CN101381740A - 用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种琥珀酸高产基因工程菌。本申请还公开了上述重组质粒以及基因工程菌的制备方法。本申请同时公开了上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。使用本发明的重组质粒构建出来的基因工程菌的稳定性高，相比较原始菌株BL21(DE3)，生长速率提高，在加入不同浓度诱导剂，即乳糖或IPTG时，在完全厌氧或先有氧积累菌体量，再无氧进行酸发酵的双阶段发酵时琥珀酸产量都有很大提高。

Description

用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途

技术领域

本发明属于生物工程领域。本发明涉及一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种琥珀酸高产基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌的制备方法。本申请同时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。

背景技术

能源和环保是当今世界面临的重要问题。琥珀酸作为一种生物材料，是最好的石油代替品之一。

琥珀酸(succinic acid)的学名为丁二酸(butanedioic acid)，是线性饱和二元羧酸，可以作为中间化工产品，生成1，4一丁二酯、四氢呋喃、γ-丁内酯和其他四碳化合物。随着催化工艺的发展，琥珀酸还可以转化为更多的化工产品和医药产品，如由琥珀酸氢化生成的丁二醇可以羧化生成己二酸，合成可生物降解的聚合物材料琥珀酸聚丁酸酯(PBS)等，这就使得琥珀酸的市场以平均每年6-10％的速率增长，预计在未来十多年间琥珀酸的世界市场将由1997年的1.5×10⁴吨扩增为大约2.75×10⁶吨。

目前，大部分工业用琥珀酸还是通过化学合成的方法生产，化学合成法生产琥珀酸的原料苯为石油化工产品，并且马来酸酐氢化生成琥珀酸酐再水合生成琥珀酸的转化过程费用高，会造成大量的污染。随着人们环保意识和可持续发展意识的提高，发酵法生产琥珀酸成了新的研究热点。一旦实现了琥珀酸发酵大规模生产，就可以琥珀酸取代石油化工产品苯及基于石化中间品的多种商品，使得在生产和消耗苯及其250种衍生物时引起的污染大大降低。琥珀酸发酵消耗1mol葡萄糖的同时固定1mol CO₂，消耗了温室效应气体，因此，发酵法生产的琥珀酸将是一种很好的绿色平台化学品。然而，采用一般厌氧瘤胃菌株发酵琥珀酸难度大，底物转化率低，产品价格偏高，因此，迫切需要寻找或构建一种能代谢多种廉价碳源，发酵条件简单，琥珀酸高产的新菌株。

与乳酸、乙醇等有机物的发酵研究相比，琥珀酸发酵研究起步较晚，文献报道也相对较少。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的菌种包括产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌和经基因改造的大肠杆菌。这三种菌都是通过混合酸发酵产能，发酵产物为乙酸、乳酸、琥珀酸等。但是，琥珀酸厌氧螺菌要求绝对厌氧环境，培养条件苛刻。并且，在低二氧化碳水平下，产琥珀酸厌氧螺菌发酵葡萄糖以产乳酸为主要产物，而产琥珀酸放线杆菌则发酵葡萄糖以产乙醇为主要产物；只有在高CO₂浓度的条件下进行发酵才以琥珀酸为主要产物，这就需要额外的供气设备，增加产品成本。相比而言，大肠杆菌培养条件简单，菌株本身有多条琥珀酸生产途径，具有代谢灵活性，易于改造。对大肠杆菌琥珀酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为底物的混合酸发酵中，琥珀酸生成是通过三羧酸循环的还原臂生成的，由该途径产生1摩尔琥珀酸伴随着1摩尔二氧化碳的固定。该途径的关键反应是将三碳中间物:磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为四碳化合物:草酰乙酸(OAA)。草酰乙酸随后被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸(malate)，由富马酸合酶生成富马酸，最后由富马酸裂解酶生成琥珀酸。大肠杆菌中催化PEP羧化的酶是PEP羧化酶(PEPC，Ppc)。同时，在某些情况下，乙醛酸旁路及其它分枝代谢途径也参与到琥珀酸代谢中，使琥珀酸的产生更具灵活性。PEP羧化酶催化反应分为三步(如图1)，自由能为-30KJmol^-1，反应是不可逆的。第一步反应为碳酸氢根和PEP反应生成carboxyphosphate和enolate，第二步反应为催化第一步产物生成磷酸根、二氧化碳和enolate，第三步反应为催化二氧化碳和enolate生成OAA。可以看出，最初二氧化碳的固定形式是碳酸氢根离子，并且反应同化了1摩尔二氧化碳。碳酸酐酶(CA:carbonicanhydrase)催化二氧化碳形成碳酸氢根的形式，这预示着在大肠杆菌体内扩增碳酸苷酶将有助于提高二氧化碳的固定速率，有利于增加三羧酸循环的碳流供应，有利于提高琥珀酸的产量。

目前国内外对大肠杆菌生产琥珀酸的代谢网络主要进行的改造有:1、过量表达大肠杆菌的Ppc酶或表达异源的Rhizobium etli pyc酶；2、使Pf1酶(丙酮酸-甲酸裂解酶)或Ldh酶(乳酸脱氢酶)失活，以减少碳源流向其它有机酸；3、过量表达Malic酶(苹果酸酶)。(Applied and EnvironmentalMicrobiology，1996，62(5):1808；Applied and EnvironmentalMicrobiology，2000，66(5):1844；Microbiology，1997(143):187；Applied and Environmental Microbiology，1997，63(7):2695)。这些改造的出发点都是针对PEP的利用，即来源于葡萄糖的碳流的利用；但是，碳流的另一个来源:二氧化碳，也应该受到同样的重视，因为琥珀酸碳骨架的一半是来源于二氧化碳的。PEPC不能直接利用二氧化碳，CO₂必须转变为HCO₃ ^-的形式才能被利用，且HCO₃ ^-的存在对PEPC酶活有底物促进作用。虽然CO₂作外非极性小分子极易透过质膜，但CO₂向外渗透形成的溢出通量远远超过转运系统所能达到的输入通量，并且细胞质内CO₂转化为HCO₃ ^-的反应受碳酸酐酶(CA)催化的

的制约，这就使得PEPC酶催化PEP的反应受到HCO₃ ^-浓度的制约。而在一般细菌培养液中，CO₂自发形成HCO₃ ^-穿膜的量是很小的，因此常在培养基中添加碳酸氢盐提供额外的HCO₃ ^-。

蓝藻属于原核生物，而本身可以利用CO₂进行光合自养，是物种进化历程的一个中间体。生态观测的数据表明，蓝藻在富营养化水体中占优势可能与它们拥有CO₂浓缩机制有关。Fridlyand L等认为CO₂可能通过被动扩散进入细胞，而后通过包括碳酸酐酶(CA)的组分将CO₂转变为HCO₃ ^-，这一步骤导致蓝藻细胞质内Ci浓度可达25～60mmol.L-1。(Biosystems，1996，37:229)。这就为蓝藻自身进行光合碳同化和PEPC催化生成OAA的三羧酸循环回补代谢途径提供了丰富的碳源。这说明蓝藻的CA酶比起一般的原核生物活性更高，在改造大肠杆菌生产琥珀酸时可以发挥更大功效。

虽然大肠杆菌自身亦能产生琥珀酸，但产量相对低。国外虽然已经有过一些琥珀酸高产基因工程菌构建的报道，但主要是以琥珀酸放线杆菌或野生型的大肠杆菌K12为出发菌株，采用自发突变的形式筛选或提高Ppc酶或Pyc酶的拷贝数，并且已经申请了专利保护。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种琥珀酸高产基因工程菌。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌的制备方法。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。

为了充分利用大肠杆菌本身具有多条琥珀酸代谢途径的优势，同时发挥外源基因提高二氧化碳利用率的作用，本发明旨在提高本实验室保存的大肠杆菌BL21(DE3)的琥珀酸产量。BL21是常用的大肠杆菌表达菌株，一般配合以强表达载体来进行目的基因的强表达。本发明提供的重组大肠杆菌BCCA111，是含有多拷贝的携带完整蓝藻鱼腥藻(cyanobacterium Anabaenasp.7120)碳酸酐酶基因(CA)的重组质粒的基因工程菌株BL21(DE3)。

综上，本发明的基本技术构思是:将蓝藻的碳酸酐酶基因克隆到质粒载体PET-21a上，再将重组后的质粒转入BL21(DE3)中，以达到通过提高蓝藻碳酸酐酶基因的拷贝数从而提高大肠杆菌BL21(DE3)的CO₂固定能力，提高琥珀酸产量的目的。

针对本发明的发明目的，本发明提供如下技术方案:

一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是携带有蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp.7120碳酸酐酶基因的pMD19-T载体(pMD-ca2)。

优选地，该重组质粒携带完整的包括蓝藻鱼腥藻cyanobacteriumAnabaena sp.7120碳酸酐酶基因上下游35个碱基在内的片段。

另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是携带有蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp.7120碳酸酐酶基因的pMD19-T载体(pMD-ca1)。

优选地，该重组质粒是携带完整的包括蓝藻鱼腥藻cyanobacteriumAnabaena sp.7120碳酸酐酶基因编码序列的pMD19-T载体。

另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是通过将前述的重组质粒pMD-ca1与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和SalI双酶切，将切下的蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp.7120碳酸酐酶基因片段连接到质粒pET-21a中而得到的(pMD-cyanoca)。

优选地，所述重组质粒是携带有含有多拷贝的完整蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp.7120碳酸酐酶基因的pET21a(+)载体。

另一方面，本发明提供一种琥珀酸高产基因工程菌，所述工程菌是通过将前述任一重组质粒转入原始菌株大肠杆菌BL21(DE3)中而得到的。

另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-ca2的构建方法，所述方法包括:

首先设计引物:ca1:5’—CAACCGCAGGGAAATGAG—3’，ca2:5’—CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT—3’；

以蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp.7120的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个约830bp的片段，其具体序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，用于构建所述的重组质粒pMD-ca2，830bp中包含CA基因上下游35个碱基在内的序列。

经测序证实其包含具体序列如序列表中SEQ ID NO:2所示的鱼腥藻7120碳酸酐酶的基因片段(795bp)；

纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到所述重组质粒。

另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-ca1的构建方法，所述方法包括:

利用设计的引物ca3:5’—AACCGCGGATCCATGAGTAGTAC—3’，划线处为BamHI酶切位点；ca4:5’—GGACAGAGTCGACTTAAATGGCTTC—3’，划线处为SalI酶切位点；以质粒pMD-ca2为模板，进行PCR扩增，得到一个约795bp的片段，其具体序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其为CA基因序列795bp，用于构建所述的重组质粒pMD-ca1和下述的重组质粒pET-cyanoca，经测序证实为碳酸酐酶基因的编码序列，连接到pMD-T载体，得到质粒pMD-ca1。

另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pET-cyanoca的构建方法，所述方法包括:将前述方法得到的质粒pMD-ca1与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和SalI双酶切，将鱼腥藻7120碳酸酐酶的基因片段插入质粒pET-21a的酶切位点处，构建出所述重组质粒。

另一方面，本发明提供一种所述琥珀酸高产基因工程菌的制备方法，将前述任一重组质粒转入原始菌株大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到所述基因工程菌。

另一方面，本发明提供一种前述任一重组质粒在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的应用。

另一方面，本发明提供一种所述基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的应用。

另一方面，本发明提供一种使用所述基因工程菌来发酵多种碳源来生产琥珀酸的方法，所述方法包括在生长过程中生物量的积累及加入不同的诱导剂时，在完全厌氧或先有氧积累菌体量，再无氧进行酸发酵的双阶段培养而生产琥珀酸。

优选地，所述碳源为葡萄糖，和/或所述诱导剂为乳糖和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)。

在本发明的一个优选的实施方式中，将pMD-ca1质粒与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和SalI双酶切，将切下的小片段连接到质粒pET-21a中，得到重组质粒pET-cyanoca；

在本发明的一个优选的实施方式中，提供一种琥珀酸高产基因工程菌，其以蓝藻(cyanobacterium Anabaena sp.7120)的总DNA为模板，用引物ca1和ca2扩增，得到完整的包括CA基因上下游35个碱基在内的片段，与pMD19-T质粒载体连接，得到重组质粒pMD-ca2；再以pMD-ca2为模版，用引物ca3和ca4扩增得到两端有BamHI和SalI酶切位点的CA基因的编码区序列，将PCR产物与pMD19-T质粒载体连接，得到重组质粒pMD-ca1；将pMD-ca1质粒与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和SalI双酶切，将切下的小片段连接到质粒pET-21a中，得到重组质粒pET-cyanoca；重组质粒pET-cyanoca转入原始菌株BL21(DE3)中，得到一株基因工程菌BCCA111。所述引物为:ca1:5’—CAACCGCAGGGAAATGAG—3’，ca2:5’—CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT—3’。

在本发明的一个优选的实施方式中，提供一种构建琥珀酸高产基因工程菌BCCA111的方法，是将含有完整鱼腥藻7120碳酸酐酶基因的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到基因工程菌BCCA111。

在本发明的一个进一步优选的实施方式中，提供所述重组质粒为pET-cyanoca，大概构建过程如下所述:

首先设计引物:ca1:5’—CAACCGCAGGGAAATGAG—3’，ca2:5’—CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT—3’以cyanobacterium Anabaena sp.7120的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个约830bp的片段，经测序证实其包含鱼腥藻7120碳酸酐酶的基因片段(795bp)；纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上(购于TaKaRa公司)，得到质粒pMD-ca2；为了在碳酸酐酶基因两端分别加上BamHI和SalI酶切位点，利用设计的引物ca3:5’—AACCGCGGATCCATGAGTAGTAC—3’(划线处为BamHI酶切位点)，ca4:5’—GGACAGAGTCGACTTAAATGGCTTC—3’(划线处为SalI酶切位点)，以pMD-ca2为模板，进行PCR扩增，得到一个约795bp的片段，经测序证实为碳酸酐酶基因的编码序列，连接到pMD-T载体(购于TaKaRa公司)，得到质粒pMD-ca1；纯化PCR产物，然后用BamHI和SalI双酶切质粒pMD-ca1和pET-21a，将其795bp片段插入质粒pET-21a的酶切位点处，构建出pET-cyanoca。重组质粒pET-cyanoca构建过程如图2所示。质粒pET-21a购于Novagen公司。

本发明产生如下的技术效果:

本发明的菌株和质粒能够提高原始大肠杆菌BL21(DE3)的琥珀酸产量，获得生长速率提高、具有更高琥珀酸产量的重组基因工程菌。

通过对比实验证明，构建出来的工程菌相对于原始菌来说，在生物量的积累速率上，在不同浓度IPTG或乳糖的诱导下以及在单纯厌氧发酵和先有氧，后无氧的双阶段发酵时琥珀酸产量都有很大的提高。表明这株工程菌存在着一定的应用潜力。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明:

图1是PEPC酶的三步催化反应机制及CA酶的催化反应机理示意图；

图2是质粒pET-cyanoca的构建过程示意图；

图3是重组大肠杆菌质粒BamHI和SalI双酶切电泳图，其中，M:λDNA双酶切marker；1#、2#、3#:pMD-ca1；4#、5#、6#:质粒pET-cyanoca；

图4是BL21(DE3)与BCCA111的生长速率曲线比较结果；

图5是BL21(DE3)与BCCA111在不同浓度IPTG诱导下的琥珀酸产量比较结果；

图6是BL21(DE3)与BCCA111在双阶段培养时的琥珀酸产量比较结果；

图7是BCCA111在双阶段补料发酵时的琥珀酸产量试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但这些实例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施方式中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

一、培养基的配制

LB培养基成份为每升水中含有5g酵母粉，10g胰蛋白胨和10gNaCl。固体培养基为液体基中加入1.5％的琼脂粉。为了增加培养基的选择性，氨苄青霉素(Amp)的使用浓度是50μg/ml。

二、cyanobacterium Anabaena sp.7120总DNA的提取

用SDS-蛋白酶K裂解菌体(蓝藻鱼腥藻菌cyanobacterium Anabaenasp.7120，购于中国科学院水生生物研究所菌种保藏中心)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA。其中使用的蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶，具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活，该酶在较广的pH范围内(pH4-12.5)均有活性。

1)取单菌落接种于100ml含氮培养基BG11中，在合适的温度下培养8天。BG11为已知的蓝藻通用培养基，配方为:1000ml含NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄ 0.03g，MgSO_4·7H₂O 0.075g，CaCl_2·2H₂O 0.036g，柠檬酸和柠檬酸铁铵0.006g，EDTA 0.001g，Na₂CO₃ 0.02g，痕量金属溶液1ml(H₃BO₃2.86g/L，MnCl_2·4H₂O 1.81g/L，ZnSO_4·7H₂O 0.222g/L，NaMoO_4·5H₂O0.39g/L，CuSO_4·5H₂O 0.079g/L，Co(NO₃)_2·6H₂O 0.0494g/L)，pH7.5。

2)取20ml菌液于离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清。

3)沉淀重悬于1.0ml 0.85％ NaCl中。

4)室温13,000rpm离心2min，弃上清。

5)沉淀重悬于550μl1×TE(Tris-HCl/EDTA缓冲液，配方为:10mmol/dm.3.Tris-HCl，1mmo l/dm.3.EDTA，pH值8.0)中。

6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min。

7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育30min。

8)加30μl 10％十二烷基磺酸钠SDS，37℃温育30min。

9)加100μl 5M NaCl充分混匀。

10)加80μl CTAB/NaC l溶液，混匀，65℃水浴10min。

11)加等体积(0.7-0.8ml)氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻振荡混匀。

12)室温，13,000rpm离心10min。

13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)轻轻振荡混匀。

14)重复第12)步。

15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)轻轻振荡混匀。

16)重复第12)步。

17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后室温静置60min。

18)20℃ 13,000rpm离心20min。

19)弃上清，加500μl 70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。

20)4℃ 15,000rpm离心20min。

21)重复洗盐两次。

22)倒置离心管，干燥DNA沉淀10-15min。

DNA沉淀溶于30μl 1×TE缓冲液(Tris-HCl/EDTA缓冲液，配方为:10mmol/dm³.Tris-HCl，1mmol/dm³.EDTA，pH值8.0)，-20℃保存备用。

三、重组质粒pMD-ca1的酶切分析

用碱裂解法提取质粒DNA。

取2μl质粒DNA，用BamHI和SalI双酶切。混合均匀，稍稍离心使溶液聚集到管底。37℃，反应2小时。酶切反应体积如下:

灭菌的去离子水                                        13μl

质粒DNA pMD-ca1                                       2μl

10×酶切缓冲液T【购于TaKaRa，330mM Tris-乙酸(pH  3μl

7.9)，100mM 乙酸镁，5mM二硫苏糖醇，660mM 乙酸钾】

限制酶BamHI                                           1μl

限制酶Sal                             I               1μl

总体积                                                20μl

酶切完毕后上样电泳检验，电泳见图3。

四、重组质粒pET-cyanoca的构建

pET-21a质粒的酶切体系按如下配比组成:

酶切反应37℃进行3小时后，电泳检验酶切程度。用DNA回收试剂盒回收酶切后的质粒。使用小牛碱性磷酸酶CIAP(浓度0.01U/μL)进行脱末端去磷酸化。反应按如下配比组成:

以上成份混合后在37℃反应30分钟后，再加入0.01U/μL的CIAP 5μl，继续在30℃反应30分钟后加入300μl的反应终止液。反应终止液的成份是10mmol/L Tris-HCL(pH7.5)，1mmol/L EDTA(pH7.5)，200mmol/L NaCl，0.5％SDS。然后用酚:氯仿抽提，再用乙醇沉淀回收得到末端脱磷pET21a质粒。用碱裂解法提取pMD-ca1重组质粒，BamHI和SalI双酶切，反应体系如下:

酶切反应在37℃进行3小时后，凝胶电泳并回收795bp的条带，此即为ca插入片段。该片段与处理好的pET-21a载体按如下的方法混和后进行连接反应。

连接反应在16℃进行4小时后用于转化反应。

五、DNA连接产物的转化反应与阳性克隆的筛选

感受态细胞用CaCl2法制备。选取大肠杆菌BL21(DE3)制成感受态细胞，用热击法进行转化反应，热击的反应条件是42℃热击90秒。热击后加入800μL的LB培养基【LB培养基的成分:(每1000ml)Trypton；10g，酵母提取物:5g，NaCl 10g，pH7.0-7.2】37℃活化45分钟后涂于含100μg/ml氨苄的LB平板上37℃过夜培养。挑取单菌落培养后碱液裂解法小量提取质粒，用BamHI和SalI双酶切分析，其结果如图3所示。表明用BL21(DE3)为宿主菌得到了阳性克隆。克隆所选用的方法是双酶切，这样克隆方向确定，保证了克隆基因的读码框方向正确。

六、重组菌的生长特征及稳定性分析

原始菌BL21(DE3)不具有氨苄抗性，质粒载体上有氨苄抗性基因。本基因工程菌能在浓度为100μg/ml的氨苄平板上正常生长，表明重组质粒已经转入于原始菌株BL21(DE3)中。挑取30个这样的菌落接种于含有100μg/ml的氨苄平板上，在该平板上没有质粒的菌则不能生长。结果经过24h的培养，平板上长出了27个菌落，说明该菌在没有任何的选择性压力的条件下仍十分稳定，稳定性达90％。

七、重组菌BCCA111的生长速率

挑取平板培养的BCA111单菌落，接入20毫升的加有氨苄1mg的LB培养基中。30℃，150转/分培养12小时后，再按1％的接种量将其接入500毫升的加有氨苄25mg的LB培养基，30℃，150转/分培养，在1.5h时加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)0.2mM。同时设立相同培养条件下的原始菌株BL21(DE3)作为对照。每隔1小时取样测定菌体的OD值，见图4。可以看出在加入IPTG诱导后第6h开始，重组菌株的生长速率加快了，且指数生长末期的菌体生物量增多，可能是因为重组菌的CO2吸收速率增加，菌体碳流的供应容易从而促进了生物量的积累加快。当然，在加入IPTG诱导后的4个小时内，因为菌体要过量表达ca酶，菌体生长速率有所降低。

八、工程菌BCCA111在不同浓度IPTG和乳糖诱导下的琥珀酸产量

当菌体生长OD值为0.2～0.4时，加入IPTG或乳糖诱导，使诱导物的终浓度为0.1mM～2mM。此时的培养基为LB培养基，葡萄糖浓度为20g/L。完全厌氧培养60h，采用HPLC的方法检测最终琥珀酸产量。同时设立相同条件下培养的原始菌株BL21(DE3)作为琥珀酸产量对照。图5显示的是分别用0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM IPTG诱导BCCA111发酵60h琥珀酸产量的变化，由图5可以看出虽然诱导物浓度存在差异，但是工程菌BCCA111的琥珀酸产量在不同浓度的IPTG诱导下都高于原始菌BL21(DE3)。

九、工程菌BCCA111在双阶段培养下的琥珀酸产量

构建的工程菌株先150rpm，37℃培养2h后加入诱导剂乳糖或IPTG诱导CA表达；6h后加入灭菌葡萄糖储液使其终浓度为30g/L，静置摇瓶进行无氧发酵。其间用NaOH调节发酵液的pH值使其保持在pH7.5处，并间或补加Amp，以防止质粒丢失。图6显示的是诱导剂为1mM乳糖时，发酵72h内每隔12h检测到的琥珀酸产量的变化。至发酵终点，琥珀酸产量为20.6g/L，比起原始菌株产量5.2g/L提高了三倍多。

十、工程菌BCCA111在双阶段培养并补料流加时的琥珀酸产量

在加有5L发酵液的6L Bioflo II发酵罐中进行补料发酵。加入100ml培养6h的种子培养基到5L发酵液中，种子培养基和发酵培养基均加入IPTG至终浓度0.5mM，种子培养基为LB培养基。发酵培养基为LB培养基加葡萄糖，初始葡萄糖浓度为40g/L，另加无机盐K₂HPO₄ 3.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgCl₂ 0.2g/L，pH7.5。当发酵过程中检测葡萄糖浓度低至5g/L时，补加葡萄糖使其浓度保持为5g/L。间或补加Amp，以防止质粒丢失。图7显示的是发酵60h内每隔12h检测到的琥珀酸产量的变化。至发酵终点72h，琥珀酸浓度达到68g/L，这使琥珀酸的产量比起原始BL21(DE3)菌株提高了13倍以上。

序列表

<110>中国科学院过程工程研究所

<120>用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途

<130>DIC07110080

<160>2

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>830

<212>DNA

<213>蓝藻鱼腥藻(cyanobacterium Anabaena sp.7120)

<400>1

<210>2

<211>795

<212>DNA

<213>蓝藻鱼腥藻(cyanobacterium Anabaena sp.7120)

<400>2

Claims (10)

1、一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表中SEQ ID NO:2的DNA片段的上下游35个碱基在内的片段；优选地，该重组质粒是携带有序列表中SEQ ID NO:1的DNA片段的pMD19-T载体。

2、一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是携带有序列表中SEQ IDNO:2的DNA片段的pMD19-T载体，是以权利要求1所述的质粒为模版扩增得到的。

3、一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求2的重组质粒与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和SalI双酶切，将切下的序列表中SEQ ID NO:2的DNA片段连接到质粒pET-21a中而得到的。

4、一株琥珀酸高产基因工程菌，其特征在于:所述工程菌是通过将权利要求1-3中任一项的重组质粒转入原始菌株大肠杆菌BL21(DE3)中而得到的。

5、权利要求1的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括:

首先设计引物:ca1:5’—CAACCGCAGGGAAATGAG—3’，ca2:5’—CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT—3’:

以cyanobacterium Anabaena sp.7120的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个约830bp的片段，经测序证实其包含序列表中SEQ ID NO:2的DNA片段；

纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到所述重组质粒pMD-ca2。

6、权利要求2的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括:

利用设计的引物ca3:5’—AACCGCGGATCCATGAGTAGTAC—3’，划线处为BamHI酶切位点；ca4:5’—GGACAGAGTCGACTTAAATGGCTTC—3’，划线处为SalI酶切位点；以权利要求5的方法得到的质粒为模板，进行PCR扩增，得到序列表中SEQ ID NO:2的DNA片段，经测序证实为碳酸酐酶基因的编码序列，连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD-ca1。

7、权利要求3的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括:将权利要求6的方法得到的质粒与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和SalI双酶切，将序列表中SEQ ID NO:2的DNA片段插入质粒pET-21a的酶切位点处，构建出所述重组质粒。

8、权利要求4的琥珀酸高产基因工程菌的制备方法，其特征在于:权利要求1-3中任一项的重组质粒转入原始菌株大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到所述基因工程菌。

9、权利要求1-3中任一项的重组质粒或权利要求4的基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的应用。

10、使用权利要求4的基因工程菌来发酵多种碳源来生产琥珀酸的方法，其特征在于:所述方法包括在生长过程中生物量的积累及加入不同的诱导剂时，在完全厌氧或先有氧积累菌体量，再无氧进行酸发酵的双阶段培养而生产琥珀酸；优选地，所述碳源为葡萄糖，和/或所述诱导剂为乳糖和IPTG。

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