CN107129959B - 生产(r)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产(R)‑乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用，该方法是将α‑乙酰乳酸合成酶基因、α‑乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列进行密码子优化，利用人工合成的方法获得包含三个基因的基因簇；将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；将多顺反子重组质粒导入宿主菌E.coli，并敲除主要副产物合成途径的关键基因，获得生产(R)‑乙偶姻的基因工程菌株。本发明提供的工程菌株所用的原料来源广泛、成本低，菌株无致病性，氧化型辅酶NAD⁺能够有效再生，菌株的(R)‑乙偶姻产量、生产效率高，最高产量可达到72.1 g/L，光学纯度可达99%以上。本发明还利用非粮木薯粉和廉价氮源作为发酵原料生产(R)‑乙偶姻，降低了生产成本。

Description

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种生产高光学纯(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建，及其在利用木薯粉和棉籽蛋白粉等非粮原料生产高光学纯(R)-乙偶姻中的应用。

背景技术

乙偶姻(acetoin)，化学名为3-羟基-2-丁酮，自然存在于乳品、黄油、干酪、酒类、玉米、葡萄、苹果、草莓、可可、肉类等食品中，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气。国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食用香料，美国食品香料和萃取物制造者协会(FEMA)安全号为2008，国内外常用于香味增强剂，还用于配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精，是一种应用广泛的食用香料。同时，乙偶姻作为一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为30种优先开发利用的平台化合物之一，在食品、医药、烟草、化妆品、化工等行业具有广泛的用途。

乙偶姻分子含有一个手性碳原子，因此存在(R)-乙偶姻、(S)-乙偶姻两种手性异构体。乙偶姻手性异构体不仅具有乙偶姻的基本功能，而且其独特的立体结构在不对称合成方面优势突出，在合成高附加值手性药物中间体、化学中间体、液晶材料等方面具有重要应用。在制药工业中，单一构型的乙偶姻手性异构体作为具有立体结构专一的化合物可以用来合成合成具有光学活性的手性药物，从而较大程度地提高药效，减轻药物的副作用。然而，微生物发酵得到的乙偶因通常是两种手性异构体的混合物，需要经过工艺复杂的手性拆分才能获得一定旋光度的手性异构体，由于(R)-乙偶姻和(S)-乙偶姻的物理化学性质相近，手性拆分十分困难，成本高昂，极大地限制了手性乙偶姻的应用。

目前报道的纯酶催化法合成(R)-乙偶姻需要破碎细胞和分离纯化酶，原料为高价的丁二酮或者光学纯meso-2,3-丁二醇，反应体系中还需要加入昂贵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，制备成本很高，无法实现商业化生产。Crout等人报道利用培养的Klebsiellaaerogenes，破碎细胞并提取乙酰羟酸合成酶(α-乙酰乳酸合成酶)、乙酰乳酸脱羧酶(α-乙酰乳酸脱羧酶)，可以催化丙酮酸产生(R)-乙偶姻，但也存在工艺复杂、产量太低及原料丙酮酸成本过高的问题【Journal of the Chemical Society,Perkin Transactions 1,1986,105-108】。全细胞催化法合成(R)-乙偶姻需要使用高价原料如光学纯(R,R)-2,3-丁二醇【Acta Biotechnologica,2002,22:355-362；PLoS ONE,2010,5:e8860；中国发明专利：200910013902.8】、光学纯meso-2,3-丁二醇【Journal of Microbiology andBiotechnology,2017,27:92-100】，或者丁二酮【中国发明专利：201410341765.1】，原料成本非常高，无法实现商业化生产。

1984年，Ui等报道了利用Pseudomonas sp.S-4发酵法合成单一构型(R)-乙偶姻【Journal of Fermentation Technology,1984,62:151-156】，该法存在产物浓度低(1.72g/L)和发酵周期长(48h)的问题。此外，研究者对丁二醇高产菌株Klebsiellapneumoniae、Serratia marcescens进行了改造获得积累(R)-乙偶姻的工程菌株【Journalof Industrial Microbiology&Biotechnology,2015,42:779-786；Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology,2015,42:1105-1115；中国发明专利：201310346916.8；中国发明专利：201510033927.X】，然而，K.pneumoniae、S.marcescens被世界卫生组织列为致病菌株(Risk group 2，pathogenic microorganisms)，大规模工业化生产的安全性原则在很大程度上限制了其应用【Biotechnology Advances,2009,27:715-725；Applied and Environmental Microbiology,2011,77:5467-5475；BioresourceTechnology,2012,124:237-244】。

也有研究者尝试在安全模式微生物Escherichia coli中构建人工合成途径来制备(R)-乙偶姻。1998年，Ui等将K.pneumoniae编码α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶导入E.coli中，获得的重组大肠杆菌可以发酵葡萄糖产生(R)-乙偶姻【Letters in AppliedMicrobiology,1998,26:275-278】。然而，糖酵解产生丙酮酸的过程中会产生大量的还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，而由丙酮酸生成(R)-乙偶姻并没有消耗过量的NADH，无法实现氧化型辅酶NAD⁺的有效再生，导致(R)-乙偶姻的产量太低(17.5g/L)。Xu等克隆Serratia marcescens包含budR、budA、budB的DNA片段，将其插入pUC19表达质粒中获得重组质粒pUC-AC，其中budA和budB形成一个操纵子，与转录调控因子编码基因budR间隔450bp。将Lactobacillus brevis的NADH氧化酶基因nox插入pUC-AC获得pAC-NOX，并将其导入E.coli DH5α中获得工程菌株E.coli(pAC-NOX)，补料分批发酵(R)-乙偶姻产量为60.3g/L。该法需要添加乙酸钠来解除budR编码的转录调控因子BudR对budA、budB转录的抑制【Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2015,90:93-100】。外源添加乙酸钠不但增加原料成本，而且乙酸钠会破坏细胞跨膜质子梯度，对菌体的生长和发酵不利【生物工程学报,2000,16:528-530；生物技术通报,2009,10:66-69】。另一方面，该法使用的丰富培养基主要成分为高纯糖(葡萄糖)和高价氮源(酵母粉)，将极大地提高商业化生产的原料成本。

发明内容

本发明针对现有合成(R)-乙偶姻技术存在原料成本过高、(R)-乙偶姻产量太低、氧化型辅酶NAD⁺不能有效再生，或者菌株具有致病性等诸多问题，提供一种生产(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用。本发明通过构建多顺反子表达载体，再导入宿主菌E.coli，获得生产(R)-乙偶姻的基因工程菌株，由于在胞内构建氧化型辅酶NAD⁺的有效再生系统，实现了(R)-乙偶姻高效合成与NAD⁺再生相偶联。同时还使用代谢工程技术对代谢网络进行优化，敲除主要副产物合成途径的关键基因，提高(R)-乙偶姻的产量、光学纯度与转化率。本发明还提供利用非粮木薯粉和廉价氮源作为发酵原料生产(R)-乙偶姻的工艺，代替高纯糖和高价氮源，可大幅降低原料成本。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

一种生产(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列进行密码子优化；(2)将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因拼接获得包含该三个基因的基因簇；(3)将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；(4)将多顺反子重组质粒导入宿主菌E.coli，获得生产(R)-乙偶姻的基因工程菌株。

进一步地，所述经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列前面添加了含核糖体结合位点和间隔序列的核苷酸序列TAAGGAGGATATACA。

在细胞内，核糖体负责将mRNA翻译成蛋白质，16S rRNA是核糖体的一个亚基，它可与核糖体结合位点通过碱基互补原则精确识别，在基因前面添加TAAGGAGGATATAC序列，可以增强核糖体与mRNA的识别与结合能力，而适当的间隔序列也可以提高翻译效率，在相同的转录水平下，提高了α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和NADH氧化酶的活力，酶促反应加快，最终提高(R)-乙偶姻的合成能力。

进一步地，所述E.coli为多基因缺失的突变菌株，通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括(S)-乙偶姻、2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸；所述合成副产物的关键基因包括dar、gldA、frdABCD、ldhA和pta。

进一步地，所述的α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株选自Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacteraerogenes、Serratia marcescens、Paenibacillus polymyxa和Bacillus licheniformis。

所述的α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株优选Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcescens。

进一步地，所述的NADH氧化酶基因的来源菌株选自Lactococcus lactis、Lactobacillus brevis、Lactobacillus rhamnosus、Streptococcus pyogenes、Bacillussubtilis和Clostridium aminovalericum。

所述的NADH氧化酶基因的来源菌株优选Lactococcus lactis、Lactobacillusbrevis、Streptococcus pyogenes和Bacillus subtilis。

本发明还提供所述基因工程菌株在生产(R)-乙偶姻的应用，包括以下步骤：

(1)发酵培养基的制备：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化钙，在80-100℃下液化0.5-5h，静置冷却；当温度降低至55℃以下时，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20h，调节pH 6.5-7.5，离心或过滤收集上清，稀释上清液后在115℃条件下灭菌15min，即得；按1000mL水计，所述液化和糖化的各组分用量为：木薯粉100-200g，氮源原料40-80g，液化酶0.5-2mL，氯化钙0.01-0.5g，糖化酶0.2-1mL，蛋白酶0.05～0.5g；所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得，所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉中的一种或一种以上组合；

(2)在无菌条件下，在发酵培养基中添加50-100μg/mL氨苄青霉素，然后移至发酵罐中，将经活化的基因工程菌菌液以体积比为1-10％的接种量接种到发酵培养基中，在温度35-42℃、搅拌转速200-800rpm、通气量0.5-1.5vvm条件下发酵培养20-72h，当检测发酵液中(R)-乙偶姻的浓度不再增加时，发酵结束。

所述氮源原料优选棉籽蛋白粉、豆粕粉；所述发酵培养温度优选37-40℃，搅拌转速优选500-600rpm，通气量优选0.5-1.0vvm。

在液化和糖化过程中，使用液化酶和糖化酶单独水解木薯粉，浓缩后可得到木薯还原糖母液。

进一步地，所述基因工程菌菌液的制备方法，包括以下步骤：(1)将生产(R)-乙偶姻基因工程菌株划线到含有质量体积比为1.8％琼脂和含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，在37℃培养10-15h；在无菌的条件下，挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体种子培养基中，37℃摇床震荡培养10-15h；所述LB培养基的配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

进一步地，在发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度，当葡萄糖浓度降至10-30g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80g/L；所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800g/L。

与现有技术相比，本发明的有益及有益效果为：

1、本发明提供的生产(R)-乙偶姻工程菌株能有效利用来源广泛、成本低廉的原料，菌株无致病性，氧化型辅酶NAD⁺能够有效再生，菌株的(R)-乙偶姻产量、光学纯度和生产效率高，最高产量可达到72.1g/L，光学纯度可达99％以上，克服了现有技术存在的问题。

2、本发明菌株的构建方法具有操作简便、效率高、成本低廉等优点，容易实现工业化生产。

3、本发明利用代谢工程敲除基因工程菌株中合成副产物的关键基因，提高了(R)-乙偶姻产量的产量和收率，同时副产物浓度的降低有利于(R)-乙偶姻的下游提取，能够降低下游成本。

4、基于载体pTrc99A等的基因表达无需添加具有毒性并且成本较高的诱导剂IPTG，工程菌株的外源基因表达水平即可满足高效合成(R)-乙偶姻的需要，同时由于不需要表达转录调控因子，因此培养基中无需添加具有细胞毒性的乙酸(盐)解除转录抑制，降低了生产成本，同时避免基因过量表达产生的代谢负荷，工程菌株性质稳定。

5、本发明利用非粮木薯粉为碳源，棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉或花生蛋白粉为氮源，替代已有报道使用的高纯糖、酵母粉用于发酵生产(R)-乙偶姻，不仅可以提高这些廉价原料的综合利用价值，还为(R)-乙偶姻发酵提供了更加廉价的原料，可大幅降低(R)-乙偶姻发酵的原料成本。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步详细说明，但不限于本发明的保护范围。

下述实施例中所涉及的材料：(1)液化酶、糖化酶、蛋白酶为商业化产品，可购于诺维信(中国)生物技术有限公司等公司；(2)棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉为商业化产品，可购于青岛科瑞培养基有限公司等公司。

下述实施例在发酵生产(R)-乙偶姻过程中，采用SBA-40C分析仪检测发酵液中葡萄糖浓度，利用液相色谱测定主要副产物的浓度，利用气相色谱测定产物(R)-乙偶姻的浓度及光学纯度，(R)-乙偶姻光学纯度的计算方法：ee＝([R])/([R]+[S])×100％。

实施例1

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA1的构建：

将来源于Enterobacter cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA和来源于Lactobacillus brevis的NADH氧化酶基因noxE的核苷酸序列进行密码子优化，在每个基因前面添加含核糖体结合位点的核苷酸序列TAAGGAGGATATACA，然后利用人工合成的方法获得基因簇budB-budA-noxE，其核苷酸序列长度为3849个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。利用双酶切与连接的方法，将基因簇budB-budA-noxE插入质粒pTrc99A的启动子后面，获得多顺反子重组质粒pTrc99A-budB-budA-noxE，再将重组质粒pTrc99A-budB-budA-noxE导入宿主菌E.coli MG1655，获得产(R)-乙偶姻的基因工程菌株ECRA1。

实施例2

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA2的构建：

对Paenibacillus polymyxa DSM 365的基因组序列进行分析，获得该菌株的α-乙酰乳酸合成酶基因alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶基因alsD的核苷酸序列。alsS基因核苷酸序列长度为1701个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述；alsD基因核苷酸序列长度为747个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述。对alsS、alsD和noxE的核苷酸序列进行密码子优化，在每个基因前面添加含核糖体结合位点的核苷酸序列TAAGGAGGATATACA，然后利用人工合成的方法获得基因簇alsS-alsD-noxE，其核苷酸序列长度为3837个碱基，核苷酸序列如SEQID NO.4所述。再将基因簇alsS-alsD-noxE插入质粒pTrc99A的启动子后面，获得多顺反子重组质粒pTrc99A-alsS-alsD-noxE，将其导入宿主菌E.coli MG1655，获得产(R)-乙偶姻的基因工程菌株ECRA2。

实施例3

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA3的构建：

通过分析发现工程菌株ECRA1和ECRA2发酵的副产物为(S)-乙偶姻、2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸，其合成途径的关键基因是dar、gldA、frdABCD、ldhA和pta。利用大肠杆菌λ噬菌体来源的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理，先用两侧带有FRT位点的抗生素抗性基因取代上述目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶删除抗生素抗性基因达到敲除目标基因的目的，具体步骤如下：

将pKD46质粒转化入宿主细胞，制备电转化感受态细胞；利用引物进行PCR构建打靶序列(含氯霉素抗性基因)，并将其直接转化入含pKD46的宿主细胞；氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆；利用测序技术验证、挑选目标基因被氯霉素抗性基因取代的克隆，制备电转化感受态细胞；电转导入pCP20质粒删除氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因删除的克隆连续划线传代三次，制备甘油管-20℃保存。通过叠加敲除，可获得多基因缺失的突变株E.coli MG1655/Δdar ΔgldA ΔfrdABCD ΔldhA Δpta，制备电转化感受态细胞，实施例1构建的多顺反子重组质粒pTrc99A-budB-budA-noxE电转导入多基因缺失突变株，获得工程菌株ECRA3。

表1各引物的核苷酸序列

实施例4

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA4的构建：

本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Klebsiella pneumoniae，NADH氧化酶基因的来源菌株为Lactococcuslactis。

实施例5

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA5的构建：

本实施例与实施例3的不同之处是：将实施例4构建的多顺反子重组质粒导入多基因缺失突变株，获得工程菌株ECRA5。

实施例6

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA6的构建：

本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Serratia marcescens，NADH氧化酶基因的来源菌株为Streptococcuspyogenes。

实施例7

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA7的构建：

本实施例与实施例3的不同之处是：将实施例6构建的多顺反子重组质粒导入多基因缺失突变株，获得工程菌株ECRA7。

实施例8

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA8的构建：

本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Enterobacter aerogenes，NADH氧化酶基因的来源菌株为Bacillussubtilis，宿主菌为E.coli BW25113。

实施例9

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA9的构建：

本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Klebsiella oxytoca，NADH氧化酶基因的来源菌株为Lactobacillusrhamnosus，宿主菌为E.coli BW25113。

实施例10

生产(R)-乙偶姻基因工程菌株ECRA10的构建：

本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Bacillus licheniformis，NADH氧化酶基因的来源菌株为Clostridiumaminovalericum。

实施例3-10合成基因簇的方法与实施例1或2相同，或为现有常规技术方法，本领域技术人员能够通过本申请公开的内容获悉该基因簇的核苷酸序列，对此不再累述实施例3-10对应合成的基因簇的核苷酸序列。

应用实施例1

工程菌株ECRA1、ECRA2、ECRA3、ECRA4、ECRA5、ECRA6、ECRA7、ECRA8、ECRA9、ECRA10在生产(R)-乙偶姻的应用，包括以下步骤：

(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉180g十份，分别加入烧杯中，每份再各补加入60g棉籽蛋白粉、1000mL自来水、0.5mL液化酶和0.2g氯化钙，充分摇匀后，95℃液化1.5h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.5mL糖化酶和0.1g蛋白酶，在55℃糖化20h，调节pH 7.5，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；

(2)在发酵培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素，分别取500mL转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取活化好的ECRA1、ECRA2、ECRA3、ECRA4、ECRA5、ECRA6、ECRA7、ECRA8、ECRA9、ECRA10工程菌菌液以体积比为5％的接种量分别接种到上述发酵培养基中，其中ECRA9、ECRA10添加0.01mM的IPTG，然后在温度37℃、搅拌转速300rpm、通气量1vvm条件下发酵培养，发酵16h、28h分别补糖50g/L，至(R)-乙偶姻浓度不再增加时结束发酵，取样并利用气相色谱和液相色谱测定产物(R)-乙偶姻及副产物(S)-乙偶姻、丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸的浓度，并计算(R)-乙偶姻的光学纯度，测定结果如表1所示。

所述工程菌菌液的活化方法：将生产(R)-乙偶姻的ECRA1、ECRA2、ECRA3、ECRA4、ECRA5、ECRA6、ECRA7、ECRA8、ECRA9、ECRA10工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养10h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

表2不同工程菌株的发酵产物

从表2可以得知，敲除副产物合成途径的关键基因dar、gldA、frdABCD、ldhA和pta，工程菌株ECRA3、ECRA5、ECRA7的(R)-乙偶姻产量和光学纯度，与未经过敲除处理的工程菌株(分别对应于ECRA1、ECRA4、ECRA6)相比显著提高，(R)-乙偶姻的副产物2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸的浓度大大降低，因此敲除副产物合成途径的关键基因不但提高了(R)-乙偶姻产量和光学纯度，而且有利于下游的产物提取，能够降低生产成本并提高产品的质量(光学纯度高)。

应用实施例2

工程菌株ECRA3在生产(R)-乙偶姻的应用，包括以下步骤：

(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉190g四份，分别加入烧杯中，再分别加入57g豆粕粉、70g豆饼粉、62g花生蛋白粉、70g棉籽蛋白粉，再加入1000mL自来水、1.2mL液化酶和0.5g氯化钙，充分摇匀后，90℃液化2h，静置冷却；温度降低至50℃以下时，加入0.3mL糖化酶和0.2g蛋白酶，在55℃糖化24h，调节pH 6.5，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；

(2)在发酵培养基中100μg/mL氨苄青霉素，分别取500mL添加至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的ECRA3工程菌菌液以体积比为10％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度40℃、搅拌转速600rpm、通气量1.0vvm条件下发酵培养，发酵12h和24h分别补糖50g/L，发酵液中(R)-乙偶姻的浓度不再增加时发酵结束。经过测定豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉、棉籽蛋白粉对应的(R)-乙偶姻产量分别是58.1g/L、63.6g/L、61.5g/L、72.1g/L，光学纯度分别为99.1％、99.3％、99.2％、99.4％。

所述ECRA3工程菌菌液的活化方法：将ECRA3工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养15h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

应用实施例3

工程菌株ECRA5在生产(R)-乙偶姻的应用，包括以下步骤：

(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为150目的木薯粉；称取木薯粉185g，加入烧杯中，再加入65g棉籽蛋白粉，再加入1000mL自来水、0.8mL液化酶和0.3g氯化钙，充分摇匀后，95℃液化2h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.8mL糖化酶和0.3g蛋白酶，在55℃糖化18h，调节pH 7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；

(2)在发酵培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素，取500mL转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的ECRA5工程菌菌液以体积比为8％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速500rpm、通气量0.7vvm条件下发酵培养15h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为23.7g/L，补糖50g/L，发酵25h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵45h后，(R)-乙偶姻产量为65.2g/L，光学纯度达到99.5％。

所述ECRA5工程菌菌液的活化方法：将ECRA5工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养10h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养15h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

应用实施例4

工程菌株ECRA6在生产(R)-乙偶姻的应用，包括以下步骤：

(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为60目的木薯粉；称取木薯粉120g，加入烧杯中，再加入40g豆粕粉，再加入1000mL自来水、1.8mL液化酶和0.03g氯化钙，充分摇匀后，85℃液化5h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.2mL糖化酶和0.08g蛋白酶，在60℃糖化6h，调节pH 7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；

(2)在发酵培养基中添加60μg/mL氨苄青霉素，取500mL转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的ECRA6工程菌菌液以体积比为2％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度42℃、搅拌转速300rpm、通气量1.3vvm条件下发酵培养16h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为28.3g/L，补糖40g/L，发酵32h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵48h后，(R)-乙偶姻产量为46.7g/L，光学纯度达到99.1％。

所述ECRA6工程菌菌液的活化方法：将ECRA6工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

应用实施例5

工程菌株ECRA7在生产(R)-乙偶姻的应用，包括以下步骤：

(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为200目的木薯粉；称取木薯粉150g，加入烧杯中，再加入20g豆粕粉、20g棉籽蛋白粉和25g花生蛋白粉，再加入1000mL自来水、1.2mL液化酶和0.25g氯化钙，充分摇匀后，100℃液化1h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入1mL糖化酶和0.1g蛋白酶，在50℃糖化20h，调节pH 7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；

(2)在发酵培养基中添加80μg/mL氨苄青霉素，取500mL转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的ECRA7工程菌菌液以体积比为5％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速700rpm、通气量0.5vvm条件下发酵培养16h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为15.8g/L，补糖70g/L，发酵32h、48h、64h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵72h后，(R)-乙偶姻产量为65.5g/L，光学纯度达到99.3％。

所述ECRA7工程菌菌液的活化方法：将ECRA7工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养10h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养15h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

应用实施例6

工程菌株ECRA8在生产(R)-乙偶姻的应用，包括以下步骤：

(1)将木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉150g，加入烧杯中，再加入50g棉籽蛋白粉和30g花生蛋白粉，再加入1000mL自来水、1.0mL液化酶和0.2g氯化钙，充分摇匀后，90℃液化3h，静置冷却；温度降低至55℃以下时，加入0.5mL糖化酶和0.25g蛋白酶，在55℃糖化12h，调节pH 7.0，离心收集上清，用无菌自来水稀释上清液使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；

(2)在发酵培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素，取500mL转移至上海百仑六联发酵罐，在无菌条件下，取经活化的ECRA8工程菌菌液以体积比为8％的接种量接种到上述发酵培养基中，在温度38℃、搅拌转速500rpm、通气量1.2vvm条件下发酵培养16h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为20.3g/L，补糖40g/L，发酵32h、48h后再次补加等量木薯还原糖母液，发酵60h后，(R)-乙偶姻产量为61.1g/L，光学纯度达到99.5％。

所述ECRA8工程菌菌液的活化方法：将ECRA8工程菌株分别划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养15h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养10h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西科学院

<120> 生产(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法及其应用

<130> 3849

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3849

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

taaggaggat atacatatga actcggagaa acagtcgcgc caatgggcgc atggcgccga 60

catggttgtg ggccaactgg aagcccaggg cgtgaagcag gtgtttggca tcccgggcgc 120

gaaaattgac aaggtgtttg actcgctgct ggatagcagc attgagatca ttcctgtgcg 180

ccatgaggcg aacgccgcct ttatggccgc cgcggttggt cgtctgaccg gtaaggccgg 240

cgtggcctta gtgaccagcg gtcctggttg ttctaatctg attaccggca ttgcgaccgc 300

gaactcggag ggcgatcctg tggtggcctt aggcggtgcg gttaagcgcg cggataaagc 360

caaactggtg caccagagca tggataccgt ggcgatgttt agcccggtga cgaagtacgc 420

cgttgaagtt agctcgccgg acgcgattgc ggaggtggtt agcaacgcgt ttcgtgccgc 480

ggaacatggc cgtcctggtg gcgcgttcgt ttcgctgccg caggacattg ttgatcagcc 540

tgcgaccggt gcgatcttac cggccagcgg tcctgccctg atgggtccgg cccctgaaag 600

cgcgatcaat gatgttgcga aattaattga caatgcgaaa aacccggtga ttctgctggg 660

cttaatggcc tcgcagcctg ccaatagcgc ggcgttacgc aaactgctgg agaagagccg 720

tattccggtg acttctactt accaagccgc cggcgcggtg aatcaggaac actttacccg 780

ctttgccggt cgcgtgggtc tgttcaacaa tcaagcgggt gaccgcctgt tacacctggc 840

ggatctgatc atttgcattg gctacagccc ggttgaatac gaaccgagca tgtggaacag 900

cggcgatgcc acgctggtgc atatcgatgt tctgcctgcg tacgaggaac gcaattatgt 960

gccggatatc gagctggtgg gtgacattgc cgcgaccctg aatttactgg cctcgcgtat 1020

tgaccacaag ctggaactga gccaacgcgc gtcggagatt ctggtggacc gccaacatca 1080

gcgcgattta ttagaccgcc gtggtgcgtc gctgaaccag tttgcgctgc atcctctgcg 1140

cattgttcgc gcgatgcagg atatcgtgaa caacgatgtg accctgaccg tggacatggg 1200

cagcttccat atctggatcg cgcgttatct gtacagcttc cgcgcccgtc aggtgatgat 1260

cagcaacggc cagcagacta tgggtgttgc cttaccgtgg gcgatcggcg cgtggctggt 1320

taacccgggt cgtaaggttg tgagcgtgtc gggcgatggc ggtttcttac agagcagcat 1380

ggagctggaa acggccgtgc gcctgaacgc caacgtgtta catattattt gggtggataa 1440

cggctataac atggtggcca tccaagagga gaagaagtat cagcgcctga gcggtgttgc 1500

gtttggcccg gtggatttca aggcctatgc ggatgccttt ggcgcccgtg gcttcgccgt 1560

ggaaagcgcc gatgcgttag aaagcaccct gcgcgcggct atggatgtta atggtccggc 1620

ggttgttgcg attccggtgg attacagcga taacccgctg ctgatgggcc agctgcatct 1680

gtcgcagatt ctgtaataag gaggatatac atatgatgca cagctcggcg tgcgattgtg 1740

aagcgtcgct gtgcgaaacc ctgcgcggct ttagcgccaa acatccggac agcgttatct 1800

accagacctc gctgatgagc gcgctgctgt cgggcgttta cgaaggcgac accacgatcg 1860

ccgatctgct ggctcatggt gatttcggtc tgggcacctt caacgaactg gacggcgaaa 1920

tgattgcctt ttcttctcag gtgtaccagt tacgcgccga cggcagcgcg cgcgcggcca 1980

aaccggaaca gaaaacgccg ttcgccgtga tgacgtggtt ccaaccgcag tatcgcaaaa 2040

cgtttgatgc cccggtttcg cgtcagcaga ttcatgacgt gatcgatcag cagattccga 2100

gcgacaacct gttctgcgcg ctgcgcattg acggcaattt tcgccacgcc cacacccgca 2160

cggttcctcg ccaaacgccg ccgtaccgtg ccatgaccga tgtgctggac gaccagccgg 2220

tgtttcgttt taaccaacgc gaaggcgtgc tggttggctt ccgcacgccg cagcacatgc 2280

agggcattaa tgttgccggc taccatgagc actttattac cgacgatcgc cagggcggcg 2340

gtcatttact ggattatcag ctggagagcg gtgtgctgac cttcggcgag attcacaaac 2400

tgatgatcga cctgccggcc gacagcgcct tcttacaagc gaatctgcac ccgagcaacc 2460

tggacgccgc gattcgttcg gtggaaaatt aataaggagg atatacatat gaaaatcgtt 2520

gttatcggta ccaaccacgc tggtatcgct accgctaaca ccctgctgga acagtacccg 2580

ggtcacgaaa tcgttatgat cgaccgtaac tctaacatgt cttacctggg ttgcggtacc 2640

gctatctggg ttggtcgtca gatcgaaaaa ccggacgaac tgttctacgc taaagctgaa 2700

gacttcgaag ctaaaggtgt taaaatcctg accgaaaccg aagtttctga aatcgacttc 2760

gctaacaaaa aagtttacgc taaaaccaaa tctgacgacg aaatcatcga agcttacgac 2820

aaactggttc tggctaccgg ttctcgtccg atcatcccga acctgccggg taaagacctg 2880

aaaggtatcc acttcctgaa actgttccag gaaggtcagg ctatcgacgc tgaattcgct 2940

aaagaaaaag ttaaacgtat cgctgttatc ggtgctggtt acatcggtac cgaaatcgct 3000

gaagctgcta aacgtcgtgg taaagaagtt ctgctgttcg acgctgaaaa cacctctctg 3060

gcttcttact acgacgaaga attcgctaaa ggtatggacg aaaacctggc tcagcacggt 3120

atcgaactgc acttcggtga actggctaaa gaattcaaag ctaacgaaga aggttacgtt 3180

tctcagatcg ttaccaacaa agctacctac gacgttgacc tggttatcaa ctgcatcggt 3240

ttcaccgcta actctgctct ggcttctgac aaactggcta ccttcaaaaa cggtgctatc 3300

aaagttgaca aacaccagca gtcttctgac ccggacgttt acgctgttgg tgacgttgct 3360

accatctact ctaacgctct gcaggacttc acctacatcg ctctggcttc taacgctgtt 3420

cgttctggta tcgttgctgg tcacaacatc ggtggtaaag aactggaatc tgttggtgtt 3480

cagggttcta acggtatctc tatcttcggt tacaacatga cctctaccgg tctgtctgtt 3540

aaagctgcta aaaaactggg tctggaagtt tctttctctg acttcgaaga caaacagaaa 3600

gcttggttcc tgcacgaaaa caacgactct gttaaaatcc gtatcgttta cgaaaccaaa 3660

tctcgtcgta tcatcggtgc tcagctggct tctaaatctg aaatcatcgc tggtaacatc 3720

aacatgttct ctctggctat ccaggaaaaa aaaaccatcg acgaactggc tctgctggac 3780

ctgttcttcc tgccgcactt caactctccg tacaactaca tgaccgttgc tgctctgaac 3840

gctaaataa 3849

<210> 2

<211> 1701

<212> DNA

<213> Paenibacillus polymyxa DSM 365

<400> 2

ttgagtacca aagttcaagc tgttcaaact aaaactaaaa ccaaatccga tacaaaagga 60

gccgaccttg ttgtcgattg tttgatcaag caaggggtta cgcatatttt tggcattcca 120

ggtgccaaga tcgattctgt ttttgatgtt cttcaagatc ggggtccaga attgatcata 180

tgccgtcatg aacaaaatgc cgcctttatg gcagcagcgg tcggtcgttt aacaggtaaa 240

ccgggcgtat gcattgttac ttccggtcca ggcgcgtcta acttggcgac aggacttgtc 300

accgctaatg cagagagtga tcctgtcgtc gccattgctg gtgcagtccc aagatcagaa 360

cgcctgaaac gcacgcatca atctatggat aacgccggac ttttcgaacc catcaccaag 420

tacagtgtag aagtagaaca tcctgatagt gtaccggaag caattactaa tgcatttcgg 480

attgcgacct cagcccagcc tggagccaca tttgtcagtc tgccgcagga cgtgttgact 540

tcgtcatccg aagtaaccgc cattgagaag gtttcccttc cccagcttgg aaccgcaccc 600

gccgagctca tcaaacaagt tgcaggccaa atcaaaaaag ccaagctgcc cgtactcctt 660

ctcggtatga aagccagcac acccgaagct acagcagcca tccgtgcact gattcgaaac 720

acggatttgc ctgtggttga aacctttcag gccgctggag ccatttcccg ggagctggaa 780

agccactatt ttgggagagt cggtctgttc cataatcagc cgggtgacat gcttcttgga 840

gcggcagatc tggtactgac gattggctat gatcctattg aatatgatcc aaaaaactgg 900

aatattcctg cgaaccgaac ccttattcat ctggatgatc atcaagcaga tattgatcat 960

gattatcaac ctgatcacga gcttatcggg aatatagccc tgattgtgag tggccttgca 1020

gaagaattgc ctaccttaaa gctacctaaa gcctcctgcg accaattaaa tcgtcttcgt 1080

catgatctaa acgagcaaga agctgttcct gtacacagtc acgattatct gattcatcca 1140

ttacaattta ttcgtacact gcgcagcctg atcgacgata atgtcactgt cacctgtgat 1200

gttggttcac actacatttg gatggcacga tatttccgtt cgtatgaacc gcggcgcctt 1260

ctattcagca acggaatgca gacgttgggc gtagcactgc cttgggggat tgctgccaca 1320

ctcgtcaacc ccggtcaaaa agtcgtttct atttctggag acggaggatt tctgttttca 1380

tccatggagc tcgaaaccgc tgtacgtctt aactctccgc tagtgcatat cgtatggaga 1440

gatggtacct atgacatggt cgcatttcaa caacagatta aatatggcag aacttccggt 1500

gtaaaatttg gagatgttga tgtagtgaaa tatgctgaaa gcttcggggc caccggatta 1560

cgcgtgcact ctcctgaaga actggaaagt gtattgcagc aggcacttca tacggatggt 1620

cctgtggttg ttgatatccc gattaattat caagataata tccagttggg acgtaaactg 1680

ctgccaaatc aattaaacta a 1701

<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> Paenibacillus polymyxa DSM 365

<400> 3

atgaccgttg caggactgga aaccaagcaa gaaactgacc atgatattta ccaaacgtcc 60

actatgctcg ctctattaga tggtctttat gacggagttg ttgcctttga ggagttgcaa 120

aagcacgggg attttgggat tggtaccttt gatcaactga atggcgagat gatcgcgttc 180

gatggtgaat tctatcactt gcttccagac ggtacggccc atcgcgtaaa accggaagaa 240

accacacctt tttccaccgt cacctttttc catgaagatt tcacatatac tattgaccgt 300

cccatgcatc gtgaagagct ggaagctctg ctgttaaagt tgtttccaag ccgtaatctg 360

ttctatgcct tccgtatgga tggcactttt cgtgaagtaa agacacgtac cgtccctcac 420

caggtgaagc cttacaaacc ttttatcgaa gcgaccaaat ctcagcctac gttctctttt 480

aacgacgctt ctggggtgat tacaggtttt tggacacctg cctatgctca aggtattggg 540

gtagccggat ttcatctgca ttttattaac gatgaacgca ctgggggtgg gcatgtcttt 600

gattttatcg tcgaaaagtg caccatccgc atttgtcaaa aatccaatct gcacctggtc 660

ctgcccgata ccccggatta cttgaaggcc aacctgtcca gagaaaacct ggagaaggaa 720

atcgccgtta ctgaaggtgc gcagtaa 747

<210> 4

<211> 3837

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

taaggaggat atacatatgt ccaccaaagt tcaagcggtc cagaccaaaa cgaaaaccaa 60

atcagatacg aaaggtgccg acctggtggt tgattgcctg atcaaacagg gcgttaccca 120

tatttttggc atcccgggtg cgaaaattga ctctgtgttc gatgttctgc aagaccgcgg 180

tccggaactg attatctgcc gtcacgaaca gaatgccgca tttatggcag ctgcggtggg 240

ccgcctgacc ggtaaaccgg gtgtctgtat tgtgacgtct ggcccgggtg caagtaacct 300

ggctacgggt ctggttaccg ccaatgcaga aagcgatccg gttgtggcta tcgcgggtgc 360

cgtgccgcgt tccgaacgcc tgaaacgtac ccatcagtca atggataacg cgggtctgtt 420

cgaaccgatt acgaaatatt ctgttgaagt cgaacacccg gacagtgtgc cggaagcgat 480

cacgaatgcc tttcgtatcg ccaccagcgc acaaccgggt gcaaccttcg tcagcctgcc 540

gcaggatgtg ctgaccagca gcagcgaagt taccgcgatt gaaaaagtct cgctgccgca 600

gctgggcacc gcaccggctg aactgatcaa acaagtcgca ggccagatta agaaagcgaa 660

actgccggtg ctgctgctgg gtatgaaagc aagcacgccg gaagctaccg ccgcaatccg 720

cgcgctgatt cgtaacaccg atctgccggt tgtcgaaacc ttccaggctg cgggcgcaat 780

ctcccgcgaa ctggaatcac attattttgg ccgtgttggt ctgttccaca atcagccggg 840

tgatatgctg ctgggcgccg cagacctggt gctgaccatc ggttatgatc cgattgaata 900

cgacccgaaa aactggaata tcccggcaaa ccgcacgctg attcatctgg atgaccacca 960

agctgatatt gaccatgatt accagccgga tcacgaactg attggtaata tcgcgctgat 1020

tgtgtctggc ctggccgaag aactgccgac cctgaaactg ccgaaagcaa gttgcgatca 1080

actgaaccgt ctgcgccatg acctgaatga acaggaagct gtgccggttc atagccacga 1140

ttatctgatc cacccgctgc aatttattcg caccctgcgt tcgctgatcg atgacaacgt 1200

cacggtgacc tgtgatgtgg gtagccatta catttggatg gcgcgctatt ttcgttctta 1260

cgaaccgcgt cgcctgctgt tcagtaacgg tatgcaaacc ctgggcgttg cactgccgtg 1320

gggtatcgct gcgacgctgg tcaatccggg tcagaaagtg gtttcgatta gcggcgatgg 1380

cggttttctg ttctcctcaa tggaactgga aaccgcagtt cgcctgaata gtccgctggt 1440

tcatatcgtc tggcgtgatg gcacctatga catggtggcc ttccagcaac agattaaata 1500

cggccgcacg tccggtgtga aatttggcga cgttgatgtc gtgaaatatg cggaatcatt 1560

cggtgcaacc ggtctgcgtg tgcatagccc ggaagaactg gaaagcgttc tgcaacaggc 1620

gctgcacacc gatggtccgg ttgtcgtgga cattccgatc aactaccaag ataatattca 1680

gctgggccgt aaactgctgc cgaaccagct gaattaataa ggaggatata catatgaccg 1740

tggcgggtct ggaaaccaaa caggaaacgg atcatgacat ttatcaaacc agtacgatgc 1800

tggcgctgct ggatggtctg tacgacggcg tggttgcctt tgaagaactg caaaaacacg 1860

gtgattttgg tattggcacc ttcgaccaac tgaacggtga aatgatcgcg tttgatggcg 1920

aattttatca tctgctgccg gatggcaccg cacaccgtgt gaaaccggaa gaaaccacgc 1980

cgttttcgac cgttacgttt ttccatgaag atttcaccta cacgatcgac cgtccgatgc 2040

accgcgaaga actggaagca ctgctgctga aactgtttcc gagccgtaac ctgttttatg 2100

ctttccgcat ggatggcacc ttccgtgaag ttaaaacccg cacggtcccg catcaggtga 2160

aaccgtacaa accgtttatt gaagcaacca aaagccaacc gacgttttct ttcaatgatg 2220

ctagtggtgt catcaccggc ttttggacgc cggcgtatgc ccagggtatt ggcgtggcgg 2280

gctttcatct gcacttcatc aacgatgaac gtaccggcgg tggccatgtt ttcgatttca 2340

tcgtcgaaaa atgcacgatt cgcatctgtc agaaatccaa tctgcacctg gttctgccgg 2400

ataccccgga ctacctgaaa gccaacctgt cacgcgaaaa tctggaaaaa gaaatcgcag 2460

tcacggaagg cgctcaataa taaggaggat atacatatga aaatcgttgt tatcggtacc 2520

aaccacgctg gtatcgctac cgctaacacc ctgctggaac agtacccggg tcacgaaatc 2580

gttatgatcg accgtaactc taacatgtct tacctgggtt gcggtaccgc tatctgggtt 2640

ggtcgtcaga tcgaaaaacc ggacgaactg ttctacgcta aagctgaaga cttcgaagct 2700

aaaggtgtta aaatcctgac cgaaaccgaa gtttctgaaa tcgacttcgc taacaaaaaa 2760

gtttacgcta aaaccaaatc tgacgacgaa atcatcgaag cttacgacaa actggttctg 2820

gctaccggtt ctcgtccgat catcccgaac ctgccgggta aagacctgaa aggtatccac 2880

ttcctgaaac tgttccagga aggtcaggct atcgacgctg aattcgctaa agaaaaagtt 2940

aaacgtatcg ctgttatcgg tgctggttac atcggtaccg aaatcgctga agctgctaaa 3000

cgtcgtggta aagaagttct gctgttcgac gctgaaaaca cctctctggc ttcttactac 3060

gacgaagaat tcgctaaagg tatggacgaa aacctggctc agcacggtat cgaactgcac 3120

ttcggtgaac tggctaaaga attcaaagct aacgaagaag gttacgtttc tcagatcgtt 3180

accaacaaag ctacctacga cgttgacctg gttatcaact gcatcggttt caccgctaac 3240

tctgctctgg cttctgacaa actggctacc ttcaaaaacg gtgctatcaa agttgacaaa 3300

caccagcagt cttctgaccc ggacgtttac gctgttggtg acgttgctac catctactct 3360

aacgctctgc aggacttcac ctacatcgct ctggcttcta acgctgttcg ttctggtatc 3420

gttgctggtc acaacatcgg tggtaaagaa ctggaatctg ttggtgttca gggttctaac 3480

ggtatctcta tcttcggtta caacatgacc tctaccggtc tgtctgttaa agctgctaaa 3540

aaactgggtc tggaagtttc tttctctgac ttcgaagaca aacagaaagc ttggttcctg 3600

cacgaaaaca acgactctgt taaaatccgt atcgtttacg aaaccaaatc tcgtcgtatc 3660

atcggtgctc agctggcttc taaatctgaa atcatcgctg gtaacatcaa catgttctct 3720

ctggctatcc aggaaaaaaa aaccatcgac gaactggctc tgctggacct gttcttcctg 3780

ccgcacttca actctccgta caactacatg accgttgctg ctctgaacgc taaataa 3837

Claims (4)

1.一种生产(R)-乙偶姻基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列进行密码子优化；（2）将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因拼接获得包含该三个基因的基因簇，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；（3）将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；（4）将多顺反子重组质粒导入宿主菌E. coli，获得生产(R)-乙偶姻的基因工程菌株；

所述宿主菌E. coli是多基因缺失的突变菌株，通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括(S)-乙偶姻、2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸；所述合成副产物的关键基因包括dar、gldA、frdABCD、ldhA和pta。

2.如权利要求1所述构建方法构建而得的基因工程菌株在生产(R)-乙偶姻的应用，其特征在于：包括以下步骤：

（1）发酵培养基的制备：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化钙，在80-100℃下液化0.5-5 h，静置冷却；当温度降低至55℃以下时，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20 h，调节pH 6.5-7.5，离心或过滤收集上清，稀释上清液后在115℃条件下灭菌15min，即得；按1000 mL水计，所述液化和糖化的各组分用量为：木薯粉100-200 g，氮源原料40-80 g，液化酶0.5-2 mL，氯化钙0.01-0.5 g，糖化酶0.2-1 mL，蛋白酶0.05~0.5 g；所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得，所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉中的一种或两种以上组合；

（2）在无菌条件下，在发酵培养基中添加50-100 μg/mL氨苄青霉素，然后移至发酵罐中，将经活化的基因工程菌菌液以体积比为1-10%的接种量接种到发酵培养基中，在温度35-42℃、搅拌转速200-800 rpm、通气量0.5-1.5 vvm条件下发酵培养20-72 h，当检测发酵液中(R)-乙偶姻的浓度不再增加时，发酵结束。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述基因工程菌菌液的制备方法包括以下步骤：（1）将生产(R)-乙偶姻基因工程菌株划线到含有质量体积比为1.8%琼脂和含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上，在37℃培养10-15 h；在无菌的条件下，挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养10-15 h；所述LB培养基的配方为：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化钠。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：在发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度，当葡萄糖浓度降至10-30 g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80 g/L；所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800 g/L。