CN104381588B - 一种用于优化葡萄籽粕营养价值的复合菌群 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于生物优化葡萄籽粕营养利用价值的复合微生物菌群，包括有草酸青霉菌F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌。本发明优化筛选了最佳发酵菌种组合、最佳菌种比例，其发酵效果优于传统的单一菌种及没有配比的复合菌种发酵，能大大的葡萄籽粕酶解产物中的蛋白含量，降低纤维含量，并且可以有效缩短生产周期、降低生产成本、增加生产效率、改善产品品质和适口性、提高产品营养利用价值，满足如今饲料行业廉价和安全需求，为葡萄籽粕的系统开发利用提供了更加科学的方法。

Description

一种用于优化葡萄籽粕营养价值的复合菌群

技术领域

本发明属于微生物发酵饲料技术领域，具体涉及一种用于优化葡萄籽粕营养价值的复合菌群。

背景技术

葡萄籽粕是葡萄酒厂的下脚料或是压榨葡萄籽油后的副产品，粗纤维含量高达50.81％，粗蛋白11.52％，钙0.80％，磷0.28％，木质素含量为14.98％。随着我国畜牧业的迅猛发展，饲料资源愈来愈缺乏；在玉米等常规饲料及其加工副产品价格不断升高的情况下，将加工处理后的葡萄籽粕产品替代部分常规饲料原料饲喂畜禽，已被同行们所关注。另外，葡萄籽粕富含大量的多酚类物质，具有清除自由基，抗衰老，抗氧化，增强免疫力的作用。如果将其合理利用对提高畜禽生产水平、增强机体抵抗力具有重要作用。因此，许多饲料生产厂家都期望寻找新的饲料资源，期望将葡萄籽添加到畜禽饲粮中，以便节约玉米，提高猪畜禽的生产性能和经济效益。

然而，由于葡萄籽粕中纤维素含量很高，蛋白质含量低，并含有大量的单宁等抗营养因子，营养利用价值低，为此在畜禽利用上受到了一定的限制，仅少量直接应用于牛、羊粗饲料中。目前，葡萄籽粕没有得到科学的开发和利用，造成资源的严重浪费。

迄今为止，国内外对于饲用葡萄籽粕加工利用没有进行系统的研究，葡萄籽粕发酵技术还处于空白。其它发酵饲料菌种无法在葡萄籽粕发酵工艺中进行复制利用。为此，深入研究最佳复合菌群发酵葡萄籽粕技术，对进一步提高其营养利用价值，扩大其在饲料中的应用范围，以廉价的发酵饲料替代常规饲料，大大提高经济效益降低生产成本的目的。该发明具有重要的经济和社会价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生物优化葡萄籽粕营养价值的复合微生物菌群组合，从而填补该领域技术的空白。

申请人通过长时间的研究，根据葡萄籽粕的营养特性、菌种的优点及菌种之间的相互协同关系，最终筛选确定出优化葡萄籽粕的最佳菌种组合、菌群中各种菌的数目比例，从而促成了本发明。

本发明的用于生物优化葡萄籽粕营养利用价值的复合微生物菌群，包括有草酸青霉菌F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌。

上述的复合微生物菌群中，F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的菌种比例为3:1:2:1；其菌种数量为3×10⁷:1×10⁷:2×10⁷:1×10⁷。

本发明优化筛选了最佳发酵菌种组合、最佳菌种比例，其发酵效果优于传统的单一菌种及没有配比的复合菌种发酵，能大大的葡萄籽粕酶解产物中的蛋白含量，降低纤维含量，并且可以有效缩短生产周期、降低生产成本、增加生产效率、改善产品品质和适口性、提高产品营养利用价值，满足如今饲料行业廉价和安全需求，为葡萄籽粕的系统开发利用提供了更加科学的方法。

附图说明

图1：单菌固态发酵试验产物的粗蛋白及纤维含量图；

图2：混合菌株固态发酵试验产物的粗蛋白及纤维含量图；

图3：36h菌体生长状况图；

图4：不同菌种接种比例对产物粗蛋白及纤维的含量的影响图；

图5：混和菌种的不同接种量对发酵产物粗蛋白及纤维含量的影响图；

图6:不同麸皮比例对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响图。

具体实施方式

本发明的用于生物优化葡萄籽粕的菌种组合，其复合菌株由F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌组成。

1)选用菌株的理化特性与组合原理：

选用的F67能够产生高活力降解纤维素的纤维素酶和果胶酶；其中纤维素酶能将葡萄籽粕中的纤维素降解为糖，供其它菌种生长所需营养；分解的果胶酶能够作用于植物饲料(包括葡萄籽粕)细胞壁中胶层，使细胞壁变薄、相邻细胞壁消失、细胞壁排列疏松、细胞壁结构破坏，使营养物质与消化酶充分接触，提高动物内源酶(如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等)的活性；并水解果胶中以α-1,4糖苷键结合的半乳糖醛基，产生还原糖；从而提高机体对饲料中纤维、蛋白质、钙、磷等营养物质的利用率；另外，磷的吸收率增加，可以有效降低畜牧场磷的排泄量，减少环境污染，有利于保护生态；另外，F67还能够产生抑制杂菌生长的青霉素，减轻发酵过程中的杂菌污染。

选用的枯草芽孢杆菌是专用于微生态制剂的菌株，具有较强的产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等解酶的活性，同时还具有降解植物性饲料中非淀粉多糖酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，特别是葡萄籽粕中的主要抗营养因子单宁，促进畜禽对营养物质的消化吸收。枯草芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡；枯草芽孢杆菌的芽孢可刺激产生免疫反应，增强机体的免疫力。另外，该菌发酵之后有清香味，提高畜禽适口性；

选用的乳酸菌进入肠道后会形成优势菌种，从而抑制病菌的繁殖，并且自身可以产生多种抑菌物质，可以抑制或杀死病原微生物，从而增强机体免疫功能，增加机体抵抗力，最终改善畜禽的消化和生长性能。另外，乳酸菌能调节发酵饲料的适口性。

选用的酿酒酵母菌能在有糖的培养基中快速增值，是发酵葡萄酒的专用菌种，对葡萄有很强的发酵能力；酵母菌是畜禽动物的长居微生物之一，也是优势菌群。在饲料中添加酵母菌可刺激动物肠道中益生菌的数量增加，改善动物肠道中的微生物环境；酵母菌的细胞壁由特殊的酵母纤维组成，主要是由甘露聚糖和葡萄糖组成。甘露聚糖能增强机体的免疫力；葡聚糖可以抑制黄曲霉毒素的活力，对黄曲霉毒素中毒有解毒作用。另外，该菌也是常用的单细胞蛋白饲料，是提高饲料中小肽含量的主要菌种。

本发明选择的上述四种发酵菌种复合发酵，其中F67能够将葡萄籽粕中的纤维素降解为单糖供其它三个菌种利用，同时将葡萄籽粕细胞壁降解，将细胞内营养物质析出，为后续菌种利用提供条件；枯草芽孢杆菌能够降解葡萄籽粕中主要的抗营养因子(单宁)，同时具有清香味，赋予产品特殊的味道；酿酒酵母菌能够利用F67产生的单糖快速生长，进而提高产品中微生物蛋白含量；以上三个菌种的生长可以消耗大量的氧，维持发酵过程中的厌氧环境进而为乳酸菌生长提供条件；乳酸菌在生长过程中产生乳酸，与枯草芽孢杆菌一起共同赋予葡萄籽粕产品清酸香味。以上四个菌种相互促进，又相互拮抗，复合应用，具有增加葡萄籽粕的营养物质含量、提高动物适口性与营养利用率、降解葡萄籽粕有毒有害物质和良好的动物生产中的益生作用。

本发明具体实施例中所用的乳酸菌为嗜酸乳酸菌，其菌株编号为ACCC10637；枯草芽孢杆菌的编号为CICC20506；酿酒酵母菌的编号为CICC1012。但在本发明的思路下，可以选用其它同种的菌株。

草酸青霉F67，该菌由青岛农业大学优质水禽研究所从鹅肠道中分离获得的，具有对纤维素很高降解能力，已经过中国科学院微生物研究所鉴定并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(微生物保藏编号：CGMCCNo.2260)。上述4种菌种组方使用能够最大提高葡萄籽粕中的蛋白含量和降低纤维素含量，并且能够完全降解主要抗营养因子单宁。

本发明选择的上述四种发酵菌种复合应用，具有增加发酵饲料的营养物质含量、提高动物适口性与营养利用率、降解葡萄籽粕中有毒有害物质和良好的动物生产中的益生作用。

2)发酵菌种扩增培养基的制备：

F67扩增培养基配制方法：在烧杯内加蒸馏水1000ml，依次加入胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，酵母浸出粉2.0g，硫酸镁0.5g，微温溶解，调节PH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖20.0g溶解后，摇匀，纱布滤清，调节PH值使灭菌后为6.4±0.2，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。培养温度为30℃，培养时间为18h～24h，培养结束后，从摇床中取出放在4℃的冰箱中保存。

乳酸菌扩增培养基配制方法：在烧杯内加蒸馏水1000ml，依次加入蛋白胨10.0g，牛肉浸取物(牛肉膏)10.0g，酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二胺2.0g，吐温-801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，用10％盐酸调节pH6.2～6.4，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。接种后培养温度为42℃，兼性厌氧，培养温度为18h～20h，培养结束后，从培养箱中取出放在4℃的冰箱中保存。

枯草芽孢杆菌扩增培养基配制方法：在烧杯内加蒸馏水1000ml，依次加入蔗糖10g、大豆蛋白胨10g、NaCl 5g，放在火上加热。待完全溶解后，用10％盐酸或10％的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。接种后培养温度为37℃，培养时间为18h～24h，培养结束后，从摇床中取出放在4℃的冰箱中保存。

酿酒酵母菌扩增培养基配制方法：取250g干麦芽，将干麦芽磨碎，粒度为100目，放入大烧杯，加入1000ml蒸馏水，在64℃～66℃水浴锅中糖化3h～4h。将糖化液用4～6层纱布过滤，滤液如果浑浊不清，用鸡蛋白澄清。方法是，将一个鸡蛋中的蛋白取出加水20ml，调匀用玻璃棒搅拌至生泡沫为止，然后倒入糖化液中搅拌煮沸后，用8层纱布过滤。滤液调节PH为7.0～7.2，糖度用糖度计测量并加蒸馏水稀释到50Be，分装在各个三角瓶中里，加棉花塞，用高压锅灭菌。培养温度为25℃～28℃，培养时间为24h，培养结束后，从摇床中取出放在4℃的冰箱中保存。

下面结合实施案例对本发明的方法进行详细描述。

实施例1：生物优化葡萄籽粕菌种的筛选试验

1)原材料处理

将市售的葡萄籽粕和麸皮用粉碎机粉碎，粒度为40目，按葡萄籽粕和麸皮的比例为9:1，料水比为3:1混合加入到250ml三角瓶中，每个三角瓶中加葡萄籽粕45g，麸皮5g，蒸馏水12.5ml，加棉花塞，用高压锅121℃灭菌30min。

2)单一菌株生物优化葡萄籽粕试验

将扩增好的F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌菌液分别用无菌水稀释到1×10⁷个/ml，接种到发酵培养基上，每一个培养基上分别接种5ml的菌液。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h，培养结束后把培养基取出，将发酵产物放在烘箱中烘干，烘干温度为35℃，烘干后测定粗蛋白(CP)、真蛋白(TP)中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)及粗纤维(CF)的含量。参照(GB/T 6432-1994)测定发酵产物中蛋白质含量；参照(GB/T 6434-1994)测定发酵产物中的粗纤维含量；参照(GB/T 27985-2011)测定发酵产物中单宁含量。

试验结果表明，所选的四个菌种均能提高粗蛋白含量，降低粗纤维含量；四个菌种的发酵产物粗蛋白含量酿酒酵母组的蛋白提高最多，比未生物优化的葡萄籽粕提高了9.20％；而粗纤维F67降低最多，比未发酵的葡萄籽粕降低了22.22％；说明四个菌种适合作为生物优化葡萄籽粕的菌株(图1)。

3)混合菌株发酵试验

将四个菌株双菌混合和多菌混合分别接入固态发酵培养基中，菌种组合为：1+2、1+3、1+4、2+3、2+4、3+4、1+2+3、1+2+4、1+3+4、2+3+4、1+2+3+4(1代表F67、2代表乳酸菌、3代表枯草芽孢杆菌、4代表酿酒酵母菌)。每一个培养基上分别接种5ml的菌液进行混合发酵(例：如果是双菌发酵及个菌种加菌液2.5ml，其它依次类推)。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。

试验结果表明，混合菌种发酵的产物CP含量明显高于单菌发酵，三菌高于双菌，四菌又高于三菌。其中1+2+3+4菌种组合发酵产物的CP含量较其它组含量最高，比未生物优化的葡萄籽粕提高了46.52％，粗纤维相比降低了25.60％，单宁含量为零。且生长迅速，在培养36～48h后即可看见菌丝覆盖基质。见附图2和附图3。

4)最佳菌种接种比例试验

将四个菌种按不同的比例分别接入固态发酵培养基中，菌种的接种比例为：1:1:1:1、1:1:1:2、1:1:2:1、2:1:1:2、1:2:1:2、3:1:2:1、2:1:1:1、1:1:2:2、2:2:1:1、1:2:2:1、1:2:2:2、2:2:2:1(依次为F67:乳酸菌：枯草芽孢杆菌：酿酒酵母菌，因葡萄籽粕CF含量较高，增加F67的比例)。每一个培养基上分别接种5ml的菌液进行混合发酵(例：如果菌种接种比例为1:1:1:1，及每个菌种的菌液添加量为1.25ml，菌种数量为3×10⁷：1×10⁷：2×10⁷：1×10⁷，将四个菌液的浓度均用无菌水稀释至1×10⁷个/ml。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。

试验结果表明，菌种的接种比例为3:1:2:1时，发酵效果最好，CP含量较其它组含量最高，比未生物优化的葡萄籽粕提高了47.30％，粗纤维降低了26.53％，单宁含量为零。见附图4。

5)最佳接种量试验

将四个菌种按比例3:1:2:1(F67×3:乳酸菌×1：枯草芽孢杆菌×2：酿酒酵母菌×1，菌种数量为3×10⁷：1×10⁷：2×10⁷：1×10⁷)分别以2％、5％、10％、15％、20％的接种量接入到固态发酵培养基中。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。

试验结果表明，菌种的接种量为15％时，发酵效果最好，CP含量较其它组含量最高，比未生物优化的葡萄籽粕提高了48.69％，粗纤维降低了27.54％。见附图5。

实施例2：生物优化葡萄籽粕发酵培养基辅料添加量试验

为了使菌种更好的生长，向培养基中添加一定量的麸皮；麸皮中含有丰富的维生素和矿物质，能够调节发酵基质的营养；另外，它还是一种很好的膨松剂，同时也可作为辅助氮源。

将四个菌种按最佳比例配合成菌液，按15％的接种量接种到不同配合固态发酵培养基上。固态发酵培养基的配合比例为：麸皮5％，葡萄籽粕95％；麸皮10％，葡萄籽粕90％；麸皮15％，葡萄籽粕85％；麸皮20％，葡萄籽粕80％。接种完后加棉花塞，三角瓶口用牛皮纸包住，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。

试验结果表明，生物优化效果随着麸皮添加量的增加而增大，而在20％的添加量时CP含量较其它组含量最高，比未生物优化混合底物提高了46.96％，粗纤维降低了25.82％。见附图6。

实施例3：复合菌株生物优化葡萄籽粕回归试验

采用复合菌株分别为：F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌；其菌种数量为3×10⁷：1×10⁷：2×10⁷：1×10⁷，将四个菌液的浓度均用无菌水稀释至1×10⁷个/ml；其按照重量分数的最佳接种量为15％；固态发酵培养基麸皮的添加比例为20％，通过5次验证试验发现，在该条件下所得CP含量比未生物优化的葡萄籽粕依次提高了46.98％、47.53％、47.32％、47.33％、47.21％；CF含量比未生物优化葡萄籽粕依次降低了25.82％、24.93％、25.62％、25.64％、25.76％；单宁含量为零。与实施案例2的结果基本一致；表明本发明的复合微生物菌群对于葡萄籽粕具有很好的发酵效果。

实施例4：不同菌株与复合菌株生物优化葡萄籽粕效果对比试验

1)単菌发酵效果试验：分别将纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和产阮假丝酵母菌四个菌液的浓度均用无菌水稀释至1×10⁷个/ml，其按照重量分数15％接种到葡萄籽粕发酵培养基上，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。并对发酵产品进行粗蛋白和纤维素含量测定。

2)复合菌发酵效果试验：分别将F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌菌种(组合1)和F67、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌菌种(组合2，专利：CN201310362029.X)按接种比例接种到葡萄籽粕发酵培养基上，放在30℃的恒温培养箱中培养，培养时间为72h。并对发酵产品进行粗蛋白(CP)、真蛋白(TP)和纤维素含量测定。

实验结果表明，枯草芽孢杆菌发酵效果显著优于纳豆芽孢杆菌，CP含量相比提高了8.53％，TP提高了2.99％，CF含量降低了7.54％；酿酒酵母菌的发酵效果优于产阮假丝酵母菌CP含量提高了9.05％，TP含量提高了3.76％，CF含量降低了4.48％。菌种组合1真蛋白平均为13.35％，比为发酵产品提高了90.86％；与组合2比较，CP含量提高了14.69％，TP含量提高了8.22％，CF含量降低了3.00％。表明，本发明所选的菌株和菌种组合优于专利CN201310362029.X的菌种和菌种组合，本发明的生物优化葡萄籽粕的菌种组合无法用上述的发明方法代替。试验结果详见表1。

表1.不同菌株生物优化葡萄籽粕营养价值的比较

注：组合1为F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌；组合2为F67、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌。

实施例5：不同复合菌株生物优化葡萄籽粕动物饲养试验

分别将菌种组合1和组合2发酵葡萄籽粕产品，按重量比的9％添加到4周龄生长五龙鹅饲粮中，比较两种组合菌种发酵的葡萄籽粕产品对鹅生产性能的影响，进行为期8周的饲养效果试验。

实验结果表明，在平均日采食量一致的条件下菌种组合1的产品显著优于菌种组合2，体重相比提高了14.85％，平均日增重提高了7.8％，料重比降低了5.9％。表明，应用本发明所生产的生物优化葡萄籽粕动物利用效果较好，是生物优化葡萄籽粕的理想菌种组合。试验结果详见表2。

表2.不同复合菌株生物优化葡萄籽粕产品对五龙鹅生产性能的影响

组别	体重/Kg	平均日增重/g	平均日采食量/g	料重比
					组合1	3.48	31.69	180.98	5.71
组合2	3.03	29.37	178.32	6.07

注：组合1为F67、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌；组合2为F67、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌。

实施例6：复合菌株生物优化葡萄籽粕适口性试验

本发明选用的枯草芽孢杆菌是微生态制剂和发酵饲料用的菌株，发酵之后有清香味，其它芽孢杆菌无法替代；所用的乳酸菌为嗜酸乳酸菌，在生长过程中产生大量的乳酸，发酵后具有酸香味，两者结合共同赋予生物优化葡萄籽粕香味，提高适口性。

将上述四个复合菌株生物优化葡萄籽粕添加到奶牛和家禽的饲粮中，测定饲喂效果。试验结果表明，发酵产品具有清香味，略带酸味，颜色呈深酒红色；在奶牛饲料中按照20％比例添加，采食速度明显加快，粪便正常，体细胞明显减少，皮毛光亮，产奶量提高；在家禽饲料中按照8％比例添加，家禽的采食速度加快，生长速度和饲料转化率明显提高，肠道有益菌明显提高，大肠杆菌降低，粪便正常，羽毛光亮；表明复合菌株生物优化葡萄籽粕具有良好的适口性和饲喂效果。

本发明筛选出的生物优化葡萄籽粕营养价值的复合菌群组合与其它单菌和双菌发酵葡萄籽粕效果比较，能够使发酵产品的粗蛋白显著提高，粗纤维显著降低，单宁含量为零；大大增加了葡萄籽粕的营养物质含量，提高了营养利用价值和使用安全性，使之产品利用更加环保高效；此项技术可以广泛应用于葡萄籽粕产品的进一步开发利用，拓宽了在畜禽饲粮中的广泛利用，具有广阔的市场开发前景。

Claims (3)

1.一种复合微生物菌群，其特征在于，所述的复合微生物菌群由草酸青霉菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌组成；所述的草酸青霉菌的保藏编号为CGMCC No.2260，且复合微生物菌群中，草酸青霉菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的数量比例为3:1:2:1。

2.如权利要求1所述的复合微生物菌群，其特征在于，所述的复合微生物菌群中，草酸青霉菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌数量为3×10⁷、1×10⁷、2×10⁷、1×10⁷。

3.权利要求1所述的复合微生物菌群在处理葡萄籽粕中的应用。