CN107384847A - 一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的重组菌是过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3‑脱氧‑D‑甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因。本发明的重组菌中构建了以木糖为原料，从头合成乙二醇的代谢途径。同时，本发明还提供了该重组菌的构建方法以及应用方法。本发明以E.coli宿主菌，实现了以木糖为底物，在大肠杆菌这种模式菌株中首次利用本发明途径合成得到乙二醇，为乙二醇的生产提供了新的技术方法。

Description

一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
有机酸是目前市场需要非常大的一类化合物，每年生产的有机酸约数百万吨，应用于食品、医药、化妆品、化工等众多领域。同时有机酸也是利用代谢改造微生物合成的一类重要的生物基产品。乙二醇是一种最简单的α-羟基酸，在众多领域中都有重要的使用价值，例如在化妆品行业：乙二醇可以有效保护皮肤的柔韧性，提高皮肤的抗病性；乙二醇复合金属离子后能够作为一种去污清洁剂；乙二醇的单聚体或者与其他有机酸的多聚体可以作为性能良好的塑料，具有广泛的工业应用价值。
目前乙二醇的化学合成法主要通过高温高压条件下甲醛羧化形成，生物法主要通过转化乙醇醛成乙二醇。化学合成的条件严苛，耗能大，污染严重，而生物法合成由于污染小、原料可再生等优势越来越受到重视。目前微生物法利用的碳源主要是植物衍生的糖类和淀粉，然而木质纤维素原料的应用也是人们普遍重视的、未来生物技术的重要研究方向。木质纤维素的主要组成成分为D-葡萄糖和D-木糖，D-葡萄糖能够被多数微生物代谢形成目标产品，而D-木糖的利用范围相对较小，仅有少数微生物能够代谢，鉴于此原因，代谢工程改造仍然集中于以葡萄糖为底物的生物合成途径的研究。D-木糖作为木质纤维素的重要成分，来源广泛、成本低，以D-木糖作为底物，生物法合成乙二醇的研究具有重要的科学和应用价值。利用木糖生产乙二醇最早在Liu et al的文章中有报道(Liu,H.,et al.(2013)."Biosynthesis of ethylene glycol in Escherichia coli."Appl MicrobiolBiotechnol 97(8):3409-3417)利用其生物途径合成的乙二醇最终产量为11.7g/L，在接下来的几年中，生物合成乙二醇的文章被相继报道。其中报道的乙二醇最高产量为40g/L(Kim,H.J.,et al.(2013)."Genome-wide analysis of redox reactions revealsmetabolic engineering targets for D-lactate overproduction in Escherichiacoli."Metabolic Engineering 18(1):44-52)。以木糖为底物生物合成乙二醇的产量、产率及生产效率还有待进一步提高。
发明内容
为解决上述问题，本发明以D-木糖为底物，经脱氢酶、脱水酶、醛缩酶等多种酶催化反应形成乙醇醛，经乙醇醛脱氢酶催化形成乙二醇，目前尚未有人报道利用该途径生产乙二醇。本发明提供了一种利用木糖生产乙二醇的重组菌，所采取的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌，所述重组菌过表达木糖脱氢酶基因、木糖酸内酯酶基因、木糖酸脱水酶基因、3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙二醇还原酶基因，敲除调节乙酸合成的全局调控因子arcA和乙醇醛脱氢酶基因aldA。
在本发明的一种实施方式中，所述木糖脱氢酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobacter crescentus)的木糖脱氢酶基因xdh；所述木糖酸内酯酶基因，为来源于新月丙杆菌(Caulobacter crescentus)的木糖酸内酯酶基因xylC；所述木糖酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的木糖酸脱水酶基因yjhG；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH；所述乙二醇还原酶基因，为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的乙二醇还原酶基因fucO；敲除的控乙酸合成的基因为全局调控因子arcA，同时敲除合成乙醇酸的乙醇醛脱氢酶基因aldA。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的表达方式为将木糖脱氢酶基因xdh、木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体pETDuet-1上，将木糖酸脱水酶基因yjhG和乙二醇还原酶基因fucO连接到质粒载体pACYCDuet-1上，并敲除全局调控因子arcA和乙醇醛脱氢酶的基因aldA。
本发明的第二个目的是提供一种所述重组菌的构建方法，步骤如下：
1)克隆获得木糖脱氢酶的基因xdh、木糖酸内酯酶的基因xylC、木糖酸脱水酶的基因yjhG、3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶的基因yjhH、乙二醇还原酶的基因fucO；
2)将步骤1)所得的木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体，获得重组质粒；
3)将步骤1)所得的木糖酸脱水酶基因yjhG和乙二醇还原酶基因fucO连接到质粒载体上，获得重组质粒；
4)宿主菌基因组敲除全局调控因子arcA和乙醇醛脱氢酶的基因aldA；
5)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到经4)改造的宿主细胞，获得重组菌。
本发明第三个目的是提供所述重组菌在发酵生产乙二醇中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是以D-木糖作为底物，发酵培养所述重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述应用中发酵培养基为含有氨苄青霉素和氯霉素的M9液体培养基，重组细胞种子液的接种量为培养基体积为1％-5％，培养温度为35-38℃，搅拌速度为400-800rpm，pH6.0-8.0，溶氧18％以上的条件下培养至OD600为10左右，加入诱导剂IPTG至终浓度为80-120μM诱导表达，诱导后置于28-30℃、400-800rpm继续培养50-55h至发酵结束。
本发明的第四个目的是提供所述重组菌在食品、药物制备、化妆品或化工领域的应用。
本发明获得的有益效果如下：
本发明以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，实现了以D-木糖为底物，合成得到乙二醇，为D-木糖的生物利用及乙二醇的微生物合成提供了新的技术方法。
本发明通过在大肠杆菌中过表达新月丙杆菌的木糖脱氢酶基因xdh和木糖酸内酯酶基因xylC；同时过表达大肠杆菌MG1655的木糖酸脱水酶基因yjhG，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH和乙醇醛脱氢酶基因fucO，首次实现以D-木糖为碳源，经乙醇醛转化形成乙二醇的生物合成路径。
经上述改造的工程菌经发酵罐扩大培养后，产量可达72g/L，产率为42％，生产效率为1.36g/L/h，产量、产率和生产效率均为目前报道的最高产量。
附图说明
图1为利用木糖合成乙二醇的代谢途径示意图；
图2为重组大肠杆菌发酵产物乙二醇的高效液相色谱检测。
具体实施方式
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液摇瓶培养基
LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
2)发酵生产摇瓶培养基
M9培养基：10g/L D-xylose，14g/L K2HPO4·3H2O，5.2g/L KH2PO4，1g/L NaCl，1g/L NH4Cl，0.25g/L MgSO4·7H2O，0.2g/L yeast extract，20g/L glucose。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的氯霉素。
实施例1：外源基因的克隆
木糖脱氢酶基因：(xdh)(GenBank Accession No.:NACL94329)的克隆是以C.crescentus为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：xdh-F/xdh-R(序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2)；木糖酸内酯酶基因(xylC)(GenBank Accession No.:NACL94328)的克隆是以C.crescentus为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：xylC-F/xylC-R(序列如SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.4)；木糖酸脱水酶基因(yjhG)(Gene ID:946829)克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：yjhG-F/yjhG-R(序列如SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6)；3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因(yjhH)(Gene ID:948825)克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：yjhH-F/yjhH-R(序列如SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8)；乙二醇还原酶基因(fucO)(ID:947273)克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，引物序列为：fucO-F/fucO-R(序列如SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10)；克隆获得基因利用胶回收试剂盒回收目的片段。
表1克隆引物序列表
实施例2：重组质粒的构建
1、重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC
1)实施例1克隆所得的木糖脱氢酶基因xdh与载体pETDuet-1经NdeI、KpnI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段xdh和载体pETDuet-1，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-xdh；
2)实施例1克隆所得xylC基因与重组质粒pETDuet-1-xdh经EcoRI、NotI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段xylC和载体pETDuet-1-xdh，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-xdh-xylC；
3)实施例1克隆所得yjhH基因与重组质粒pETDuet-1-xdh-xylC经EcoRI、NcoI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段yjhH和载体pETDuet-1-xdh-xylC，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC。
2、重组质粒pACYCDuet-1-fucO-yjhG
1)实施例1克隆所得的木糖脱氢酶基因yjhG与载体pACYCDuet-1经NdeI、xhoI双酶切后,利用回收试剂盒回收酶切后目的片段yjhG和载体pACYCDuet-1，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pETDuet-1-yjhG；
2)实施例1克隆所得fucO基因与重组质粒pETDuet-1-yjhG经EcoRI、NcoI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段fucO和载体pETDuet-1-yjhG，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet-1-fucO-yjhG。
实施例3：重组菌株构建
按照PRE112自杀质粒介导的基因敲除的方法，将调控乙酸合成的全局调控因子arcA和氧化形成乙醇酸的乙醇醛还原酶aldA在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组上敲除，形成E.coliBL21(DE3)ΔarcAΔaldA，按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备E.coliBL21(DE3)ΔarcAΔaldA感受态，将重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC和pACYCDuet-1-fucO-yjhG通过热激法转化至宿主菌株E.coliBL21(DE3)ΔarcAΔaldA感受态细胞，得到重组菌株，编号为ZG-2843。
实施例4：重组菌株的3L发酵罐发酵试验
将活化后的重组菌株ZG-2843按1:100的比例接种到含有50mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到1.2左右时，转接入含有1L培养基的发酵罐扩大培养，OD600达到10左右时加入IPTG至终浓度为100μM诱导表达，诱导后置于30℃、800rpm继续培养52h至发酵结束。每间隔4h，取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测发酵产物。液相色谱(图2)证实得到了产物乙二醇；在发酵罐发酵中工程菌产量为72g/L，转化率为43％，生产效率为1.36g/L/h。
本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；上述过量表达的5种基因共同克隆到大肠杆菌(E.coli)中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。
对照例：
将重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC和pACYCDuet-1-fucO-yjhG通过热激法转化至宿主菌株E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌株，编号为ZG-2766。将活化后的重组菌株ZG-2766按1:100的比例接种到含有50mL的M9改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到1.2左右时，转接入含有1L培养基的发酵罐扩大培养，OD600达到10左右时加入IPTG至终浓度为100μM诱导表达，诱导后置于30℃、800rpm继续培养52h至发酵结束。每间隔4h，取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清，进行HPLC检测证实得到了产物乙二醇；在发酵罐发酵中工程菌产量为17.3g/L，转化率为16.7％，生产效率为0.33g/L/h。
选取了三个基因ackA、iclR和arcA分别进行单基因敲除。将上述双质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC和pACYCDuet-1-fucO-yjhG转入含有单基因敲除的大肠杆菌感受态细胞内，得到重组菌，分别命名为：ZG-2773、ZG-2774和ZG-2775。经摇瓶发酵，乙二醇产量分别为1.76g/L、1.59g/L和2g/L，远远低于重组菌株ZG-2843的摇瓶发酵产量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 1
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggaattcca tatgtcctca gccatctatc cc 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggggtacct caacgccagc cggcgtcgat 30
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccggaattct aatacgactc actatagggg aattg 35
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaggaaaaaa gcggccgctt aaaccagacg aacttcgtgc tg 42
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggaattccat atgtctgttc gcaatatttt tgc 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgctcgagt cagtttttat tcataaaatc gcg 33
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgccatggc atgaaaaaat tcagcggcat 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccggaattct cagactggta aaatgccct 29
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccgccatggg atgtcagtac ccgttcaaca 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccggaattct taagactgta aataaacca 29

Claims (10)

1.一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达木糖脱氢酶基因、木糖酸内酯酶基因、木糖酸脱水酶基因、3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙二醇还原酶基因，并敲除调节乙酸合成的全局调控因子arcA和乙醇醛脱氢酶基因aldA。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述木糖脱氢酶基因，为来源于新月丙杆菌的木糖脱氢酶基因xdh；所述木糖酸内酯酶基因，为来源于新月丙杆菌的木糖酸内酯酶基因xylC；所述木糖酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌的木糖酸脱水酶基因yjhG；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因，为来源于大肠杆菌的3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH；所述乙二醇还原酶基因，为来源于大肠杆菌的乙二醇还原酶基因fucO。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的表达方式为将木糖脱氢酶基因xdh、木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体pETDuet-1上，将木糖酸脱水酶基因yjhG和乙二醇还原酶基因fucO连接到质粒载体pACYCDuet-1上，并敲除全局调控因子arcA和乙醇醛脱氢酶的基因aldA。
6.一种权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)克隆获得木糖脱氢酶的基因xdh、木糖酸内酯酶的基因xylC、木糖酸脱水酶的基因yjhG、3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶的基因yjhH、乙二醇还原酶的基因fucO；
2)将步骤1)所得的木糖脱氢酶基因xdh，木糖酸内酯酶基因xylC和3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒载体，获得重组质粒；
3)将步骤1)所得的木糖酸脱水酶基因yjhG和乙二醇还原酶基因fucO连接到质粒载体上，获得重组质粒；
4)宿主菌基因组敲除全局调控因子arcA和乙醇醛脱氢酶的基因aldA；
5)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到经4)改造的宿主细胞，获得重组菌。
7.权利要求1所述重组菌在发酵生产乙二醇中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用是以D-木糖作为底物，发酵培养权利要求1所述重组菌。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用中发酵培养基为含有氨苄青霉素和氯霉素的M9液体培养基，重组细胞种子液的接种量为培养基体积为1％-5％，培养温度为35-38℃，搅拌速度为400-800rpm，pH6.0-8.0，溶氧18％以上的条件下培养至OD600为10左右，加入诱导剂IPTG至终浓度为80-120μM诱导表达，诱导后置于28-30℃、400-800rpm继续培养50-55h至发酵结束。
10.权利要求1所述重组菌在食品、药物制备、化妆品或化工领域的应用。
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