CN108342342B - 一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法 - Google Patents

一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法，应用益生菌枯草芽孢杆菌和Cu2+共同发酵，通过逐步提高CuSO4浓度的方法驯化枯草芽孢杆菌，获得枯草芽孢杆目标菌株NT66。采用的逐步提高Cu2+浓度的方法驯化枯草芽孢杆菌，能够显著地提高枯草芽孢杆菌的耐受性，增加了菌体的含铜量。通过优化培养基、发酵条件，获得枯草芽孢杆菌铜产品，不仅提高了菌体发酵过程中产生的酶、氨基酸以及小肽等活性物质，而且提高枯草芽孢杆菌富集铜的量。制备的枯草芽孢杆菌铜不仅拥有枯草芽孢杆菌的优点，而且将无机铜转化成菌体有机铜，大大提高了动物对微量金属元素的利用率，更好地发挥有机铜的生物学功能。

Description

一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法
技术领域
本发明属畜禽微生态制剂生产技术领域，具体涉及一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌作为肠道益生菌，它能迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌的生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，抑制致病菌的生长，刺激免疫器官的生长，提高机体免疫力，提高生长速率。另一方面，枯草芽孢杆菌能够吸附二价金属阳离子，常被用于处理重金属环境污染问题；然而，目前该菌种的应用只考虑肠道微生态的效果，没有兼顾微量元素的“富集”能力，极大地限制了市场的发展空间。因此，开发一种融合枯草芽孢杆菌多种功能的产品，对满足不同消费群体的需要具有重要的社会意义。
众所周知，一定浓度的铜能促进动物的生长发育，但在饲料中添加高剂量的铜，铜的利用率低，造成近35％左右的铜排除体外，对自然生态环境和水造成污染，尤其是现代规模化畜禽养殖，排放到环境中的铜的含量很高，会造成水体富营养化，并使动物和植物产品造成残留，从而危及整个生态环境。因此，探究一种既满足动物生长，又能够减少铜排放量的方法，对畜牧绿色发展和维护生态良好循环具有重要社会价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法，该菌株能够作为动物饲料添加剂，既能满足动物对铜的需要量，又能提高饲料利用率。
本发明首先提供一种富含铜的枯草芽孢杆菌菌株，为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT66株，于2018年1月31日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15329。
所提供的枯草芽孢杆菌NT66株可以用作制备饲料添加剂。
本发明再一个方面提供一种提高枯草芽孢杆菌中有机铜含量的培养方法，是在富含铜培养基中接种耐铜离子的枯草芽孢杆菌种后，在27～36℃培养，转速150～250r/min。使菌种传代18～25次，在收集发酵的菌株。
优选是在32.7℃培养时间48h；转速180r/min。
培养基的配方最终铜离子的浓度为40-55mg/L。
其中培养基的一种具体配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉7g/L，NaCl 3g/L，葡萄糖7.53g/L，Cu2+浓度51.2mg/L，pH值6.08。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：
1、获得了高耐受铜的菌种：本发明驯化后的菌能够耐受高浓度的Cu2+，并且能够稳定的生长。
2、所获得菌株具有能补铜和促进饲料利用率双重功效。本发明弥补了无机铜和单一菌种的缺陷。能够将无机铜大部分转化成有机铜，不仅能够达到补铜作用，更能增强动物免疫力，提高饲料利用率。
3、工艺简单安全，可操作性强，成本低。所获得的菌株具有能在肠道内生长、分泌酶和维生素、促进肠道各种消化酶活性、抑制有害菌等作用。另外，本发明在进行发酵时操作工艺简便，规模可大可小，适合推广，并且成本较低。
附图说明
图1：驯化对枯草芽孢杆菌红外光谱吸收峰的影响图；
图2：菌体含量响应面中温度与pH值交互对枯草芽孢杆菌铜的影响图；
图3：菌体含量响应面中温度与葡萄糖浓度交互对枯草芽孢杆菌的影响图；
图4：菌体含量响应面中葡萄糖浓度与pH交互对枯草芽孢杆菌铜的影响图；
图5：菌体铜含量响应面中温度与pH值交互对枯草芽孢杆菌铜的影响图；
图6：菌体铜含量响应面中温度与葡萄糖浓度交互对枯草芽孢杆菌影响图；
图7：菌体铜含量响应面中葡萄糖浓度与pH交互对枯草芽孢杆菌铜影响图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本发明的实施例是用于解释本发明而不是对本发明的限制。
本发明应用益生菌枯草芽孢杆菌和Cu2+共同发酵，通过驯化枯草芽孢杆菌获得了富含铜的菌株，且能够稳定的生长。同时优化培养基、发酵条件，不仅提高了菌体发酵过程中产生的酶、氨基酸以及小肽等活性物质，而且提高枯草芽孢杆菌富集铜的量。所筛选的菌株应用于动物饲料中，可以起到促进肠道消化、提高饲料利用率等作用。
虽然酵母菌和枯草芽孢杆菌在动物肠道中均属于过路菌，但是枯草芽孢杆菌属于耗氧菌，能够抑制肠道有害菌繁殖，耐胃酸胆盐强；因此，利用枯草芽孢杆菌吸附二价金属离子的功能特点，开发一种富含铜的枯草芽孢杆菌产品具有重要的经济价值。
本发明的方法经过筛选的富铜枯草芽孢杆菌，并优化枯草芽孢杆菌的培养条件后，得到的枯草芽孢杆菌铜菌种不仅能够保证获得较多枯草芽孢杆菌的同时，还可以富集较多的铜；其中，当铜添加量为52.1mg/L时，菌体含量为0.46g/L，菌体的有机铜含量为2906.34mg/kg；然而，照搬酵母铜的制备方法来获得枯草芽孢杆菌铜菌株无法得到上述的理想效果。
本发明的枯草芽孢杆菌的筛选步骤如下：
1)菌种的驯化：利用微生物能逐渐适应不利生长环境因素的特性，采用逐步提高培养基中Cu2+浓度的方式进行驯化，培养若干代后，最终获得能够耐受高浓度Cu2+的菌种，并将该菌种进行斜面保藏，4℃储藏备用。
2)确定目标菌种：将驯化后的菌种再连续培养若干代后，与驯化前的枯草芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等进行分析，筛选确定目标菌种，并确定能够进行稳定传代。
本发明的枯草芽孢杆菌的培养方法如下：
1)发酵平衡点的确定：根据该菌种的生长特性以及对Cu2+的耐受能力，以菌体含量和菌体铜含量为最终衡量指标。
2)培养基及培养条件的优化：通过单因素试验优化葡萄糖、pH、培养温度、转速、接种量等含量，初步获得枯草芽孢杆菌铜菌种的培养条件。
3)响应面分析：根据单因素试验结果，通过响应面分析确定枯草芽孢杆菌铜的培养条件。
4)枯草芽孢杆菌铜的制备：在最终优化的培养条件下，枯草芽孢杆菌经过发酵一定时间，离心、除去培养基中无机铜及其他成分后即得枯草芽孢杆菌铜菌种的湿样，经55℃烘干后，检测含量，得到枯草芽孢杆菌铜产品。
枯草芽孢杆菌铜的制备参数为：①培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉7g/L，NaCl3g/L，葡萄糖7.53g/L，Cu2+浓度51.2mg/L，pH值6～8；②培养条件：接种量1～3％，培养温度24～36℃，培养时间24～56h，转速150～250r/min。③目标菌种传代18～25次。
当Cu2+的添加量为51.2mg/kg时，最终获得的枯草芽孢杆菌铜的菌体含量为0.43g/L，菌体有机铜含量2906.34mg/kg。
下面结合具体实施案例对本发明方法进行详细描述。
实施例1：富含铜枯草芽孢杆菌的筛选
1、本发明步骤如下：
1)菌种的筛选：采用逐步提高培养基中Cu2+浓度的方式进行驯化；将驯化后的菌种再连续培养若干代后，与驯化前的枯草芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等比较，进一步确定驯化后的枯草芽孢杆菌性质特点，并且能够稳定传代，最终获得能够耐受高浓度硫酸铜(300mg/L)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NT66株，于2018年1月31日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15329。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT66株与出发菌株的活性物质变化情况见表1，表2。
由表1可知，经过传代20次驯化后枯草芽孢杆菌发酵液中淀粉酶比驯化前显著增多(P<0.05)，小肽含量显著增高(P<0.05)，而脂肪酶在驯化前后无显著变化。说明枯草芽孢杆菌在经过驯化后，在产淀粉酶能力方面明显升高。
由表2结果可知，驯化前后的枯草芽孢杆菌至少含有17种氨基酸，其中含有人体必需氨基酸7种，儿童必需氨基酸8种，半必需氨基酸2种。与驯化前相比，驯化后枯草芽孢杆菌的发酵液中游离氨基酸总含量升高，其中人体必需氨基酸增加55.00mg/kg，提高百分之4.32％，儿童必需氨基酸升高61.70mg/kg，提高百分之4.85％。说明驯化后的枯草芽孢杆菌氨基酸产生了显著变化，驯化后更适合用于机体营养需求。
表1：驯化对枯草芽孢杆菌发酵液中酶及小肽的影响
Figure BDA0001598909600000051
表2：驯化对枯草芽孢杆菌中氨基酸的影响
Figure BDA0001598909600000052
实施例2：培养方法的建立
1、培养方法的建立
1)平衡点的确定：根据该菌种的生长特性以及对Cu2+的耐受能力，以菌体含量和菌体铜含量为最终衡量指标。
2)培养基及培养条件的优化：通过单因素试验优化葡萄糖、pH、培养温度、转速、接种量、传代次数等，初步确定枯草芽孢杆菌铜菌种的培养条件。
3)响应面分析：根据单因素试验结果，通过响应面分析确定枯草芽孢杆菌铜菌种的培养条件。
通过单因素初步筛选得到，所述的培养基参数为：①培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉7g/L，NaCl 3g/L，葡萄糖5g/L，pH值6.5；②培养条件：接种量3％，培养温度30℃，培养时间48h，转速180r/min。
通过SPSS 17.0统计软件包，对可能影响枯草芽孢杆菌铜的菌体含量和菌体内有机铜含量的因素进行单因素线性回归分析，筛选出统计学上具有显著意义性的影响因素(P＜0.05)：培养温度、葡萄糖浓度、培养PH。
2、响应面试验因素和方案结果
响应面试验因素编码及水平、设计及其结果分别见表3、表3。
表3：响应面试验因素编码及水平
Figure BDA0001598909600000061
表4：响应面试验设计及其结果
Figure BDA0001598909600000062
Figure BDA0001598909600000071
3、响应面试验回归模型的建立与分析
通过响应面软件Design-Expert 8.0.6Trial对试验结果进行分析后得出其线性回归方程如下：
菌体干重
＝0.54-0.010A-0.0002063B+0.0009102C-0.028AB-0.037AC-0.021BC-0.050A2-0.047B2-0.060C2
铜富集量＝1.67-0.21A-0.043B+0.095C+0.19
AB+0.57AC-0.11BC+0.72A2+0.59B2+0.70C2
响应面试验方差分析
对上述响应面试验回归方程进行方差分析，结果见表5、表6。
表5：菌体含量响应面方差分析
Figure BDA0001598909600000072
Figure BDA0001598909600000081
表6：富铜量响应面方差分析
Figure BDA0001598909600000082
由表5、6可知，两个响应面的回归模型整体显著，菌体含量响应面的失拟项为0.1423，菌体铜含量响应面的失拟项为0.2490，两个失拟项均大于0.05，说明残差由随机误差造成，且回归方程可以代替真实点进行真实结果的分析。
两个模型的p分别为0.0011、0.0002，均小于0.05说明总回归方程显著，方程能很好的拟合实验结果。
经design expert 7.0软件分析后，得出试验的最优条件为：
枯草芽孢杆菌铜的制备参数为：当铜的添加量为51.2mg/kg，培养温度32.70℃、葡萄糖7.53g/L，pH值6.08时，最终获得的枯草芽孢杆菌铜的菌体含量为0.46g/L，菌体内铜含量为2906.34mg/kg。
4、响应面试验的响应曲面和等高线图
根据二次方程模型分别做出试验因素间交互作用的三维立体响应曲面和等高线图，考察在某个因素固定在中心值不变的情况下，其他两个因素的交互作用对菌体含量和菌体内有机铜含量的影响，见图2～图7。等高线图呈椭圆说明两因素的交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著。
从图2的等高线图可以直观地看出，在葡萄糖浓度不变的条件下，培养温度与培养PH交互作用显著。从三维立体图中可看出，菌体含量在合适的离心转速和离心时间下，具有最大值，该最大值出现在较高的培养温度(29.00℃～31.01℃)范围内，较高的培养PH(6.40～6.60)范围内。
从图3的等高线图可以看出，在培养PH不变条件下，培养温度与葡萄糖浓度交互作用显著，从三维立体图中可看出，当培养温度(29.00℃～31.00℃)范围内，葡萄糖浓度(4g/L～6g/L)范围内时，菌体含量会出现最大值。
从图4的等高线图可以看出，培养温度不变的情况下，葡萄糖浓度与培养PH两者交互作用显著。由三维立体图可见，当葡萄糖浓度(4g/L～6g/L)范围内、培养PH(29.00℃～31.00℃)范围内，菌体含量增加，菌体含量存在最大值点。
从图5的等高线图可以直观地看出，在葡萄糖浓度不变的条件下，培养温度与培养PH交互作用显著。从三维立体图中可看出，菌体内有机铜含量在合适的离心转速和离心时间下，具有最大值，该最大值出现在较高的培养温度(27.28℃～28.00℃与32℃～33.00℃)范围内，较低的培养PH(6.00～6.10)范围内。
从图6的等高线图可以看出，在培养PH不变条件下，培养温度与葡萄糖浓度交互作用显著，从三维立体图中可看出，当培养温度较高，葡萄糖浓度较低或者当培养温度较低，葡萄糖浓度较高，菌体内有机铜含量会出现最大值。
从图7的等高线图可以看出，培养温度不变的情况下，葡萄糖浓度与培养PH两者交互作用显著。由三维立体图可见，当葡萄糖浓度在10g/L、培养PH 6.20左右时，菌体内有机铜含量较大。本研究表明，当菌体含量增加时，菌体内有机铜含量会有所降低；反之，当菌体含量降低时，菌体内有机铜含量升高。
最终确定的平衡点发酵条件为：①温度为32.70℃、pH值6.08、葡萄糖浓度7.53g/L、无机铜添加量为51.2mg/kg；②产品含量指标为：菌体含量为0.46g/L，菌体有机铜为2906.34mg/kg；③目标菌种传代20次。
实施例3：枯草芽孢杆菌在高铜环境下培养试验
将普通枯草芽孢杆菌，在普通培养基培养至对数期，即为母液。将枯草芽芽孢杆菌母液以3％的接种量添加到含有51.2mg/kg Cu2+的液体培养基中，在32.7℃，180r/min的恒温震荡培养箱中培养48h后，结束发酵。将发酵液在6000r/min，4℃下离心获得湿菌体，并用去离子水冲洗2～3次，将湿菌体55℃烘干，获得枯草芽孢杆菌粉末。称取一定量的枯草芽孢杆菌粉末，测定菌体铜量。
在此条件下菌体含量为0.40g/L，菌体内有机铜含量为1337.55mg/kg。比采用驯化菌的菌体含量低15％，菌体铜含量低117.29％。
实施例4：枯草芽孢杆菌铜干预孕鼠对其子代的影响
选择108(6×6×3)只受孕5d的清洁级S.D孕鼠，购入的孕鼠适应饲养7d。之后随机分成6个处理，每个处理6个重复，每个重复3只，所有处理参照表1进行，饲养至哺乳期结束，眼球取血，每组分别抽取6只子鼠进行处死，取样。在适饲养阶段，饲喂正常饲料，铜含量为6mg/kg，正式试验阶段饲喂缺铜饲料，铜含量为0.33mg/kg，所有饲料均购于南通特洛菲有限公司，按照AIN-93标准生产。
表7铜水平对哺乳期大鼠影响干预试验设计
Figure BDA0001598909600000101
Figure BDA0001598909600000111
*注：1.缺铜饲料Cu为0.33mg/kg。
2.发酵物溶液根据铜添加水平采用去离子水进行稀释。
试验结果如表8。结果发现，同浓度的枯草芽孢杆菌NT66株组比无机硫酸铜组能够显著提高幼鼠成活率，并且体重、体长比无机硫酸铜组显著提高。
表8枯草芽孢杆菌铜干预哺乳期大鼠对其幼鼠成长指数影响
Figure BDA0001598909600000112
本发明将驯化的枯草芽孢杆菌在含有一定Cu2+的培养基中进行发酵后，获得枯草芽孢杆菌铜，所采用的驯化方法和发酵工艺，操作简单，安全性高，产品使用效果好。本发明采用的逐步提高Cu2+浓度的方法驯化枯草芽孢杆菌，能够显著地提高枯草芽孢杆菌的耐受性，增加了菌体的含铜量。制备的枯草芽孢杆菌铜不仅拥有枯草芽孢杆菌的优点，而且将无机铜转化成菌体有机铜，大大提高了动物对微量金属元素的利用率，更好地发挥有机铜的生物学功能，可谓一菌两效；另外，有机铜利用率的提高大大降低了饲料中无机铜的使用量和排放量，减少了生态环境的污染。为此，此发明对开发新型动物微生态制剂以及微量元素“减量化”使用提供了重要技术支撑。

Claims (7)

1.一种富含铜的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CGMCCNo.15329。
2.权利要求1所述的富含铜的枯草芽孢杆菌菌株在制备饲料添加剂中的应用。
3.一种提高枯草芽孢杆菌中有机铜含量的培养方法，其特征在于，所述的方法是在富含铜离子的培养基中接种权利要求1所述的富含铜的枯草芽孢杆菌菌株后，在27～36℃培养，转速150～240r/min。使菌种传代18～25次后，再收集发酵的菌株。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是在32.7℃培养48h；转速180r/min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养基的配方中最终铜离子的浓度为51.2mg/L。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的菌种传代为20次。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养基的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉7g/L，NaCl 3g/L，葡萄糖7.53g/L，Cu2+浓度51.2mg/L，pH值6.08。
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