谷氨酸棒杆菌来源的ilvE基因进行特定修饰(优选结合对谷氨酸棒杆菌来源的ilvN基因和/或ilvC基因和/或ilvD基因的特定修饰)，实现了对支链氨基酸氨基转移酶(优选结合乙酰羟酸合酶和/或乙酰羟酸异构还原酶和/或二羟酸脱水酶)的突变，使得所述微生物产缬氨酸的能力与未修饰的菌株相比增强，产副产物异亮氨酸的能力下降，最终提高了缬氨酸的产量。
具有本发明突变体的发酵菌，其生产L-缬氨酸的能力得到了明显提升，产量高、副产物少。本发明为发酵生产L-缬氨酸提供了一种新的高效率生产方式。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
本发明实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物序列(SEQ ID No.19-62)
本发明的出发菌株MHZ-1012-3为谷氨酸棒杆菌，其构建方法见中国专利CN201911370732.9，该菌为出发菌株MHZ-1012-2的a-异丙基苹果酸合酶基因leuA其编码区第1个碱基由A突变为G得到。MHZ-1012-2于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13406，见中国专利CN201611250330.1。
实施例1乙酰羟酸合酶突变菌株的构建
以MHZ-1012-3为出发菌株，将MHZ-1012-3中ilvN基因(野生型ilvN核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，野生型乙酰羟酸合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)突变为编码SEQID NO.2的乙酰羟酸合酶突变体的基因(乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示)，构建乙酰羟酸合酶突变菌株，具体构建方法如下：
1、质粒pK18mobsacB-ilvNV25I的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-3的基因组为模板，以ilvNV25I-UP-1F/ilvNV25I-UP-1R为引物，制备重组片段UP-1，以ilvNV25I-DN-2F/ilvNV25I-DN-2R为引物，制备重组片段DN-1；以谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032的基因组为模板，以ilvNV25I-1F/ilvNV25I-1R为引物，制备重组片段ilvNV25I；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvNV25I-pk18-3F/ilvNV25I-pk18-3R为引物获得片段pk18-1，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系如表2所示。
表2吉普森组装反应体系
组分 UP-1 DN-1 ilvNV25I pk18-1 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 1 2 4 2 9
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvNV25I。
2、乙酰羟酸合酶突变菌株的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ilvNV25I转入出发菌株MHZ-1012-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-31。
实施例2乙酰羟酸异构还原酶突变菌株的构建
以MHZ-1012-3为出发菌株，将MHZ-1012-3中ilvC基因(野生型ilvC核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，野生型乙酰羟酸异构还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)突变为编码SEQ ID NO.6的乙酰羟酸异构还原酶突变体的基因(乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)，构建乙酰羟酸异构还原酶突变菌株，具体构建方法如下：
1、质粒pK18mobsacB-ilvCI90S的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-3的基因组为模板，以ilvCI90S-UP-1F/ilvCI90S-UP-1R为引物，制备重组片段UP-1，以ilvCI90S-DN-2F/ilvCI90S-DN-2R为引物，制备重组片段DN-1；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvCI90S-pk18-3F/ilvCI90S-pk18-3R为引物获得片段pk18-1，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系如表3所示。
表3吉普森组装反应体系
组分 UP-1 DN-1 pk18-1 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 2 4 2 10
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvCI90S。
2、乙酰羟酸异构还原酶突变菌株的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ilvCI90S转入出发菌株MHZ-1012-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-33。
实施例3乙酰羟酸异构还原酶突变叠加菌株的构建
以MHZ-1012-31为出发菌株，将MHZ-1012-31中ilvC基因突变为编码SEQ ID NO.6的乙酰羟酸异构还原酶突变体的基因，构建乙酰羟酸异构还原酶突变叠加菌株，具体构建方法如下：
将上述实施例2所述方法构建的重组质粒pK18mobsacB-ilvCI90S转入出发菌株MHZ-1012-31中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-35。
实施例4 ppc基因突变菌株的构建
在上述实施例3所述方法构建的乙酰羟酸异构还原酶叠加突变菌株MHZ-1012-35中，进一步在位点cg1507处引入以Ptac为启动子的ppc基因，以强化ppc基因的表达，具体方法如下：
1、质粒pK18mobsacB-ppc的构建
以出发菌株MHZ-1012-35的基因组为模板，以PI-ppc-1f/PI-ppc-1r为引物制备上同源臂重组片段UP4，以PI-ppc-2f/PI-ppc-2r为引物制备ppc基因及终止子重组片段PPC，以PI-ppc-4f/I-ppc-4r为引物制备下同源臂重组片段DN4；以质粒pXMJ19为模板，以PI-ppc-3f/PI-ppc-3r为引物制备tac启动子的重组片段Ptac；以质粒pK18-mob-sacB为模板，以PI-pK18-F/PI-pK18-R为引物制备重组片段pk18-4，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系如表4所示。
表4吉普森组装反应体系
组分 UP4 PPC DN4 Ptac pk18-4 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 1 1 2 4 2 8
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ppc。
2、ppc基因增强突变菌的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ppc，转入菌株MHZ-1012-35中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为MHZ-1012-37。
实施例5 gndA基因增强突变菌株的构建
在上述实施例4所述方法构建的菌株MHZ-1012-37中，将gndA基因的原有启动子替换为强启动子Ptac，以强化gndA基因的表达，具体方法如下：
1、质粒pK18mobsacB-gndA的构建
以出发菌株MHZ-1012-3的基因组为模板，以PI-gndA-1f/PI-gndA-1r为引物制备上同源臂重组片段UP5，以PI-gndA-3f/PI-gndA-3r为引物制备下同源臂重组片段DN5；以质粒pXMJ19为模板，以PI-gndA-2f/PI-gndA-2r为引物制备tac启动子的重组片段Ptac；利用重叠PCR将3个重组片段进行融合，并利用酶切位点BamHI/EcoRI将融合片段与pK18-mob-sacB载体连接，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-gndA。
2、gndA基因增强突变菌的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-gndA，转入菌株MHZ-1012-37中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株命名为MHZ-1012-38。
实施例6二羟酸脱水酶突变菌株的构建
以MHZ-1012-38为出发菌株，将MHZ-1012-38中ilvD基因(野生型ilvD核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，野生型二羟酸脱水酶氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)突变为编码SEQ ID NO.10的二羟酸脱水酶突变体的基因(二羟酸脱水酶突变体ilvDA237K氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)，构建二羟酸脱水酶突变菌株，具体构建方法如下：
1、质粒pK18mobsacB-ilvDA237K的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-38的基因组为模板，以ilvDA237K-UP-1F/ilvDA237K-UP-1R为引物，制备重组片段UP-1，以ilvDA237K-DN-2F/ilvDA237K-DN-2R为引物，制备重组片段DN-1；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvDA237K-pk18-3F/ilvDA237K-pk18-3R为引物获得片段pk18-1，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系如表5所示。
表5吉普森组装反应体系
组分 UP-1 DN-1 pk18-1 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 2 4 2 10
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvDA237K。
2、突变菌株的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ilvDA237K转入出发菌株MHZ-1012-38中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-60。
实施例7支链氨基酸氨基转移酶突变菌株的构建
以MHZ-1012-3为出发菌株，将MHZ-1012-3中ilvE基因(野生型ilvE核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，野生型支链氨基酸氨基转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示)突变为编码SEQ ID NO.14的基因(支链氨基酸氨基转移酶突变体ilvEV191S氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示)，构建支链氨基酸氨基转移酶突变菌株，具体构建方法如下。
1、质粒pK18mobsacB-ilvEV191S的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以出发菌株MHZ-1012-3的基因组为模板，以ilvEV191S-UP-1F/ilvEV191S-UP-1R为引物，制备重组片段UP-1，以ilvEV191S-DN-2F/ilvEV191S-DN-2R为引物，制备重组片段DN-1；以质粒pk18-mob-sacB为模板，以ilvEV191S-pk18-3F/ilvEV191S-pk18-3R为引物获得片段pk18-1，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后按照吉普森组装试剂盒配置体系进行反应，反应体系表6所示。
表6吉普森组装反应体系
组分 UP-1 DN-1 pk18-1 CE Buffer CE Exnase 无菌水
体积/μL 1 1 2 4 2 10
将配制的反应体系于37℃反应30min，吸取10μL转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定插入的片段正确，进一步酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，最后将质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，将所得到的测序正确的质粒命名为pK18mobsacB-ilvEV191S。
2、突变菌株的构建
将上述1所述方法构建获得的重组质粒pK18mobsacB-ilvEV191S转入出发菌株MHZ-1012-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-65。
3、采用上述1和2所述的相同方法，将支链氨基酸氨基转移酶第191位的缬氨酸突变为与丝氨酸相似的其他氨基酸——苏氨酸(T)，构建获得突变菌株命名为MHZ-1012-66。
其中所用引物相应替换为ilvEV191T-UP-1R、ilvEV191T-DN-2F，ilvEV191T突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，支链氨基酸氨基转移酶突变体ilvEV191T氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示。
实施例8支链氨基酸氨基转移酶突变叠加菌株的构建
分别以MHZ-1012-31、MHZ-1012-35、MHZ-1012-38、MHZ-1012-60为出发菌株，将上述实施例7所述方法构建的重组质粒pK18mobsacB-ilvEV191S转入出发菌株中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。培养的温度为30℃，倒置培养。将筛选获得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。对在此培养基上长出的转化子进行鉴定。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，命名为MHZ-1012-68、MHZ-1012-69、MHZ-1012-70、MHZ-1012-71。
实施例9谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵产缬氨酸
1、培养基
种子培养基：豆粕抽提物15g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵7g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素2g/L，余量为水，pH7.2。
发酵培养基：豆粕抽提物15g/L，葡萄糖20g/L，硫酸铵7g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素2g/L，VB3 15μg/L，VB1·HCl 100μg/L，余量为水，pH7.2。
2、摇瓶发酵
(1)种子培养：挑取斜面种子1环，接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养10-12h。
(2)发酵培养：将5mL种子液接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养72h。
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测酵液中的L-缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，分光光度法检测562nm下的OD值，结果如表7所示。
表7中，菌株A为将棒状杆菌ATCC14067中ilvN基因突变为SEQ ID NO.2所示基因的菌株；菌株B为将棒状杆菌ATCC14067中ilvC基因突变为SEQ ID NO.6所示基因的菌株；菌株C为将棒状杆菌ATCC14067中ilvN基因突变为SEQ ID NO.2所示基因，并将ilvC基因突变为SEQ ID NO.6所示基因的菌株；菌株D为将棒状杆菌ATCC14067中ilvD基因突变为SEQ IDNO.10所示基因的菌株；菌株E为将棒状杆菌ATCC14067中ilvN基因突变为SEQ ID NO.2所示基因，ilvC基因突变为SEQ ID NO.6所示基因，并将ilvD基因突变为SEQ ID NO.10所示基因的菌株。菌株F为将棒状杆菌ATCC14067中ilvN基因突变为SEQ ID NO.2所示基因，ilvC基因突变为SEQ ID NO.6所示基因，ilvD基因突变为SEQ ID NO.10所示基因，并将ilvE基因突变为SEQ ID NO.14所示基因的菌株。
表7发酵结果
说明：*表示与各自的出发菌相比，结果有显著差异(P＜0.01)。
结果显示，出发菌株MHZ-1012-3的缬氨酸积累量为7.5g/L，而本发明提供的乙酰羟酸合酶突变菌株MHZ-1012-31的缬氨酸积累量达到9.9g/L，增长2.4g/L，提升幅度达到32％，且副产物异亮氨酸积累量为1.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-3下降34.8％，亮氨酸和菌体OD无显著变化。
进一步，叠加突变体ilvCI90S得到的乙酰羟酸异构还原酶突变叠加菌株MHZ-1012-35的缬氨酸积累量达到10.5g/L，较出发菌株MHZ-1012-31增长0.6g/L，提升幅度6％，且副产物异亮氨酸没有进一步增加，亮氨酸和菌体OD无显著变化。
进一步，叠加突变体ppc和gndA得到菌株MHZ-1012-38的缬氨酸积累量达到13.8g/L，较出发菌株MHZ-1012-35增长3.3g/L，提升幅度31.4％，且副产物异亮氨酸没有显著增加，亮氨酸和菌体OD无显著变化。
进一步，叠加突变体ilvDA237K得到的突变菌株MHZ-1012-60的缬氨酸积累量达到15.3g/L，较出发菌株MHZ-1012-38增长1.5g/L，提升幅度10.9％，且副产物异亮氨酸减少0.3g/L，亮氨酸减少0.2g/L，菌体OD下降1.4。
进一步，叠加突变体ilvEV191S得到的突变菌株MHZ-1012-71的缬氨酸积累量达到17.6g/L，较出发菌株MHZ-1012-60增长2.3g/L，提升幅度15.0％，且副产物异亮氨酸减少0.2g/L，亮氨酸减少0.3g/L，菌体OD无显著变化。
由此可见，本发明提供的乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I、乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S、二羟酸脱水酶突变体ilvDA237K和支链氨基酸氨基转移酶突变体ilvEV191S，及其突变菌株对主产物缬氨酸产量有显著的正效果，对副产物异亮氨酸产量有显著的负效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等三支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。
同时，在乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S的基础上，叠加ppc增强、或ppc和gndA同时增强，缬氨酸的积累量显著增加，分别达到12.1g/L和13.8g/L，提高幅度分别达到15.2％和31.4％。由此可见，乙酰羟酸合酶突变体ilvNV25I和乙酰羟酸异构还原酶突变体ilvCI90S，与ppc增强、或ppc和gndA同时增强叠加，有显著正效果，对产缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等三支链氨基酸，及以其为前体的衍生物的生产菌株构建提供借鉴。
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种支链氨基酸氨基转移酶突变体，其特征在于，以野生型支链氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列为参考序列，所述支链氨基酸氨基转移酶突变体含有第191位缬氨酸被丝氨酸或苏氨酸取代的突变。
2.根据权利要求1所述的支链氨基酸氨基转移酶突变体，其特征在于，所述支链氨基酸氨基转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或18所示。
3.一种DNA分子，其特征在于，以野生型ilvE基因为参考序列，所述DNA分子含有第571-573位碱基由GTC突变为TCC或ACC的突变。
4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.14或15所示。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1或2所述的支链氨基酸氨基转移酶突变体。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物还表达乙酰羟酸合酶突变体、乙酰羟酸异构还原酶突变体和/或二羟酸脱水酶突变体；
所述乙酰羟酸合酶突变体以野生型乙酰羟酸合酶的氨基酸序列为参考序列，含有第25位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸的突变；
所述乙酰羟酸异构还原酶突变体以野生型乙酰羟酸异构还原酶的氨基酸序列为参考序列，含有第90位氨基酸由异亮氨酸突变为丝氨酸的突变；
所述二羟酸脱水酶突变体以野生型二羟酸脱水酶的氨基酸序列为参考序列，含有第237位丙氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸或脯氨酸取代的突变。
7.根据权利要求5或6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的ppc基因被增强，或ppc和gndA被同时增强；
优选，ppc基因的增强通过在出发菌株的cg1507处引入以Ptac为启动子的ppc基因来实现；
gndA基因的增强通过将gndA基因的原有启动子替换为强启动子Ptac来实现。
8.根据权利要求5-7任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)、黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
9.权利要求5-8任一项所述的重组微生物的如下任一种应用：
(1)在发酵生产L-缬氨酸及其衍生物中的应用；
(2)在用于生产L-缬氨酸及其衍生物的微生物遗传育种中的应用；
(3)在提高发酵生产L-缬氨酸及其衍生物产量上的应用；
(4)在发酵生产L-缬氨酸及其衍生物时，降低副产物异亮氨酸生成中的应用。
10.一种L-缬氨酸的生产方法，其特征在于，包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物如权利要求5-8任一项所述。
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