CN1800364A - 产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与应用。其目的是提供一株产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与其在生产1，3－丙二醇和/或2，3－丁二醇中的应用。该工程菌是通过同源重组的方法将产1，3－丙二醇和/或2，3－丁二醇的野生型菌株中的乳酸脱氢酶基因沉默后获得的工程菌。所述产1，3－丙二醇和/或2，3－丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和沙雷氏菌属的菌株。本发明将在1，3－丙二醇和2，3－丁二醇的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

Description

产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与应用，特别是涉及产乳酸途径缺失的工程菌及其构建方法与其在生产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇中的应用。

背景技术

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂制备油墨、印染、涂料、药物、润滑剂、抗冻剂等，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯类以及环状化合物的生产中具有潜在应用价值的单体。已知有多种化学方法能够生产1，3-丙二醇，例如，用环氧乙烷为原料经催化加氢再酰化的方法可以合成出1，3-丙二醇；用丙烯醛水合得到3-羟基丙醛，3-羟基丙醛经催化加氢可生成1，3-丙二醇。虽然这些方法目前已用于工业生产，但这些方法需要高温、高压和复杂的贵重金属催化剂才能实现，不仅投资大，分离提纯困难，还会造成严重的环境污染。

2，3-丁二醇可作为燃料，也可作为有机溶剂或化工原料用于合成其它化学品，例如香料物质二乙酰和应用相当广泛的化工原料甲乙酮。由于2，3-丁二醇结构特殊，化学法合成2，3-丁二醇成本很高，一直没有实现工业化生产，因而其用途也没有得到充分开发，但由于具有良好的应用前景，目前国际上对2，3-丁二醇的需求日益增高。尽管发酵法生产2，3-丁二醇水平相对较高，但也没有实现工业化。

早在1881年，Freund就发现巴斯德梭菌能发酵甘油产生1，3-丙二醇。至今所发现的1，3-丙二醇生产者均为细菌，主要有肠道细菌中的肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌及成团肠杆菌，梭菌属的丁酸梭菌和巴斯德梭菌及乳杆菌属的短乳杆菌和布氏乳杆菌，它们只能利用甘油(而不能利用糖类等廉价碳源)产生1，3-丙二醇。在产生1，3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应，氧化途径中的产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH₂；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3-丙二醇。氧化途径中生成丙酮酸的反应在各菌中是相同的，丙酮酸的去向则因微生物种类而异。在肠道细菌中，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又会分解为CO₂和H₂；乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的ATP，而在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力；丙酮酸也可能转化为2，3-丁二醇；此外，肠道细菌发酵甘油的产物中还有乳酸和琥珀酸，生成乳酸的过程要消耗1个还原力，而生成琥珀酸的过程要消耗2个还原力。在丁酸梭菌中，有两个典型的氧化产物：乙酸和丁酸。丁酸在由两分子乙酰CoA氧化2个NADH₂后的一连串反应中生成，并伴随着ATP的产生。在巴斯德梭菌中丁醇是主要的氧化产物，生成丁醇的过程要消耗4个还原力，另外，也有少量的乙醇产生。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B₁₂的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由1，3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1，3-丙二醇，此过程消耗一分子还原力。

能够产生2，3-丁二醇的菌种主要有克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、气单胞菌属和沙雷氏菌属。肺炎克雷伯氏菌多粘芽孢杆菌是最具工业化潜力的。它们可以利用糖类经丙酮酸、α-乙酰乳酸、3-羟基丁酮并最终转化为2，3-丁二醇，此过程消耗一分子还原力。

在细菌发酵甘油产生1，3-丙二醇的过程中，细胞的生长受到底物甘油和多种产物的抑制作用。在肺炎克氏杆菌中，副产物乳酸最多。野生型肺炎克氏杆菌发酵甘油产生1，3-丙二醇的过程中乳酸产量可达40g/L以上，如此大量乳酸的生成不但对细胞生长不利，还会造成底物甘油的浪费。由于产生乳酸的途径会争夺还原力，乳酸的产生必然导致1，3-丙二醇产量降低。作为肺炎克氏杆菌发酵甘油产生1，3-丙二醇的副产物，2，3-丁二醇对细胞生长和1，3-丙二醇产生的副作用远远小于其它副产物，而其价值却远远大于其他副产物，因此减少其它副产物产量，使2，3-丁二醇成为氧化途径的主要产物是非常合理有效的途径。

为了提高甘油的转化率及1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的产量，有人采取菌种筛选、菌种化学诱变、优化培养基和发酵条件等方法，这些方法虽然对甘油转化率及1，3-丙二醇和2，3-丁二醇产量有所提高，但无法从根本上解决多种副产物积累对细胞的毒害作用对1，3-丙二醇和2，3-丁二醇生产所带来的巨大负面影响。

发明内容

本发明的目的是提供产乳酸途径缺失的工程菌。

本发明所提供的产乳酸途径缺失的工程菌，是通过同源重组的方法将产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)沉默后获得的工程菌。

所述可用于生产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和沙雷氏等菌属的菌株。

本发明的第二个目的是提供一种上述产乳酸途径缺失的工程菌的构建方法。

本发明所提供的构建方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增乳酸脱氢酶基因的部分同源序列；

2)将步骤1扩增的乳酸脱氢酶基因的部分同源序列导入到双亲本杂交供体菌株中；

3)将步骤2)获得的携带有乳酸脱氢酶基因的部分同源序列的重组菌与产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株进行双亲本杂交，经抗性筛选后得到产乳酸途径缺失的工程菌。

根据同源重组的原理，所述步骤1)扩增的乳酸脱氢酶基因的部分同源序列是该基因的哪一部分序列并不重要，只要是其同源的序列即可，如以产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株的基因组DNA为模板，经由序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID№：2或是由序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：4组成的引物对PCR扩增的序列。

所述步骤2)中乳酸脱氢酶基因的部分同源序列可通过含有所述乳酸脱氢酶基因的部分同源序列的自杀载体导入到用于双亲本杂交的供体菌株中，所述自杀载体可为pGPCm(赵德华、李季伦.肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性.科学通报，2004，49(15)：1512-1518)、pGP704(Miller VL and Mekalanos JJ.Anovel suicide vector and its use in construction of insertion mutations：Osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in VibrioCholerae requires toxR.J Bacteriol 1988，170(6)：2575-2583.)、pUX19(ZhangYP，et al.Functional Characterization of Three GlnB Homologs in thePhotosynthetic Bacterium Rhodospirillum rubrum：Roles in Sensing Ammonium andEnergy Status.J Bacteriol 2001，183(21)：6159-6168.)、pSUP202(Simon R，PrieferU，Pühler A(1983)A broad-host range mobilization system for in vivo geneticengineering：transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria.Biotechnology1：784-791.)、pJQ200SK(Quadt，J.，and M.F.Hynes.1993.Versatile suicidevectors which allow direct selection for gene replacement in Gram-negativebacteria.Gene 127：15-21.)或pPHU281(Hübner，P.，B.Masepohl，W.Klipp，andT.A.Bickle.1993.nif gene expression studies in Rhodobacter capsulatus：ntrC-independent repression by high ammonium concentrations.Mol.Microbiol.10：123-132.)等。

以pGPCm为出发载体，构建的携带有乳酸脱氢酶基因部分同源序列的自杀载体为pGP-ldhA或pGP704-ldhAk12。

携带有乳酸脱氢酶基因部分同源序列的自杀载体可通过使用热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化宿主菌。

所述步骤2)中用于双亲本杂交的菌株为含有λpir的大肠杆菌菌株，如大肠杆菌SM10(λpir)(Miller VL and Mekalanos JJ.A novel suicide vector and its usein construction of insertion mutations：Osmoregulation of outer membraneproteins and virulence determinants in Vibrio Cholerae requires toxR.JBacteriol 1988，170(6)：2575-2583.)、S17-1(λpir)(Simon R，Priefer U，PühlerA(1983)A broad-host range mobilization system for in vivo genetic engineering：transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria.Biotechnology 1：784-791.)等。

通过双亲杂交，使乳酸脱氢酶基因的部分同源序列与产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的目的菌株发生同源重组，从而使产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脱氢酶基因沉默。

所述可用于生产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属和沙雷氏等菌属的菌株。其中，肺炎克氏杆菌产乳酸最多，因此本发明的方法也适用于其它的产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株。

本发明利用同源重组的方法使产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脱氢酶基因沉默，从而得到产乳酸途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的发酵生产，不产生乳酸，使得副产物对细胞的毒害作用大大减少；另外，由于副产物种类减少，也简化了后提取工艺。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵40小时，1，3-丙二醇浓度可达50g/L以上，2，3-丁二醇浓度可达40g/L以上；发酵60小时，1，3-丙二醇浓度可达80g/L以上，2，3-丁二醇浓度可达70g/L以上。本发明将在1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的工业化生产中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。

说明书附图

图1为载体pGPCm的物理图谱

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，引物合成工作由上海生工完成，甘油百分比浓度为质量百分比浓度，硫酸铵百分比浓度为质量百分比浓度。

实施例1、产乳酸途径缺失的工程菌的构建

一、乳酸脱氢酶基因ldhA部分序列的克隆

根据乳酸脱氢酶基因ldhA完整的DNA序列(GenBank号：WUGSC_573)设计引物PCR扩增其部分同源序列，引物序列如下：

primer1(上游引物)：5’-ACGGTTGCGAACGGTATGTA-3’(序列表中SEQ ID №：1)

primer2(下游引物)：5’-AGTGGTCTCCGAAATGCTGA-3’(序列表中SEQ ID №：2)

以野生型肺炎克氏杆菌基因组DNA为模板，在引物primer1和primer2的引导下，PCR扩增乳酸脱氢酶基因ldhA的部分序列，PCR扩增条件为：先94℃5min；然后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约800bp的目的片段，将其克隆入载体pGEM-T easy(TaKaRa公司)中，将重组产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，经酶切获得了805bp的酶切片段，表明获得了插入序列正确的重组载体，命名为pT-ldhA。

二、乳酸脱氢酶基因ldhA自杀载体pGP-ldhA的构建

用限制性内切酶EcoR I酶切pT-ldhA质粒，回收并纯化步骤一扩增的长度为805bp的ldhA的部分片段，再将其与经EcoR I酶切的载体pGPCm(其物理图谱如图1所示)用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌SM10(λpir)感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，得到乳酸脱氢酶基因ldhA的自杀载体，命名为pGP-ldhA。

三、肺炎克氏杆菌产乳酸途径缺失突变株的构建

将携带有载体pGP-ldhA的大肠杆菌SM10(λpir)(供体菌)和野生型肺炎克氏杆菌(受体菌)进行双亲本杂交，具体方法为：在含有氯霉素的LB液体培养基中过夜培养供体和受体菌；供体菌和受体菌按3∶1比例混合于10mM的MgSO₄溶液中，过滤，将滤膜置于LB平板上，37℃培养8-12小时；用10mM的MgSO₄溶液洗下长在滤膜上的菌苔，梯度稀释后涂布于氯霉素抗性平板上，37℃培养进行筛选。最终得到具有氯霉素(Cm)抗性的重组菌株，即为产乳酸途径被阻断的肺炎克氏杆菌突变株。

实施例2、产乳酸途径缺失的工程菌的构建

根据大肠杆菌K12菌株ldhA基因(GenBank号：U36928)设计如下引物：

primer3(上游引物)：5’-CGAGTCCTTTGGCTTTGAGC-3’(序列表中SEQ ID №：3)

primer4(下游引物)：5’-TCAGTGCTTCTGCTGTCAGG-3’(序列表中SEQ ID №：4)

以大肠杆菌K12菌株基因组DNA为模板，在引物primer3和primer4的引导下，PCR扩增大肠杆菌K12菌株乳酸脱氢酶基因ldhA的部分序列，PCR扩增条件为：先94℃5min；然后94℃1min，58℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收得到854bp大小的片段，将此片段连接入自杀载体pGP704中得到乳酸脱氢酶基因ldhA的自杀载体，命名为pGP704-ldhAk12，将此重组质粒转化大肠杆菌SM10(λpir)感受态细胞，筛选阳性转化子，用携带自杀质粒pGP704-ldhAk12的大肠杆菌SM10(λpir)与大肠杆菌K12菌株进行双亲本杂交，选择具有氨苄青霉素(Ap)抗性的菌株，即为产乳酸途径被阻断的大肠杆菌K12菌株突变株。

实施例3、产乳酸途径缺失的工程菌的乳酸脱氢酶的活性检测

对实施例1和实施例2构建的产乳酸途径缺失的工程菌进行乳酸脱氢酶的活性检测，以野生型菌株为对照，具体方法包括以下步骤：

(1)将工程菌接种于200mL rich broth培养基(每L水中含有胰蛋白胨10g，酵母粉1g，NaCl 5g，pH7.0，121℃灭菌30min)中，在37℃下振荡培养12小时，离心收集菌体；

(2)用100mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮洗涤菌体2次；

(3)用2.5mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮菌体；

(4)超声波破碎菌体；

(5)1270g离心1小时，取上清测定酶活，测定方法为用BECKMAN DU640紫外可见分光光度计测定OD_340nm在1min内的变化，其中乳酸脱氢酶反应体系包含：NADH0.33mM，丙酮酸钠30mM，酶液20μl，用磷酸缓冲液补至1mL。加入丙酮酸钠开始反应。

结果实施例1和实施例2构建的其中4株产乳酸途径缺失突变株的乳酸脱氢酶活性最低的为野生型菌株的3.85％，最高的为野生型菌株的6.92％，表明获得了乳酸脱氢酶活性几乎丧失的工程菌，可用于发酵生产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇。

实施例4、产乳酸途径缺失的工程菌的发酵

(1)种子培养基配方(1L)：K₂HPO₄(磷酸氢二钾)3.4g，KH₂PO₄(磷酸二氢钾)1.3g，(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)2.0g，MgSO₄·7H₂O(硫酸镁)0.2g，CaCl₂·2H₂O(氯化钙)0.02g，yeast extract(酵母粉)1.0g，sucrose(蔗糖)20g，Fe solution(铁溶液)2.0mL，trace element solution(微量元素溶液)1.0mL。

(2)发酵培养基配方(1L)：K₂HPO₄(磷酸氢二钾)1.0g，KH₂PO₄(磷酸二氢钾)0.5g，(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)2.0g，MgSO₄·7H₂O(硫酸镁)0.2g，CaCl₂·2H₂O(氯化钙)0.02g，yeast extract(酵母粉)1.0g，glycerol(甘油)20g，Fe solution(铁溶液)1.0mL，trace element solution(微量元素溶液)1.0mL。

铁溶液(1L)：FeSO₄·7H₂O 5g，HCl(37％)4mL。

微量元素溶液(1L)：ZnCl₂ 70mg，CuCl₂·2H₂O 20mg，MnCl₂·4H₂O 0.1g，NiCl₂·6H₂O25mg，H₃BO₃ 60mg，Na₂MO₄·2H₂O 35mg，CoCl₂·2H₂O 0.2g，HCl(37％)4mL。

一、种子培养

从平板上挑取经实施例3检测的产乳酸途径缺失的肺炎克氏杆菌突变菌株的单菌落，接入到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，37℃、180r/min培养14h，使OD_600nm达3.0以上。

二、发酵

按10％接种量将步骤一培养的种子液接入装有4L发酵培养基的NBS公司7.5L自动发酵罐中，发酵过程中补加80％甘油和40％硫酸铵，并用氢氧化钾控制pH值为7.0。分别于发酵40和60小时后取样，测定发酵产物中1，3-丙二醇浓度和2，3-丁二醇的浓度。结果发酵40小时，1，3-丙二醇浓度可达50g/L以上，2，3-丁二醇浓度可达40g/L以上，发酵60小时，1，3-丙二醇浓度可达80g/L以上，2，3-丁二醇浓度可达70g/L以上，在此过程中没有乳酸产生，表明本发明构建的工程菌可用于1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的发酵生产。

                         序列表

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

acggttgcga acggtatgta                                        20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agtggtctcc gaaatgctga                                         20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cgagtccttt ggctttgagc                                  20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tcagtgcttc tgctgtcagg                                  20

Claims (10)

1、产乳酸途径缺失的工程菌，是通过同源重组的方法将产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脱氢酶基因沉默后获得的工程菌。

2、根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属和沙雷氏菌属的菌株。

3、一种产乳酸途径缺失的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增乳酸脱氢酶基因的部分同源序列；

2)将步骤1扩增的乳酸脱氢酶基因的部分同源序列导入到双亲本杂交供体菌株中；

3)将步骤2)获得的携带有乳酸脱氢酶基因的部分同源序列的重组菌与产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株进行双亲本杂交，经抗性筛选后得到产乳酸途径缺失的工程菌。

4、根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中乳酸脱氢酶基因的部分同源序列是以产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株的基因组DNA为模板，经由序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2或是由序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：4组成的引物对PCR扩增的序列。

5、根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中乳酸脱氢酶基因的部分同源序列通过含有所述乳酸脱氢酶基因的部分同源序列的自杀载体导入到用于双亲本杂交的供体菌株中；所述自杀载体为pGPCm、pGP704、pUX19、pSUP202、pJQ200SK或pPHU281。

6、根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述携带有乳酸脱氢酶基因部分同源序列的自杀载体为pGP-ldhA或pGP704-ldhAk12。

7、根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)用于双亲本杂交的供体菌株为含有λpir的大肠杆菌菌株，包括大肠杆菌SM10(λpir)、S17-1(λpir)。

8、根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述用于双亲本杂交的菌株为大肠杆菌SM10(λpir)。

9、根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中用于生产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和沙雷氏菌属的菌株。

10、权利要求1所述的产乳酸途径缺失的工程菌在生产1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇中的应用。