CN102168029A - 一种地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）BG05菌株CCTCC NO.M2010251，及其在生产浓酱兼香型白酒中的应用。本发明的菌株最适pH7.0左右，最适生长温度为40℃～50℃，以大豆或麸皮为发酵基质能够产香，发酵底物中游离氨基酸含量较高，具有较好的耐热性能，适用于兼香型及酱香型固态法白酒发酵生产，能够为生产用高温大曲增香，提升浓酱兼香型白酒的典型风味，经济环保。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株及其应用，具体涉及一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及其在生产白酒中的应用。
背景技术
近年来，国内有关研究单位与生产厂家，对酱香型白酒的微量成分、生产工艺进行了大量的研究与分析，取得了一些有益的进展，但是对于酱香型白酒风味物质的本质及酱香产生所必须的微生物种类尚不清楚；而从其生理生化角度，对于微生物在酱香物质产生过程中产生何种酶及其具体作用及各种微生物之间存在怎样的相互协同作用等方面亦一直没有确切的解释。
浓酱兼香型白云边酒吸取了酱香型白酒的工艺特点——高温曲、高温堆积和浓香型白酒的工艺特点——混蒸续渣、泥窖发酵，把两者的生产工艺创造性地结合在一起，形成了其独特的生产工艺。兼香型白酒的主体香主要来自高温大曲，其主体香成分一直是白酒行业的研究热点。到目前为止，关于酱香型白酒和兼香型白酒的特征香气成分，在学术界仍未有定论。但可以确定的是，这些香味物质的产生、风格的形成，是美拉德反应的结果，而高温大曲中的产香功能菌所代谢的生物酶对美拉德反应起了较强的催化作用。因此，从产香细菌的角度来分析白酒的主要呈香物质及其形成机制，是非常必要的。
尽管通过气相色谱分离等手段可检测高温大曲中的香气成分，但仍存在着香味成分的形成是由哪些微生物参与以及哪一种微生物起着主导作用等问题。白云边高温大曲中微生物的数量大，种类多，且含有数量巨大的嗜热微生物，其中以耐高温的芽孢杆菌为最。然而目前还没有报道关于分离酱香高温大曲中有益于酱香风味产生的功能微生物。
中国专利CN 101215538公开了一株地衣芽孢杆菌及其应用。该地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)BL57CGMCC №.2277，该菌株可以利用含纤维素的工农业废弃物为原料，如植物秸秆、叶片、其它农业废弃组织、酒糟等，将这些原料其中的纤维素转化为还原糖。中国专利CN1390942公开了一种编码β-1，3-1，4葡聚糖酶的基因和含有前述基因的地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)EGW039。该菌株所产生的β-1，3-1，4-葡聚糖酶对β-葡聚糖的β-1，3和β-1，4键都有高效的分解作用，能提高大麦、小麦等饲料粮利用率，节约饲料粮。此外，在啤酒生产中降低啤酒生产中过滤的困难，提高原料利用率。中国专利CN1369552公开了一种微生物复合菌剂及使用其制成的微生物发酵剂和肥料，采用枯草芽孢杆菌35-45％、地衣芽孢杆菌25-35％、嗜热脂肪芽孢杆菌25-35％作为菌种，以上菌种分别经接种、一级菌种培养，使菌数含量达108个/ml，然后再按上述菌种配比混合并经二级菌种培养，使菌数含量达5-9×109个/ml，即得复合菌剂。然而该文献公开的是含有地衣芽孢杆菌及其它两种芽孢杆菌的复合菌剂，且仅仅用来将池塘泥、草炭土、鸡畜粪、酒糟、粉煤灰、作物秸秆、城市废弃物等作为基料发酵生产微生物肥料。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种嗜热芽孢杆菌，该菌株适用于兼香型及酱香型固态法白酒发酵生产，能够为生产用高温大曲增香，提升浓酱兼香型白酒的典型风味，经济环保。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验筛选，最终从白云边酒厂的高温大曲中，筛选分离得到适应性良好、能在55℃-65℃高温环境下生长良好的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株，并于2009年12月10日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2010251。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251具有以下培养特征：
牛肉膏蛋白胨培养基50℃培养24h，菌落呈圆形，灰色，凸起，边缘有细小绒毛，表面光滑，湿润，粘稠不易挑。菌落大小为(0.3-0.5)cm×(0.3-0.5)cm，生长速度快。
葡萄糖培养基50℃培养24h，菌落呈山丘状，湿润，有大量粘液，表面有光泽，无皱纹，边缘缺刻至明显，缺刻呈羽毛状。菌落大小为(0.4-0.5)cm×(0.4-0.5)cm，菌落生长极为迅速。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251具有以下形态特征：
于1000倍显微镜观察嗜热芽孢杆菌的菌体形态，菌株形态特征为：菌体杆状，单生，大小约0.87×1.43μm(平均)，复红染色均匀，未见不着色脂肪粒，抗酸复红染色阳性，芽孢红色。孢囊不膨大，芽孢椭圆形，中生或次中生。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251具有以下生物学特性：
嗜热芽孢杆菌BG05的生长温度为20℃～65℃，最适生长温度为40℃～50℃，在pH2.0～9.0的范围内均能生长。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和葡萄糖琼脂培养基50℃培养24h，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。
本发明的第二个目的是提供地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCCNO.M2010251在生产浓酱兼香型白酒中的用途。
本发明涉及的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251能够耐高温，以麸皮作为发酵基质高温培养可获得香味突出的发酵物，发酵物中游离氨基酸含量较高。将其制成人工大曲投入酿造生产可提高经济效益。具体表现为如下优点：
1)根据实施例2表1的温度耐受性实验可以看出，实验菌在50℃作用生长情况良好，在55℃下仍能保持一定的生长量，在60℃时菌株生长速度受到抑制。这说明本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株温度耐受性强，完全适合工业上浓酱兼香型白酒生产中的应用；
2)根据实施例3表2的菌株大豆发酵实验可以看出，实验组在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株的作用下，大豆随发酵温度的上升逐渐增香，在55℃高温条件下香味浓郁，发酵完毕，其吸光度达到0.693。这说明本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株温度耐受性强，而且在55℃以下随着温度的升高，增香能力越强。
3)根据实施例4表3、表4的单菌发酵麦麸产游离氨基酸的含量测定试验中可以看出，试验组和对照组在氨基酸种类上没有差别；然而从含量上看，试验组发酵分解得到的各类氨基酸含量大多高于对照组。这表明，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株发酵代谢分泌的酶类分解蛋白质的能力较强。
4)根据实施例5表5的菌株产香培养基的选择实验可以看出，试验菌株在麸皮浸出汁中发酵产香效果最好，香味浓郁，其次为麸皮固体培养基。实验结果表明，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株在以麸皮为底物的发酵物中产香效果最好，液态发酵产香效果优于固态发酵。
附图说明
图1为本发明所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的菌落图
图2为本发明所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株在葡萄糖琼脂培养基上的菌落图
图3为本发明所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株在1000倍显微镜菌体形态图
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株的培养
从白云边酒厂生产用高温大曲中筛选分离得到适应性良好、能在55℃-65℃高温环境下生长良好的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株，并于2009年12月10日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2010251。
该菌株的保藏采用牛肉膏蛋白胨斜面培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min。
该菌株的培养采用以下两种培养基：(1)牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min；(2)LB培养基：蛋白胨1g，酵母浸出汁0.5g，NaC l1g，水100mL，pH7.0，121℃灭菌20min。
根据培养基不同，该菌株的培养方式可选用两种：(1)液体培养制种子液：把菌株接种于LB培养基中，在40℃温度下，150rpm摇瓶培养16h；(2)固体培养活化菌株：接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，于50℃培养箱培养16h。
实施例2地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株的温度耐受性实验
将活化后的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株培养液按无菌操作法分别接种到装有100mL实施例1所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，将接种后的培养管置于摇床上，分别放置在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下，160rpm振荡培养24h后，测定600nm波长下的OD值，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨培养液适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，经稀释后测得的OD值乘以稀释倍数，即为培养液实际的OD值。
从表1中可以看出，实验菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05在50℃作用生长情况良好，在55℃下仍能保持一定的生长量，在60℃时菌株生长速度受到抑制。这说明本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株温度耐受性强，完全适合工业上浓酱兼香型白酒生产中的应用。
表1不同温度下吸光度值
实施例3地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株大豆发酵实验
将活化后的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株制成种子液，以10％接种量接种于大豆培养基(黄豆用水浸泡12h，去皮，分装，每瓶25g，121℃灭菌30min。)，按照35℃、45℃、55℃顺序升温发酵，各温度下发酵48h，以不接菌为对照发酵后观察并感官评价。发酵物用无水乙醇浸提3h后离心，取上清液于490nm处测吸光值。
从表2中可以看出，实验组在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株的作用下，大豆随发酵温度的上升逐渐增香，在55℃高温条件下香味浓郁，发酵完毕，其吸光度达到0.693。这说明本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株温度耐受性强，而且在55℃以下随着温度的升高，增香能力越强。
表2单菌发酵大豆结果
实施例4地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株单菌发酵麦麸产游离氨基酸的含量测定试验
干燥麸用水浸泡3h，分装(25g/瓶)，121℃灭菌30min。每瓶加入1mL地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株种子液，按照55℃发酵6d，发酵后观察嗅闻，以一株不产香的枯草芽孢杆菌为对照。发酵结束后，用50mL的95％乙醇分两次抽提发酵原料，然后在70℃条件下烘干，测定其分解产生的各种氨基酸的量。
发酵结束，接有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株的试验组发酵物颜色加深，香味突出，明显区别于对照组。从表3、表4中可以看出，试验组和对照组在氨基酸种类上没有差别；然而从含量上看，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株发酵分解得到的各类氨基酸含量大多高于对照。这表明，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BG05菌株发酵代谢分泌的酶类分解蛋白质的能力较强。
表3单菌发酵麦麸产游离氨基酸含量测定(mg/100g)
表4单菌发酵麦麸产游离氨基酸含量测定(mg/100g)
实施例5地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株产香培养基的选择实验
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株在麸皮培养基(麸皮49.5g，葡萄糖0.5g，加水35mL，搅拌均匀后，115℃灭菌30min)、小麦固体培养基(干燥小麦麦粒破碎为麦沙、麦粉各半，加等量水，润浸18h后，蒸熟、冷却、打散，称取50g于三角瓶中，121℃灭菌30min)、麸皮浸出汁(小麦麸皮100g，高温淀粉酶1500IU，加水500mL，于100℃蒸煮10min。待冷却后，加入碱性蛋白酶50000IU，于55℃保持30min。过滤取上清液，pH6.2。1×105Pa灭菌20min，使用前加葡萄糖至终浓度为10g/L)和小麦浸出汁(将干燥小麦麦粒粉碎后，取麦粉100g，按麸皮浸出汁方法制作)四种发酵培养基中进行培养，以不接菌的培养基为对照。其中固体发酵培养基接种量为10％，55℃条件下培养15d；液体发酵培养基接种量为5％，150rpm，55℃条件下培养6d。发酵结束嗅闻，筛选获得产香最为明显的发酵培养基。发酵液的香味，按无香味(-)、微香(+)、香味明显(++)、香味突出(+++)四个等级划分。
表5产香培养基的选择
从表5中可以看出，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株在麸皮浸出汁中发酵产香效果最好，香味浓郁，其次为麸皮固体培养基。实验结果表明，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株在以麸皮为底物的发酵物中产香效果最好，液态发酵产香效果优于固态发酵。
从上述实施例2、3、4、5可以看出，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株具有一定程度的产香效果，能够耐高温。BG05从白云边高温大曲中分离得到，它与白酒酿造关系密切，将其制成强化大曲应用于大曲生产，有助于高温大曲的发酵生香，应用于酿造生产，能为白酒增香。既经济又环保，减少企业开支，提高经济效益。
Claims (7)
1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：它的培养特征为：
牛肉膏蛋白胨培养基50℃培养24h，菌落呈圆形，灰色，凸起，边缘有细小绒毛，表面光滑，湿润，粘稠不易挑，菌落大小为(0.3-0.5)cm×(0.3-0.5)cm；
葡萄糖培养基50℃培养24h，菌落呈山丘状，湿润，有大量粘液，表面有光泽，无皱纹，边缘缺刻至明显，缺刻呈羽毛状，菌落大小为(0.4-0.5)cm×(0.4-0.5)cm。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：于1000倍显微镜观察得到的形态特征为：菌体杆状，单生，平均大小为0.87×1.43μm，复红染色均匀，未见不着色脂肪粒，抗酸复红染色阳性，芽孢红色，孢囊不膨大，芽孢椭圆形，中生或次中生。
4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：它的生长温度为20℃～65℃，最适生长温度为40℃～50℃，在pH2.0～9.0的范围内均能生长。
5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于：它的生长温度为40℃～50℃。
6.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或葡萄糖琼脂培养基50℃培养24h，连续传代数代培养，它的培养特征和形态特征均无明显变化。
7.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BG05菌株CCTCC NO.M2010251在生产浓酱兼香型白酒中的应用。
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