CN111961552B - 一种减少浓香型白酒发酵过程丁醇生成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种减少浓香型白酒发酵过程丁醇生成的方法，属于生物工程技术领域。使用液体培养基富集培养窖泥微生物，通过传统可培养技术从窖泥中分离纯化得到厌氧细菌纯培养物，并在丁醇发酵培养基体系以及模拟浓香型白酒窖内发酵体系比较各菌株的正丁醇合成能力，寻找正丁醇合成的重要贡献微生物，最终将怀疑目标锁定为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)。在分别考查入池酒醅的水分、稻壳量、酸度以及发酵温度这四种单因素对酒体内正丁醇含量的影响的基础上，选择最适条件对浓香型白酒生产工艺进行调整，使得窖泥中高产丁醇菌株Clostridium beijerinckii的含量减少，从而实现酒体丁醇含量的降低。

Description

一种减少浓香型白酒发酵过程丁醇生成的方法
技术领域
本发明涉及一种减少浓香型白酒发酵过程丁醇生成的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
高级醇是一类在发酵酒精饮料中共存的重要芳香成分和呈味物质，是三个碳及以上的一元醇类物质的总称。高级醇在酒中的存在具有两面性，适量的高级醇能使白酒具有丰满的香味和口感，并增加酒的协调性，但含量过多会产生头痛、头晕等不利影响。
正丁醇作为高级醇的主要成分之一，其含量对白酒品质也有影响。因此，需要将其在白酒中的含量控制在合适的范围。目前主要通过改进发酵工艺和对微生物进行基因改造来控制白酒中的正丁醇。其中，对微生物进行基因改造的微生物手段主要集中在单个菌株的遗传修饰上，然而，这些单一菌株改造方法不适用于复杂的混菌发酵体系。与此同时，改进发酵工艺这一途径具有操作简易方便可控的优势，一直是减少酒精饮料中高级醇的主要方法。
窖池发酵是浓香型白酒的特色，其酒体中正丁醇含量显著高于酿造工艺中无窖泥参与的酒精饮料；同时在长期的浓香型白酒生产中，人们发现新窖泥所产酒中正丁醇的含量远远超过老窖泥，由此可知正丁醇的生成与窖泥具有较强的相关性。窖泥是浓香型白酒发酵过程重要功能微生物栖息的主要环境之一，窖泥细菌产生的代谢产物对白酒品质和风味的形成有重要影响。浓香型白酒中正丁醇含量较高是很有必要解决的一个难题，目前存在着几个相关的问题需要解决：(1)浓香型白酒窖内发酵过程中正丁醇的合成与哪种窖泥微生物相关，(2)发酵过程中存在哪些因素能够影响正丁醇的生成，如果能解决这些问题，将对降低浓香型白酒酒体中正丁醇含量的应用具有积极的推动作用。
发明内容
在目前的报道中，梭菌是白酒酿造过程中产生丁醇最主要的菌属，发明人从窖泥中分离出了梭菌属的菌株，并在丁醇发酵培养基体系以及模拟浓香型白酒窖内发酵体系对各菌株的正丁醇合成能力进行比较，寻找合成正丁醇的重要贡献窖泥微生物。发现在分离出的8个种的21株菌株中，拜氏梭菌的丁醇合成能力最高。本发明通过对白酒发酵过程进行改进，从而通过减少拜氏梭菌的含量，降低酒醅中丁醇的含量。
本发明提供了一种减少丁醇生成的方法，其特征在于，调节白酒发酵过程中入池酒醅的水分、稻壳量、酸度以及发酵温度。
在本发明的一种实施方式中，所述入池酒醅的水分控制在54％～62％。
在本发明的一种实施方式中，所述稻壳量按质量计为20％～29％。
在本发明的一种实施方式中，所述酸度为1.4～1.8mmol/10g。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵温度为24～30℃。
本发明提供了一种降低白酒发酵体系中拜氏梭菌含量的方法，通过调节白酒发酵过程中入池酒醅的水分、稻壳量、酸度以及发酵温度来降低拜氏梭菌的含量。
在本发明的一种实施方式中，所述入池酒醅的水分控制在54％～62％，所述稻壳量按质量计为20％～29％。
在本发明的一种实施方式中，所述酸度为1.4～1.8mmol/10g。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵温度为24～30℃。
本发明提供了一种提高白酒安全性的方法，所述方法能够降低发酵食品发酵过程中产生的丁醇含量。
在本发明的一种实施方式中，调节白酒发酵过程中入池酒醅的水分、稻壳量、酸度以及发酵温度；所述入池酒醅的水分控制在54％～62％；所述稻壳量按质量计为20％～29％；所述酸度为1.4～1.8mmol/10g；所述发酵温度为24～30℃。
本发明提供了一种同时减少正丁醇生成和降低拜氏梭菌含量的方法，所述方法是调节白酒发酵过程中入池酒醅的水分、稻壳量、酸度以及发酵温度。
在本发明的一种实施方式中，所述入池酒醅的水分控制在54％～62％；所述稻壳量按质量计为20％～29％；所述酸度为1.4～1.8mmol/10g；所述发酵温度为24～30℃。
本发明还保护所述方法在降低发酵食品中丁醇含量中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括以小米、大米、糯米、小麦、大麦、高粱、玉米中的一种或多种的混合物为原料制备得到食品。
本发明的有益效果：
本发明通过调整浓香型白酒生产工艺，提供一种能减少浓香型白酒发酵过程正丁醇生成的方法。通过对池酒醅的水分、稻壳量、酸度以及发酵温度这四种单因素对酒体内正丁醇含量的影响，选择了最适条件对浓香型白酒生产工艺进行调整，在降低酒体丁醇含量的同时，使得窖泥中高产丁醇菌株Clostridium beijerinckii的含量减少。
附图说明
图1是梭菌正丁醇合成能力的比较；
图2是白酒发酵模拟体系梭菌正丁醇合成能力的比较；
图3是不同窖泥中拜氏梭菌含量的变化。
具体实施方式
实施例1：产丁醇的梭菌的分离鉴定及产丁醇能力比较
称取10g窖泥与100mL TPS(胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L)混合，80℃处理10min以杀死非芽孢状态的菌体及其他营养细胞，室温放置20min富集菌体，再置于80℃热处理10min，冷却至30-40℃，以10％的接种量接入RCM液体培养基，37℃厌氧富集培养7d。取1mL菌液稀释涂布RCM培养基，37℃厌氧培养2-5d。挑取不同形态的菌落划线分离3次后得到各菌株的单菌落。
使用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。用细菌16S rRNA基因的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)进行PCR扩增，产物纯化后送无锡天霖测序公司测序。将测序所得16S rRNA基因序列提交至GenBank进行BLAST比对，进行细菌的种属鉴定。PCR反应体系为(25μL)：2×Extaq 酶(0.1U/μL)12.5μL，ddH2O 11μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，模板DNA(10ng/μL)0.5 μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；随后34个循环(95℃30s，55℃30s，72℃90s)； 72℃终延伸5min。
从窖泥中共分离得到8个种的21株梭菌。
表1窖泥微生物的分离与鉴定
Figure BDA0002647918150000031
实施例2：梭菌正丁醇合成能力的比较
将实施例1筛选的8个种的21株梭菌分别划线培养，分别挑取单菌落接入强化梭菌液体培养基(RCM)中厌氧培养24-28h至OD600为0.9，以10mL/100mL接种量接种至丁醇发酵培养基，37℃厌氧培养3d。发酵液中加入内标(终浓度为10mg/L的叔戊醇)，混匀后待测。
色谱分析：通过顶空-气相色谱-氢离子火焰检测器(HS-GC-FID)测定样品中正丁醇含量，色谱柱为DB-Wax(30.0m×0.32mm×0.25μm)，平衡温度为70℃，平衡时间35min。进样口温度为200℃，检测器温度为260℃，分流比为3：1。升温程序为：40℃下保持5分钟，然后以10℃/min的速度升至180℃保持5分钟。使用氮气作为载气，流速为9mL/min。
将每个种的菌株生产的丁醇量取平均值，结果展示于图1中，在培养基体系中，拜氏梭菌Clostridium beijerinckii产丁醇能力最高，其正丁醇合成能力是其余梭菌的510-4511倍。
实施例3：白酒发酵模拟体系各梭菌正丁醇合成能力的比较
为探究各梭菌在白酒发酵过程中正丁醇的合成能力，因此设置了白酒窖内发酵的模拟体系进行验证。
发酵原料主要由高粱，大米，糯米，玉米和小麦组成(各组分质量比为9：4：3：2：2)，蒸熟混匀后待用。将上述发酵原料和大曲按16:1的质量比混合均匀，形成入池酒醅，随后添加入池酒醅质量的1/10的窖泥，混匀后单独分装，分别添加待考查菌株(105CFU/g)，37℃厌氧发酵7d后取样。将样品与水以1：2的质量比混匀，超声30min后，取上清，加入内标 (终浓度为10mg/L的叔戊醇)，混匀后待测。
结果表明，在模拟体系中，拜氏梭菌丁醇合成能力也明显高于其他菌株，其正丁醇合成能力是其余梭菌的2.95-9.18倍。
实施例4：浓香型白酒发酵工艺因素对正丁醇合成的影响
浓香型白酒的酿造以高粱为主要原料，再添加一定比例的大米、小麦、玉米、糯米做为辅料，使用中高温大曲为发酵剂进行发酵。它的主要生产工艺流程为：将五种粮食粉碎后按照一定比例混合，用热水浸泡后与出窖醅和适量稻壳混匀后入甑(一种蒸酒的容器)蒸馏。馏酒采取“低温馏酒、混蒸混烧、分段摘酒”工艺。出甑的酒醅冷却至13-16℃后拌入大曲，入池进行为期60天的固态发酵。馏酒后的出窖酒醅中的一部分再回到白酒发酵过程继续发酵。蒸馏获得的原酒被放入陶坛罐中进行储存老熟，用于后续的勾兑。
已有研究表明，人工窖泥质量、用曲量、投料量、窖泥pH、发酵轮次、发酵周期等对浓香型白酒中正丁醇生成存在影响。本发明针对与浓香型白酒窖内发酵相关的投料相关参数指标(发酵工艺参照宋瑞滨,邵泽良,宋军.浓香型白酒发酵过程中多因素对正丁醇生成影响的研究，公开日2018年)，包括：入池酒醅的水分、稻壳量(稻壳质量/粮食原料的质量)、酸度以及发酵温度，分别考查以上四种发酵工艺条件对酒体正丁醇含量的影响。以水分62-66％，稻壳量30％-34％，酸度1.2-1.4mmol/10g，发酵温度24-27℃分别作为对照。在发酵结束后，对白酒酒体中正丁醇含量进行测定，结果如表2所示。
降低入池酒醅水分含量可使酒中丁醇含量降低15.2-34.6％，减少稻壳量可使酒中丁醇含量降低18.6-33.3％，增加酒醅的酸度可使酒中丁醇含量降低8.5-22.0％，降低发酵温度可使酒中丁醇含量降低10.3-30.2％。
表2发酵工艺单因素对浓香型白酒酒体中正丁醇含量的影响
Figure BDA0002647918150000051
实施例5：发酵工艺减控正丁醇效果的验证
采用以下发酵工艺：入池酒醅水分54-58％，稻壳量20-24％，酸度1.6-1.8mmol/10g，发酵温度24-27℃进行浓香型白酒的生产试验。发酵结束后对白酒酒体中正丁醇含量进行测定。
通过上述工艺条件进行发酵，可使酒体正丁醇含量最高可降低47％左右。与对照相比， A窖池和B窖池酒中正丁醇含量分别降低29.6-46.7％、37.2-47.1％。而该发酵工艺的调整并不会影响浓香型白酒的风味和品质。与工艺调整前相比，此时酒体中四大酯的含量基本保持稳定，其中作为骨架风味成分的己酸乙酯最高，为200-350mg/100mL，乙酸乙酯次之，为150- 250mg/100mL，乳酸乙酯和丁酸乙酯含量分别为150-200mg/100mL，20-40mg/100mL。
表3发酵工艺改变对酒体正丁醇含量的影响
Figure BDA0002647918150000052
实施例6：发酵工艺的改进对拜氏梭菌的影响
通过发酵工艺调整，使窖池窖泥中合成正丁醇的最主要贡献菌株——拜氏梭菌数量下降，实现丁醇少产。由于窖底泥独特的地理优势以及其中微生物之间的相互作用，受人为因素及环境因素影响较小，窖底泥中拜氏梭菌生物量维持在105copies/g左右。与之相比，窖壁泥更易受外界因素的影响，由于工艺调整，其中拜氏梭菌含量变化显著，下降了2-3个数量级。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种减少浓香型白酒中丁醇生成同时降低白酒发酵体系中拜氏梭菌含量的方法，其特征在于，调节白酒发酵过程中入池酒醅的水分、稻壳量、酸度以及发酵温度来减少浓香型白酒中丁醇生成同时降低白酒发酵体系中拜氏梭菌含量；所述入池酒醅的水分控制在54％～58％；所述稻壳量为20％～24％；所述酸度为1.6～1.8mmol/10g；所述发酵温度为24～27℃，所述浓香型白酒的粮食原料以高粱为主要原料，再添加大米、小麦、玉米、糯米做为辅料。
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