CN115927136B - 一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌、其构建方法及其应用。本发明的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌，所述的重组乳酸菌，以乳酸菌为宿主，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的乙偶姻操纵子基因；该菌株已于2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2022430。本发明具有如下技术效果：1)本发明通过将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌中代谢乙偶姻的基因与载体连接构建质粒，然后转入到乳酸菌中，获得一种新的重组乳酸菌。2)本发明获得的重组乳酸菌在用于复配小曲的制备过程中，能够不受窖池氧浓度不断下降的影响，依然能够高产四甲基吡嗪。

Description

一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌、其构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌、其构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

目前重庆小曲酒生产普遍存在风味物质种类数量不足(主要骨架成分10种左右)，而杂醇油(以异戊醇计100mg/100ml以上)等杂质含量过高的问题。虽然课题组前期进行了复配小曲的研制，将重庆小曲白酒的主要风味物质从10多种提高到了30多种，但与大曲白酒的风味物质相比还有较大的差距。白酒的风味物质主要由微生物代谢产生，由于小曲白酒生产周期较短，完全通过环境微生物代谢产生风味物质来提高白酒品质十分困难，这也是重庆小曲白酒风味物质少、放香不足的根本原因，其次，由于重庆小曲白酒中微生物数量不如大曲白酒，不仅风味成分少，所含健康成分更少，如，四甲基吡嗪等一类明确的健康因子。如何提高重庆小曲白酒中的风味成分，尤其是对人体有益的健康成分是提高重庆小曲白酒品质的重要方面。

在研究过程中，发明人筛选出了两株产四甲基吡嗪较高的芽孢杆菌，产四甲基吡嗪分别为1.6g/L和0.78g/L，但是将这两株菌与复配小曲按不同配比进行组合，应用于实际生产后，结果表明，与复配小曲组合后的两株菌产四甲基吡嗪的量都很少，气相色谱几乎检测不出。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够在白酒的窖池生产中产四甲基吡嗪工程菌、其构建方法及其应用。

为了解决现有技术存在的问题，发明人对“将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌与复配小曲组合后，产四甲基吡嗪的量很少且气相色谱几乎检测不出”这种现象的原因进行了深入研究。发明人通过高能量测序分别对小曲白酒发酵期中各阶段的酒糟进行微生物群落及多样性分析，结果表明，进入窖池的2天开始，芽孢杆菌属的数量急剧下降，在发酵第3～7天主要优势菌属为乳杆菌属，酵母菌属在发酵第2天到发酵结束相对丰度平稳提高。由此可知，产四甲基吡嗪少的主要原因是芽孢杆菌属的数量不足，由于入窖后氧浓度不断下降抑制了芽孢杆菌类好氧微生物的生长，而兼性厌氧的乳酸菌数量增加较大。

针对上述问题的发生原因，发明人利用基因工程技术将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌中代谢乙偶姻的基因克隆出来，与载体连接构建质粒，然后转入到乳酸菌中，进行代谢表达，构建了产四甲基吡嗪工程菌。在着力提高小曲的产香能力，改善小曲酒放香不足的同时，也提高小曲酒中健康因子的含量。在整个过程中，通过GC分析检测各项指标。并逐级放大到中试及生产中，进一步验证工程菌的生产性能，摸索其在白酒实际生产中产风味物质的情况。

本发明的技术方案如下：

在本发明的第一方面，提供了一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌。

所述的重组乳酸菌，以乳酸菌为宿主，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的乙偶姻操纵子基因；该菌株已于2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022430。

在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述产四甲基吡嗪的重组乳酸菌的构建方法。

所述的构建方法步骤如下：

1)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的乙偶姻操纵子基因片段，插入到质粒pMG36e载体上的Xba I和Pst I限制性酶切位点之间，使核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，构建重组表达质粒pMG36e-ALS；

2)用步骤2)得到的重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞，获得初步重组菌，并提取初步重组菌中的重组质粒；

3)用步骤3)提取的重组质粒转化乳酸菌感受态细胞，得到产四甲基吡嗪的重组乳酸菌。

优选地，所述的大肠杆菌感受态细胞为E.coilMC1061。

优选地，所述的乳酸菌感受态细胞为NZ9000。

在本发明的第三方面，提供了利用第一方面所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌产四甲基吡嗪的方法。

所述的方法步骤如下：

1)将产四甲基吡嗪的重组乳酸菌置于发酵罐中进行发酵，诱导乙偶姻操纵子基因表达，得到发酵液；

2)将得到的发酵液在水浴锅中100℃蒸煮10min，使其发生非酶促的美拉德反应，使乙偶姻与氨反应得到产物四甲基吡嗪。

在本发明的第四方面，提供了如第一方面所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌在重庆小曲生产中的应用。

本发明具有如下技术效果：

1)本发明通过将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌中代谢乙偶姻的基因与载体连接构建质粒，然后转入到乳酸菌中，获得一种新的重组乳酸菌。

2)从实施例2可以看出，本发明的重组乳酸菌在用于复配小曲的制备过程中，能够不受窖池氧浓度不断下降的影响，依然能够高产四甲基吡嗪。

本发明涉及到的微生物的保藏信息如下：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；

保藏单位地址：中国武汉；

分类命名：Lactococcus lactis FPX-1；

保藏编号：CCTCC NO：M 2022430；

保藏日期为：2022年4月27日。

附图说明

图1为蜡样芽孢杆菌总DNA电泳图。其中，M：DNA Maker DL 10000；1、2：蜡样芽孢基因组。

图2为PCR扩增ALS基因电泳图。其中，M：DNA Maker DL 10000；1：PCR扩增产物。

图3为胶回收目的片段电泳图。其中，M：DNA Maker DL 10000；1、2：PCR产物切胶回收。

图4为阳性大肠杆菌菌落PCR鉴定电泳图。其中，M:DNA Maker DL 10000；1、2：挑取的阳性大肠杆菌。

图5为电转乳酸菌菌液PCR电泳图。其中，M:DNA Maker DL 10000；1、2：阳性乳酸菌。

图6为乙偶姻标样气相色谱图。

图7为四甲基吡嗪标样气相色谱图。

图8为空载乳酸菌发酵液气相色谱图。

图9为工程菌代谢产物气相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明中涉及的各种试验材料的购买来源如下：

NZ9000上海钦诚生物科技有限公司，NZ9000感受态自己制备；

载体pMG36e湖南丰晖生物科技有限公司；

E.coli MC1061感受态上海柯雷生物科技有限公司；

内切酶(Xba I，Pst I)和连接酶等酶赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

培养基(M17，MRS等)重庆崇浩生物技术有限公司；

实施例1重组乳酸菌的构建及验证

1.1出发菌株的DNA提取

从-80℃冰箱中取出蜡样芽孢杆菌菌种，冻融后接种于LB液体培养30℃条件下震荡过夜培养，离心集收菌体，用基因提取DNA小量提取试剂盒对蜡样芽孢杆菌基因组的提取后，收集基因组DNA电泳检测。为更好的提取蜡样芽孢杆菌的DNA，在进行细胞壁破碎时，可以用溶菌酶温水处理30min以上。

提取蜡样芽孢杆菌基因组后电泳检测，结果如图1所示，出现了大小在10000bp以上的条带，且亮度较大，结果符合预期，证明总DNA提取质量较高，符合进一步实验的要求。

1.2蜡样芽孢杆菌的ALS扩增

根据蜡样芽孢杆菌中的乙偶姻操纵子基因序列，设计特征引物对，以步骤1.1获得的蜡样芽孢杆菌基因组为模板进行扩增。

以NCBI数据库比对获得的ALS基因为模板(GenBank:CP001176.1)，利用Primerpremier 5.0软件设计引物，在ALS基因上游引物5’端引入酶切位点Xba I，下游引物3’端引入酶切位点Pst I。

设计扩增ALS的引物序列如下：

表1：设计的扩增ALS引物序列

引物设计时需注重引物设计的原则。同时要为后续重组载体构建考虑，在ALS基因上游引物5’端引入酶切位点Xba I，下游引物3’端引入酶切位点Pst I，插入酶切位点时，要注意目的基因片段中是否有酶切位点，防止对目的基因造成误切而遭到破坏。

表2：PCR扩增体系

表3：PCR扩增程序

PCR扩增结束后电泳检测并进行切胶回收。胶回收按柱式DNA回收试剂盒进行操作。

由图2扩增结果显示，出现了一条条带大小在1689bp的亮带，说明成功克隆出来ALS基因。在进行PCR时由于目的基因的条带较大，延伸时间应相应的延长，因此延伸时间设置为3min。这样所获得的目的基因才完整。

将电泳效果较好的PCR产物进行切胶回收，实验结果如图3所示。可见目的条带的特异性较高，大小在1689bp。说明ALS基因切胶回收结果的效果较好且片段大小符合预期。扩增的目的基因可以用于下一步的实验。

经过测序，得到ALS基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

通过比较NCBI数据库获得的ALS基因(GenBank:CP001176.1)和本发明中的ALS基因的核苷酸序列，发现本发明的ALS基因有如下几处突变：

1.3重组载体pMG36e-ALS构建

将扩增后的ALS基因回收后，用酶为Xba I和Pst I进行酶切，再与同样进行酶切后载体pMG36e连接，构建重组质粒pMG36e-ALS。

表4：酶切体系

37℃下酶切15min。

表5：酶连体系

放入22℃，进行过夜连接。

将连接产物热激转化至E.coilMC1061感受态细胞中。

大肠杆菌感受态制备与转化流程，包括如下步骤：

1)大肠杆菌37℃涂布过夜培养。

2)接种，220rpm，37℃摇床培养至OD600＝0.5。

3)冰上放置30min，离心弃上清，CaCl₂重悬，冰上放置30min，再次离心弃上清。

4)重复步骤3)一次；

5)100微升预冷CaCl₂溶液冰上重悬细胞；

6)连接反应；

7)连接产物与大肠杆菌混匀，放置30min；

8)42℃热激60s，再置于冰上2min；

9)摇床培养；

10)涂布于选择培养基上培养；

11)挑取阳性菌到加有氨苄青霉素的LB液体培养基培养；

12)菌落PCR检测。

检测正确后按细菌质粒小提试剂盒进行质粒的提取。

观察图4可发现，图中均出现特异条带，条带大小为1689bp与预期结果一致，表明菌落均为阳性。将菌液于-80℃进行保存，并命名为E.coliMC1061(pMG36e-AC)。

对阳性菌株所提取质粒进行测序，将测序结果进行拼接比对，对结果进行对比后确定扩增片段为ALS基因，说明重组载体构建成功。

1.4重组乳酸菌的构建与验证

1.4.1 NZ9000感受态细胞制备

乳酸菌感受态制备流程如下：

1)划线培养活化菌株，将NZ9000划线到GM17平板，30℃厌氧静置培养；

2)待菌落生长至直径1-2mm大小，挑取单菌落，接种于GM17液体培养基中，30℃静置培养12h；

3)以5％比例转接于2.5％甘氨酸的SGM17培养液中，30℃静置培养至菌液OD600＝0.3-0.4；

4)用8ml细胞预处理液重悬，室温静置30min，4℃，5000rpm，10min离心，弃上清；

5)先用溶液Ⅰ洗涤，再用溶液Ⅱ洗涤，最后再用溶液Ⅰ洗涤；

6)用溶液Ⅰ重悬菌体，按照每管80微升分装于1.5ml离心管中，-80℃保存。

其中，

溶液Ⅰ组分如下：0.5mol/L蔗糖，10％甘油；

溶液Ⅱ组分如下：0.5mol/L蔗糖，10％甘油，0.05mol/L EDTA；

细胞预处理液组分如下：100mmol/L乙酸锂二水，10mmol/L DTT，0.6mol/L蔗糖，1mL 1mol/L Tris-HCl母液，调节pH至7.5。

1.4.2重组乳酸菌的构建

乳酸菌电转操作流程如下：

1)向每管感受态细胞中加入质粒(质粒为步骤1.3提取得到的重组质粒pMG36e-ALS)，轻轻混匀，转移至冰上预冷的电击杯中，轻敲电击杯，确保混合物进入电击杯底部；

2)调节电转化参数电压为2.0kV，电击电转化杯；

3)迅速向电转化杯中加入1mL预冷的恢复培养基，混匀后转移1.5ml离心管中。

4)于厌氧培养箱中30℃静置复苏培养2h后取适量菌液涂布红霉素的GMS平板，于厌氧培养箱中倒置培养24-48h至长出单菌落。

1.4.3重组乳酸菌的验证

将平板上长出的单菌落接种至M17液体培养基，30℃培养24h后按照质粒小提试剂盒提取质粒，再以所设计的引物进行PCR后进行电泳验证。PCR的程序同前面步骤1.2的扩增程序一样。

挑取电转乳酸菌进行菌液PCR后电泳检测结果如图5所示，

由图5可知；电转后的乳酸菌经过厌氧发酵后，对所长出来的菌落，进行菌落PCR电泳验证，电泳结果显示，有一条带条带大小为1689bp，与前面从蜡样芽孢中所克隆的ALS基因的大小一致。说明ALS基因成功导入乳酸菌。

1.5检验重组乳酸菌四甲基吡嗪的含量

将在含红霉素培养基上的单菌落接种于液体M17培养基，加入铵盐后，在30℃无氧条件下进行发酵24h。将得到的发酵液用0.2um的细菌过滤器下进行过滤，去除菌体后收集滤液，进行气相色谱分析产乙偶姻的含量，气相色谱检测时，以0.2mg/L的乙偶姻作为标准品。

将得到的发酵液在水浴锅中100℃蒸煮10min，使其发生非酶促的美拉德反应，使乙偶姻与氨反应得到产物四甲基吡嗪。同样对其进行细菌过滤去除菌体后，收集滤液。对滤液进行气相色谱检测，以0.2g/L的四甲基吡嗪作为标准品。

图6为乙偶姻标样的气相检测结果，由图可知乙偶姻的色谱峰出现的时间为10.185min。

图7为四甲基吡嗪标样的气相检测结果，由图可知四甲基吡嗪的色谱峰出现在15.698min。

图8为对照组空载体乳酸菌的气相检测结果，由图可知，空载体的在10min和15min时菌均未出现色谱峰，说明空载体中并不存在ALS基因。

由图9可知，在10.171min和15.628min出现了色谱峰。根据标样的出峰时间判断，10.171min时出现的色谱峰是乙偶姻，15.628min时出现的色谱峰是四甲基吡嗪。由于在在跑气相时，存在出峰时间存在一定偏差，故出现产物的时间会有微小的不同，但总体上不影响确定产物。

该结果表明经转化的工程菌中出现了目标产物乙偶姻。根据乙偶姻计算公式，乙偶姻含量＝(样品的峰面积/标样的峰面积)×标样的浓度。计算乙偶姻的含量为0.08mg/L。说明导入的ALS基因在乳酸菌中已成功表达，产生了代谢产物乙偶姻。

同理，根据计算公式，经计算后四甲基吡嗪浓度为0.06g/L。说明乙偶姻能够转化为四甲基吡嗪，即我们所构建的乳酸菌工程菌和我们预期结果一样，表明所构建的工程菌可以产四甲基吡嗪。

实施例2将实施例1的重组乳酸菌用于复配小曲的实际生产试验

复配小曲的制作、酵母菌的培养、乳酸工程菌的培养方法同前

1.泡粮：将500kg原料糯高粱倒入装有其重量4倍沸水的泡粮池，泡粮10h.

2.初蒸：在蒸篦底部轻撒一层清蒸的稻壳，倒入高粱云盘进行初蒸，圆汽之后蒸15min。

3.闷水：关火，从底部打入80℃以上热水没过高粱面10cm左右，闷水5min。

4.复蒸：放去闷粮水，大火蒸粮1h。

5.下曲：将蒸好的糯高粱取出摊凉至品温降至46℃时，下第一次复配曲(复配曲采用现有专利中公开的复配曲：专利号：ZL 2016 1 0778887.6授权公告号：CN 106591160B)，曲量为总下曲量0.3％的一半，拌匀；再待品温降至35℃时下入另外一半曲药，同时添加培养好的酵母0.8％(产酯酵母：QXC酵母＝8:2)，拌匀，扒平至厚度为10cm，以粮糟比1:3的比例盖上配糟至厚度20cm后开始糖化。

6.糖化：糖化28h；

7.发酵：将糖化后的粮和配糟混匀，同时加入100ml、200ml、300ml培养好的乳酸工程菌液(乳酸工程菌液的制备方法如下：首先将乳酸工程菌从-80℃中划线到MRS培养基中进行活化，然后挑取单菌落到5ml MRS液体培养基中培养24h，将培养好的乳酸工程菌液作为种子液转移到50ml MRS液体培养基中继续培养24h。)入窖发酵7d。

8.蒸馏：将蒸锅加水，用旺火把水烧开，将发酵好的原料一层层顶汽撒在料锅里，进行装甑，装完甑后，立即盖上甑盖，接上过汽管，做好水封。此时减小火力，同时打开循环水。

出酒时最初500mL酒头单独接收后面，正常回收，当酒精浓度低于45°(V/V)时停止接收。将酒精溶液混合均匀后，用酒精计测出酒精度。

9.白酒中四甲基吡嗪含量的测定

对蒸馏后的白酒进行气相色谱检测，以0.2g/L的四甲基吡嗪作为标准品。

将上述步骤重复三次，作为三个生产批次。

三次生产试验出酒率和产四甲基吡嗪结果

从实施例2的结果可以看出，本发明通过将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌中代谢乙偶姻的基因克隆出来与载体连接构建质粒，然后转入到乳酸菌中，获得的重组乳酸菌用于复配小曲的制备过程中，能够不受窖池氧浓度不断下降的影响，依然能够高产四甲基吡嗪。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌，其特征在于，所述的重组乳酸菌，以乳酸菌为宿主，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的乙偶姻操纵子基因；该菌株已于2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2022430。

2.如权利要求1所述产四甲基吡嗪的重组乳酸菌的构建方法，其特征在于，所述的构建方法步骤如下：

1)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的乙偶姻操纵子基因片段，插入到质粒pMG36e载体上的XbaI和PstI限制性酶切位点之间，使核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，构建重组表达质粒pMG36e-ALS；

2)用步骤1)得到的重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞，获得初步重组菌，并提取初步重组菌中的重组质粒；

3)用步骤2)提取的重组质粒转化乳酸菌感受态细胞，得到产四甲基吡嗪的重组乳酸菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的大肠杆菌感受态细胞为E.coilMC1061。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的乳酸菌感受态细胞为NZ9000。

5.使用如权利要求1所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌产四甲基吡嗪的方法，其特征在于，所述的方法步骤如下：

1)将产四甲基吡嗪的重组乳酸菌置于发酵罐中进行发酵，诱导乙偶姻操纵子基因表达，得到发酵液；

2)将得到的发酵液在水浴锅中100℃蒸煮10min，使其发生非酶促的美拉德反应，使乙偶姻与氨反应得到产物四甲基吡嗪。

6.如权利要求1所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌在重庆小曲生产中的应用。

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