CN1390942A - 一种葡聚糖酶基因和地衣芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种编码β－1，3－1，4葡聚糖酶的基因和含有前述基因的地衣芽孢杆菌菌株(Bacilluslicheniformis)EGW039。本发明所产生的β－1，3－1，4－葡聚糖酶对β－葡聚糖的β－1，3和β－1，4键都有高效的分解作用，能提高大麦、小麦等饲料粮利用率，节约饲料粮，缓解我国南方地区畜牧生产大量依靠北方玉米的局面，此外在啤酒生产中降低啤酒生产中过滤的困难，提高原料利用率。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说涉及一种葡聚糖酶基因和一种地衣芽孢杆菌。
背景技术
β-葡聚糖广泛分布于植物和微生物细胞壁中，不同来源的β-葡聚糖，其葡聚糖苷键的结合方式和比例不尽相同。在大麦等麦类子粒和麦芽中葡聚糖含量很高，而且这些葡聚糖是由葡萄糖经由β-1，3键和β-1，4键，以30％和70％的比例聚合而成的高分子化合物，具有很高的黏度，在啤酒生产中它们会增加过滤困难和降低原料利用率。同时葡聚糖是一种抗营养因子，它在动物肠道中会形成很粘稠的物质，影响营养物质吸收，降低饲料转化率和动物生产性能，并使粪便粘稠，不易管理，有害于肠道健康，有利于一些病原菌繁殖，增加发病率。
β-葡聚糖酶是一类能够降解β-葡聚糖的酶类，在大麦型饲料中加入β-葡聚糖酶可以消除上述不利影响，达到和玉米一样的饲喂效果。β-葡聚糖酶至今在国内没有产业化，近年由于麦类饲料原料的增加，β-葡聚糖酶在饲料中的应用需求日益增多，逐渐成为一种非常重要的饲料酶种。β-葡聚糖酶是发达国家应用于畜牧业生产的重要饲用酶制剂之一，早在70年代，美国和欧洲各国就已开展了对β-葡聚糖酶的研究，目前已有许多商业化产品，此外，如美国的“八宝威”、荷兰的“爱维生”等复合酶制剂中也含有β-葡聚糖酶。关于β-葡聚糖酶的研究目前已经进入以分子生物学为主的时期，已经公布的微生物来源的β-葡聚糖酶基因序列至少有120个之多，基因长度一般在1.2-1.6kbp，表达的酶蛋白前体一般为400-500个氨基酸，其中信号肽长度一般为18-24个氨基酸，分子量一般为45-55Kda.国外已经成功构造出β-葡聚糖酶工程菌株，基因供体包括Oerskovia xanthineolytica，Bacillussubtilis，Bacillus licheniforms，Bacillus amyloliquefaciens，Penicillium melinii，Trichoderma reesei，Trichoderma viride，Trichoderma longibrachiatum，尤其以Bacillus属和Trichoderma属来源的居多，表达宿主菌包括E.coli，Aspergilli，Saccachromyces cerevisiae，尤其以E.coli和Saccachromyces cerevisiae作为表达宿主菌的居多，基本上是Bacillus--E.coli和Trichoderma--Saccachromyces cerevisiae两个系统。但表达量均很低。国内从九十年代初开始了β-葡聚糖酶的研究，已取得较大进展，分离到了多种β-葡聚糖酶产生菌株并做了研制与应用研究。但因酶产量太低，无法产业化。互联网检索表明：到2001年9月20日止在著名的EMBL，Genbank和ExPASy分子生物学网站的基因资料库中仅有6个β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因序列来自于四种微生物Xanthophyllomycesdendrorhous，Clostridium thermocellum，Bacillus subtilis和T.harzianum；在1986-2001年美国专利资料库中仅发现芽孢杆菌中只有Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus macerans产β-1，3-1，4-葡聚糖酶。国内外研制的葡聚糖酶90％以上几乎都是β-1，4-葡聚糖酶，对于降解葡聚糖更为实用和有效的β-1，3-1，4-葡聚糖酶很少研究，更少有产业化。但是麦类子粒中葡聚糖是由葡萄糖经由β-1，3和β-1，4键以30％和70％的比例聚合而成，因此β-1，3-1，4-葡聚糖酶比β-1，4-葡聚糖酶更有实用价值，尤其能克隆到该酶的基因，则为构造高产β-1，3-1，4-葡聚糖酶工程菌株奠定了坚实基础。
本发明目的在于提供一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因。
本发明目的在于提供一种能高效产生β-1，3-1，4-葡聚糖酶的菌株。
发明内容：
一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，其氨基酸序列是说明书附图图1所述的序列。
上述β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，其核苷酸序列是说明书附图图2所述的序列。
一种含有上述β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的地衣芽孢杆菌菌株(Bacilluslicheniformis)EGW039，已于2001年9月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.0635。
上述本发明地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)EGW039是在筛选蛋白酶的研究中选留的产葡聚糖酶的芽孢杆菌，后作为筛选β-1，3-1，4-葡聚糖酶的出发菌株，经紫外线照射后对产生β-1，3-1，4-葡聚糖酶的菌株进行定向初筛、复筛得到该菌株，经驯化稳定后，经鉴定并命名为地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)EGW039。细菌定种的主要分类依据《Bergey’s细菌学分类手册》(第8版)和《细菌分类基础》(王大稆编著，1977，科学出版社)。
本发明地衣芽孢杆菌菌落或菌体形态特征：上述本发明地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis在30℃下培养24小时后，革兰氏反应阳性，杆状，不成链，大小为1.11×2.22微米，芽孢中生，大小为1.11×2.00微米，好氧，能够利用葡萄糖，木糖，蔗糖，阿拉伯糖和甘露醇。在琼脂培养基上为近圆形菌落，表面光滑，整齐，呈现不透明的奶牛色。
碳源对Bacillus licheniformis EGW039产葡聚糖酶的效应：
在培养基中加入不同的糖，测定糖对本发明菌株产生β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活性的影响，结果(见表1)高果糖浆的效应值最高，其次为蔗糖和葡萄糖，二者效应相近，半乳糖的最次。
表1、碳源对Bacillus licheniformis EGW039产葡聚糖酶的效应
*培养条件：37℃，48h，250r/min。
| 碳水化合物，浓度％ | 酶活性，相对值％ | 碳水化合物 | 酶活性，相对值％ |
| 葡萄糖， 0.5 | 406.2 89.07 | 纤维二糖，0.5 | 340.5 74.63 |
| 高果糖浆，1.0 | 456.3， 100.00 | 甘蔗糖蜜，1.0 | 350.3 76.77 |
| 木糖， 0.5 | 268.5 58.84 | 玉米糖蜜，1.0 | 297.8 65.26 |
| 蔗糖， 0.5 | 416.2 91.2 | 麦芽糖， 0.5 | 358.2 78.50 |
| 乳糖， 0.5 | 372.8 81.7 | 棉子糖， 0.5 | 162.4 35.58 |
| 半乳糖， 0.5 | 125.7 27.54 |
氮源对Bacillus licheniformis EGW039产葡聚糖酶的效应：
在培养基中加入不同的氮源，测定氮源对Bacillus licheniformis EGW039产葡聚糖酶的效应，结果(见表2)(NH4)2SO4的效果最好，其次为(NH4)2HPO4和酵母膏，最次为NaNO3。
表2、氮源对Bacillus licheniformis EGW039产葡聚糖酶的效应
*培养条件：37℃，48h，250r/min。
| 氮源及浓度，％ | 酶活性，相对值％ | 碳水化合物 | 酶活性，相对值％ |
| (NH4)2SO4， 0.12 | 461.5 100.00 | NH4NO3，0.12 | 389.0 84.3 |
| (NH4)2HPO4，0.12 | 454.6 98.50 | 蛋白胨，0.12 | 378.9 82.1 |
| 酵母膏， 0.12 | 437.9 94.90 | NaNO3， 0.12 | 291.7 63.2 |
地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis)EGW039菌株保藏条件：培养基成分(g/l)：大麦粉(或玉米粉)30，牛肉膏10，葡萄糖5，磷酸氢二氨3，氯化钠5，琼脂20，pH自然；121℃下灭菌20分钟，冷却后接种微生物；37℃下培养48小时，然后在-80℃或-20℃左右进行菌种保存。
β-1，3-1，4--葡聚糖酶基因克隆及测序：
按照下列程序从供体菌Bacillus licheniformis EGW039提取总DNA作为PCR模板：6g Bacillus licheniformis EGW039湿菌体，悬浮于50ml 0.05molphosphorate buffer(内含0.6mol/l蔗糖)，依照上述体积加入lysozyme0.5mg/ml，在37℃反应1小时，然后在2000r/min下离心，弃上清，收原生质体沉淀；50ml去离子水悬浮原生质体，再在13000g下离心10min，留下沉淀，50ml of 10％(1.5mol/l)NaCl含(0.034mol/l Na3citrate)，重复前述离心沉淀，将沉淀溶入0.6-0.8ml去离子水，再加入25微升RNase，在37℃下培养10-20min，向其中加入等量苯酚、酚-氯仿、氯仿(每次13000g，10min，留上清)，向前述上清液中0.54体积异丙醇，在13000g下离心10min，留沉淀，将沉淀用70％冷乙醇洗涤，冻干，得地衣芽孢杆菌EGW039总DNA。
以Bacillus subtilis(Nucl Acids Res.，1984，12(13)，5355-5367)的β-1，3-1，4--葡聚糖酶基因序列作为设计引物的依据，去除葡聚糖酶基因5’端一个编码36个氨基酸的信号肽编码序列，设计如下特异性引物通过PCR方法进行目的基因的扩增：
P1：5’CAGAGCTCTATGCAAACAGGTGGATCGTTTTTTGAC3’
P2：5’CAGGATCCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAGT3’PCR反应体系如下(50微升)：无菌水22.5，10倍PCR buffer，dNTPs，P1，P2，模板DNA，2.5μl Taq ploymerase(5U/μl)；PCR程序如下：混合(6000r/min，20sec)前6种组分，后94℃，5min，加入2.5μl Taqploymerase(5U/μl)，6000r/min，20sec，然后进行PCR：94℃，1min→55℃，1min→72℃，1min；30个循环后，72℃，10min；4℃，5-30min；琼脂糖电泳，切下唯一的DNA带提取DNA，快速纯化，按照常规方法克隆到pUC18载体上测序；DNA测序由上海Genecore Biotech.Inc.进行，测序结果见说明书附图图2。
根据上述测序结果，来自Bacillus licheniformis EGW039 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的ORF基因长度为645bp，编码215个氨基酸，其编码的氨基酸序列见说明书附图图1，与Bacillus subtilis在DNA序列上有58个核苷酸的差异，基因结构的主要特征与Bacillus subtilis(Nucl Acids Res.，1984，12(13)，5355-5367)的β-1，3-1，4--葡聚糖酶基因相似。
本发明优点和有益效果：
(1)本发明β-1，3-1，4--葡聚糖酶对β-葡聚糖的β-1，3键和β-1，4键都有降解作用，降解更彻底，提高了大麦、小麦等作为饲料的利用率，提高利用大麦生产啤酒时原料的利用率，而一般所用的葡聚糖酶只对β-1，4有作用，降解不彻底；(2)、本发明测出了β-1，3-1，4--葡聚糖酶的氨基酸和核苷酸序列，为构造高产β-1，3-1，4-葡聚糖酶工程菌株打下了基础。
附图说明
图1为本发明β-1，3-1，4--葡聚糖酶的氨基酸序列；
图2为本发明β-1，3-1，4--葡聚糖酶的核苷酸序列。
具体实施方式
实施例1 本发明β-1，3-1，4-葡聚糖酶的生产
中试采用二级发酵，种子罐为1立方米，发酵罐为20立方米机械搅拌标准型发酵罐，连续5批次运行。从斜面到种子瓶接种量为一环，从摇瓶到种子罐接种量为0.1％，从种子罐到二级罐接种量为1-2％。发酵培养基灭菌温度均为121℃，培养温度均为37℃，摇瓶和发酵罐的转速均为200--250r/min.，包括以下步骤：
(1)按照下述成分和比例(g/L)大麦粉30，蛋白胨10，牛肉膏10，葡萄糖5和NaCl 5配制摇瓶种子培养基1.5L，pH为7.2.将摇瓶种子培养基分装入10个1L的三角瓶，121℃下灭菌20分钟，冷却后接种EGW039菌株1环。37℃，200r/min，摇瓶12-15h后经无菌操作一并倒入专用的无菌接种瓶，以供接种用；
(2)按照下述成分和比例(g/L)大麦粉40，磷酸氢二氨5，磷酸氢二钠25，磷酸二氢钠2，硫酸镁0.1，柠檬酸三钠1配制种子罐培养基220L，pH自然，将所配制种子罐培养基装入1立方米种子罐，121℃下灭菌45分钟，冷却到37℃以下后接种已经培养好的摇瓶种子液1.5L。37℃，250r/min，培养12-16h，罐压：0.6-0.07MMa，空气比0-8h∶1∶0.3；9-12h∶1∶0.4；12-16h∶1∶0.5(种子液质量检测指标：菌体密度：1*109-1010个/ml；菌体形态：长杆，短杆，联杆，杆直径为1-2.5微米，都是正常形态，相对整齐一致，健壮；pH值：6.5左右)；
(3)按照下述成分和比例(g/L)大麦粉45，磷酸氢二氨5，磷酸氢二钠25，磷酸二氢钠2，硫酸镁0.1，柠檬酸三钠1，消泡剂0.5配制发酵罐培养基10立方米，pH自然，将配制的发酵罐培养基10立方米装入20立方米种子罐，121℃下灭菌45分钟，冷却到37℃以下后由种子罐压入已经培养好的种子液约250L；37℃，200r/min，搅拌发酵培养25-30h，罐压：0.6-0.07Mma，空气比0-8h为1∶0.45；9-12h为1∶0.50；12-18h为1∶0.55；19-30h为1∶0.50；发酵终了时发酵液中还原糖含量＜0.5％，pH6-6.3；
(4)发酵液凝絮与分离：向步骤(3)所得发酵液中添加凝絮剂，以有效地使菌体、微粒型杂质等沉淀(发酵液中含有酶、菌体、培养基残余物及其它杂质和非目的物质，比较粘稠)，然后通过压滤(本实验选用35平方米塑料防腐型具压干性能的板框过滤机，首先上好压滤机滤布，用泵均匀打入调配好的硅藻土(用水稀释))将菌体和酶液分离，将成熟的发酵液从发酵罐放至澄清罐，添加盐Na2HPO4(使用终浓度为0.6％)，搅拌至完全溶解，通冷却水降低温度，随即加入盐CaCl2(使用终浓度为1％)，通过配成30％浓度缓慢均匀加入，搅拌均匀后停止搅拌，室温下静置让沉淀物自然沉降，一般3-5h即可完全澄清；先过滤上层清液，如遇到初滤液浑浊不清，再次过滤直至滤液清彻透明，沉淀部分如过滤困难，可加入约1％粗硅藻土，边搅拌边过滤，清澈滤液合并至储罐；
(5)浓缩：将步骤(4)所得清澈滤液用双效低压低温蒸发器(真空度≥700mmHg柱高，工作效率为500L/h，因为酶的活性受限制于55℃)进行减压低温浓缩；
(6)喷雾干燥：根据终产品酶活性大小和喷雾干燥工艺的要求，在喷雾前用廉价和具有保护酶活性功能至少没有有害效应的填充物将浓缩后的物料调制为含水量为15-25％的程度，进行喷雾干燥。喷雾塔进口温度为170℃，出口温度为70℃。喷雾干燥效率为150L/h。
(7)粉碎过筛：60目通过率＞90％，得本发明β-1，3-1，4--葡聚糖酶产物。
实验实施例1 上述实施例1所产生β-1，3-1，4--葡聚糖酶活性测定
1个酶活性单位定义为在40℃下，每1秒钟每毫升酶液降解0.9％大麦β-葡聚糖释放出1nmol还原糖(葡萄糖).反应体系中的还原糖(葡萄糖)用DNS法测定.反应体系的pH值为7.5，由0.1Mol/L的磷酸钠缓冲液提供.底物配制：1.0％大麦β-葡聚糖(Sigma Co.)配制，准确称取1.0000g大麦β-葡聚糖(Sigma产品)，溶解于6ml无水乙醇，加入80ml 0.1Mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)，置沸水浴10min，待底物完全溶解后冷却至室温，并用上述缓冲液定容至100ml。储于4℃下备用。斐林试剂A，B配制：按照<生物化学技术>的方法配制。反应在40℃的水浴中进行，取0.9ml配制好的底物1.0％大麦β-葡聚糖，加0.1ml经过适当稀释的酶液，反应15min，通过加入斐林试剂A，B各2ml，置沸水浴显色反应15min，显色液在3000r/min下离心10min后，测定上清液在520nm下的吸光值.并按照由葡萄糖标准曲线建立的回归方程计算出反应体系中的葡萄糖产量和酶活性大小，结果本发明酶制剂酶活为13万BU/g.
实验实施例2 肉鸡饲喂实验
2000年8月-9月在中国农业科学畜牧研究所进行。试验选用1日龄AA商品代肉仔鸡480只，随机分为6组，每组80只；每个组设四个重复(由于密度太高，22日龄后将4个重复重新划分成5个重复)，每个重复20只。I组为玉米豆粕日粮对照组，II组在I组基础上添加0.1％的本发明实施例1所得β-1，3-1，4-葡聚糖酶，III组为玉米-豆粕-大麦日粮对照组，IV组在III的基础上添加0.1％的本发明实施例1所得β-1，3-1，4-葡聚糖酶，V组在III的基础上添加0.2％的本发明实施例1所得β-1，3-1，4-葡聚糖酶，VI组在III的基础上添加0.25％的本发明实施例1所得β-1，3-1，4-葡聚糖酶，试验日粮组成见表3。
试验分为0-3周和4-6周两个阶段，试验鸡笼养，饲养管理和免疫按常规程序进行。试验按重复记录增重和耗料量，并记录死亡情况。7日龄时观察并记录肛门不洁鸡的数量。
表3、对照组日粮组成及营养指标
| 组成 | 玉米-豆粕日粮 | 玉米-豆粕-大麦日粮 | ||
| 0-3周 | 4-6周 | 0-3周 | 4-6周 | |
| 玉米 | 59.14 | 63.52 | 39.30 | 32.18 |
| 豆粕 | 35.50 | 31.26 | 34.43 | 29.99 |
| 大麦 | 20.00 | 30.00 | ||
| 石粉 | 1.60 | 0.93 | 1.10 | 0.93 |
| 磷酸氢钙 | 2.13 | 1.96 | 2.08 | 1.90 |
| 食盐 | 0.30 | 0.30 | 0.30 | 0.30 |
| 植物油 | 0.72 | 1.47 | 3.41 | |
| 蛋氨酸 | 0.22 | 0.18 | 0.22 | 0.19 |
| 赖氨酸 | 0.01 | 0.03 | 0.01 | |
| 预混料 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 氯化胆碱 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
| 营养指标 | ||||
| 代谢能 | 2.80 | 2.90 | 2.80 | 2.90 |
| 粗蛋白 | 21.00 | 19.5 | 21.00 | 19.5 |
| 钙 | 1.17 | 0.90 | 1.00 | 0.90 |
| 有效磷 | 0.48 | 0.45 | 0.48 | 0.45 |
| 赖氨酸 | 1.05 | 0.97 | 1.05 | 0.97 |
| 蛋氨酸 | 0.50 | 0.45 | 0.50 | 0.45 |
由表4可以看出，在玉米-豆粕日粮中添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶可以提高肉鸡增重速度，对照I组和添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶II组0-21日龄增重分别为571.03克和602.65克，试验组比对照组增重提高5.54％；0-21日龄两组的饲料效率分别为1.521和1.497，试验组比对照组降低1.58％。由表4可以看出，对照I和试验II组22-42日龄的增重分别为1186.3克和1220。33克，试验组比对照增重提高2.89％；42日龄平均体重两组分别为1866.52克和1809.98，试验比对照提高3.13％，试验全期增重分别为1765.90克和1822.07克，试验组比对照提高3.18％；全期饲料效率分别为2.00和1.98，试验组比对照组略有下降。从试验结果可以看出，在玉米-豆粕日粮中添加β-葡聚糖酶可以改善肉鸡的增重。尽管玉米和豆粕中β-葡聚糖的含量较低，但据报道，豆粕和玉米分别中含有约20％和4.9％的非淀粉多糖，这些非淀粉多糖也会引起肠道消化物粘性的增加，引起饲料消化率的降低和家禽生产性能的下降。
表4、试验前期增重和饲料效率结果项目 平均始重 21日龄平均重 0-21日龄增重 饲料效率I 44.08±0.63 615.10±30.59 571.03±30.05 1.521±0.086II 44.45±0.78 647.13±17.62 602.65±17.44 1.497±0.041III 44.30±0.52 640.23±22.55 595.93±22.53 1.494±0.064IV 43.93±0.68 641.68±20.12 597.75±19.57 1.521±0.056V 43.30±0.76 661.05±20.37 617.75±20.25 1.561±0.056VI 43.83±1.18 637.50±34.35 593.68±35.02 1.582±0.060
由表4和表5的增重结果看出，在0-21日龄阶段，在玉米-豆粕-大麦日粮中添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶以添加0.2％的V组效果最好，增重为617.75克，比对照组III的595.93克提高3.67％，添加0.1％的IV和添加0.25％的VI的增重分别为597.75和593.68克，与对照组无差异。在22-42日龄阶段，增重以V组和VI组最高，分别为1324.08和1327.38克，分别比对照III组(1256.97克)提高5.34％和5.60％，IV组的增重为1298.56克，比对照组提高3.30％。从全期增重看，玉米-豆粕-大麦日粮组中，以V组效果最佳，增重为1942.83克，比对照组(1850.10克)提高5.01％，其次为VI和IV，增重分别为1921.43和1906.55克，分别比对照组提高3.85％和3.05％。
表5、试验后期增重和饲料效率项目 42日龄平均重 22-42日龄增重 22-42饲料效率 全期增重 全期饲料效率I 1809.98±79.54 1186.03±87.20 2.24±0.13 1765.90 2.00II 1866.52±90.76 1220.33±86.61 2.22±0.12 1822.07 1.98III 1894.40±40.16 1256.97±45.31 2.20±0.09 1850.10 1.97IV 1950.48±69.45 1298.56±58.23 2.15±0.15 1906.55 1.88V 1986.13±56.58 1324.08±56.23 2.20±0.10 1942.83 2.00VI 1965.26±118.8 1327.38±86.92 2.20±0.09 1921.43 2.01
从0-21日龄，在玉米-豆粕-大麦日粮中添加β-葡聚糖酶有使饲料效率增高的趋势，以不添加酶制剂组最低为1.494，添加0.25％酶制剂组最高为1.582。在22-42日龄，添加0.1％β-1，3-1，4-葡聚糖酶组的饲料效率为2.15，比对照组有所下降，但其它两个试验组的饲料效率与对照组一致均为2.2。全期饲料效率也以IV最低，为1.88。
表6、死亡率和7日龄肛门不洁数组别 I II III IV V VI全期成活率 97.5％ 95.0％ 93.75％ 97.5％ 87.5％ 85.0％7日龄肛门不洁数 2 5 8 6 2 8
表6的结果表明，玉米-豆粕日粮添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶对死亡率的影响差异不显著。在玉米-豆粕-大麦日粮中添加0.1％可以降低肉鸡死亡率，但添加0.2％和0.25％组的死亡率有所上升，而且添加0.25％组鸡的7日龄肛门不洁鸡数较其它两个试验组高，7日龄肛门不洁鸡数以添加0.2％组最低。
结果表明，在玉米-豆粕日粮中添加0.1％的β-葡聚糖酶可提高肉鸡的增重3.18％。在肉鸡饲喂前期含有20％大麦和后期含有30％大麦日粮时，均以添加0.2％的β-葡聚糖酶可获得最佳的增重效果，增重可比对照组提高5.01％。
实验实施例3 动物毒性实验
(1)用本发明实施例1所得酶制剂产品对小鼠的LD50急性毒性实验，20±2克体重的小鼠40只随机分为4组，雌雄各半，灌胃受试物剂量为2.15，4.64，10.0和21.5g/kg，结果小鼠没有受到影响，表明该酶制剂安全无毒。
(2)用本发明实施例1所得酶制剂产品对小鼠骨髓细胞微核试验：21±1克体重的小鼠50只随机分为5组，雌雄各半，灌胃受试物剂量为1.0，2.0，4.0g/kg。阳性对照组喂80mg/kg环磷酰胺，阴性对照组喂同量蒸馏水，结果未检出致突变性，表明该酶制剂终产品对人畜动物安全无毒。
参考文献1.Argos et al.″Thermal Stability and Protein Structure″，Biochemistry，18：5698-5703(1979).2.Borriss″Purification and characterization of an extracellularbeta-glucanase from Bacillus IMET B376.sup.1)″，Z.Alg.Mikrobiologie 21：7-17(1981).3.Borriss et al.″.beta.-1，3-1，4-glucanase in sporeformingmicroorganisms.V.The efficiency of.beta.-glucanase in reducingthe viscosity of wort″Zbl.Bakt II Abt.136：324-329(1981).4.Borriss et al.″Expression in Escherichia coli of acloned.beta.-glucanase gene from Bacillus Amyloliquefaciens″Appl.Microbiol.Biotechnol.22：63-71(1985).5.Borriss et al.″Molecular cloning of a gene coding for thermostablebeta-glucanase from Bacillus macerans″J.Basic Microbiol.28：3-10(1988).6.Cantwell et al.″Molecular cloning and expression of a Bacillussubtilis.beta.-glucanase gene in Escherichia coli″Gene 23：211-219(1983).7.Classen H L，G L Campbell，J W D Grootwassink.1988.Improved feedingvalue of saskatchewen-grown barley for broiler chickens withdietary enzyme supplement.Can.J Anmi.Sic.，65：725-7338.Godfrey″On comparison of key characteristics of industrial enzymesby type and source，″Industrial Enzymology，5：466-569(1983).9.Hofemeister ″The.beta.-glucanase gene from Bacillusamyloliquefaciens shows extensive homology with that of Bacillussubtilis″Gene 49：177-187(1986).10.Honda et al.″Cloning and expression in Escherichia coli of aThermoanaerobacter cellulolyticus gene coding for heat-stable.beta.-glucanase″Appl Microbiol.Biotechnol.25：480-483(1987).11.Horton et al.″Engineering hybrid genes with the use of restrictionenzymes：Gene splicing by overlap extension″Gene 77：61-68(1989).12.Imanaka et al.″A new way of enhancing the thermostability ofproteases″Nature，324：695-697(1986).13.Klyosov et al.″A thermostable endo-1，4-.beta.-glucanase fromMyceliophtora thermophilia″Chemical Abstracts 109：50624w(1988).14.Loi et al.″Survival of barley(1-3，1-4).beta.-D-glucanaseisoenzymes during kilning and mashing″J.Cereal Sci. 5：45-50(1987).15.Matthews et al.″Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding″Proc.Natl.Acad.Sci.84：6663-6667(1987).16.McFadden et al.″Expression sites and developmental regulation ofgenes encoding(1-3，1-4)-.beta.-D-glucanases in germinatedbarley″Planta 173：500-508(1988).17.McNab J M.1992.Barley β-glucanase：an antinutritional factorin poultry feeding.Nutrition Research Rewiews，5：45-5018.Miller″Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination ofreducing sugars″Analytical Chemistry 31：426-428(1959).19.Murphy″The DNA sequence of the gene and genetic control sites forthe excreted B.subtilis enzyme.beta.-glucanase″Nucleic AcidsRes.12：5355-5367(1984).20.Petre et al.″Purification and properties of an endo-.beta.-1，4-glucanase from Clostridium thermocellum″，(abst.)7-Enzymes95：145879q(1981)，Biochemie 63：629-639(1981).21.Politz，O.，et al.，(1993)Eur.J.Biochem 216，829-834.22.Querol″Tentative rules for increasing the thermostability ofenzymes by protein engineering″Enzyme Microb.Technol.9：238-244(1987).23.Schwarz et al.″Isolation of a Clostridium thermocellum geneencoding a thermostable.beta.-1，3-glucanase(laminarinase)″Chemical Abstracts 108：217067k(1988)，Biotechnology Letters10(4)：225-230(1988).24.Tikhomirov et al.″Endo-1，4-.beta.-glucanases of the anaerobicbacterium Clostridium thermocellum st.No.3 with high heatstability″Chemical Abstracts 110：168879g(1989).
Claims (3)
1、一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，其特征在于该基因的氨基酸序列是说明书附图1所述的的序列。
2、按照权利要求1所述的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列是说明书附图2所述的的序列。
3、含有权利要求1所述基因的地衣芽孢杆菌，其特征在于菌株保藏号为CGMCC NO.0635。
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