CN112251385B - 一株地衣芽孢杆菌scu-e及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌SCU‑E及其应用，属于微生物技术领域。本发明公开的地衣芽孢杆菌SCU‑E，保藏编号为CGMCC No.20675，其能够很好地适应小曲制作环节，其能够产生酱香风味物质，酯化力高，具有优良的产香能力，具备优质的发酵性能，可用于发酵酿酒。

Description

一株地衣芽孢杆菌SCU-E及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株地衣芽孢杆菌SCU-E及其应用。

背景技术

曲为酒之魂，曲是白酒酿造过程中重要的糖化发酵剂，是白酒酿造中重要的菌源、酶源和风味物质来源，发酵酿造过程就是粮食被酒曲和窖泥中的微生物发酵转化而合成乙醇和风味物质的过程；其中，各种各样的微生物是发酵酿酒的关键。“曲为酒之魂”，不同的酒曲，微生物千差万别，因而形成了风味品质各异的各种品牌的白酒。

曲的可培和免培研究结果都表明，芽孢杆菌是优势细菌，尤其是制曲的后期和陈曲阶段。芽孢杆菌是普遍存在于自然环境中，具有耐酸、耐盐、耐高温特点的细菌，非常适合温度、湿度和酸度波动大的制曲环境。随着对酿酒过程微生物菌群变迁规律及代谢调控的深入了解，筛选开发微生物强化技术已成为白酒生产领域研究与开放的热门课题。在制曲过程加入筛选的优势菌种，能够生产出群落与代谢组分更具特色的曲。目前芽孢杆菌与曲料制作环境不能很好的兼容，由于曲料制作环境开放性，对芽孢杆菌的要求更高。

因此，提供一株地衣芽孢杆菌SCU-E及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌SCU-E及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SCU-E，保藏编号为CGMCCNo.20675，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年09月18日，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。

进一步，地衣芽孢杆菌SCU-E在发酵酿酒中的应用。

进一步，地衣芽孢杆菌SCU-E在制作小曲中的应用。

进一步，地衣芽孢杆菌SCU-E在制作小曲中的应用，具体操作为：将OD₆₀₀＝2.4～3.0的地衣芽孢杆菌SCU-E菌悬液以6％-8％(V/V)的接种量接种到麦料上。

进一步，地衣芽孢杆菌SCU-E在生产风味物质中的应用。

进一步，地衣芽孢杆菌SCU-E产生酱香风味物质。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株地衣芽孢杆菌SCU-E及其应用，地衣芽孢杆菌SCU-E能够很好地适应小曲制作环节，其能够产生酱香风味物质，酯化力高，具有优良的产香能力，具备优质的发酵性能，可用于发酵酿酒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明地衣芽孢杆菌SCU-E在营养肉汤固体培养基培养的菌落形态；

图2附图为本发明地衣芽孢杆菌SCU-E的电镜扫描图；

图3附图为本发明地衣芽孢杆菌SCU-E的系统进化树。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1地衣芽孢杆菌的分离

地衣芽孢杆菌从茅台镇酱香大曲中筛选培养分离，具体筛选培养分离方法过程如下：

以酱香大曲为原料，选择营养肉汤固体培养基(蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、琼脂15g、1000mL去离子水)，分别取酱香大曲各部分的曲粉2g于装有无菌玻璃珠及45ml生理盐水的150ml三角瓶中打散，经80℃水浴处理30min后获得芽孢悬液，将芽孢悬液按系列稀释涂布到平板上，37℃恒温培养，再挑取菌落进行平板划线得到单菌落。

实施例2地衣芽孢杆菌的鉴定

(1)对菌种进行形态学、生理生化研究

挑取单菌落，在37℃条件下培养48小时；可形成菌落白色不透明、中凸、干燥有折皱、有缘毛，稀释涂布得到的多个单菌落，见图1。菌株的生长耐受温度范围为20-60℃，生长盐度范围为0-12％NaCl，生长pH值范围为5.0-10.0。对菌株进行扫描电镜观察，菌体形态均为杆状，单个或成对排列，菌体大小0.40-0.68μmx1.12-2.50μm，结果见图2。将该菌株命名为SCU-E。

菌株的生理生化特征使用API50CHB、API ZYM，以及BIOLOG GENⅢ碳源等检测试剂盒。其他菌株生理特征，包括革兰氏染色属性(革兰氏阳性杆菌)、氧需求、接触酶活性、氧化酶活性等，主要参照《伯杰氏细菌鉴定手册》。同时使用两株标准株(Bacilluslicheniformis ATCC 14580^T购买自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心，以下简称为ATCC 14580T；Bacillus paralicheniformis KACC 18426T，由Korean AgriculturalCulture Collection(KACC)提供，以下简称为KACC 18426T)进行相同的操作。结果见表1-表5。

表1 API 50CHB产酸作用测试差异结果

表2 API ZYM测试结果

表3分离株SCU-E与模式菌株的碳源可利用情况相似率

表4分离株SCU-E和模式菌株细胞壁氨基酸含量的比较

表5分离株SCU-E与模式菌株的生理生化特征比较

(2)16S rRNA基因测序及进化树构建

提取SCU-E菌株DNA：将SCU-E菌株37℃、180r/min培养24h后，按照UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒操作手册提取裂解液总DNA，DNA提取后放入-20℃保存备用。PCR引物：细菌通用引物27F和1492R。

27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2；

PCR反应条件：94℃预变性3min，95℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸1min 45s，循环35次，最后再72℃保温10min。反应结束后取适量PCR样品与染料混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

16S rRNA序列获得：PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结束后，将SCU-E的16S rRNA序列(SEQ ID NO.3)提交至NCBI进行在线比对服务检索相似性序列，并通过软件MEGA构建系统发育树，结果见图3。

SCU-E的16S rRNA序列：

GGCACTGGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTGCAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGGACAGATGG；SEQ ID NO.3。

(3)地衣芽孢杆菌的细胞化学特征检测

通过GC气相色谱、HPLC液相色谱和TLC薄层色谱检测地衣芽孢杆菌的脂肪酸、醌类型等细胞化学组分。

地衣芽孢杆菌SCU-E的细胞脂肪酸成分检测结果见表6。

表6分离株SCU-E和标准菌株脂肪酸含量的比较

表6结果显示，地衣芽孢杆菌SCU-E的主要脂肪酸是iso-C14:0，异式十四碳饱和脂肪酸；C14:0，十四碳饱和脂肪酸；C15:0，十五碳饱和脂肪酸；anteiso-C15:0，反异式十五碳饱和脂肪酸；iso-C16:0，异式十六碳饱和脂肪酸；C16:0，十六碳饱和脂肪酸；iso-C17:0，异式十七碳饱和脂肪酸；anteiso-C17:0，反异式十七碳饱和脂肪酸；C17:0，十七碳饱和脂肪酸；C18:0，十八碳饱和脂肪酸。

地衣芽孢杆菌SCU-E的呼吸醌组成检测：

将收集的菌体冷冻干燥后用于甲基萘醌的提取及纯化，再通过反相液相色谱层析分析法测定其甲基萘醌的种类，选择模式菌ATCC 14580T和KACC18426T作对照。在标准色谱条件下分析得到：菌株分离株SCU-E的主要的呼吸醌类型为MK-7，和模式菌株一样。

实施例3地衣芽孢杆菌SCU-E在制作小曲中的应用

将菌种SCU-E活化培养即接种到营养肉汤液体培养基(蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、1000mL去离子水)，150r/min 37℃摇床培养24h，接种的地衣芽孢杆菌菌悬液浓度为OD₆₀₀＝2.4，再将菌悬液以6％(V/V)的接种量接种到麦料(麦料购买于成都雄健粉业有限公司)上，37℃恒温培养14d，检测培养物的理化性质，将菌种ATCC 14580T进行相同的操作。结果见表7。

表7

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一株地衣芽孢杆菌SCU-E及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1453

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggcactggcg gcgtgctata catgcagtcg agcggaccga cgggagcttg ctcccttagg 60

tcagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatgcttgat tgaaccgcat ggttcaatca taaaaggtgg 180

cttttagcta ccacttgcag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360

gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaaactct gttgttaggg 420

aagaacaagt accgttcgaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540

ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg 600

ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg 720

taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagcaaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggtcttgac atcttctgac aaccctagag atagggcttc cccttcgggg gcagagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200

acacgtgcta caatgggcag aacaaagggc agcgaagccg cgaggctaag ccaatcccac 1260

aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttggag ccagccgccg 1440

aagggacaga tgg 1453

Claims (6)

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SCU-E，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.20675。

2.权利要求1所述的一株地衣芽孢杆菌SCU-E在发酵酿酒中的应用。

3.权利要求1所述的一株地衣芽孢杆菌SCU-E在制作小曲中的应用。

4.根据权利要求3所述的一株地衣芽孢杆菌SCU-E在制作小曲中的应用，其特征在于，将OD₆₀₀＝2.4～3.0的地衣芽孢杆菌SCU-E菌悬液以6％-8％(V/V)的接种量接种到麦料上。

5.权利要求1所述的一株地衣芽孢杆菌SCU-E在生产风味物质中的应用。

6.根据权利要求5所述的一株地衣芽孢杆菌SCU-E在生产风味物质中的应用，其特征在于，产生酱香风味物质。

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