CN115873773A - 高效利用蔗糖生产l-乳酸的大肠杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效利用蔗糖生产L‑乳酸的大肠杆菌及应用，属于生物技术领域。本发明的大肠杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M 20221463的大肠杆菌HBUT‑SL或保藏编号为CCTCC NO：M 20221464的大肠杆菌HBUT‑SLE。大肠杆菌HBUT‑SL与出发菌株HBUT‑L相比，多了一拷贝glpD基因。大肠杆菌HBUT‑SLE是在大肠杆菌HBUT‑SL的基础上进一步转入了表达glpD的ptrc99a‑glpD质粒。本发明的大肠杆菌HBUT‑SL、HBUT‑SLE与出发菌株HBUT‑L相比，在乳酸产量、平均生产强度和最大生物量上有大幅的提升。本发明为蔗糖糖蜜的利用提供了宝贵的菌种资源。

Description

高效利用蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及高效利用蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌及应用。

背景技术

L-乳酸是一种重要的三碳有机酸，被广泛用于食品、医药、烟草和化工等行业。L-乳酸作为单体可合成生物可降解材料聚乳酸(PLA)，而PLA则是目前最有应用价值的可降解材料之一，在“禁塑令”的背景下，因其优异的综合性更能被广泛用于医药、建筑、农林业和服装等行业，L-乳酸在未来的市场潜力也将越来越大。

L-乳酸的生产方法有化学法、酶法和发酵法，其中化学合成法生产的产品是外消旋乳酸即DL-乳酸，这种产物用于合成聚乳酸会导致材料耐热性变差；酶法也可以得到L-乳酸，但以丙酮酸等原料酶法合成L-乳酸，成本太高；发酵法生产乳酸则有生产成本低、产品光学纯度高和原料来源广泛等特点，成为近年来生产L-乳酸的主要方法。其中大肠杆菌发酵所产的L-乳酸，具有光学纯度高和微生物培养营养要求低等特点，备受业内关注。、除了选用合适的微生物发酵L-乳酸，低成本且容易获取的原料也是能推动L-乳酸发酵成本降低的重要因素，如玉米浆(中国专利CN104450585A)、木薯(中国专利CN101805759A；CN102304480)、含五碳糖或者六碳糖的工业/农业废弃物(中国专利CN102690764A；CN102174602A；CN105506005A)、木糖(中国专利CN102433293A)、有机废弃物和剩余活性污泥的混合物(中国专利103923952)和糖蜜(中国专利CN104178438A)等都在L-乳酸发酵中进行了应用。近些年来，在“不与民争粮”的政策思路引导下，利用木质纤维素产L-乳酸的专利申请数量逐步增加(中国专利CN107988274A；CN109837316A；CN112662710A；CN112501218A；CN 112941117 A)。

与木质纤维素相比，糖蜜的价格并不高，被称为发酵原料中最为廉价的碳源(CN104178438A)，且具有原料预处理相对简单和原料收集更为便利的优点，其主要成分为蔗糖、葡萄糖和果糖。但高效利用蔗糖又能产高光学纯度L-乳酸的菌株仍然有待选育。中国专利CN104178438A“一株适合于糖蜜发酵生产高纯度L-乳酸的德式乳酸杆菌及发酵方法和应用”采用了德式乳酸杆菌，这种产高光学纯度L-乳酸的菌株较难获得，且其它研究者分离得到的德式乳酸杆菌，D-乳酸为主要产物(郑佐兴,刘祖同.德氏乳杆菌ZL—513发酵玉米粉生产乳酸的研究[J].食品与发酵工业,1992(4):5)。

大肠杆菌具有遗传背景清晰，基因水平改造技术成熟的特点。尽管常用于工业微生物构建的大肠杆菌Escherichia coli K1、B和C株系不能利用蔗糖，但仍能找到一些具有蔗糖利用能力的大肠杆菌，如大肠杆菌B62(Tsunekawa H,Azuma S,Okabe M,etal.Acquisition of a sucrose utilization system in Escherichia coli K-12derivatives and its application to industry[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,1992,58(6):2081-2088.)。也可以通过转座方式在基因组上引入其它大肠杆菌如大肠杆菌W株的蔗糖利用相关基因(Carruthers D N,TE Saleski,Scholz S A,etal.Random chromosomal integration and screening yields E.coli K-12derivativescapable of efficient sucrose utilization[J].ACS Synthetic Biology,2020,9(12).)。当然也可通过质粒表达方式引入外源的蔗糖的磷酸化或非磷酸转运系统(CN112501105 A；He X,Li Y,TaoY,et al.Discovering and efficiently promoting theextracellular secretory expression of Thermobacillus sp.ZCTH02-B1 sucrosephosphorylase in Escherichia coli[J].International Journal of BiologicalMacromolecules,2021，173:532–540)。

大肠杆菌W作为出发菌株(ATCC 9637)，自带蔗糖利用相关基因，具有较好的利用蔗糖生产乳酸潜力，如何结合基因工程手段和传统的菌株选育方法，更进一步选育出高效利用蔗糖产L-乳酸的大肠杆菌工程菌菌株，无疑对糖蜜的利用和L-乳酸的低成本生产起着关键的促进作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有菌株利用蔗糖产L-乳酸效率不高的现状，提供一种通过适应性驯化及反向生物学得到的高效利用蔗糖生产L-乳酸的的大肠杆菌工程菌及其应用。本发明的目的还在于提供一种提高大肠杆菌利用蔗糖产L-乳酸能力的方法。

本发明的目的经过如下技术方案实现：

一种高效利用蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌，其为下述大肠杆菌中的一种：

保藏编号为CCTCC NO：M 20221463的大肠杆菌HBUT-SL；

保藏编号为CCTCC NO：M 20221464的大肠杆菌HBUT-SLE。

所述的大肠杆菌HBUT-SL以大肠杆菌HBUT-L(记载于文献Engineering andadaptive evolution of Escherichia coli W for L-lactic acid fermentationfrommolasses and.corn steep liquor without additional nutrients,BioresourceTechnology,2013,184:394-400)为出发菌株，在富含蔗糖的环境下进行适应性驯化获得。大肠杆菌HBUT-L已敲除编码富马酸还原酶的基因frdBC、编码乙醇脱氢酶的基因adhE、编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta、编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因pflB、编码蔗糖启动子抑制基因cscR、编码乙醛脱氢酶的基因aldA、编码D-乳酸脱氢酶的基因ldhA，同时插入来源于乳酸片球菌Pediococcus acidilactici的编码L-乳酸脱氢酶的基因ldhL。大肠杆菌HBUT-SL大肠杆菌HBUT-L相比，其基因组多了一拷贝甘油-3-磷酸脱氢酶glpD基因。

大肠杆菌HBUT-L对蔗糖原料适应性驯化：将HBUT-L在5L发酵罐中进行适应性驯化。菌株划线在含有无机盐培养基的平板中35-37℃过夜培养，然后挑选平板上长好的4-10个HBUT-L菌落接种于含2％蔗糖的50mL的无机盐培养基中，35-37℃150-200r/min培养12-16h后，按5％-10％接种量转入到装有含10％蔗糖的3L无机盐培养基中，发酵条件为：35-37℃搅拌桨转速150-200r/min。通过流加18-22％(w/w)的Ca(OH)₂控制发酵液pH值为6.5。发酵18-24h后，按10％接种量转入另外一罐装有含有10％蔗糖的3L新鲜的无机盐培养基中，如此重复发酵转接6代。转接的发酵液，用无菌水稀释后涂在LB平板上分离单菌落，随机选取若干单菌落给予命名，对蔗糖利用效果最好的菌株命名为HBUT-SL。

所述的大肠杆菌HBUT-SLE在大肠杆菌HBUT-SL的基础上，进一步转入了表达glpD基因的质粒ptrc99a-glpD。

大肠杆菌HBUT-SL，在含10％蔗糖和0.5％玉米浆干粉的无机盐培养基培养时，L-乳酸产量为90.85g/L，发酵时间为36h，平均生产强度为2.52g·L^-1h^-1，最大生物量为19.55，其乳酸产量、平均生产强度和最大生物量较未驯化的大肠杆菌HBUT-L分别提高到1.10、1.83和2.02倍，发酵时间缩短了24h。大肠杆菌HBUT-SLE在上述培养基培养时，L-乳酸产量为95.30g/L，发酵时间为24h，平均生产强度为3.97g·L^-1h^-1，最大生物量为16.28，其乳酸产量、平均生产强度和最大生物量较未驯化的大肠杆菌HBUT-L分别提高到1.15、2.88和1.68倍，发酵时间缩短了36h。

所述的高效利用蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌在生产L-乳酸中的应用。

一种生产L-乳酸的方法，包括如下步骤：将上述大肠杆菌采用含蔗糖和玉米浆干粉的培养基培养。

一种提高大肠杆菌利用蔗糖产L-乳酸能力的方法，为使产L-乳酸的大肠杆菌过表达glpD基因。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明结合单基因改造和驯化选育的手段，实现大肠杆菌高效利用蔗糖产L-乳酸。以往改造大肠杆菌产L-乳酸的思路主要是敲出编码富马酸还原酶的基因frdBC，编码乙醇脱氢酶的基因adhE，编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta，编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因pflB，编码蔗糖启动子抑制基因cscR，编码乙醛脱氢酶的基因aldA，编码D-乳酸脱氢酶的基因ldhA，来避免其它杂酸如乙酸、D-乳酸、甲酸、琥珀酸等的生成。提高其利用蔗糖主要通过敲出编码蔗糖启动子抑制基因cscR。但大肠杆菌对各种碳源的利用往往有多个转运途径，对碳源的利用也涉及到多个基因，因此传统的依赖单个基因改造的思路不一定实现高效利用蔗糖产L-乳酸的目标。本发明结合定向驯化的方式，进一步挖掘大肠杆菌利用蔗糖能力，弥补了原有方法的不足。

(2)借助于反向基因组功能学的思路，挖掘了glpD基因，推测其可能通过影响糖酵解，解除果糖激酶(编码基因为cscK)或蔗糖水解酶(编码基因为cscB)的产物抑制来达到增强蔗糖利用，通过质粒过表达glpD基因初步证实了推测，为高效利用蔗糖产L-乳酸构建了新的工程菌株HBUT-SLE。该菌株其乳酸产量、平均生产强度和最大生物量较未驯化的大肠杆菌HBUT-L分别提高到1.15、2.88和1.68倍，发酵时间缩短了36h，为蔗糖糖蜜的利用提供了宝贵的菌种资源。

附图说明

图1是驯化前菌株HBUT-L和驯化后菌株HBUT-SL基因组的比较。

图2是驯化前菌株HBUT-L和驯化后菌株HBUT-SL基因组glpD基因的比较。

图3是ptrc99a-glpD质粒构建图谱。

菌株保藏信息：

(1)大肠杆菌HBUT-SL，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2022年09月20日；分类命名：Escherichia coli HBUT-SL；保藏编号：CCTCC NO：M 20221463。

(2)大肠杆菌HBUT-SLE，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2022年09月20日；分类命名：Escherichia coli HBUT-SLE；保藏编号：CCTCC NO：M 20221464。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中大肠杆菌HBUT-SL和大肠杆菌HBUT-SLE，申请人于2022年09月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221463和CCTCC NO：M20221464，其分类命名为Escherichia coli HBUT-SL和Escherichia coli HBUT-SLE。

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1工程菌的构建

出发菌株为本实验室保藏大肠杆菌HBUT-L，其NCBI access number为CP104442-CP104443(记载于文献Engineering and adaptive evolution of Escherichia coli Wfor L-lactic acid fermentation frommolasses and.corn steep liquor withoutadditional nutrients,Bioresource Technology,2013,184:394-400)。该菌已敲除编码富马酸还原酶的基因frdBC，编码乙醇脱氢酶的基因adhE，编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta，编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因pflB，编码蔗糖启动子抑制基因cscR，编码乙醛脱氢酶的基因aldA，编码D-乳酸脱氢酶的基因ldhA，同时插入来源于乳酸片球菌Pediococcusacidilactici的编码L-乳酸脱氢酶的基因ldhL。

实施例2工程菌的驯化

过夜培养，然后挑选平板上长好的4个HBUT-L菌落接种于含2％蔗糖的50mL的无机盐培养基中，37℃200r/min培养12h后，按5％接种量转入到装有含10％蔗糖的3L无机盐培养基中，发酵条件为：37℃搅拌桨转速200r/min。通过流加22％(w/w)的Ca(OH)₂控制发酵液pH值为6.5。发酵24h后，按10％接种量转入另外一罐装有含有10％蔗糖的3L新鲜的无机盐培养基中，如此重复发酵转接6代。每个批次发酵液定时取样，并测定发酵72h的乳酸含量和生物量，结果见表1。最后一次转接的发酵液，用无菌水稀释后涂在LB平板上分离单菌落，随机选取单菌落给予命名，对蔗糖利用效果最好的菌株命名为HBUT-SL。其中无机盐培养基配方为：每升培养基含3.5g KH₂PO₄、5.0g K₂HPO₄、3.5g(NH₄)₂HPO₄、0.25g MgSO₄·7H₂O、15mgCaCl₂·2H₂O、0.5mg硫胺素、1mL微量元素母液。微量元素母液组分为：在0.1mol/L的HCl中每升加入1.6g FeCl₃、0.2g CoCl₂·6H₂O、0.1g CuCl₂、0.2g ZnCl₂·4H₂O、0.2g NaMoO₄、0.05gH₃BO₃。

表1驯化过程中各个批次发酵液产乳酸结果(发酵72h结果)

实施例3驯化前后大肠杆菌工程菌基因组差异

驯化后基因序列及工程菌遗传特性的确定按如下步骤进行：

(1)对驯化出来且能高效利用蔗糖产L-乳酸的菌株(实施例2中的HBUT-SL)连同驯化前的菌株(实施例1中的HBUT-L)送相关公司进行基因组二代及三代测序。基因组重测序由深圳华大基因科技有限公司和北京擎科生物科技有限公司武汉分公司完成，序列分析的参考序列为ATCC 9637的基因组序列(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/008/868/305/GCF_008868305.1_ASM886830v1/)，测序深度为100倍。

(2)基因组注释工作已经由测序公司采用注释选用prokka 1.14.6(https://github.com/tseemann/prokka)完成，并生成了相应的gbk文件。

(3)注释完成后使用Mauve进行基因组序列比对，找出差异基因。优选地，选用Mauve(版本2.3.0，win8系统选用32位java版本1.8.0_131)。基因组比对的结果见表2。

表2驯化前后菌株基因组差异基因的比对

找出与蔗糖利用、转运或者糖酵解相关基因，发现HBUT-SL比HBUT-L多了一拷贝甘油-3-磷酸脱氢酶glpD基因。相关基因组的对比见图2。

同样方法对两个基因组进行SNP分析，未能找出与蔗糖利用、转运或者糖酵解相关基因发生碱基突变或者缺失。

实施例4 glpD基因过表达

推测glpD基因能促进糖酵解，从而减少蔗糖利用基因cscK和cscA所编码相关酶的产物抑制作用，从而促进了蔗糖进一步的利用，基于此，可通过表达glpD基因提高大肠杆菌利用蔗糖产乳酸能力。具体步骤如下：

(1)首先扩增来自HBUT-L的glpD基因并将其克隆到ptrc99a质粒上，得到新的质粒ptrc99a-glpD。

以1μL的质粒ptrc99a作为PCR扩增的模板，表3中ptrc99a-P1(序列SEQ ID NO.1所示)和ptrc99a-P1(序列SEQ ID NO.2所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物切胶回收即得线性化的质粒ptrc99a。

采用菌落PCR的方法，沾取少量HBUT-L菌落作为PCR扩增的模板，以表3中glpD-P1(序列SEQ ID NO.3所示)和glpD-P2(序列SEQ ID NO.4所示)为引物进行PCR扩增，PCR产物回收试剂盒回收。

将ptrc99a载体片段和glpD基因片段按照摩尔比1:3进行添加，使用GeneArt^TMGibson Assembly EX克隆试剂盒进行无缝克隆，反应产物通过热击法化转入DH5α感受态细胞，细胞复苏后，涂布于含50mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体平板，37℃培养16h后挑取单菌落对克隆子进行验证。以表3中glpD-P3(序列SEQ ID NO.5所示)和glpD-P4(序列如SEQ IDNO.6所示)为验证引物，进行菌落PCR验证。验证成功的菌落进一步提取质粒送测序公司测序验证，验证正确后的质粒命名为ptrc99a-glpD，其序列如SEQ ID NO.7所示。

(2)将质粒ptrc99a-glpD通过化学转化的方法转化到大肠杆菌HBUT-SL。采用CaCl₂法制备大肠杆菌HBUT-SL感受态细胞，将ptrc99a-glpD质粒采用热击法化转入大肠杆菌HBUT-SL感受态细胞中，将复苏好的菌液涂布于含有50mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中，37℃培养箱培养16h。挑取单菌落在含有50mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中划线传代培养，菌株命名为HBUT-SLE。

表3 glpD基因克隆使用相关引物

实施例5工程菌发酵L-乳酸结果比较

评价大肠杆菌利用蔗糖产L-乳酸能力时，在发酵罐中比较HBUT-L、HBUT-SL和HBUT-SLE利用蔗糖产L-乳酸的能力。采用如下发酵方法：在含50mL 2％蔗糖无机盐培养基中，分别接种入平板上的6个大肠杆菌菌落，37℃200r/min培养12h后，按10％接种量转入到装有含10％蔗糖和0.5％玉米浆干粉的3L无机盐培养基中，发酵条件为：37℃搅拌桨转速200r/min。通过流加22％(w/w)的Ca(OH)₂控制发酵液pH值为6.5，发酵72h。其中，对于有ptrc99a的质粒的菌株HBUT-SLE，所有培养基中加入50mg/L氨苄青霉素，同时发酵6h后加入0.1M IPTG进行诱导。

发酵液取样和L-乳酸的检测方法为：菌体浓度用紫外分光光度计测定波长600nm下的OD值。葡萄糖或蔗糖和有机酸采用高效液相色谱法分析，色谱仪为waters e2695，色谱柱为welch Xtimate Sugar-H(7.8×300mm，8μm)，流动相为5mmol/L H₂SO₄，流速1mL/min，柱温45℃，检测器为PDA检测器(waters 2998)，检测波长210nm。乳酸光学纯度采用高效液相色谱分析，色谱仪为waters e2695，色谱柱为手性柱SCAS Sumichiral OA-500(4.6×150mm，5μm)，流动相为加入5％异丙醇的2mmol/L CuSO₄，流速1mL/min，柱温40℃，检测器为PDA检测器(waters 2998)，检测波长254nm。

从表4可以看出，获得的驯化大肠杆菌菌株HBUT-SL，在含10％蔗糖和0.5％玉米浆干粉的无机盐培养基培养时，L-乳酸产量为90.85g/L，发酵时间为36h，平均生产强度为2.52g·L^-1h^-1，最大生物量为19.55，其乳酸产量、平均生产强度和最大生物量较未驯化的大肠杆菌HBUT-L分别提高到1.10、1.83和2.02倍，发酵时间缩短了24h。进一步根据基因组比对的结果，在HBUT-SL基础上过表达glpD基因得大肠杆菌HBUT-SLE，L-乳酸产量为95.30g/L，发酵时间为24h，平均生产强度为3.97g·L^-1h^-1，最大生物量为16.28，其乳酸产量、平均生产强度和最大生物量较未驯化的大肠杆菌HBUT-L分别提高到1.15、2.88和1.68倍，发酵时间缩短了36h。

表4利用10％蔗糖发酵产乳酸结果

注：发酵周期为从接种开始至发酵液残糖不能检出所需的发酵时间。

综上可知，本发明克服了现有菌株利用蔗糖产L-乳酸效率不高的现状，提供一种通过适应性驯化结合反向生物学手段得到高效利用蔗糖大肠杆菌工程菌的方法及相应菌株，为利用低成本的蔗糖糖蜜资源生产L-乳酸提供了一条新的思路。

应理解，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌，其特征在于：所述的大肠杆菌为下述大肠杆菌中的一种：

(1)保藏编号为CCTCC NO：M 20221463的大肠杆菌HBUT-SL；

(2)保藏编号为CCTCC NO：M 20221464的大肠杆菌HBUT-SLE。

2.权利要求1所述的大肠杆菌在生产L-乳酸中的应用。

3.一种生产L-乳酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求1所述的大肠杆菌采用含蔗糖和玉米浆干粉的培养基培养。

4.一种提高大肠杆菌利用蔗糖产L-乳酸能力的方法，其特征在于：所述的方法为使产L-乳酸的大肠杆菌过表达glpD基因。

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