CN112592861B - 一株减少白酒发酵过程正丁醇含量的酪丁酸梭菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株减少白酒发酵过程正丁醇含量的酪丁酸梭菌。本发明从窖泥中筛选分离菌株，通过丁醇培养基筛选获得一株具有减少正丁醇含量的酪丁酸梭菌，随后在五粮培养基体系考察了共培养时不同添加比例对正丁醇合成的影响，最终模拟窖泥窖内发酵体系对其减控效果进行验证。在白酒模拟发酵过程中，与只含窖泥的空白对照相比，添加酪丁酸梭菌可使发酵过程中正丁醇的生成量减少30.05％，使浓香型白酒的骨架风味物质己酸乙酯的含量增加25.77％；与添加拜氏梭菌6Y‑1的高产丁醇的发酵体系相比，添加酪丁酸梭菌可使体系内正丁醇的生成量减少27.08％，使己酸乙酯的含量增加5.09％。

Description

一株减少白酒发酵过程正丁醇含量的酪丁酸梭菌

技术领域

本发明涉及一株减少白酒发酵过程正丁醇含量的酪丁酸梭菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

高级醇(杂油醇)是指具有3个碳原子及以上的一元醇类，是酒类产品卫生标准中的一个限制性指标。适当含量的高级醇可提高酒的浓厚感，并增加酒的协调性。若少含或不含高级醇，则酒味淡薄；但含量过多会使人头痛、头晕等，同时也是导致醉酒上头的主要原因之一。正丁醇是高级醇的主要成分之一，因此，需要将其在白酒中的含量降至合适的浓度。

目前主要从两个方面控制白酒中的正丁醇：1、改进发酵工艺。高级醇含量受发酵因素和发酵工艺的影响，其中加曲量、加糠量、粮糟比、发酵力、糖化力等多因素的调控有可能有效地降低其生成量；此外，发酵过程的温度、pH、氧气含量等发酵条件也存在影响。其弊端是由影响因素过多导致的工作量大，耗时耗力，效率低。2、微生物手段。对微生物进行基因改造来调控正丁醇代谢，可从源头上阻断其生成途径，是目前最有效的一种方法，局限性在于人们担心这类菌株的安全性以及可能会对酒体风味形成产生不可控的影响；因此，筛选能减少白酒发酵过程中正丁醇生成的菌株是当前最安全有效的方法。

窖泥是浓香型白酒发酵过程重要功能微生物栖息的主要环境之一，窖泥细菌代谢产生的己酸和丁酸是浓香型白酒主体香己酸乙酯的前体，对白酒品质和风味的形成有重要影响。本课题组前期自合成正丁醇较多的窖池窖泥中分离得到一株高产菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii6Y-1，在不断的驯化以及菌群动态更替过程中，适应各个窖池不同环境的功能微生物菌群逐渐被富集。因此，从优质窖池的窖泥细菌筛选可以减少白酒发酵过程中正丁醇生成的菌株具有可行性，这对于推动降低浓香型白酒酒体中正丁醇含量的应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能减少白酒发酵过程中正丁醇含量的菌株。

本发明提供了一株酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)ZY-4，已于2020年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020650。

本发明提供了一种所述酪丁酸梭菌ZY-4的培养方法，所述方法是将酪丁酸梭菌ZY-4接种至RCM培养基中在30-40℃进行厌氧培养。

本发明提供了一种制备酒醅的方法，将所述酪丁酸梭菌与拜氏梭菌同时加入发酵体系中。

在本发明的一种实施方式中，所述拜氏梭菌已于2020年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020651。

在本发明的一种实施方式中，将粮食加水后，进行糊化反应，糊化反应结束后再进行糖化，即得到五粮培养基，将五粮培养基与一定比例大曲混合均匀，将所述酪丁酸梭菌与拜氏梭菌置于窖泥进行发酵，即得到酒醅。

在本发明的一种实施方式中，所述酪丁酸梭菌与拜氏梭菌的添加比例为(1:1)～(10:1)。

在本发明的一种实施方式中，所述酪丁酸梭菌的添加量为不低于1.0×10⁵CFU/g。

在本发明的一种实施方式中，在37℃进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，在无氧条件下发酵。

本发明提供了一种发酵剂，所述发酵剂中含有所述酪丁酸梭菌。

本发明提供了一种微发酵剂，所述发酵剂的制备方法为：取200～600μL的酪丁酸梭菌ZY-4接种于10～30mL RCM液体培养基中，30℃下活化2至3代，待酪丁酸梭菌ZY-4达到1.0×10⁶CFU/mL以上活菌数时，6000～1000rpm下离心15min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度不低于1.0×10⁶CFU/mL时，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH值为6～7的0.1～0.3M磷酸盐缓冲液和/或0.5％～1％的生理盐水和/或双蒸水，冷冻保护剂为10～20％的甘油和/或8～12％的脱脂乳粉和/或8～12％的海藻糖。

本发明提供了所述酪丁酸梭菌ZY-4，或所述发酵剂，或所述制备酒醅的方法在制备白酒中的应用。

有益效果：

本发明通过对窖泥微生物分离纯化，得到一株能显著减少白酒发酵过程中正丁醇生成的菌株酪丁酸梭菌ZY-4。该菌株与正丁醇合成菌株拜氏梭菌6Y-1共培养，能够很好地降低体系中生成的正丁醇，可使正丁醇减少达68.91％；在模拟白酒的发酵体系中，添加酪丁酸梭菌ZY-4与可使体系内正丁醇的含量减少30.05％，使浓香型白酒的骨架风味物质己酸乙酯的含量增加25.77％；与添加拜氏梭菌6Y-1的高产丁醇的发酵体系相比，添加酪丁酸梭菌ZY-4可使体系内正丁醇的生成量减少27.08％，使己酸乙酯的含量增加5.09％。因此，酪丁酸梭菌ZY-4是一株适用于白酒发酵生产环境并能降低发酵过程中正丁醇含量的菌株，同时能增加浓香型白酒的骨架风味物质己酸乙酯的生成量，这对于在白酒发酵生产中减控正丁醇含量具有重要意义。

生物材料保藏

本发明所提供的拜氏梭菌，分类命名为Clostridium beijerinckii6Y-1，已于2020年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020651，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

本发明所提供的酪丁酸梭菌，分类命名为Clostridium tyrobutyricumZY-4，已于2020年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020650，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

附图说明

图1为减少拜氏梭菌6Y-1正丁醇生成菌株的筛选；对照为只添加拜氏梭菌6Y-1，其余为拜氏梭菌6Y-1与各菌株按1:10添加，各菌株均为本发明筛选得到的其他的菌株。

图2为五粮培养基体系验证酪丁酸梭菌ZY-4添加比例对丁醇合成的影响；1:0为只添加拜氏梭菌6Y-1，0:1为只添加酪丁酸梭菌ZY-4，10:1为将拜氏梭菌6Y-1和酪丁酸梭菌ZY-4按10:1添加，5:1为将拜氏梭菌6Y-1和酪丁酸梭菌ZY-4按5:1添加，1:1为将拜氏梭菌6Y-1和酪丁酸梭菌ZY-4按1:1添加，1:5为将拜氏梭菌6Y-1和酪丁酸梭菌ZY-4按1:5添加，1:10为将拜氏梭菌6Y-1和酪丁酸梭菌ZY-4按1:10添加。

图3为模拟发酵装置及完全厌氧条件下酪丁酸梭菌ZY-4减控正丁醇效果的验证；6Y-1为只添加拜氏梭菌6Y-1，6Y-1+ZY-4＝1:10为将拜氏梭菌6Y-1和酪丁酸梭菌ZY-4按1:10添加。

图4为模拟白酒窖内发酵酪丁酸梭菌ZY-4减控丁醇的应用；对照只含窖泥，6Y-1为只添加拜氏梭菌6Y-1，ZY-4为只添加酪丁酸梭菌ZY-4，6Y-1+ZY-4为将拜氏梭菌6Y-1和酪丁酸梭菌ZY-4按1:10添加。

具体实施方式

RCM培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

五粮培养基：将用于生产浓香型白酒的粮食按比例混合，添加4倍水(w/v)和高温淀粉酶(50U/kg)蒸煮糊化1h，迅速冷却至60℃后加入糖化酶(120U/kg)，于60℃条件下糖化2h，121℃、灭菌20min，即为五粮培养基。

丁醇培养基：葡萄糖60g/L，酵母粉3g/L，磷酸二氢钾1g/L，碳酸钙3g/L，七水硫酸镁0.02g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，对氨基甲苯0.001g/L，维生素B₁0.001g/L，生物素0.00001g/L。

色谱分析：通过顶空-气相色谱-氢离子火焰检测器(HS-GC-FID)测定样品中正丁醇含量，色谱柱为DB-Wax(30.0m×0.32mm×0.25μm)，平衡温度为70℃，平衡时间35min。进样口温度为200℃，检测器温度为260℃，分流比为3：1。升温程序为：40℃下保持5min，然后以10℃/min的速度升至180℃保持5分钟。使用氮气作为载气，流速为9mL/min。

酒醅中挥发性风味物质采用固相微萃取联合气质联用技术(SPME-GC-MS)进行测定：萃取方法：50μm/30μmDVAB/CAR/PDMS固相微萃取头，于60℃萃取30min，热解吸附15min。GC-MS检测条件：色谱柱为DB-Wax(30.0m×0.32mm×0.25μm)，进样口温度为260℃，分流比为4：1；升温程序为：40℃保持1min，以3℃/min的速度升至180℃，以20℃/min的速度升至230℃保持12min。载气：高纯度氦气，流速为5mL/min。质谱条件：EI电离源，离子源温度230℃，接口温度260℃。测定后将样品质谱图与NIST2.0标准谱库进行比对鉴定，依据保留指数对挥发性物质进行定性，根据内标2-辛醇(终浓度为0.1mg/L)与挥发性物质的峰面积之比对其含量进行半定量分析。

实施例1：窖泥微生物的分离与鉴定

称取5g窖泥样品于装有玻璃珠的100mL RCM液体培养基中，摇匀，80℃热处理10min以淘汰非芽孢菌，37℃厌氧静置培养4-7d；将培养得到的菌液取上清液在4℃、12000rpm离心5min，取上清；对上清液进行梯度稀释10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，吸取0.1mL各梯度菌液分别涂布于RCM培养基，37℃厌氧培养2-5d；挑取不同形态的菌落分别在RCM固体培养基上进行划线，然后37℃厌氧静置培养4-7d至长出菌落；按照上述步骤划线分离3次后得到各菌株的单菌落。

分别挑取平板上的单菌落接种至8-10mL RCM液体培养基，37℃厌氧静置培养24-28h，得到不同单菌落的菌液。

使用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒对上述菌液提取细菌基因组DNA。用细菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R进行PCR扩增，将PCR产物送无锡天霖测序公司测序。将测序所得16S rRNA基因序列提交至GenBank进行BLAST比对，进行细菌的种属鉴定，共鉴定出12株不同的菌株。

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′。

PCR反应体系为(25μL)：2×Extaq酶(0.1U/μL)12.5μL，ddH₂O 11μL，上述引物(10μmol/L)各0.5μL，模板DNA(10ng/μL)0.5μL。

PCR扩增条件为：95℃预变性5min；随后34个循环(95℃30s，55℃30s，72℃90s)；72℃延伸5min。

实施例2：减少拜氏梭菌6Y-1正丁醇生成菌株的筛选

将进行种属鉴定后的菌株的菌液分别接入RCM液体培养基37℃厌氧培养24-28h至OD₆₀₀为1.1，将各菌株与正丁醇合成能力最强的拜氏梭菌6Y-1以体积比10:1的接种比例混合后接入发酵培养基，对照是只添加拜氏梭菌6Y-1的培养基。均以丁醇培养基体积的10％(10mL/100mL)接种量(混合后)接种至丁醇发酵培养基，37℃厌氧培养3d。发酵液中加入内标(终浓度为10mg/L的叔戊醇)，混匀后待测。

与只添加拜氏梭菌6Y-1对照相比，添加酪丁酸梭菌ZY-4可使正丁醇含量减少68.91％(图1)。

实施例3：丁醇培养基体系酪丁酸梭菌ZY-4减控机制的解析

将具有减控效果的酪丁酸梭菌ZY-4与高产丁醇的拜氏梭菌6Y-1以体积比10:1的接种比例混合后接入丁醇发酵培养基，以丁醇培养基体积的10％接种量接入后，37℃厌氧培养3d。分别通过气相色谱法、高效液相法测定由葡萄糖这一重要前体生成的丁醇含量及副产物，包括乙酸、丁酸、乙醇和丙酮。

在以葡萄糖为前体的丁醇培养基中进行减控机制的研究。与只添加拜氏梭菌6Y-1的对照相比，添加酪丁酸梭菌ZY-4可使体系内正丁醇的生成量减少103.08±9.55mmol/L，而其余副产物共生成103.01±10.55mmol/L(表1)。其中，乙酸含量生成量增加54.66±6.93mmol/L，丁酸含量生成量增加44.61±3.29mmol/L，乙醇含量生成量增加0.30±0.05mmol/L，丙酮含量生成量增加3.53±0.29mmol/L。

表1酪丁酸梭菌ZY-4减控机制的解析

实施例4：酪丁酸梭菌ZY-4不同添加比例的影响

添加1.0×10⁵CFU/g(在发酵体系内的浓度)的拜氏梭菌，同时按照拜氏梭菌6Y-1与减控菌株酪丁酸梭菌ZY-4的添加量分别为10:1、5:1、1:1、1:5、1:10的比例进行接种，以体积比10％的接种量接入200g五粮培养基内，37℃厌氧培养3d。

如图2所示，体系内正丁醇含量随ZY-4添加量的增加而减少，这表明通过调整ZY-4的添加量，可以将正丁醇的含量控制在一定范围内，且当拜氏梭菌6Y-1与酪丁酸梭菌ZY-4的比例为1:10时进行添加，对正丁醇含量的降低效果最好。与只含拜氏梭菌6Y-1的对照相比，添加酪丁酸梭菌ZY-4可使体系内正丁醇的含量最高减少81.61％。

实施例5：全程厌氧条件下的模拟发酵体系验证ZY-4减控正丁醇生成

以窖泥+酒醅+大曲+强化菌为考查体系，模拟窖内发酵(反应装置如图3A所示)。为排除酒醅中其他微生物对实验结果的干扰，取200g酒醅在121℃、灭菌20min，向酒醅添加质量比6.25％的大曲(大曲取自江苏洋河酒厂)后混匀；将窖泥均匀涂抹在模拟发酵装置内侧，于37℃进行5d的全程厌氧发酵。

在发酵开始前，向上述发酵体系的窖泥中分别添加1.0×10⁶CFU/g(在发酵体系内的浓度)的酪丁酸梭菌ZY-4和1.0×10⁵CFU/g拜氏梭菌6Y-1，对酪丁酸梭菌ZY-4减控正丁醇效果进行验证。

在为期5d的发酵过程中，与添加拜氏梭菌6Y-1的对照相比，添加酪丁酸梭菌ZY-4可使体系内正丁醇的生成量减少19.90％-47.40％。

实施例6：模拟白酒窖内发酵酪丁酸梭菌ZY-4减控丁醇的应用

向酒醅添加质量比6.25％的大曲(大曲取自江苏洋河酒厂)混匀后于30℃培养箱发酵2d，模拟浓香型白酒窖内发酵前期的有氧条件，使得大曲中的微生物对酒醅的营养成分进行初步的分解。而后同实施例5一样进行菌株添加及发酵装置的构建，以窖泥+酒醅+大曲+强化菌为考查体系，将只含窖泥、不强化任意一种梭菌的发酵体系设为空白对照，37℃进行48h的全程厌氧发酵。

结果表明，添加拜氏梭菌6Y-1可使发酵过程正丁醇的含量增加6.61-34.85％。与只含窖泥的空白对照相比，单独强化酪丁酸梭菌ZY-4最高可使体系内正丁醇的生成量减少30.05％，在添加6Y-1增加正丁醇生成量的基础上，添加ZY-4也具备减少正丁醇合成的效果，此时最多可降低27.08％。

表2菌株添加对模拟发酵过程酒醅中正丁醇生成量的影响

实施例7：窖泥梭菌对模拟发酵酒醅主要风味物质的影响

对实施例6发酵终点酒醅中主要的挥发性风味物质的种类和含量进行半定量分析，以评估向窖泥中添加梭菌对白酒风味的影响，结果如表3所示。

向窖泥单独添加两种梭菌或两菌的混合物，除己酸、己酸乙酯、辛酸乙酯等风味物质的含量显著增加外，酒醅中其余主要风味物质的含量基本与对照相同。其中强化酪丁酸ZY-4，不仅可在发酵过程降低正丁醇的生成，还使浓香型白酒的骨架风味物质己酸乙酯的含量增加25.77％。

表3窖泥梭菌扰动对酒醅中挥发性风味物质的影响

实施例8：制备含酪丁酸梭菌ZY-4的微生物菌剂

取200～600μL的酪丁酸梭菌ZY-4接种于10～30mL RCM液体培养基中，30℃下活化2至3代，待酪丁酸梭菌ZY-4达到1.0×10⁶CFU/mL以上活菌数时，6000～1000rpm下离心15min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(双蒸水)和冷冻保护剂(15％的甘油)，待细胞浓度不低于1.0×10⁶CFU/mL时，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum），已于2020年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020650。

2.一种制备酒醅的方法，其特征在于，将权利要求1所述酪丁酸梭菌和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）加入发酵体系中，所述拜氏梭菌已于2020年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020651。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将粮食加水后，进行糊化反应，糊化反应结束后再进行糖化，即得到五粮培养基，将五粮培养基与一定比例大曲混合均匀，将权利要求1所述酪丁酸梭菌与拜氏梭菌置于窖泥进行发酵，即得到酒醅。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酪丁酸梭菌与拜氏梭菌的添加比例为(1:10)~(10:1)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酪丁酸梭菌的添加量为不低于1.0×10⁵ CFU/g。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在35-40℃进行发酵。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在无氧条件下发酵。

8.一种发酵剂，其特征在于，含有权利要求1所述酪丁酸梭菌。

9.权利要求1所述酪丁酸梭菌，或权利要求2-7任一一项所述方法，或权利要求8所述发酵剂在制备白酒中的应用。

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