CN112501107B - 一种驯化米根霉的方法及生产乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵，公开了一种驯化米根霉的方法及生产乳酸的方法。驯化米根霉的方法包括以下步骤：将所述米根霉利用含有乳酸根离子和/或铜离子的驯化培养基进行驯化。本发明还提供了上述驯化米根霉的方法得到的米根霉驯化菌株在生产乳酸中的应用。本发明还提供了一种生产乳酸的方法，包括以下步骤：将根据上述的方法驯化得到的米根霉驯化菌株进行发酵。本发明实现米根霉高产乳酸的定向驯化改造，具有很强的目标性，驯化方法简便、效率高，获得的米根霉驯化菌株遗传稳定性强、菌株生长速度快、乳酸产量高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵，具体地，涉及一种驯化米根霉的方法及生产乳酸的方法。
背景技术
乳酸(Lactic acid)是一种常见的羧酸，可以作为抑菌剂、增味剂、pH调节剂等，此外，由乳酸合成的聚乳酸材料具有可生物降解性，能够应用于生产医用缝合线、食品包装材料等。生物可降解聚乳酸材料具有替代石油基塑料产品的潜能，是当前材料研究的热点。目前，90％以上的乳酸是通过微生物发酵生产的，而米根霉是生物法合成乳酸的一种常用菌株。
目前，关于米根霉发酵生产乳酸技术多集中在菌株的选育、菌体形态的控制、培养基或培养条件的控制这三个方面。乳酸作为米根霉的发酵产品，米根霉菌种的性能对发酵结果的影响重大，传统的通过优化培养基配方和发酵调控设计以提高米根霉的发酵性能，不仅操作复杂，而且容易受菌种活力的影响，造成发酵结果不稳定、乳酸含量不高等，此外，菌种的传统诱变筛选方法工作量大、筛选工作盲目，筛得的菌种往往达不到预期的效果、遗传稳定性差。因此，新的菌种选育方法对提高米根霉的乳酸产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中米根霉菌种的选育过程存在盲目性、所选育的菌种稳定性低的问题，提供一种驯化米根霉的方法及生产乳酸的方法，该驯化方法能够获得高产乳酸的菌株，且稳定性高、发酵性能好。
本申请的发明人在利用米根霉发酵生产乳酸的研究过程中发现，在发酵培养基中添加一定浓度的铜离子时，能够提高乳酸的产量与碳源消耗量的比值，这表明铜离子的添加能够促进米根霉发酵过程中乳酸的生成量。
为了实现上述目的，同时基于上述发现，本发明第一方面提供一种驯化米根霉的方法，包括以下步骤：将所述米根霉利用含有乳酸根离子和/或铜离子的驯化培养基进行驯化。
优选地，所述乳酸根离子由水溶性乳酸盐提供，所述铜离子由水溶性铜盐提供；
优选地，所述水溶性乳酸盐选自乳酸钠、乳酸锂、乳酸钙和乳酸镁中的至少一种；
所述水溶性铜盐选自氯化铜、硫酸铜、醋酸铜和溴化铜中的至少一种。
优选地，所述驯化的过程包括：利用含有所述铜离子的固态驯化培养基和含有所述乳酸根离子的液态驯化培养基对所述米根霉进行交替驯化。
优选地，所述液态驯化培养基还含有碳源、氮源和无机盐；所述固态驯化培养基为含有所述铜离子的PDA固态培养基；
优选地，所述碳源选自葡萄糖、糊精、小麦淀粉和蔗糖中的至少一种；
所述氮源选自蛋白胨、酵母粉、棉籽粉和豆粕中的至少一种；
所述无机盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸镁中的至少一种。
优选地，所述液态驯化培养基中乳酸根离子的浓度为0.1-1mol/L、所述固态驯化培养基中铜离子的浓度为30-100μmol/L。
优选地，所述交替驯化过程中，所述固态驯化培养基中铜离子的浓度以每次5-15μmol/L的梯度进行递增，所述液态驯化培养基中乳酸根离子的浓度以每次0.1-0.2mol/L的梯度进行递增。
优选地，所述交替驯化的过程包括：将所述米根霉驯化至能够在铜离子浓度为80-100μmol/L的所述固态驯化培养基中生长出米根霉孢子，且所述米根霉孢子能够在乳酸根离子浓度为0.8-1mol/L的所述液态驯化培养基中生长至细胞干重为2-5g/L。
本发明第二方面提供根据上述任意一项所述的方法驯化得到的米根霉驯化菌株在生产乳酸中的应用。
本发明第三方面提供一种生产乳酸的方法，包括以下步骤：将根据上述任意一项所述的方法驯化得到的米根霉驯化菌株进行发酵。
优选地，所述发酵的过程包括：将所述米根霉驯化菌株在含有铜离子的发酵培养基中进行培养；
所述发酵培养基中铜离子的浓度为20-100μmol/L，所述米根霉驯化菌株的接种量为1×104-1×105cfu/mL。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的米根霉驯化方法通过乳酸根离子和/铜离子对米根霉的驯化诱导作用，实现米根霉高产乳酸的定向驯化改造，具有很强的目标性，驯化方法简便、效率高，获得的米根霉驯化菌株遗传稳定性强、菌株生长速度快、乳酸产量高；进一步地，本发明通过乳酸根离子与铜离子的配合，对米根霉进行交替驯化，促进米根霉利用碳源流向乳酸的合成代谢，使得米根霉菌体在发酵过程中能够持续高效利用碳源生产乳酸，减弱产物抑制效应，实现乳酸高产的目的。
附图说明
图1是实施例1获得的米根霉驯化菌株和原始菌株的发酵过程中乳酸积累曲线；
图2是实施例1获得的米根霉驯化菌株和原始菌株的发酵过程中生物量变化曲线。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种驯化米根霉的方法，包括以下步骤：将所述米根霉利用含有乳酸根离子和/或铜离子的驯化培养基进行驯化。
根据本发明，驯化培养基可以是液态培养基，也可以是固态培养基，在配制驯化培养基的过程中加入相应的乳酸根离子和/或铜离子即可。优选情况下，所述乳酸根离子由水溶性乳酸盐提供；更优选地，所述水溶性乳酸盐选自乳酸钠、乳酸锂、乳酸钙和乳酸镁中的至少一种，例如，所述水溶性乳酸盐为乳酸钠和乳酸钙时，乳酸钠与乳酸钙的摩尔比为2-4:1，所述水溶性乳酸盐为乳酸钠、乳酸钙和乳酸镁时，乳酸钠、乳酸钙与乳酸镁的摩尔比为1-2:1-2:1；所述铜离子由水溶性铜盐提供；更优选地，所述水溶性铜盐选自氯化铜、硫酸铜、醋酸铜和溴化铜中的至少一种。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够提高乳酸根离子或者铜离子对米根霉的驯化效果，提高米根霉生产乳酸的转化率。
根据本发明，可以是利用含有乳酸根离子的驯化培养基对米根霉进行驯化，可以是利用含有铜离子的驯化培养基对米根霉进行驯化，也可以是利用含有乳酸根离子和铜离子的驯化培养基对米根霉进行驯化，或者是利用含有乳酸根离子的驯化培养基和含有铜离子的驯化培养基单独交替地对米根霉进行驯化。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述驯化的过程包括：利用含有所述铜离子的固态驯化培养基和含有所述乳酸根离子的液态驯化培养基对所述米根霉进行交替驯化。优选情况下，固态驯化培养基进行驯化的过程至少满足以下条件：温度为20-30℃；液态驯化培养基进行驯化的过程至少满足以下条件：米根霉的接种量为1×104-1×105cfu/mL、温度为20-30℃、转速为150-300rpm。
发明人发现，在该优选的具体实施方式下，利用固态驯化培养基驯化米根霉能够在一定浓度的铜离子条件下正常生长形成孢子，利用液态驯化培养基驯化米根霉能够在一定浓度的乳酸根离子条件下正常生长，以实现米根霉发酵过程中高产乳酸。
根据本发明，米根霉的发酵培养采用基础培养基，其中含有碳源、氮源和无机盐。优选情况下，所述液态驯化培养基采用基础培养基中加入乳酸根离子制得，即所述液态驯化培养基还含有碳源、氮源和无机盐。示例性地，基础培养基中碳源的浓度为50-100g/L、氮源的浓度为4-8g/L和无机盐的浓度为0.4-1.2g/L。
进一步优选地，所述碳源选自葡萄糖、糊精、小麦淀粉和蔗糖中的至少一种；所述氮源选自蛋白胨、酵母粉、棉籽粉和豆粕中的至少一种；所述无机盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸镁中的至少一种。
根据本发明，所述固态驯化培养基为含有所述铜离子的PDA固态培养基，即所述固态驯化培养基采用PDA固态培养基中加入铜离子制得。
根据本发明，所述液态驯化培养基中乳酸根离子的浓度为0.1-1mol/L，例如可以为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mo/L、1mol/L以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；所述固态驯化培养基中铜离子的浓度为30-100μmol/L，例如可以为30mol/L、40mol/L、50mol/L、60mol/L、70mol/L、80mol/L、90mol/L、100mol/L以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，更利于对米根霉高产乳酸的驯化作用。
作为交替驯化的一种优选实施方式，所述交替驯化过程中，所述固态驯化培养基中铜离子的浓度以每次5-15μmol/L的梯度进行递增，所述液态驯化培养基中乳酸根离子的浓度以每次0.1-0.2mol/L的梯度进行递增。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够逐步提高米根霉对乳酸根离子和铜离子的耐受能力，实现对米根霉发酵合成乳酸的逐步提高，进而使得驯化后米根霉具有较强的遗传稳定性。
根据本发明，所述交替驯化的过程包括：将所述米根霉驯化至能够在铜离子浓度为80-100μmol/L的所述固态驯化培养基中生长出米根霉孢子，且所述米根霉孢子能够在乳酸根离子浓度为0.8-1mol/L的所述液态驯化培养基中生长至细胞干重为2-5g/L。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，所获得的米根霉驯化菌株的生长速度具快，具有较高的菌体产量和乳酸含量。
示例性地，所述驯化的过程具体可以包括如下步骤：
(1)在基础培养基上接种米根霉孢子液，经活化培养得到米根霉活化菌液；
(2)将步骤(1)中米根霉活化菌液接种于铜离子浓度为30μmol/L的固态驯化培养基中，培养至长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成米根霉孢子液；
(3)将步骤(2)中的孢子接种于乳酸根离子浓度为0.1mol/L的液体驯化培养基中，米根霉的接种量为1×104-1×105cfu/mL，培养至细胞干重为2-5g/L；
(4)以5-15μmol/L的梯度提高固体驯化培养基中铜离子的浓度，将步骤(3)中的米根霉接种于该固态驯化培养基中，培养至长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成米根霉孢子液；
(5)以0.1-0.2mol/L的梯度提高液体驯化培养基中乳酸根离子的浓度，将步骤(4)的孢子接种于该液体驯化培养基中，米根霉的接种量为1×104-1×105cfu/mL，培养至细胞干重为2-5g/L；
(6)按照步骤(4)和步骤(5)的方法不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在80-100μmol/L的所述固态驯化培养基中正常生长出孢子，且该孢子在乳酸根离子浓度为0.8-1mol/L的所述液态驯化培养基中正常生长，细胞干重为2-5g/L。
第二方面，本发明提供了根据上述任意一项所述的方法驯化得到的米根霉驯化菌株在生产乳酸中的应用。
第三方面，本发明提供了一种生产乳酸的方法，包括以下步骤：将根据上述任意一项所述的方法驯化得到的米根霉驯化菌株进行发酵。
根据本发明，可以采用上述的基础培养基作为米根霉驯化菌株的发酵培养基，发酵过程中不断添加碳源以维持碳源的浓度为5g/L以上，并且发酵过程中通过补加pH调节剂维持发酵液的pH为5.0-7.0，示例性地，pH调节剂可以为碳酸钙、氢氧化钠溶液。本发明对米根霉的发酵培养条件没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述米根霉驯化菌株在发酵培养基中大量增殖即可，示例性地，米根霉驯化菌株的发酵至少满足以下条件：温度为20-30℃、转速为150-300rpm、风量为0.5-1.0vvm，时间为50-90h。
优选地，所述发酵的过程包括：将所述米根霉驯化菌株在含有铜离子的发酵培养基中进行培养；所述发酵培养基中铜离子的浓度为20-100μmol/L，所述米根霉驯化菌株的接种量为1×104-1×105cfu/mL。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够促进米根霉驯化菌株在发酵过程中合成乳酸，提高乳酸的产量，降低其生产成本。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，葡萄糖和乳酸的含量通过SBA-40E生物传感分析仪测得；米根霉的原始菌株为米根霉R.oryzae LA-Un-1(具体可参见Yin,L.F.,Ruan,Q.C.,Fu,Y.Q.,Strain improvement of Rhizopus oryzae foroverproduction of lactic acid by random mutations.African journal ofmicrobiology research.2013.7(23),2970–2975)，由台州学院保藏。
在没有特别说明的情况下，所用原料均采用市售产品，所述室温为25±5℃。
基础培养基：葡萄糖100g/L、酵母粉4g/L、磷酸二氢钾0.5g/L；
PDA培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L。
实施例1
液态驯化培养基：基础培养基+乳酸钠(乳酸根离子浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1mol/L)
固态驯化培养基：PDA培养基+硫酸铜(铜离子浓度分别为30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、70μmol/L、80μmol/L、90μmol/L、100μmol/L)
发酵培养基：基础培养基+硫酸铜(铜离子浓度为60μmol/L)
(1)在50mL基础培养基上接种米根霉原始菌株，米根霉的接种量为5×104cfu/mL，在温度为25℃、转速为200rpm的条件下进行活化培养至细胞干重为3g/L(计为一代)，得到活化的米根霉菌液；
(2)将步骤(1)中活化的米根霉接种于铜离子浓度为30μmol/L的固态驯化培养基中，培养至长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成驯化一代孢子液；
(3)将步骤(2)中的驯化一代孢子液接种于乳酸根离子浓度为0.1mol/L的液体驯化培养基中，米根霉的接种量为5×104cfu/mL，培养至细胞干重为3g/L，得到驯化一代菌液；
(4)以10μmol/L的梯度提高固体驯化培养基中铜离子的浓度，将步骤(3)中的驯化一代菌液接种于该固态驯化培养基中，培养至长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成驯化二代孢子液；
(5)以0.1mol/L或者0.2mol/L的梯度提高液体驯化培养基中乳酸根离子的浓度，将步骤(4)的驯化二代孢子液接种于该液体驯化培养基中，米根霉的接种量为5×104cfu/mL，培养至细胞干重为3g/L，得到驯化二代菌液；
(6)按照步骤(4)和步骤(5)的方法不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在100μmol/L的所述固态驯化培养基中正常生长出孢子，且该孢子在乳酸根离子浓度为1mol/L的所述液态驯化培养基中正常生长，细胞干重为4g/L，得到米根霉驯化菌株。
将实施例1中不同乳酸根离子浓度和铜离子浓度条件驯化得到的菌液，进行乳酸发酵性能考察，即将上述驯化过程中的驯化一代菌液、驯化二代菌液、米根霉驯化菌株等菌液接种于发酵培养基中，米根霉的接种量为2×104cfu/mL，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，测定结果见表1，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为6，培养温度为25℃、风量1.0vvm、转速为200rpm。
表1
实施例2
液态驯化培养基：基础培养基+乳酸钠与乳酸钙混合物(二者摩尔比例为3:1)(乳酸根离子浓度分别为0.1mol/L、0.25mol/L、0.4mol/L、0.55mol/L、0.7mol/L、0.85mol/L)
固态驯化培养基：PDA培养基+氯化铜(铜离子浓度分别为30μmol/L、45μmol/L、60μmol/L、75μmol/L、90μmol/L、100μmol/L)
发酵培养基：基础培养基+氯化铜(铜离子浓度为80μmol/L)
(1)在50mL基础培养基上接种米根霉原始菌株，米根霉的接种量为6×104cfu/mL，在温度为20℃、转速为250rpm的条件下进行活化培养至细胞干重为5g/L(计为一代)，得到活化的米根霉菌液；
(2)将步骤(1)中活化的米根霉接种于铜离子浓度为30μmol/L的固态驯化培养基中，培养至长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成驯化一代孢子液；
(3)将步骤(2)中的驯化一代孢子液接种于乳酸根离子浓度为0.1mol/L的液体驯化培养基中，米根霉的接种量为6×104cfu/mL，培养至细胞干重为5g/L，得到驯化一代菌液；
(4)以15μmol/L的梯度提高固体驯化培养基中铜离子的浓度，将步骤(3)中的驯化一代菌液接种于该固态驯化培养基中，培养至长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成驯化二代孢子液；
(5)以0.15mol/L的梯度提高液体驯化培养基中乳酸根离子的浓度，将步骤(4)的驯化二代孢子液接种于该液体驯化培养基中，米根霉的接种量为6×104cfu/mL，培养至细胞干重为4g/L，得到驯化二代菌液；
(6)按照步骤(4)和步骤(5)的方法不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在100μmol/L的所述固态驯化培养基中正常生长出孢子，且该孢子在乳酸根离子浓度为0.85mol/L的所述液态驯化培养基中正常生长，细胞干重为5g/L，得到米根霉驯化菌株；
将实施例2中不同乳酸根离子浓度和铜离子浓度条件驯化得到的菌液，进行乳酸发酵性能考察，即将上述驯化过程中的驯化一代菌液、驯化二代菌液、米根霉驯化菌株等菌液接种于发酵培养基中，米根霉的接种量为1×104cfu/mL，在培养温度为28℃、风量为0.5vvm、转速为300rpm的条件下进行发酵，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为5，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，结果见表2。
表2
实施例3
液态驯化培养基：基础培养基+乳酸钠、乳酸钙、乳酸镁混合物(三者摩尔比例为4:3:3)(乳酸根离子浓度分别为0.1mol/L、0.28mol/L、0.46mol/L、0.64mol/L、0.82mol/L、1mol/L)
固态驯化培养基：PDA培养基+硫酸铜(铜离子浓度分别为30μmol/L、42μmol/L、54μmol/L、66μmol/L、78μmol/L、90μmol/L)
发酵培养基：基础培养基+氯化铜(铜离子浓度为90μmol/L)
(1)在50mL基础培养基上接种米根霉原始菌株，米根霉的接种量为8×104cfu/mL，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下进行活化培养至细胞干重为4g/L(计为一代)，得到活化的米根霉菌液；
(2)将步骤(1)中活化的米根霉接种于铜离子浓度为30μmol/L的固化驯化培养基中，培养到长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成驯化一代孢子液；
(3)将步骤(2)中的驯化一代孢子液接种于乳酸根离子浓度为0.1mol/L的液体驯化培养基中，米根霉的接种量为8×104cfu/mL，培养至细胞干重为4g/L，得到驯化一代菌液；
(4)以12μmol/L的梯度提高驯化培养基中铜离子的浓度，将步骤(4)的驯化二代孢子液接种于该液体驯化培养基中，米根霉的接种量为8×104cfu/mL，培养至细胞干重为4g/L，得到驯化二代菌液；
(5)以0.18mol/L的梯度提高驯化培养基中乳酸根离子的浓度，将步骤(2)中的驯化一代菌液接种于该驯化培养基中，培养至长出孢子，培养至细胞干重为4g/L，得到驯化二代菌液；
(6)按照步骤(4)和步骤(5)的方法不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在90μmol/L的所述固态驯化培养基中正常生长出孢子，且该孢子在乳酸根离子浓度为1mol/L的所述液态驯化培养基中正常生长，细胞干重为3g/L，得到米根霉驯化菌株；
将实施例2中不同乳酸根离子浓度和铜离子浓度条件驯化得到的菌液，进行乳酸发酵性能考察，即将上述驯化过程中的驯化一代菌液、驯化二代菌液、米根霉驯化菌株等菌液接种于发酵培养基中，米根霉的接种量为6×104cfu/mL，在培养温度为25℃、风量为1.0vvm、转速为250rpm的条件下进行发酵，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为7，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，结果见表3。
表3
实施例4
驯化培养基：基础培养基+乳酸钠+氯化铜
发酵培养基：基础培养基+氯化铜(铜离子浓度为90μmol/L)
(1)在50mL基础培养基上接种米根霉原始菌株，米根霉的接种量为4×104cfu/mL，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下进行活化培养至细胞干重为2g/L(计为一代)，得到活化的米根霉菌液；
(2)将步骤(1)中活化的米根霉接种于乳酸根离子为0.1mol/L、铜离子浓度为30μmol/L的驯化培养基中(固态)，培养至长出孢子，将长出的孢子用无菌水洗脱形成驯化一代孢子液；
(3)以10μmol/L的梯度提高驯化培养基中铜离子的浓度，以0.1mol/L的梯度提高驯化培养基中乳酸根离子的浓度，将步骤(2)中的驯化一代孢子液接种于乳酸根离子为0.2mol/L、铜离子浓度为40μmol/L的驯化培养基(液态)，米根霉的接种量为5×104cfu/mL，培养至细胞干重为2g/L，得到驯化一代菌液；
(4)按照步骤(2)和(3)的方法不断提高驯化培养基中铜离子和乳酸根离子的浓度，不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在乳酸根离子浓度为0.8mol/L、铜离子浓度为100μmol/L的液态驯化培养基中正常生长至细胞干重为3g/L，得到米根霉驯化菌株；
将实施例4中不同铜离子和乳酸根离子浓度条件驯化得到的菌液，进行乳酸发酵性能考察，即将上述驯化过程中的驯化一代菌液、驯化二代菌液、米根霉驯化菌株等菌液接种于发酵培养基中，米根霉的接种量为5×104cfu/mL，在培养温度为25℃、风量为1.0vvm、转速为300rpm的条件下进行发酵，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为7，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，结果见表4
表4
实施例5
驯化培养基：基础培养基+硫酸铜(铜离子浓度分别为30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、70μmol/L、80μmol/L、90μmol/L、100μmol/L)
发酵培养基：基础培养基+硫酸铜(铜离子浓度为90μmol/L)
(1)在50mL基础培养基上接种米根霉原始菌株，米根霉的接种量为3×104cfu/mL，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下进行活化培养至细胞干重为4g/L(计为一代)，得到活化的米根霉菌液；
(2)将步骤(1)中活化的米根霉接种于铜离子浓度为30μmol/L的驯化培养基中，培养至细胞干重为4g/L，得到驯化一代菌液；
(3)以10μmol/L的梯度提高驯化培养基中铜离子的浓度将步骤(2)中的驯化一代菌液接种于该驯化培养基中，培养至长出孢子，培养至细胞干重为4g/L，得到驯化二代菌液；
(4)按照步骤(3)的方法不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在铜离子浓度为100μmol/L的驯化培养基中正常生长至细胞干重为4g/L，得到米根霉驯化菌株；
将实施例5中不同铜离子浓度条件驯化得到的菌液，进行乳酸发酵性能考察，即将上述驯化过程中的驯化一代菌液、驯化二代菌液、米根霉驯化菌株等菌液接种于发酵培养基中，米根霉的接种量为5×104cfu/mL，在培养温度为25℃、风量为1.0vvm、转速为300rpm的条件下进行发酵，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为7，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，结果见表5。
表5
实施例6
驯化培养基：基础培养基+乳酸钠(乳酸根离子浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1mol/L)
发酵培养基：基础培养基+氯化铜(铜离子浓度为90μmol/L)
(1)在50mL基础培养基上接种米根霉原始菌株，米根霉的接种量为7×104cfu/mL，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下进行活化培养至细胞干重为2g/L(计为一代)，得到活化的米根霉菌液；
(2)将步骤(1)中活化的米根霉接种于乳酸根离子浓度为0.1mol/L的驯化培养基中，培养至细胞干重为2g/L，得到驯化一代菌液；
(3)以0.1mol/L的梯度提高驯化培养基中乳酸根离子的浓度，将步骤(2)中的驯化一代菌液接种于该驯化培养基中，培养至长出孢子，培养至细胞干重为2g/L，得到驯化二代菌液；
(4)按照步骤(3)的方法不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在乳酸根离子浓度为1.0mol/L的驯化培养基中正常生长至细胞干重为2g/L，得到米根霉驯化菌株；
将实施例6中不同乳酸根离子浓度条件驯化得到的菌液，进行乳酸发酵性能考察，即将上述驯化过程中的驯化一代菌液、驯化二代菌液、米根霉驯化菌株等菌液接种于发酵培养基中，米根霉的接种量为1×104cfu/mL，在培养温度为25℃、风量为1.0vvm、转速为300rpm的条件下进行发酵，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为7，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，结果见表6。
表6
对比例1
驯化培养基：基础培养基+氯化铝(铝离子浓度分别为30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、70μmol/L、80μmol/L、90μmol/L、100μmol/L)
发酵培养基：基础培养基+氯化铝(铝离子浓度为90μmol/L)
(1)在50mL基础培养基上接种米根霉原始菌株，米根霉的接种量为1×104cfu/mL，在温度为20℃、转速为150rpm的条件下进行活化培养至细胞干重为2g/L(计为一代)，得到活化的米根霉菌液；
(2)将步骤(1)中活化的米根霉接种于铝离子浓度为30mol/L的驯化培养基中，培养至细胞干重为2g/L，得到驯化一代菌液；
(3)以10mol/L的梯度提高驯化培养基中铝离子的浓度，将步骤(2)中的驯化一代菌液接种于该驯化培养基中，培养至长出孢子，培养至细胞干重为2g/L，得到驯化二代菌液；
(4)按照步骤(3)的方法不断重复培养驯化，直到驯化菌种能够在铝离子浓度为100mol/L的驯化培养基中正常生长至细胞干重为2g/L，得到米根霉驯化菌株；
将对比例1中不同铝离子浓度条件驯化得到的菌液，进行乳酸发酵性能考察，即将上述驯化过程中的驯化一代菌液、驯化二代菌液、米根霉驯化菌株等菌液接种于发酵培养基中，米根霉的接种量为1×104cfu/mL，在培养温度为25℃、风量为1.0vvm、转速为300rpm的条件下进行发酵，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为7，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，结果见表7。
表7
对比例2
将米根霉原始菌株接种于发酵培养基中，米根霉驯化菌株的接种量为1×104cfu/mL，在培养温度为25℃、风量为1.0vvm、转速为200rpm的条件下进行发酵，其中发酵葡萄糖消耗量为100g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为7，测定发酵周期、乳酸含量和乳酸得率，结果见表8。
表8
测试例
发酵培养基：基础培养基+硫酸铜(铜离子浓度为90μmol/L)
将上述实施例1-实施例6和对比例1-对比例2获得的米根霉驯化菌株接种于发酵培养基中，接种量为5×104cfu/mL，在培养温度为28℃、风量为1.0vvm、转速为200rpm的条件下进行发酵，发酵过程中补加葡萄糖溶液使得发酵液中葡萄糖浓度不低于5g/L，补加碳酸钙维持发酵液的pH为6.5，在相同的发酵周期(80h)测定乳酸含量和乳酸得率，结果见表9。其中，实施例1获得的米根霉驯化菌株和原始菌株的发酵过程中乳酸积累曲线如图1所示、生物量变化曲线如图2所示。
表9
通过表9的结果可以看出，在相同的发酵周期条件下，本发明所提供的实施例1-实施例3获得的米根霉驯化菌株，发酵80h后乳酸的含量最高，乳酸得率最高；本发明所提供的实施例4-实施例6获得的米根霉驯化菌株，即使在非最优的驯化条件下，驯化得到的菌株也比对比例1-2表现出较高的乳酸含量和乳酸得率。因此，利用本发明提供的驯化方法进行米根霉菌株的驯化，能够实现米根霉高产乳酸的定向驯化改造，并用驯化后的菌株进行乳酸发酵，与原始菌株相比，表现出更好的乳酸生产性能，实现乳酸高产的目的。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种驯化米根霉的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将所述米根霉利用含有铜离子的驯化培养基进行驯化，以获得高产乳酸的菌株，其中，所述含有铜离子的驯化培养基由水溶性铜盐、碳源、氮源和无机盐组成，所述驯化培养基中铜离子以30μmol/L为起始驯化浓度，再以10μmol/L的梯度提高直至驯化菌种能够在铜离子浓度为100μmol/L的驯化培养基中正常生长至细胞干重为4g/L；
或者，该方法包括以下步骤：利用含有铜离子的固态驯化培养基和含有乳酸根离子的液态驯化培养基对所述米根霉进行交替驯化，以获得高产乳酸的菌株，其中，所述含有铜离子的固态驯化培养基由水溶性铜盐和PDA固态培养基组成，所述含有乳酸根离子的液态驯化培养基由水溶性乳酸盐、碳源、氮源和无机盐组成，所述液态驯化培养基中乳酸根离子的浓度为0.1-1mol/L、所述固态驯化培养基中铜离子的浓度为30-100μmol/L，所述交替驯化过程中所述固态驯化培养基中铜离子的浓度以每次5-15μmol/L的梯度进行递增，所述液态驯化培养基中乳酸根离子的浓度以每次0.1-0.2mol/L的梯度进行递增。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性乳酸盐选自乳酸钠、乳酸锂、乳酸钙和乳酸镁中的至少一种；
所述水溶性铜盐选自氯化铜、硫酸铜、醋酸铜和溴化铜中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有乳酸根离子的液态驯化培养基中，所述碳源选自葡萄糖、糊精、小麦淀粉和蔗糖中的至少一种；
所述氮源选自蛋白胨、酵母粉、棉籽粉和豆粕中的至少一种；
所述无机盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸镁中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交替驯化的过程包括：将所述米根霉驯化至能够在铜离子浓度为80-100μmol/L的所述固态驯化培养基中生长出米根霉孢子，且所述米根霉孢子能够在乳酸根离子浓度为0.8-1mol/L的所述液态驯化培养基中生长至细胞干重为2-5g/L。
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